CN102230027A - 同步检测spfmv、spvc、spvg和spv2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，属植物保护领域。通过分别设计合成SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2特异性的正向引物和四种病毒的通用反向引物，CTAB法提取病组织总核酸，采用一步法四重RT-PCR，达到对这四种病毒的同步检测。所设计的引物特异性强，且四种病毒共用一条反向引物，显著减少了引物间的相互作用。将CTAB法应用到RNA病毒侵染植物组织的核酸提取中，既能保证RNA质量，又有效降低了检测成本。反转录与多重PCR一步完成，节约了检测时间。本发明具有快速、高效、特异性强、灵敏度高和成本低廉等优点，能一次实现四种甘薯病毒的同步检测，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域：
本发明涉及一种同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，属植物保护领域。
背景技术：
甘薯是世界第七大粮食作物，也是发展中国家继水稻、小麦、玉米和木薯后的第五大粮食作物，年产量达1亿2700万吨，中国是世界最大甘薯生产国，年产量占世界的82.7％。甘薯主要靠秧蔓、薯块进行无性繁殖，极易造成病毒的传播和积累。病毒病是继甘薯小象甲后对甘薯生产为害最大的限制性因素之一，每年因病毒侵染造成的甘薯减产高达30％-50％，中国每年因甘薯病毒病造成的损失高达40亿元。据报道侵染甘薯的病毒有20多种，其中甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV)、甘薯C病毒(Sweet potato virus C，SPVC)、甘薯G病毒(Sweetpotato virusG，SPVG)和甘薯病毒2(Sweetpotato virus 2，SPV2)等四种病毒为甘薯上经常发生的马铃薯Y病毒属成员。SPFMV几乎在世界甘薯产区都有发现，常造成甘薯产生褪绿斑或沿叶脉形成紫色羽状斑纹，SPFMV的RC株系可在某些甘薯品种表面或内部形成褐色龟裂或木栓化，而O株系的症状较轻。SPVC过去被认为是SPFMV的C株系，最近的研究表明该株系应该是一个独立的种，其单独侵染甘薯不产生明显症状。SPVG最早于中国被发现，目前几乎在中国甘薯产区都有为害，而SPV2(有的称为SPVY或IVMV)自台湾首次发现后，也逐渐在很多国家被报道，SPVG和SPV2单独侵染甘薯也往往不产生明显症状。然而，这些病毒在田间往往复合侵染，常造成甘薯产量降低、品质变劣和种性退化，进一步加重了对甘薯的危害。迄今，国内外尚无特别有效的植物病毒病防治药剂，因此加强甘薯病毒检测尤其是对四种主要病毒的检测和监测，对于准确诊断病害和防止病毒的传播流行具有重要的现实意义，是生产上对甘薯病毒病进行综合治理的重要措施之一。
通常检测甘薯病毒的方法有鉴别寄主法、电镜技术、血清学技术和分子生物学技术等。鉴别寄主法中往往将病组织摩擦接种或嫁接至指示植物巴西牵牛(Ipomoeasetosa)上，而且常常要复合接种甘薯褪绿矮缩病毒(SPCSV)，通过SPCSV的协生作用来观察待测病毒的症状反应，检测周期长、灵敏度低，还受到季节、环境以及病毒种类等方面的影响，因此已经很少用于甘薯病毒的检测。由于电镜技术仅能观察到病毒的粒体形态，很难准确鉴定出病毒种类，而且设备昂贵，不适合作为甘薯病毒检测的普通方法。目前应用最为广泛的甘薯病毒检测方法是酶联免疫吸附法(ELISA)和分子生物学技术。ELISA方法检测周期较短，灵敏度高，一次可以对大规模样品进行检测，然而由于SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2在系统进化上关系非常近，具有部分血清学交叉反应，往往造成对一些病毒的漏检或误检。分子生物学技术，尤其是RT-PCR技术不但操作简单，而且特异性、灵敏度较ELISA方法高，但普通RT-PCR方法每次只能检测一种病毒，对于多种病毒复合侵染的情况，则需要针对每种病毒进行单独检测，工作量大，效率不高。此外，通常的RT-PCR检测前都需要使用价格昂贵的RNA提取试剂提取病组织总RNA，导致检测成本偏高。现有的很多植物病毒多重RT-PCR检测技术中，每一种病毒均需要一对检测引物，增加了引物间相互作用的概率，往往容易导致假阴性和非特异性，影响了检测结果的准确性。
申请号为200810049503.2的专利公开了一种能同时检测甘薯潜隐病毒(SPLV)、SPVG和SPFMV三种甘薯病毒的多重RT-PCR检测方法，由于SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2在系统进化上关系非常近，该方法设计的引物无法区分SPFMV和SPVC，而且其中的引物SEQ6既能与SPVG的基因组RNA结合也能与SPV2的基因组RNA结合。
发明内容：
本发明克服了现有技术在检测多种病毒复合侵染甘薯时的不足，提供了一种高效、灵敏、特异且低成本的检测甘薯上发生的SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2四种病毒的方法。
本发明的技术方案为：
(1)引物设计合成：
(a)设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG2R：5’-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’，R＝A或G，Y＝C或T；
