CN108660227A - 用于检测溶脲脲原体血清型10的引物对及其试剂盒 - Google Patents

用于检测溶脲脲原体血清型10的引物对及其试剂盒 Download PDF

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CN108660227A CN201710192737.1A CN201710192737A CN108660227A CN 108660227 A CN108660227 A CN 108660227A CN 201710192737 A CN201710192737 A CN 201710192737A CN 108660227 A CN108660227 A CN 108660227A
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游宗启
张智皓
张郁莹
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Abstract

本发明提供一种用于检测溶脲脲原体血清型10的引物对及其试剂盒。其中，所述引物对的DNA序列如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示。本发明的引物对可用于UU‑10泌尿生殖系统感染的快速检验，以及感染引发的相关病症的风险评估。还提供一种用于UU‑10的PCR检测的试剂盒，其包含本发明的引物对。

Description

用于检测溶脲脲原体血清型10的引物对及其试剂盒
技术领域
本发明涉及溶脲脲原体血清型10的核酸检测方法，特别是用于检测溶脲脲原体血清型10的引物对及其试剂盒。
背景技术
尿浆菌感染为泌尿生殖系统最常见的细菌感染，感染后常引起泌尿生殖系统相关的疾病如前列腺炎、阴道炎、尿道炎及不孕等，孕妇若感染尿浆菌，自然流产、早产、绒毛膜羊膜炎(chorioamnionitis)等疾病的风险将提高[1]，若进一步经由羊水进入婴儿口、鼻、肺部，恐引起小儿肺支气管发育不全(bronchopulmonary dysplasia，BPD)、呼吸窘迫症候群(respiratory distress syndrome，RDS)或甚至新生儿死亡等[1-3]。
因其潜伏期长且多无症状，据估计，健康成年女性子宫颈或阴道感染尿浆菌的比例约为40至80％[2,4]，孕妇由于妊娠期间荷尔蒙改变，抑制免疫反应，导致更容易受到尿浆菌的感染，而由母亲垂直感染至新生儿的比例更达90％[2]。
尿浆菌(Ureaplasma spp.)分类上属于柔膜菌纲(Mollicutes)、支原体目(Mycoplasmatales)、支原体科(Mycoplasmataceae)、尿浆菌属(Genus ureaplasma)，包括微小脲原体(Ureaplasma parvum)及溶脲脲原体(Ureaplasma urealyticum)[2]，目前依据尿浆菌表面的多带抗原(Multiple banded antigen，MBA)可区分成14种血清型[2,5]，其中4种属于微小脲原体(血清型1、3、6及14)，其他10种属于溶脲脲原体(血清型2、4、5及7-13)[1]。
特定血清型的尿浆菌常被探讨其盛行率、抗药性、致病性、侵入性、早产并发症及特定疾病的关联性等[6-8]，Sung等人研究发现微小脲原体血清型3以及溶脲脲原体血清型10多在具有严重BPD及死亡的婴儿的呼吸道分泌物中发现[4]，而Naessens等人提出溶脲脲原体血清型4常在反复性流产的孕妇上发现[6]，显示尿浆菌血清型的分型与辨别有助于厘清其致病机转及流行病学研究。
尿浆菌检测较常应用于妇女泌尿生殖道感染及新生儿呼吸道感染，检测方法包含传统培养法、聚合酶连锁反应法(PCR)、即时定量聚合酶连锁反应(real-time PCR)等，其中传统培养法耗时、专一性与灵敏度较低。
即时定量聚合酶连锁反应主要利用荧光染剂及聚合酶连锁反应进行即时监测反应产物量，聚合酶连锁反应以DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)延长专一性引物所粘合的区域而合成新的双股DNA。而荧光染剂可搭配Taqman探针或SYBR Green I等，使用SYBR Green I具有快速、易操作及灵敏度佳的优势[9]。
目前坊间诊所及医院检验科多以即时定量聚合酶连锁反应法提供相关服务，可利用尿素酶(urease)基因片段为检测目标设计引物，针对微小脲原体及溶脲脲原体的检测极限分别为107及104复制体(copies)/mL。
中国CN102094072A号专利揭示一种SYBR Green法检测溶脲脲原体感染的PCR试剂盒。中国CN10149726B号专利则揭示一种快速同步检测沙眼衣原体、微小脲原体和溶脲脲原体的试剂盒。
仍需要能够专一地检测特定血清型的微小脲原体或溶脲脲原体的核酸检测方法。
发明内容
在一方面，本发明提供一种用于检测溶脲脲原体血清型10(Ureaplasmaurealyticum serovar 10，UU-10)的引物对，其DNA序列如SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2所示。本发明的引物对能够达成快速、稳定、具灵敏度、可准确定量与鉴别尿浆菌特定血清型(UU-10)的核酸诊断。
本发明的引物对由一正向引物及一反向引物组成，该正向引物为5’-GCTAGTATTATCGATGCTAA-3’(序列如SEQ ID NO:1所示)，该反向引物为5’-CTCGATCAAACAAGTCAA-3’(序列如SEQ ID NO:2所示)。
本发明的引物对可用于PCR或RT-PCR。在本发明的一较佳具体实施例中，所述引物对配合SYBR Green I染剂而用于RT-PCR。
另一方面，本发明提供一种用于UU-10的PCR检测的试剂盒，其包含如上述的引物对。在本发明部分具体实施例中，该试剂盒还包含一DNA结合染剂，例如，一SYBR Green I染剂。
