CN110157838A - 检测hsv1及hsv2的试剂盒及方法 - Google Patents

检测hsv1及hsv2的试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒，包含对HSV1具专一性的顺向引物和逆向引物，以及对HSV2具专一性的顺向引物和逆向引物。对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列，对HSV1具专一性的该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列。对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列，而对HSV2具专一性的该逆向引物具有序列编号7的序列。

Description

检测HSV1及HSV2的试剂盒及方法
技术领域
本发明关于一种HSV1及HSV2的快速诊断，尤指一种检测HSV1及HSV2的试剂盒及方法。
背景技术
单纯疱疹病毒1型(Herpes Simplex Virus type 1，简称HSV1)和单纯疱疹病毒2型(Herpes Simplex Virus type 2，简称HSV2)在分类上属α疱疹病毒亚科(alphaherpesvirus subfamily)，其包含被衣壳包围的双股DNA中心核。在α疱疹病毒亚科的所有病毒中，HSV1和HSV2具有约50％的最高同源性(homology)。HSV1和HSV2通过口腔及/或性接触而传播，并可感染口腔、生殖道和神经系统。疱疹病毒的一项独特能力是能够建立休眠期(或潜伏期)，并在后期阶段重新活化。
HSV感染对感染个体而言是地方性和持久性的，估计有67％的人群感染HSV1，而有11％的人群感染HSV2。HSV感染的症状可能在感染部位有疼痛水疱和溃疡，也可能在健康个体中大部分无症状。HSV感染在有症状时最具传染性，但无症状的带原者也可传播HSV。此外，感染HSV2的个体更容易感染艾滋病毒(HIV)，而免疫功能低下的个体(如感染HIV者)的HSV感染可能导致更严重的并发症，如脑炎、角膜炎(针对HSV1感染)、脑膜脑炎、食道炎、肝炎、肺炎、视网膜坏死或播散性感染(针对HSV2感染)。HSV感染也可以在分娩过程中从母亲传染给婴儿，并可能导致婴儿持续的神经残疾或死亡。因此，如何有效治疗HSV感染及预防HSV传播实为一重要课题，这也点出了对HSV感染的快速、灵敏及专一诊断的需求。
目前，HSV1和HSV2的检测和诊断包含病毒培养分析、抗原分析和核酸扩增分析。病毒培养分析是HSV检测的传统黄金标准分析法，其系利用荧光标记抗体进行病毒抗原染色，并由受过训练的人员来检验HSV的不同荧光模式或细胞病变效应的存在。因此这种检测方法需要专门及劳力密集的实验室，且只能在采样后2-7天内取得检测结果。此外，样本采集和运送条件也会影响病毒培养试验的灵敏度，因而降低辅助诊断的有效性。
抗原分析(例如市售1&2免疫印迹试剂盒)能够在约4小时内递送结果。然而，这样的试剂盒需要新鲜的样品、训练有素的人员以及多个步骤来获取和验证诊断结果。此外，抗原分析可能会因为抗原交叉反应性而得到伪阳性的结果。
确认HSV感染的最佳方式是分子诊断，亦即核酸扩增分析，尤其是藉由聚合酶链锁反应(polymerase chain reaction，PCR)进行测定。PCR是灵敏、可靠、且能早期检测传染病原的方法之一。核酸扩增分析(例如市售和试剂盒)利用实时聚合酶链锁反应(real-time PCR)技术检测HSV的DNA。这些分析法相较于病毒培养分析和抗原分析，提供了更高的可靠性和灵敏度，还具有易于使用和可同时检测两种HSV亚型的优点。由于所述分析是利用PCR的原理，必须进行95℃(30秒)供DNA变性、50-60℃(20秒)供引物退火、以及72℃(30-60秒)供引物延长以扩增核酸的温度循环，这些分析法在获得结果之前仍然需要很长的运作时间(1至2小时)。
因此，为了改善先前技术之缺失，实有必要提供一种更有效的HSV诊断方法。
发明内容
本发明的一目的在于提供可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒及方法，其具高灵敏度、高专一性及反应时间缩减等优点。
本发明的另一目的在于提供检测HSV1的试剂盒及方法，其具高灵敏度、高专一性及反应时间缩减等优点。
本发明的又一目的在于提供检测HSV2的试剂盒及方法，其具高灵敏度、高专一性及反应时间缩减等优点。
为达上述目的，本发明的一较广义实施方式为提供一种可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒。所述试剂盒包含对HSV1具专一性的一顺向引物和一逆向引物，其中对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，而对HSV1具专一性的该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒亦包含对HSV2具专一性的一顺向引物和一逆向引物，其中对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，而对HSV2具专一性的该逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。该顺向引物及该逆向引物用于实时聚合酶链锁反应。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号3或序列编号5的序列、与序列编号3或序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3或序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以专一地检测HSV1。所述试剂盒更包含另一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以专一地检测HSV2。
为达上述目的，本发明的另一较广义实施方式为提供一种可同时检测HSV1及HSV2的方法。所述方法包含利用实时聚合酶链锁反应并采用对HSV1具专一性的一顺向引物和一逆向引物以及对HSV2具专一性的一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV1或HSV2的DNA的步骤。其中用于实时聚合酶链锁反应的顺向引物、逆向引物和探针皆与前段说明相同。