(b)分别设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F，引物序列如下：
SPFF：5’-GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’，
SPCF：5’-GTGAGAAAYCTATGCGCTCTGTT-3’，
SPGF：5’-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG-3’，
SP2F：5’-CGTACATTGAAAAGAGAAACAGGATA-3’，
其中，Y＝C或T；
(c)每对引物扩增片段大小及待测病毒为：
(2)CTAB法提取感病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；
(3)一步法RT-PCR扩增；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
所述CTAB法提取感病植物组织的总核酸为：将3～5片病叶叠加在一起，称取100mg左右至研钵中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mM Tris-HCl，pH 8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％巯基乙醇)；充分研磨后，转入1.5mL离心管中，65℃温浴15～60min；13000r/min离心15min，取750μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋震荡混匀30s；13000r/min离心10min，小心转移600μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，13000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 70％乙醇，13000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀10～15min；加入100μL 20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)并置于冰上10min，用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解，-20℃保存备用，也可以将所获得的总核酸以干粉状态放入-86℃进行长期保存。
所述一步法RT-PCR的反应体系为20μL，包括10μL 2×Reaction mix(含0.4mM各dNTP，2.4mM MgSO4的buffer)、2μL 10μM引物SPFF、0.4μL 10μM引物SPCF、2.5μL 10μM引物SPGF、0.2μL 10μM引物SP2F、2μL 10μM引物SPFCG2R、0.7μLddH2O、1μL RNA模板和1.2μL Enzyme mix(含SuperScriptTMIII RT及
Taq HighFidelity)。
所述一步法RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min，94℃2min，94℃30s、60℃30s、65～68℃1～3min，扩增30个循环，72℃延伸5min后4℃保存。
本发明的有益效果：
(1)SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2是甘薯生产中较为常见的四种病毒，这些病毒往往复合侵染甘薯造成更加严重的危害。由于这四种病毒在系统进化上关系非常近，现有的检测技术很难做到对其进行准确鉴定，往往造成很多误检。本发明在对已报道的大量SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2基因序列进行对比分析的基础上，选择这四种病毒的基因变异区设计针对不同病毒的特异性正向引物。另外，多重检测中由于所使用的引物数量较多，引物间的相互作用往往造成检测结果非特异性增多甚至不能从阳性样品中检测到相关病毒。为了尽可能地减少引物间的相互作用和得到均一的扩增结果，本发明选择这四种病毒的共同保守区设计了能同时扩增这四种病毒的通用反向引物，明显减少了引物数量。通过对温室和田间样品所扩增的目标条带进行割胶纯化回收、cDNA克隆及序列分析反复验证所扩增产物的真实性，从而筛选出特异性强、兼容性高的引物组合。并对各引物的工作浓度、退火温度等进行了优化，最终确定四种病毒正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F的最佳工作浓度分别为1.0μM、0.2μM、1.25μM和0.1μM，下游通用引物SPFCG2R的工作浓度为1.0μM；最佳退火温度为60℃(图1)。另外，本发明对稀释至10-3的样品模板仍能同时获得四种病毒清晰的扩增结果(图2)。因此，本发明设计的引物特异性强，尽可能地避免了引物间的相互作用，能真正做到对SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的准确检测鉴定，重复性好、灵敏度高。