应了解先前的一般描述及以下的详述两者皆仅为示例性及解释性且并不限制本发明。
配合附图阅读可更佳也了解本发明如前的概述和以下的详细说明。附图中显示目前较佳的实施例。
附图说明
图1显示不同浓度下(1011-104复制体/mL)的UU-10阳性质粒模板及阴性控制组的扩增曲线图(amplification plot)。
图2显示1010-105复制体/mL浓度下UU-10阳性质粒模板的线性回归。
图3显示不同浓度下的UU-10阳性质粒模板及UU-10引物的熔解曲线图(meltingcurve plot)。
具体实施方式
以下详细描述都仅为示例性及解释性的，而非对本发明的限制。
本发明提供一种用于检测溶脲脲原体血清型10(Ureaplasma urealyticumserovar 10，UU-10)的引物对，其由一正向引物及一反向引物组成，该正向引物为5’-GCTAGTATTATCGATGCTAA-3’(序列如SEQ ID NO:1所示)，该反向引物为5’-CTCGATCAAACAAGTCAA-3’(序列如SEQ ID NO:2所示)。
本发明的引物对可用于PCR或RT-PCR。在本发明的一较佳具体实施例中，所述引物对配合SYBR Green I PCR反应试剂而用于RT-PCR分析，具有可准确定量及专一地辨别UU-10的优势，其准确定量范围广(105-1010复制体/mL)、灵敏度高(检测极限为104复制体/mL)。
另一方面，本发明提供一种用于UU-10的PCR检测的试剂盒，其包含如上述的引物对。根据本发明的部分具体实施例，该试剂盒进一步包含一DNA结合染剂。所述DNA结合染剂包括但不限于：SYBR Green I、SYBR Green II、GelStar及SYBR Gold染剂，或其衍生物。
在本发明的较佳具体实施例中，所述PCR为RT-PCR，在一具体实施例中，该DNA结合染剂为一SYBR Green I染剂。
本发明的引物对或试剂盒能够达成快速、稳定、具灵敏度、可准确定量与鉴别尿浆菌特定血清型(UU-10)的核酸诊断。此外，本发明的引物对或试剂盒可用于UU-10感染及UU-10感染引起的疾病的风险评估试验，所述UU-10感染引起的疾病包括但不限于小儿肺支气管发育不全(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)及其严重程度、脑膜炎、脑缺损疾病…等。
本发明通过以下实例进一步说明，其提供作为例示的用途而非限制本发明。
下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人主编的分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或参照试剂制造商所建议的条件及步骤。
实例
实例1：溶脲脲原体血清型10的定量范围及灵敏度分析
将溶脲脲原体血清型10(UU-10)阳性质粒模板进行10倍序列稀释为1011复制体/mL、1010复制体/mL、109复制体/mL、108复制体/mL、107复制体/mL、106复制体/mL、105复制体/mL、104复制体/mL及阴性控制组(non-template control，NTC)。所述UU-10阳性质粒模板系将UU-10菌株(美国标准菌株保存中心ATCC编号33699)的特定175bp序列(NCBI序列编号NC_011374.1的第367945-368119bp)插入pUC57质粒以制备得到。
阴性控制组及UU-10阳性质粒模版每浓度分别取5.0μL，加入聚合酶反应液(2X，包含SYBR Green I染剂)10.0μL，SEQ ID NO:1的正向引物1.0μL(终浓度0.5μM)，SEQ ID NO:2的反向引物1.0μL(终浓度0.5μM)，再以双蒸水(ddH2O)将每反应管反应总体积调整至20μL，同一浓度进行三反应管的重复试验。
在即时定量聚合酶反应仪进行检测，仪器条件设定为：于50℃、2分钟及95℃、10分钟下进行1次循环的预备程序，接着以95℃、15秒及60℃、1分钟的条件进行40次循环的扩增程序，最后于95℃下持续15秒及60℃下持续1分钟，并以每秒0.15℃的速度上升至95℃进行熔解曲线(melting curve)测试。
检测结束后，以即时定量聚合酶反应仪搭配的软件分析各组样品经阈值界定后所得出的循环数(Ct)。三重复结果平均为：1011复制体/mL、1010复制体/mL、109复制体/mL、108复制体/mL、107复制体/mL、106复制体/mL、105复制体/mL及104复制体/mL的Ct值分别为9.00、13.62、16.88、20.30、23.52、26.62、29.87及27.88，阴性对照组无扩增曲线产生。参见图1。
将UU-10阳性质粒模板浓度1011复制体/mL、1010复制体/mL、109复制体/mL、108复制体/mL、107复制体/mL、106复制体/mL、105复制体/mL及其对应的Ct值进行回归分析，R2为0.9998，如图2所示，显示此范围浓度下可进行准确定量。
重复此操作试验三次，PCR效率皆介于90-105％之间，线性回归R2均高于0.99，定量范围为1010至105复制体/mL，灵敏度可至104复制体/mL，三次独立试验间(inter-assay)及相同试验三重复间(intra-assay)的精确度(变异系数＝标准差/平均值x100％)小于15％，显示不同批次间检验结果稳定，再现性高，见下表1。
表1.三次独立试验分析的结果
实例2：对UU-10的专一性的分析
如实例1所述的UU-10阳性质粒模版各取5.0μL，加入聚合酶反应液(2X，包含SYBRGreen I染剂)10.0μL，正向引物1.0μL(终浓度0.5μM)，反向引物1.0μL(终浓度0.5μM)，再以双蒸水(ddH2O)将每反应管反应总体积调整至20μL，同一浓度进行三反应管的重复试验。