为达上述目的，本发明的又一较广义实施方式为提供一种可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒，其包含对HSV1具专一性的一顺向引物、对HSV2具专一性的一顺向引物、以及对HSV1及HSV2皆具专一性的一通用逆向引物，以及一种可同时检测HSV1及HSV2的方法，其包含利用实时聚合酶链锁反应并采用对HSV1具专一性的一顺向引物、对HSV2具专一性的一顺向引物、以及对HSV1及HSV2皆具专一性的一通用逆向引物来扩增HSV1或HSV2的DNA的步骤。对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。对HSV1及HSV2皆具专一性的该通用逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号3或序列编号5的序列、与序列编号3或序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3或序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV1。所述试剂盒更包含另一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV2。
为达上述目的，本发明的又一较广义实施方式为提供一种可单独检测HSV1的试剂盒，其包含一顺向引物和一逆向引物，以及一种可单独检测HSV1的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV1的DNA的步骤。该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号3或序列编号5的序列、与序列编号3或序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3或序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV1。
为达上述目的，本发明的又一较广义实施方式为提供一种可单独检测HSV2的试剂盒，其包含一顺向引物和一逆向引物，以及一种可单独检测HSV2的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV2的DNA的步骤。该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。该逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV2。
附图说明
图1显示用来检测HSV1及HSV2的引物和探针的DNA序列。
图2显示引物和探针在相应的HSV序列上的黏合位置。
图3显示在单一反应中对500拷贝数的HSV1及HSV2的共同检测。
图4A及4B显示HSV1及HSV2之间无交叉反应。
图5A及5B分别显示与其他致病原质体DNA及基因体DNA的交叉反应测试的综合结果。
图6A及6B显示HSV1不同拷贝数的扩增曲线及对应的线性分析。
图7A及7B显示HSV2不同拷贝数的扩增曲线及对应的线性分析。
具体实施方式
体现本发明特征与优点的一些实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及附图在本质上为说明之用，而非用以限制本发明。
本发明利用实时聚合酶链锁反应(real-time polymerase chain reaction，简称real-time PCR)，又称定量聚合酶链锁反应(quantitative polymerase chain reaction，简称为qPCR)，并采用探针检测系统(probe-based detection)来对人类感染的单纯疱疹病毒1型(Herpes Simplex Virus type 1，简称HSV1)和单纯疱疹病毒2型(Herpes SimplexVirus type 2，简称HSV2)进行迅速、灵敏、专一及同时诊断。由于HSV1和HSV2的基因共享85％的序列相似性，使得HSV1和HSV2的同时诊断变得更为复杂。在本发明中，HSV1和HSV2的糖蛋白B(UL27)基因被选作感染原检测的目标基因，而引物设计则是针对同源基因的两个不同区域，以区分HSV1和HSV2的UL27基因。
藉由减少每个循环的变温和延伸时间(ramping and extension timing)的优化设计，本发明的引物和探针可利用实时聚合酶链锁反应达成HSV1或HSV2 DNA的快速检测，使得总反应时间缩短至少33％。本发明的引物和探针更可在不损害对每个目标的灵敏度和专一性情况下，达成HSV1和HSV2目标的同时或单独检测。
在实时聚合酶链锁反应中，具有专一性的顺向引物、逆向引物及探针会杂合到HSV1或HSV2的DNA目标上，其中探针的5’端接上报导染剂(reporter dye)，3’端接上淬灭体(quencher)。在PCR扩增反应过程中，探针会被切割，使得报导染剂与淬灭体分离，即可检测到报导染剂所发出的荧光。在一实施例中，报导染剂可为但不限于FAM荧光基团，淬灭体可为但不限于BHQ1基团。
HSV1和HSV2的DNA目标-糖蛋白B(UL27)基因在HSV1和HSV2之间具有充分的非同源性(non-homology)，可提供亚型专一性。本发明的引物对设计为具有60-70％的GC含量及65-68℃的Tm值，探针则设计为具有70-85％的GC含量及72-77℃的Tm值。而由引物对所扩增的扩增子(amplicon)的目标GC含量为60-70％，且具110-420个碱基对，较佳为110-190个碱基对。
