CN108753928B - 利用rt-rpa方法快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种RT‑RPA快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒的方法及其在病害诊断上的应用。利用这一方法可以快速鉴定出水稻黑条矮缩样品，进而采取针对性的防治策略，减少病害带来的损失。

Description

利用RT-RPA方法快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒
技术领域：
本发明涉及植株中水稻黑条矮缩病毒的快速检测技术及其在病害诊断和测报上的应用，属于农业科学技术领域。
背景技术：
水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarf virus，RBSDV)，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)。水稻黑条矮缩病首次报道在1963年中国江苏、浙江、上海等地的水稻种植地区大面积爆发，之后造成小麦和玉米的普遍发病，曾造成江南地区水稻的几乎绝收。近几年，RBSDV在江苏、河南、浙江和江苏的水稻产区呈现爆发流行趋势。该病毒主要侵染水稻、玉米、和小麦等植物，侵染水稻引起水稻黑条矮缩病。感病植株表现为秧苗暗绿、叶片稍短且僵直、叶背基部常有浅绿至蜡白色的短条状脉肿，分蘖期病状更为明显，拔节至孕穗期，病株明显矮缩，病叶暗绿，病株一般不能正常抽穗或很少结实。发病田区减产明显，严重时甚至会造成颗粒无收。RBSDV侵染小麦时，造成小麦的绿矮病，症状与水稻相似；侵染玉米，造成玉米的粗缩病，发病植株有明显的粗缩、形如姜丛、叶色暗绿、叶片短直等症状。
目前植物病毒鉴定常用的方法有：生物学接种实验、血清学检测、电镜观察及分子生物学方法。这些方法大都需要特定仪器且耗时久，不适用于田间快速检测。重组聚合酶扩增法技术(recombinase polymerase amplification，RPA)是由Piepenburget等在2006年发明的一种新颖的恒温核酸扩增方法，是一种高灵敏链置换技术，一种新型PCR替代技术。RPA特点是针对靶基因的1个区域设计2条特异引物和1条特异性探针，利用重组酶(recombinases)、单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein)和链置换聚合酶(strand-displacing polymerase)在恒温(37℃)的条件下反应20min左右即可完成核酸扩增反应。通过快速检测试纸条(横向流动技术)检测RPA反应产物，直接得到清晰的反应结果。不需要长时间的温度循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，不需要繁琐的电泳紫外观察等过程。目前已广泛应用于人类和动植物各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测和快速诊断中。
发明内容：
本发明提供了一种快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒的方法，通过该方法可以快速诊断出植株是否携带该病毒。
本发明所提供的一种快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒的方法，通过以下方法获得：
1)根据NCBI已报道水稻黑条矮缩病毒P10核苷酸序列(NC_003733.1)，通过软件DNAstar分析后选择相对保守区域300-600bp，利用在线引物设计软件Primer blast(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝ BlastHome)设计3条引物，其中包括2条引物P10-RPA-F/P10-RPA-R和1条探针P10-probe；
2)Trizol reagent提取植株总RNA；
3)利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂，将RNA反转录成cDNA；
4)设置不同cDNA模板稀释浓度、反应时间、反应温度，确定最佳RT-RPA反应体系；
5)与RT-PCR方法进行比较，验证RT-RPA方法的可靠性；
本发明提供的引物序列如下：
P10-RPA-F CGAACAACGACCTAAGTGAAGAATTTGTAG
P10-RPA-R[5’BIOTIN]CTATACCAATATAACTATCATCGAGAATGA
P10-probe：
[5’FAM]TTATTTGCTACCTCCAAACTTGATGCTGAA[THF]AAATAGAACGT GTACA[3’BLOCK]。
RT-RPA的反应温度为37℃，反应时间为20min。
一种检测植株中水稻黑条矮缩病毒方法的应用包括：植株疑似病株的快速诊断与鉴别。
利用这一方法可以快速鉴定出植株是否感染水稻黑条矮缩病毒，进而采取针对性的防治策略，减少病害带来的损失。
附图说明：
图1：RT-RPA方法检测感病水稻植株中RBSDV(A，RBSDV病株病害症状；B，RT-RPA方法检测RBSDV；C，RT-PCR方法检测RBSDV)。
图2：RT-RPA检测RBSDV灵敏性(A，RT-RPA方法检测RBSDV的灵敏性；B，RT-PCR方法检测RBSDV的灵敏性)。
图3：RT-RPA反应温度和时间的优化(A，不同反应温度下的RT-RPA检测结果；B，不同反应时间的RPA检测结果)。
图4：RT-RPA与RT-PCR检测田间水稻样品中RBSDV对比(A，RT-RPA检测田间水稻样品中的RBSDV；B，RT-PCR检测田间水稻样品中的RBSDV)。