在即时定量聚合酶反应仪进行检测，仪器条件设定为：于50℃、2分钟及95℃、10分钟下进行1次循环的预备程序，接着以95℃、15秒及60℃、1分钟的条件进行40次循环的扩增程序，最后于95℃下持续15秒及60℃下持续1分钟，并以每秒0.15℃的速度上升至95℃进行熔解曲线(melting curve)测试。
检测结束后，以即时定量聚合酶反应仪搭配的软件分析熔解曲线图，如图3所示，结果为单一熔解曲线，表示引物对仅扩增单一产物，具有专一性。
实例3：对UU-10的专一性的电脑分析
将本发明及相关现有的引物及探针，以NCBI提供的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)分析可检测的尿浆菌血清型，结果见下表2。由结果可知，本发明的引物对能够专一性地辨认UU-10，而不辨认其他血清型的尿浆菌。
表2.比较本发明的引物与现有的引物或探针可检测的尿浆菌血清型
*表示经BLAST分析可检测的血清型。
本领域技术人员应理解可对上述的实施例进行改变而不背离其广泛的发明概念。因此，应了解本发明不受限于所揭示的特定实施例，而是意欲涵盖在如权利要求书所定义的本发明的精神与范畴内的修改。
参考文献：
[1]Viscardi,Rose M."Ureaplasma species:role in diseases ofprematurity."Clinics in perinatology 37.2(2010):393-409.
[2]Paralanov,V.,等人."Comparative genome analysis of 19Ureaplasmaurealyticum and Ureaplasma parvum strains."BMC microbiology 12.1(2012):88.
[3]Kallapur,Suhas G.,Boris W.Kramer,and Alan H.Jobe."Ureaplasma andBPD."Seminars in perinatology.Vol.37.No.2.WB Saunders,2013.
[4]Sung,T.J.,等人."Frequency of Ureaplasma serovars in respiratorysecretions of preterm infants at risk for bronchopulmonary dsyplasia."ThePediatric infectious disease journal 30.5(2011):379.
[5]Kong,F.,等人."Species identification and subtyping of Ureaplasmaparvum and Ureaplasma urealyticum using PCR-based assays."Journal of clinicalmicrobiology 38.3(2000):1175-1179.
[6]Naessens,A.,等人."Serotypes of Ureaplasma urealyticum isolatedfrom normal pregnant women and patients with pregnancy complications."Journalof clinical microbiology 26.2(1988):319-322.
[7]Quinn,P.A.,等人."Serologic evidence of Ureaplasma urealyticuminfection in women with spontaneous pregnancy loss."American journal ofobstetrics and gynecology 145.2(1983):245-250.
[8]Zhang,Y.,等人.,“Ureaplasma urealyticum serotypes distribution anddrug resistance.”Chinese journal of zoonoses 32.1(2016):45-50.
[9]Ponchel,F.,等人."Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence:an alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of generearrangements,gene amplifications and micro gene deletions."BMCbiotechnology 3.1(2003):18.
序列表
<110> 宣捷干细胞生技股份有限公司
<120> 用于检测溶脲脲原体血清型10的引物对及其试剂盒
<130> MRD0006TW
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
gctagtatta tcgatgctaa 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
ctcgatcaaa caagtcaa 18

Claims (5)

1.一种用于检测溶脲脲原体血清型10的引物对，其DNA序列如SEQ ID NO:1及SEQ IDNO:2所示。
2.一种用于溶脲脲原体血清型10的PCR检测的试剂盒，其包含如权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的用于溶脲脲原体血清型10的PCR检测的试剂盒，其还包含一DNA结合染剂。
4.根据权利要求3所述的用于溶脲脲原体血清型10的PCR检测的试剂盒，其中该PCR为RT-PCR。
5.根据权利要求4所述的用于溶脲脲原体血清型10的PCR检测的试剂盒，其中该DNA结合染剂为SYBR Green I染剂。
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