图1显示用来检测HSV1及HSV2的引物和探针的DNA序列，图2显示引物和探针在相应的HSV序列上的黏合位置。对HSV1具专一性的引物和探针，其顺向引物起始于序列第1112个位置且包含21-mer(5’-AGGTGGACGAGATGCTGCGCT-3’；序列编号1)，或起始于序列第1388个位置且包含22-mer(5’-TGTACGTGCGGGAACACCTCCG-3’；序列编号4)，探针起始于序列第1163个位置且包含30-mer(5’-CCGACGCCATATCCACCACCTTCACCACCA-3’；序列编号3)，或起始于序列第1430个位置且包含22-mer(5’-CAAACCCCACGCCCCCGCCGCC-3’；序列编号5)，而逆向引物终止于序列第1292个位置且包含21-mer(5’-GCGTTGTACCTGCGGGCGAAG-3’；序列编号2)，或终止于序列第1524个位置且包含22-mer(5’-CGAGTTCGCCCGGCTGCAGTTT-3’；序列编号7)。对HSV2具专一性的引物和探针，其顺向引物起始于序列第1390个位置且包含22-mer(5’-CAGGACCGCAAGCCCCGGAATG-3’；序列编号6)，探针起始于序列第1433个位置且包含23-mer(5’-AGGCGCCCAGCGCCAACGCGTCC-3’；序列编号8)，而逆向引物终止于序列第1506个位置且包含22-mer(5’-CGAGTTCGCCCGGCTGCAGTTT-3’；序列编号7)。其中，序列编号7为对HSV1和HSV2皆具有专一性的通用逆向引物。
因此，为了专一地检测出HSV1的UL27基因，所采用的顺向引物可为序列编号1或序列编号4，逆向引物可为序列编号2或序列编号7，探针则可为序列编号3或序列编号5。
在一实施例中，如图2的组合A所示，序列编号1的顺向引物、序列编号2的逆向引物及序列编号3的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为181个碱基对的区域。
在一实施例中，如图2的组合B所示，序列编号4的顺向引物、序列编号7的逆向引物及序列编号5的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为130个碱基对的区域。
在一实施例中，如图2的组合C所示，序列编号1的顺向引物、序列编号7的逆向引物及序列编号3的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为413个碱基对的区域。
在一实施例中，如图2的组合D所示，序列编号1的顺向引物、序列编号7的逆向引物及序列编号5的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为413个碱基对的区域。
为了专一地检测出HSV2的UL27基因，如图2的组合E所示实施例，序列编号6的顺向引物、序列编号7的逆向引物及序列编号8的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV2的DNA上片段大小为117个碱基对的区域。
由于组合A至D中的引物及探针对于HSV1检测具有专一性，而组合E中的引物及探针对于HSV2检测具有专一性，因此组合A至D中任一组合及组合E可共同使用以同时且独立地检测HSV1及HSV2目标，且不损害对每个目标的灵敏度和专一性。
在一实施例中，组合A及组合E被共同使用以同时检测HSV1及HSV2。亦即，序列编号1及6的顺向引物、序列编号2及7的逆向引物、以及序列编号3及8的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为181个碱基对的区域，以及HSV2的DNA上片段大小为117个碱基对的区域。
在一实施例中，组合B及组合E被共同使用以同时检测HSV1及HSV2。亦即，序列编号4及6的顺向引物、序列编号7的通用逆向引物、以及序列编号5及8的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为130个碱基对的区域，以及HSV2的DNA上片段大小为117个碱基对的区域。由于序列编号7的通用逆向引物可同时用于HSV1及HSV2检测，可使得所采用的引物数目减少，因而降低反应复杂度。
在一实施例中，组合C及组合E被共同使用以同时检测HSV1及HSV2。亦即，序列编号1及6的顺向引物、序列编号7的通用逆向引物、以及序列编号3及8的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为413个碱基对的区域，以及HSV2的DNA上片段大小为117个碱基对的区域。由于序列编号7的通用逆向引物可同时用于HSV1及HSV2检测，可使得所采用的引物数目减少，因而降低反应复杂度。
在一实施例中，组合D及组合E被共同使用以同时检测HSV1及HSV2。亦即，序列编号1及6的顺向引物、序列编号7的通用逆向引物、以及序列编号5及8的探针被用于实时聚合酶链锁反应，以扩增HSV1的DNA上片段大小为413个碱基对的区域，以及HSV2的DNA上片段大小为117个碱基对的区域。由于序列编号7的通用逆向引物可同时用于HSV1及HSV2检测，可使得所采用的引物数目减少，因而降低反应复杂度。
为确认所采用的引物及探针对HSV1及HSV2具有专一性，图1所列的每个引物及探针皆利用美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation,NCBI)提供的BLAST系统进行比对，结果显示没有其他相近的物种具有与本发明设计的每个引物及探针完全相同的序列。此结果也显示本发明的引物及探针的专一性相当高，且对应的引物对及探针只能用来扩增及检测HSV1的UL27基因或HSV2的UL27基因。
在一些实施例中，本发明的引物及探针不限于具有与序列编号1至8完全相同的序列。举例来说，与序列编号1至8具有至少80％序列一致性(sequence identity)的序列也应具有与序列编号1至8相似的专一性，因而可同样用于检测HSV1及HSV2。特别是与序列编号1至8具有至少80％序列一致性且包含序列编号1至8最后10-mer的引物及探针更具有与序列编号1至8极为相似的专一性，故必然可用于检测HSV1及HSV2。另外，相同位置的互补序列可杂合至DNA的另一股上，故亦可做为引物或探针序列。举例来说，在组合A中，序列编号1的互补序列与序列编号2的互补序列也可组成检测HSV1的引物对，而探针则可采用序列编号3的序列或是序列编号3的互补序列。其他组合B至E亦可采用相同的变化态，在此不赘述。因此，与序列编号1至8互补的序列，或与序列编号1至8互补的序列有至少80％序列一致性的序列亦可适用作为本发明检测HSV1或HSV2的引物或探针。
在一些其他实施例中，由于包含对应的顺向引物和逆向引物的引物对可专一地检测HSV1或HSV2，故只要是位于顺向引物及逆向引物序列位置之间的序列，皆可设计为探针序列，因此，本发明提供的检测HSV1及/或HSV2的试剂盒或方法亦可不限制采用前述的探针序列。又，探针可设计为杂合至DNA的任一股上，故相同位置的互补序列亦可做为探针序列，因此，与前述探针序列互补的序列亦可做为检测HSV1或HSV2的探针序列。