(2)传统RT-PCR检测甘薯病毒时要对SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2四种病毒逐一进行检测，所用的试剂量较大，耗时较长。本方法将反转录和多重PCR一步完成，一次反应即能同时检测四种病毒，与传统RT-PCR相比，在对大批量样品进行检测时最多能够节约三分之二的检测时间和试剂成本。此外，在对感病组织的总核酸提取中，采用了在DNA病毒中广泛使用的CTAB法，以此为模板进行的RT-PCR扩增同样能够达到准确、清晰的检测效果，因此显著节约了试剂成本，而且所获得的核酸稳定性高，便于长时间存储和远距离运输。因此，本发明具有高效率、低成本的特点，尤其适合较大样品量的检测。
附图说明：
图1：多重RT-PCR的特异性和兼容性
M：1Kb Plus DNA Ladder；1：SPVG；2：SPVC；3：SPFMV；4：SPV2；5：SPVG+SPVC；6：SPVG+SPFMV；7：SPVG+SPV2；8：SPVC+SPFMV；9：SPVC+SPV2；10：SPFMV+SPV2；11：SPVG+SPVC+SPFMV；12：SPVG+SPVC+SPV2；13：SPVG+SPFMV+SPV2；14：SPVC+SPFMV+SPV2；15：SPVG+SPVC+SPFMV+SPV2；16：健康甘薯叶片
图2：不同稀释倍数RNA模板的多重RT-PCR扩增结果
M：1Kb Plus DNA Ladder；1：100×稀释；2：101×稀释；3：102×稀释；4：103×稀释；5：104×稀释；6：105×稀释
图3：田间甘薯样品多重RT-PCR的部分检测结果
M：1Kb Plus DNA Ladder；1：SPVG；2：SPVC+SPFMV+SPV2；3：SPVC+SPFMV；4：SPFMV；5：SPVG；6：SPFMV；7：SPVG+SPVC+SPFMV+SPV2；8：SPVG+SPFMV+SPV2；9：SPFMV；10：健康甘薯叶片
具体实施方式：
实施例一：
1、实验材料
以经单一RT-PCR证实单独感染了甘薯G病毒(SPVG)、甘薯C病毒(SPVC)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯病毒2(SPV2)以及复合感染了SPVG+SPVC、SPVG+SPFMV、SPVG+SPV2、SPVC+SPFMV、SPVC+SPV2、SPFMV+SPV2、SPVG+SPVC+SPFMV、SPVG+SPVC+SPV2、SPVG+SPFMV+SPV2、SPVC+SPFMV+SPV2和SPVG+SPVC+SPFMV+SPV2的温室甘薯植株为材料，以健康甘薯植株为阴性对照。
2、引物设计及合成(由Invitrogen公司合成)
(a)设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG2R：5’-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’，R＝A或G，Y＝C或T；
(b)分别设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F，引物序列如下：
SPFF：5’-GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’，
SPCF：5’-GTGAGAAAYCTATGCGCTCTGTT-3’，
SPGF：5’-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG-3’，
SP2F：5’-CGTACATTGAAAAGAGAAACAGGATA-3’，
其中，Y＝C或T；
(c)每对引物扩增片段大小及待测病毒为：
3、CTAB法提取待测植物材料的总核酸
将3片病叶叠加在一起，称取100mg左右至研钵中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mM Tris-HCl，pH 8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％巯基乙醇)；充分研磨后，转入1.5mL离心管中，65℃温浴30min；13000r/min离心15min，取750μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋震荡混匀30s；13000r/min离心10min，小心转移600μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，13000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 70％乙醇，13000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀10min；加入100μL 20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)并置于冰上10min，用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解，-20℃保存备用，也可以将所获得的总核酸以干粉状态放入-86℃进行长期保存。
4、一步法RT-PCR
采用Invitrogen公司的SuperScript III one-step RT-PCR System with Platinum TaqHigh Fidelity试剂盒进行一步法RT-PCR扩增。反应体系为20μL，其中包括10μL 2×Reaction mix(含0.4mM各dNTP，2.4mM MgSO4的buffer)、2μL 10μM引物SPFF、0.4μL 10μM引物SPCF、2.5μL 10μM引物SPGF、0.2μL 10μM引物SP2F、2μL 10μM引物SPFCG2R、0.7μL ddH2O、1μL RNA模板和1.2μL Enzyme mix(含SuperScriptTM III RT及