具体实施方式：
下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1，水稻黑条矮缩病毒RT-RPA检测方法的建立
(1)引物设计
根据NCBI上已报道的水稻黑条矮缩病毒P10核苷酸序列(NC_003733.1)设计引物。选取相对保守的一段序列332-523bp作为模板，使用在线PrimerBlast引物设计软件(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝Blast Home)设计引物。最终确定序列如下：
P10-RPA-F CGAACAACGACCTAAGTGAAGAATTTGTAG
P10-RPA-R[5’BIOTIN]CTATACCAATATAACTATCATCGAGAATGA
P10-probe：
[5’FAM]TTATTTGCTACCTCCAAACTTGATGCTGAA[THF]AAATAGAACGTGTACA[3’BLOCK]。
(2)RT-RPA RBSDV检测方法的建立
从南京江苏省农业科学院采集水稻病株，参照季英华等RT-PCR方法筛选出水稻样品用于RT-RPA检测试验(季英华等，《中国水稻科学》，2011)。参照
Figure BSA0000165601420000041
Reagents(康为世纪)使用说明，提取样品总RNA。PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒(大连宝生物)反转录得到cDNA。RT-RPA反应采用TwistAmp nfo kit(TwistDx，UK)试剂盒，体系为1μl cDNA，30μl水化缓冲液(rehydration buffer)，2μl 10mM P10-RPA-F引物，2μl 10mM P10-RPA-R引物，0.5μl 10mM P10-probe探针，2.5μl 280mM醋酸镁(magnesium acetate)，补充水至50μL。混匀反应物在37℃恒温反应20min，10μl RT-RPA反应产物用100μl检测缓冲液稀释，直接用Milenia GenLine HybriDetect检测试纸条(Milenia，Germany)检测。病株叶片用RT-RPA方法检测中表现为明显的阳性条带，而健康的叶片则为阴性条带，并且RT-PCR的扩增结果条带与RT-RPA试纸条带显示一致，同时UBQ内参引物扩增的病株和健株都有相同的亮带，说明健康植株没有在试纸条中显现阳性结果的原因是不含RBSDV，即成功建立了RT-RPA检测技术检测水稻RBSDV(图1)。因此本发明建立了RBSDV的RT-RPA检测方法。
(3)RT-RPA检测RBSDV的灵敏度
分别从cDNA稀释浓度的1到104倍共5种浓度cDNA作为模板，进行RT-RPA反应和RT-PCR反应。实验结果显示：当RBSDV病株叶片的cDNA的浓度稀释10倍时，RT-RPA检测与RT-PCR检测都表现为阳性结果，而稀释100倍、1000倍、10000倍则不能看到明显的阳性结果，说明在cDNA模板的稀释程度在1-10000倍之间时，稀释十倍就可以达到较好的检测结果，同时验证了RT-RPA具有与RT-PCR相似的检测病毒的灵敏性(图2)。因此本发明确定的RT-RPA的灵敏度为cDNA稀释10倍。
(4)RT-RPA反应温度和时间的优化
为了研究RPA反应最佳的反应温度和反应时间，从35℃到45℃之间每2个温度的间隔设置6种温度，实验结果显示RT-RPA在各个温度条件下都能得到良好的结果，其中37℃显示条带最为显著。在反应时间优化实验中，RT-RPA反应20min就可以看到明显的阳性条带显示，因此在用RPA方法检测RBSDV时，反应温度为37℃，反应时间为20min(图3)。本发明确定的RT-RPA检测RBSDV的反应温度为37℃，反应时间为20min。
(5)RT-RPA与RT-PCR检测田间水稻样品中RBSDV对比
RT-PCR是常用的检测病原菌的方法，具有较高的灵敏度和准确性。为了验证RT-RPA检测RBSDV方法的准确性，采用RBSDV病株和健株叶片共8个水稻样品，提取RNA后反转录为cDNA，分别用这两种方法检测比较。实验结果显示：RT-RPA检测和RT-PCR检测结果显示一致，即有5个样品显示RBSDV阳性，3个样品没有明显的条带，结果为阴性(图4)。本发明RT-RPA RBSDV检测方法可用于田间样品的检测。
一种检测植株中水稻黑条矮缩病毒的方法应用包括：在植株中的快速诊断与鉴别水稻黑条矮缩病毒。
上述实施不以任何形式限定本发明。
Figure ISB0000193456110000011

Claims (1)

1.一种快速检测植株中水稻黑条矮缩病毒的方法，其特征在于：利用RT-RPA反应的特异性引物，在37℃条件下恒温反应20min，鉴定出植株中水稻黑条矮缩病毒；所述“RT-RPA反应的特异性引物”是指以下3条引物：
P10-RPA-F：5’-CGAACAACGACCTAAGTGAAGAATTTGTAG-3’，
P10-RPA-R：5’-BIOTIN-CTATACCAATATAACTATCATCGAGAATGA-3’，
P10-probe：5’-FAM-TTATTTGCTACCTCCAAACTTGATGCTGAA(THF)AAATAGAACGTGTACA-BLOCK-3’。
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Title
江苏水稻黑条矮缩病病毒的RT-PCR分析和快速检测;杨杰等;《华北农学报》;20081231;第23卷(第06期);第87-92页 *

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