根据上述，本发明提供一种可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒。所述试剂盒包含对HSV1具专一性的一顺向引物和一逆向引物，其中对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，而对HSV1具专一性的该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒亦包含对HSV2具专一性的一顺向引物和一逆向引物，其中对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，而对HSV2具专一性的该逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。该顺向引物及该逆向引物用于实时聚合酶链锁反应。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号3或序列编号5的序列、与序列编号3或序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3或序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以专一地检测HSV1。所述试剂盒更包含另一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以专一地检测HSV2。
本发明亦提供一种可同时检测HSV1及HSV2的方法。所述方法包含利用实时聚合酶链锁反应并采用对HSV1具专一性的一顺向引物和一逆向引物以及对HSV2具专一性的一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV1或HSV2的DNA的步骤。其中用于实时聚合酶链锁反应的顺向引物、逆向引物和探针皆与前段说明中的顺向引物、逆向引物和探针相同，故不再赘述。
由于序列编号7为对HSV1及HSV2皆具专一性的通用逆向引物，故本发明也提供一种可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒，其包含对HSV1具专一性的一顺向引物、对HSV2具专一性的一顺向引物、以及对HSV1及HSV2皆具专一性的一通用逆向引物，以及一种可同时检测HSV1及HSV2的方法，其包含利用实时聚合酶链锁反应并采用对HSV1具专一性的一顺向引物、对HSV2具专一性的一顺向引物、以及对HSV1及HSV2皆具专一性的一通用逆向引物来扩增HSV1或HSV2的DNA的步骤。对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。对HSV1及HSV2皆具专一性的该通用逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号3或序列编号5的序列、与序列编号3或序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3或序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV1。所述试剂盒更包含另一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV2。
此外，本发明更提供一种可单独检测HSV1的试剂盒，其包含一顺向引物和一逆向引物，以及一种可单独检测HSV1的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV1的DNA的步骤。该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号3或序列编号5的序列、与序列编号3或序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3或序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV1。
又，本发明更提供一种可单独检测HSV2的试剂盒，其包含一顺向引物和一逆向引物，以及一种可单独检测HSV2的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV2的DNA的步骤。该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。该逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。所述试剂盒更包含一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，且该探针亦用于所述方法，以专一地检测HSV2。
以下将以实例说明本发明检测HSV1及HSV2的方法。
实时聚合酶链锁反应以Taqman试剂(Taqman probe based mastermix)、600nM的每一引物、200nM的HSV1检测探针、100nM的HSV2检测探针来进行，且总体积为10μL。FASTPCR的循环条件则先95℃30秒，接着进行95℃1秒的变性(denaturation)及68℃10秒的退火(annealing)及引物延伸(extension)，重复40个循环。
值得注意的是，由于所设计的引物、探针及扩增子具有提升的Tm值及较高的GC含量，使本发明可达成仅需两步骤的PCR，亦即95℃的变性步骤及68℃的退火/延伸步骤。换言之，本发明允许升高的退火温度，使得退火步骤可与延伸步骤结合，故可省略单独的退火步骤。因此，本发明显著地减少了在热循环仪中每个循环所需的变温和延伸时间，这使得整体反应时间从传统方法所需的1小时缩减为少于20分钟，故本发明具有缩减反应时间的优点，且同时维持检测分析的专一性及灵敏度。
再者，本发明可在同一反应中同时达成HSV1及HSV2的检测。图3显示在单一反应中对500拷贝数的HSV1及HSV2的共同检测。从图中可清楚看出，HSV1及HSV2可在同一反应中被独立检测出来。因此，本发明可达成HSV1及HSV2的快速及同时检测。