Taq High Fidelity)。依次加入上述试剂，轻弹管壁充分混匀，稍离心后置PCR管于Bio-Rad C1000 Thermal Cycler中，进行RT-PCR反应。反应程序为50℃反转录30min，94℃2min，94℃30s、60℃30s、65℃1min，扩增30个循环，72℃延伸5min后4℃保存。
5、电泳检测
配制1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL溴化乙锭)，在0.5×TBE缓冲液环境中，80V稳压电泳70min，然后于凝胶成像仪观察拍照。
6、检测结果分析
单独感染了SPVG、SPVC、SPFMV以及SPV2的甘薯叶片中分别检测到了1191bp、836bp、589bp和369bp的单一核酸条带；复合感染了SPVG和SPVC的甘薯材料中检测到了1191bp和836bp两条核酸带，复合感染了SPVG和SPFMV的甘薯材料中检测到了1191bp和589bp两条核酸带，复合感染了SPVG和SPV2的甘薯材料中检测到了1191bp和369bp两条核酸带，复合感染了SPVC和SPFMV的甘薯材料中检测到了836bp和589bp两条核酸带，复合感染了SPVC和SPV2的甘薯材料中检测到了836bp和369bp两条核酸带，复合感染了SPFMV和SPV2的甘薯材料中检测到了589bp和369bp两条核酸带；复合感染了SPVG、SPVC和SPFMV的甘薯材料中检测到了1191bp、836bp和589bp三条核酸带，复合感染了SPVG、SPVC和SPV2的甘薯材料中检测到了1191bp、836bp和369bp三条核酸带，复合感染了SPVG、SPFMV和SPV2的甘薯材料中检测到了1191bp、589bp和369bp三条核酸带，复合感染了SPVC、SPFMV和SPV2的甘薯材料中检测到了836bp、589bp和369bp三条核酸带；复合感染了SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2的甘薯材料中检测到了1191bp、836bp、589bp和369bp四条核酸带，而健康对照中未检测到任何条带(图1)，说明通过本发明可同步检测出甘薯中感染的SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2四种病毒，引物特异性强、兼容性高。
7、扩增产物真实性验证
随机挑选上述扩增产物中的1191bp、836bp、589bp和369bp四条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用QIAGEN公司的QIAquick PCR PurificationKit纯化回收后，将回收产物连接至Promega公司的pGEM-T easy载体，按常规分子克隆方法转化至E.coli DH5α，采用5PRIME公司的FastPlasmidTM Mini Kit质粒提取试剂盒抽提重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送测序公司进行双向测序。序列分析表明，1191bp的cDNA与GenBank中登录的SPVG的核苷酸一致性达99％，836bp的cDNA与GenBank中登录的SPVC的核苷酸一致性达99％，589bp的cDNA与GenBank中登录的SPFMV的核苷酸一致性达99％，369bp的cDNA与GenBank中登录的SPV2的核苷酸一致性达99％，证明通过本发明从温室感病甘薯中获得的1191bp、836bp、589bp和369bp四条核酸带就是SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2的相应cDNA扩增产物，本发明的扩增产物真实可信。
实施例二：
1、实验材料
以经单一RT-PCR证实单独感染了SPVG、SPFMV以及复合感染了SPVC+SPFMV、SPVG+SPFMV+SPV2、SPVC+SPFMV+SPV2和SPVG+SPVC+SPFMV+SPV2的田间感病甘薯植株为材料，以健康甘薯植株为阴性对照。
2、引物设计及合成(由Invitrogen公司合成)
(a)设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG2R：5’-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’，R＝A或G，Y＝C或T；
(b)分别设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F，引物序列如下：
SPFF：5’-GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’，
SPCF：5’-GTGAGAAAYCTATGCGCTCTGTT-3’，
SPGF：5’-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG-3’，
SP2F：5’-CGTACATTGAAAAGAGAAACAGGATA-3’，
其中，Y＝C或T；
(c)每对引物扩增片段大小及待测病毒为：
3、CTAB法提取待测植物材料的总核酸
