CN106834436A - 一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，该发明的恒温检测试剂盒，不依赖于ATP、磷酸肌酸等高能能量分子，相对现有的恒温扩增体系，其组成更为简单，成本更为低廉，使用更为方便。其中的关键组分包括有dNTPs、聚合酶Bsu、单链结合蛋白、重组酶（E.coli RecT）。本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增，扩增速度快且稳定，可以在30 min以内完成扩增反应，扩增的灵敏度和准确性高，不易出现错配，扩增效果好。

Description

一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，特别涉及一种不依赖于高能量分子的恒温扩增技术。
背景技术
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，是食物中毒最常见的致病菌之一，其侵袭力很强，能产生多种致病物质如：如肠毒素、凝固酶等；可引起化脓性炎症、毒素性疾病及葡萄球菌性肠炎。其流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年金葡萄引起的食物中毒事件屡次有报道，在细菌性食物中毒事件中仅次于沙门菌和副溶血弧菌，对人类健康具有确定危害，对食品中金黄色葡萄球菌进行定性和定量检测具有实际意义。
1983年，Mullis等发明了聚合酶链式反应（PCR）技术，30多年间，PCR技术得到长足发展，由于其在灵敏度和特异性方面的优势，PCR技术被迅速运用到科学研究和临床研究的各个方面。这种类似于DNA的天然复制过程的PCR技术，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
与传统的PCR技术相比，恒温扩增技术主要利用重组酶的活性，不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下（如37℃）进行核酸的扩增，因此不需要昂贵的仪器，也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物，降低了引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。另外，恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增，扩增效率远远高于传统PCR技术，所用时间更短，最短可以在5min内实现。由于恒温扩增技术具有扩增用时短、不需昂贵仪器、特异性好等特点，使其在项目上的应用越来越广泛。本发明将恒温扩增技术应用在食品安全中金黄色葡萄球菌的检测上，让金黄色葡萄球菌的检测过程更加简便快捷。
发明内容
本发明的目的在于一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，金黄色葡萄球菌nuc基因特异性引物。
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒反应液的具体成分如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒启动液的具体组分如下：
氯化镁 10mM
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒反应酶系的具体组分如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒特异性引物序列如下：
上游引物：CTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCG
下游引物：GCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATAC
本发明的有益效果：扩增用时短，特异性好，检测过程更快捷。
附图说明：
图1~3对应实施例1~3的实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实验，进一步说明快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒的优势。
本发明的目的在于一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，包括反应液，启动液，反应酶系，金黄色葡萄球菌nuc基因特异性引物。各组分的具体成分如下：
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒反应液的具体成分如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒启动液的具体组分如下：
氯化镁 10mM
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒反应酶系的具体组分如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒特异性引物序列如下：
上游引物：CTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCG
下游引物：GCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATAC
下面结合具体的实验，进一步说明快速检测金黄色葡萄球菌试剂盒的优势，但并非限制本发明。
实验样本来源：
以外购金黄色葡萄球菌经放大培养后提取得到的核酸溶液作为样本；
以外购沙门氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、李斯特菌经放大培养后提取得到的核酸溶液作为特异性实验的样本；
以混合感染沙门氏菌-金黄色葡萄球菌、大肠杆菌-金黄色葡萄球菌的奶制品经放大培养后提取得到的核酸溶液作为混合感染实验的样本；
以灭菌纯水为阴性对照样本。
实施例1（灵敏度实验）：
本实施例将金黄色葡萄球菌核酸按照10倍、100倍、1000倍、10000倍稀释，将稀释后的核酸依次标记为样本1、样本2、样本3、样本4，其浓度分别是10ng/ul、1ng/ul、0.1ng/ul、0.01ng/ul，用灭菌水作为阴性对照。取5个200ul反应管，依次标记为反应管1~5，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~5中，在反应管1中加入2ul 样本1，在反应管2中加入2ul 样本2，依次类推，反应管5加入2ul灭菌水，最后用灭菌水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。
反应结束后，从反应管1~5中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图1.
实施例2（特异性实验）：
本实施例将金黄色葡萄球菌核酸、沙门氏菌核酸、大肠杆菌核酸、志贺氏菌核酸、李斯特菌核酸依次标记为样本1、样本2、样本3、样本4，样本5，其浓度均为10ng/ul。取5个200ul反应管，依次标记为反应管1~5，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~5中，在反应管1中加入2ul 样本1，在反应管2中加入2ul 样本2，依次类推，最后用灭菌水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。
反应结束后，从反应管1~5中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图2.
实施例3（混合感染实验）：
本实施例将沙门氏菌-金黄色葡萄球菌核酸、大肠杆菌-金黄色葡萄球菌核酸依次标记为样本1、样本2，其浓度均为10ng/ul。取3个200ul反应管，依次标记为反应管1~3，分别加入20ul反应液、5ul反应酶系到反应管1~3中，在反应管1中加入2ul 样本1，在反应管2中加入2ul 样本2，反应管3加入2ul灭菌水，，最后用灭菌水将体系补足到45ul，混匀后再分别加入5ul启动液。
选择恒温水浴锅提供反应所需要的恒温环境，设置恒温水浴锅温度为37℃，反应时间为30min。
反应结束后，从反应管1~3中分别取10ul产物，用2%的琼脂糖凝胶进行电泳。结果如图3.
结论：
1.从图1的结果可以看到，金黄色葡萄球菌核酸浓度在10ng/ul、1ng/ul跟0.1ng/ul在200bp处有清晰的目的条带，浓度0.01ng/ul有较弱的目的条带，说明本发明试剂盒扩增效果好，灵敏度高。
2.从图2的结果可以看到，仅在样本1即金黄色葡萄球菌核酸在200bp处有扩增条带，其余样本无非特异性条带，说明本发明试剂盒扩增的特异性好，能准确的区分所检测的目的菌与其他食品常见菌。
3.从图3的结果可以看到，混合感染样本1跟2在200bp处有扩增条带，说明样本中不同核酸对本发明试剂盒的检测不造成干扰，说明本发明试剂盒特异性好，稳定性高。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州和实生物技术有限公司
<120> 一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒
<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttataggga tggctatcag taatgtttcg 30
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgacattaa ttaaagcgat tgatggtgat ac 32

Claims (8)

1. 一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，其反应液组成如下：
Tris-HCl（pH8.3） 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，其启动液组成如下：
氯化镁 10mM。
3. 根据权利要求1所述的一种快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，其反应酶系组成如下：
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 50U
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶（E.coli RecT） 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
重组酶为不依赖于能量分子的重组酶。
4.根据权利要求3所述的快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，所采用的上游引物跟下游引物，其特征在于上游引物序列为：CTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCG；
下游引物序列为：GCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATAC 。
5.根据权利要求1所述的快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：Tris-缓冲液的pH为7～9，优选pH为8.3。
6. 根据权利要求3任意一项所述的快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：重组酶选自E.coli RecT蛋白；λ噬菌体β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p140/Exoǁ蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
7.根据权利要求1-6所述的快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于：恒温扩增的温度为37～42℃，优选扩增温度为37℃。
8.根据权利要求1-3所述的快速检测金黄色葡萄球菌的恒温检测方法及其试剂盒，其特征在于用氯化镁作为反应的启动液，浓度为5mM~20mM，优选浓度为10mM。
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