此外，本发明可藉由快速热循环方式对HSV1或HSV2的DNA进行一致和专一的检测。利用NCBI BLAST针对人类和人类致病原数据库来仿真验证本发明设计的引物，结果显示缺乏与其他α疱疹病毒、人类和人类致病原DNA的交叉反应性。图4A及4B显示HSV1及HSV2之间无交叉反应。在图4A中，当HSV1引物和HSV2的浓缩阳性对照(106-107拷贝数)进行二重复反应(duplex reaction)试验时，仅检测到HSV1的扩增，此显示HSV1引物与另一亚型HSV2无任何交叉反应性。而在图4B中，当HSV2引物和HSV1的浓缩阳性对照(106-107拷贝数)进行二重复反应试验时，仅检测到HSV2的扩增，此显示HSV2引物与另一亚型HSV1无任何交叉反应性。因此，本发明所设计的引物具有极高的专一性。
又，HSV1或HSV2引物和其他致病原的质体DNA及基因体DNA的浓缩阳性对照也进行了二重复反应试验。如图5A及5B所示，本发明的HSV1或HSV2引物与其他细菌质体及基因体DNA并无任何交叉反应性。
另外，本发明可使用快速热循环方式达成少至数个拷贝数的检测并定量HSV1或HSV2的DNA拷贝数。图6A及图6B显示HSV1不同拷贝数的扩增曲线及对应的线性分析，图7A及图7B显示HSV2不同拷贝数的扩增曲线及对应的线性分析。试验条件的灵敏度、效率及线性在10-105DNA拷贝数之间皆被维持。从图6A及7A可见，此试验具有极高的灵敏度。从图6B及7B可见，HSV1及HSV2扩增的效率分别可达100.6％及92.6％，且R2值分别为0.994及0.987。由于R2值接近理论最佳值1.0，故该试验可进一步用于定量分析，以估算临床检验的基因拷贝数。
综上所述，本发明提供检测HSV1及/或HSV2的试剂盒及方法，其采用具专一性的引物及探针进行实时聚合酶链锁反应。本发明可在同一反应中同时达成HSV1及HSV2DNA的检测。本发明具有高灵敏度及高专一性的优点，且可用于定量检测。此外，本发明具有缩减反应时间的优点，可显著减少延伸时间，且同时维持反应的专一性及灵敏度。因此，本发明提供了快速、灵敏及专一的HSV感染诊断，可藉此有效治疗HSV感染及预防HSV传播。
纵使本发明已由上述实施例详细叙述而可由本领域普通技术人员任施匠思而为诸般修饰，然皆不脱如附权利要求书所欲保护者。
<110> 台达电子国际（新加坡）私人有限公司
<120> 检测HSV1及HSV2的试剂盒及方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引物
<400> 1
aggtggacga gatgctgcgc t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引物
<400> 2
gcgttgtacc tgcgggcgaa g 21
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成探针
<400> 3
ccgacgccat atccaccacc ttcaccacca 30
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引物
<400> 4
tgtacgtgcg ggaacacctc cg 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成探针
<400> 5
caaaccccac gcccccgccg cc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引物
<400> 6
caggaccgca agccccggaa tg 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成引物
<400> 7
cgagttcgcc cggctgcagt tt 22
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成探针
<400> 8
aggcgcccag cgccaacgcg tcc 23

Claims (21)

1.一种可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒，包含：
对HSV1具专一性的一顺向引物和一逆向引物，其中对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，而对HSV1具专一性的该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列；以及
对HSV2具专一性的一顺向引物和一逆向引物，其中对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，而对HSV2具专一性的该逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中该顺向引物及该逆向引物为用于实时聚合酶链锁反应。
3.如权利要求1所述的试剂盒，更包含一探针，其具有序列编号3的序列、与序列编号3有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
4.如权利要求1所述的试剂盒，更包含一探针，其具有序列编号5的序列、与序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
5.如权利要求1所述的试剂盒，更包含一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
6.一种可同时检测HSV1及HSV2的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用对HSV1具专一性的一顺向引物和一逆向引物以及对HSV2具专一性的一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV1或HSV2的DNA的步骤，
其中对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，
其中对HSV1具专一性的该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，
其中对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以及