将5片病叶叠加在一起，称取100mg左右至研钵中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mM Tris-HCl，pH 8.0，1.4M NaCl，20mM EDTA，0.2％巯基乙醇)；充分研磨后，转入1.5mL离心管中，65℃温浴60min；13000r/min离心15min，取750μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋震荡混匀30s；13000r/min离心10min，小心转移600μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，13000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 70％乙醇，13000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀15min；加入100μL 20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)并置于冰上10min，用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解，-20℃保存备用，也可以将所获得的总核酸以干粉状态放入-86℃进行长期保存。
4、一步法RT-PCR
采用Invitrogen公司的SuperScript III one-step RT-PCR System with Platinum TaqHigh Fidelity试剂盒进行一步法RT-PCR扩增。反应体系为20μL，其中包括10μL 2×Reaction mix(含0.4mM各dNTP，2.4mM MgSO4的buffer)、2μL 10μM引物SPFF、0.4μL 10μM引物SPCF、2.5μL 10μM引物SPGF、0.2μL 10μM引物SP2F、2μL 10μM引物SPFCG2R、0.7μL ddH2O、1μL RNA模板和1.2μL Enzyme mix(含SuperScriptTMIII RT及
Taq High Fidelity)。依次加入上述试剂，轻弹管壁充分混匀，稍离心后置PCR管于Bio-Rad C1000 Thermal Cycler中，进行RT-PCR反应。反应程序为50℃反转录30min，94℃2min，94℃30s、60℃30s、68℃3min，扩增30个循环，72℃延伸5min后4℃保存。
5、电泳检测
配制1.0％的琼脂糖凝胶(含0.5μg/μL溴化乙锭)，在0.5×TBE缓冲液环境中，80V稳压电泳70min，然后于凝胶成像仪观察拍照。
6、检测结果分析
单独感染了SPVG和SPFMV的甘薯叶片中分别检测到了1191bp和589bp的单一核酸条带；复合感染了SPVC和SPFMV的甘薯材料中检测到了836bp和589bp两条核酸带，复合感染了SPVG、SPFMV和SPV2的甘薯材料中检测到了1191bp、589bp和369bp三条核酸带，复合感染了SPVC、SPFMV和SPV2的甘薯材料中检测到了836bp、589bp和369bp三条核酸带；复合感染了SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2的甘薯材料中检测到了1191bp、836bp、589bp和369bp四条核酸带，而健康对照中未检测到任何条带(图3)，说明通过本发明可同步检测出田间甘薯中感染的SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2四种病毒，重复性好。
7、扩增产物真实性验证
随机挑选上述扩增产物中的1191bp、836bp、589bp和369bp四条核酸带，在紫外灯下从凝胶中分别切下相应条带，采用QIAGEN公司的QIAquick PCR PurificationKit纯化回收后，将回收产物连接至Promega公司的pGEM-T easy载体，按常规分子克隆方法转化至E.coli DH5α，采用5PRIME公司的FastPlasmidTM Mini Kit质粒提取试剂盒抽提重组质粒，每个片段至少选3个阳性克隆送测序公司进行双向测序。序列分析表明，1191bp的cDNA与GenBank中登录的SPVG的核苷酸一致性达99％，836bp的cDNA与GenBank中登录的SPVC的核苷酸一致性达99％，589bp的cDNA与GenBank中登录的SPFMV的核苷酸一致性达99％，369bp的cDNA与GenBank中登录的SPV2的核苷酸一致性达99％，证明通过本发明从田间感病甘薯中获得的1191bp、836bp、589bp和369bp四条核酸带就是SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2的相应cDNA扩增产物，再次证明本发明的扩增产物真实可信。
结果表明：无论是在一种病毒单独侵染，还是在两种、三种或是四种病毒复合侵染的情况下，本发明的方法均能在不同实验条件下从温室和田间感病甘薯样品中检测到相应病毒，而阴性对照无非特异性结果发生，检测结果特异性强、真实可靠。由于反转录与多重PCR一步完成，一次扩增就能同时检测SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2四种病毒，既简化了检测手续，又节约了检测时间和检测成本。由于四种病毒共用一条通用反向引物，加之采用CTAB法提取感病组织总核酸，有效降低了检测成本。因此本发明具有效率高、特异性强、灵敏度高和成本低等优点，可应用于甘薯植株或其他相关植物上发生的SPVG、SPVC、SPFMV和SPV2四种病毒的同步检测，具有广阔的应用前景。