其中对HSV2具专一性的该逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
7.如权利要求6所述的方法，其中该实时聚合酶链锁反应更采用对HSV1具专一性的一探针，其具有序列编号3的序列、与序列编号3有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
8.如权利要求6所述的方法，其中该实时聚合酶链锁反应更采用对HSV1具专一性的一探针，其具有序列编号5的序列、与序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
9.如权利要求6所述的方法，其中该实时聚合酶链锁反应更采用对HSV2具专一性的一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
10.一种可同时检测HSV1及HSV2的试剂盒，包含对HSV1具专一性的一顺向引物、对HSV2具专一性的一顺向引物、以及对HSV1及HSV2皆具专一性的一通用逆向引物，
其中对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，
其中对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以及
其中对HSV1及HSV2皆具专一性的该通用逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
11.一种可同时检测HSV1及HSV2的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用对HSV1具专一性的一顺向引物、对HSV2具专一性的一顺向引物、以及对HSV1及HSV2皆具专一性的一通用逆向引物来扩增HSV1或HSV2的DNA的步骤，
其中对HSV1具专一性的该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，
其中对HSV2具专一性的该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以及
其中对HSV1及HSV2皆具专一性的该通用逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
12.一种检测HSV1的试剂盒，包含：
一顺向引物，其具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列；以及
一逆向引物，其具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
13.如权利要求12所述的试剂盒，更包含一探针，其具有序列编号3的序列、与序列编号3有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
14.如权利要求12所述的试剂盒，更包含一探针，其具有序列编号5的序列、与序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
15.一种检测HSV1的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV1的DNA的步骤，
其中该顺向引物具有序列编号1或序列编号4的序列、与序列编号1或序列编号4有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号1或序列编号4互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以及
其中该逆向引物具有序列编号2或序列编号7的序列、与序列编号2或序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号2或序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
16.如权利要求15所述的方法，其中该实时聚合酶链锁反应更采用一探针，其具有序列编号3的序列、与序列编号3有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号3互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
17.如权利要求15所述的方法，其中该实时聚合酶链锁反应更采用一探针，其具有序列编号5的序列、与序列编号5有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号5互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
18.一种检测HSV2的试剂盒，包含：
一顺向引物，其具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列；以及
一逆向引物，其具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其中该实时聚合酶链锁反应更采用一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
20.一种检测HSV2的方法，包含利用实时聚合酶链锁反应并采用一顺向引物和一逆向引物来扩增HSV2的DNA的步骤，
其中该顺向引物具有序列编号6的序列、与序列编号6有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号6互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列，以及
其中该逆向引物具有序列编号7的序列、与序列编号7有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号7互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
21.如权利要求20所述的方法，其中该实时聚合酶链锁反应更采用一探针，其具有序列编号8的序列、与序列编号8有至少80％序列一致性的序列、或是与序列编号8互补的序列或与此互补的序列有至少80％序列一致性的序列。
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