Claims (4)
1.一种同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其步骤为：
(1)引物设计合成：
(a)设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的通用反向引物SPFCG2R：5’-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA-3’，R＝A或G，Y＝C或T；
(b)分别设计合成检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的正向引物SPFF、SPCF、SPGF和SP2F，引物序列如下：
SPFF：5’-GGATTAYGGTGTTGACGACACA-3’，
SPCF：5’-GTGAGAAAYCTATGCGCTCTGTT-3’，
SPGF：5’-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG-3’，
SP2F：5’-CGTACATTGAAAAGAGAAACAGGATA-3’，
其中，Y＝C或T；
(c)每对引物扩增片段大小及待测病毒为：
(2)CTAB法提取感病植物组织的总核酸，作为RT-PCR扩增模板；
(3)一步法RT-PCR扩增；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
2.根据权利要求1所述的同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于，所述CTAB法提取感病植物组织的总核酸为：将3～5片病叶叠加在一起，称取100mg左右至研钵中，加入1.2mL CTAB缓冲液(2％CTAB，2％PVP-40，100mMTris-HCl，pH 8.0，1.4MNaCl，20mMEDTA，0.2％巯基乙醇)；充分研磨后，转入1.5mL离心管中，65℃温浴15～60min；13000r/min离心15min，取750μL上清至一新的1.5mL离心管，加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，涡旋震荡混匀30s；13000r/min离心10min，小心转移600μL上清液至一新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min，13000r/min离心15min，小心地用微量移液器吸出上清；沉淀加入500μL 70％乙醇，13000r/min离心10min，小心地用微量移液器吸出上清，室温下自然干燥沉淀10～15min；加入100μL 20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)并置于冰上10min，用微量移液器反复吹打液体使沉淀充分溶解，-20℃保存备用，也可以将所获得的总核酸以干粉状态放入-86℃进行长期保存。
3.根据权利要求1所述的同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于，所述一步法RT-PCR的反应体系为20μL，包括10μL 2×Reaction mix(含0.4mM各dNTP，2.4mM MgSO4的buffer)、2μL 10μM引物SPFF、0.4μL 10μM引物SPCF、2.5μL 10μM引物SPGF、0.2μL 10μM引物SP2F、2μL 10μM引物SPFCG2R、0.7μL ddH2O、1μL RNA模板和1.2μL Enzyme mix(含SuperScriptTM III RT及
Taq High Fidelity)。
4.根据权利要求1所述的同步检测SPFMV、SPVC、SPVG和SPV2的方法，其特征在于，所述一步法RT-PCR的反应条件为：50℃反转录30min，94℃2min，94℃ 30s、60℃ 30s、65～68℃ 1～3min，扩增30个循环，72℃延伸5min后4℃保存。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586484A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-18 | 河南省农业科学院 | 烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的检测方法及其应用 |
| CN103849691A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-11 | 福建省农业科学院作物研究所 | 一种甘薯病毒检测引物及方法 |
| KR101557045B1 (ko) | 2013-11-19 | 2015-10-21 | 대한민국 | Spv2, spvc, spsmv-1 및 spcfv 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 |
| CN105695456A (zh) * | 2016-03-21 | 2016-06-22 | 河南省农业科学院植物保护研究所 | 克隆甘薯羽状斑驳病毒o株系和甘薯病毒c全长基因组序列的引物及克隆方法 |
| CN106755602A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-05-31 | 云南农业大学 | 一种同步检测spvg、splv和spmmv的方法 |
| CN110157838A (zh) * | 2018-02-13 | 2019-08-23 | 台达电子国际（新加坡）私人有限公司 | 检测hsv1及hsv2的试剂盒及方法 |
| WO2020047949A1 (zh) * | 2018-09-03 | 2020-03-12 | 河南省农业科学院植物保护研究所 | 一种预测甘薯育苗期病毒病显症率和严重度的方法 |
| CN111057789A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-24 | 云南农业大学 | 一种同步检测PnVY和TYLCCNV的方法 |
| CN111455109A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-28 | 云南农业大学 | 一种同步检测zymv、prsv和ztmv的方法 |
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Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 《www.invitrogen.com》 20100601 www.invitrogen.com "SuperScript™ III One-Step RT-PCR System with Platinum(R) Taq High Fidelity"产品手册 3、4 , * |
| WWW.INVITROGEN.COM: ""SuperScript™ III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq High Fidelity"产品手册", 《WWW.INVITROGEN.COM》 * |
| WWW.INVITROGEN.COM: ""SuperScript™ III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq High Fidelity"产品手册", 《WWW.INVITROGEN.COM》, 1 June 2010 (2010-06-01) * |
| 季英华: "一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法", 《中国水稻科学》 * |
| 左瑞娟: "CTAB法用于染病烟草植株中烟草丛顶病毒RNA的提取", 《云南农业大学学报》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586484A (zh) * | 2012-03-09 | 2012-07-18 | 河南省农业科学院 | 烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒的检测方法及其应用 |
| KR101557045B1 (ko) | 2013-11-19 | 2015-10-21 | 대한민국 | Spv2, spvc, spsmv-1 및 spcfv 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 |
| CN103849691A (zh) * | 2014-02-26 | 2014-06-11 | 福建省农业科学院作物研究所 | 一种甘薯病毒检测引物及方法 |
| CN105695456A (zh) * | 2016-03-21 | 2016-06-22 | 河南省农业科学院植物保护研究所 | 克隆甘薯羽状斑驳病毒o株系和甘薯病毒c全长基因组序列的引物及克隆方法 |
| CN106755602A (zh) * | 2017-03-24 | 2017-05-31 | 云南农业大学 | 一种同步检测spvg、splv和spmmv的方法 |
| CN106755602B (zh) * | 2017-03-24 | 2020-02-04 | 云南农业大学 | 一种同步检测spvg、splv和spmmv的方法 |
| CN110157838A (zh) * | 2018-02-13 | 2019-08-23 | 台达电子国际（新加坡）私人有限公司 | 检测hsv1及hsv2的试剂盒及方法 |
| WO2020047949A1 (zh) * | 2018-09-03 | 2020-03-12 | 河南省农业科学院植物保护研究所 | 一种预测甘薯育苗期病毒病显症率和严重度的方法 |
| CN111057789A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-24 | 云南农业大学 | 一种同步检测PnVY和TYLCCNV的方法 |
| CN111455109A (zh) * | 2020-04-15 | 2020-07-28 | 云南农业大学 | 一种同步检测zymv、prsv和ztmv的方法 |
| CN111455109B (zh) * | 2020-04-15 | 2022-04-08 | 云南农业大学 | 一种同步检测zymv、prsv和ztmv的方法 |
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|---|---|
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