CN109439769A

CN109439769A - 一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物及其应用

Info

Publication number: CN109439769A
Application number: CN201811463306.5A
Authority: CN
Inventors: 廖金铃; 孙丹丹; 林柏荣; 王宏洪; 卓侃
Original assignee: Guangdong Vocational College Of Ecological Engineering
Current assignee: Guangdong Vocational College Of Ecological Engineering
Priority date: 2018-12-03
Filing date: 2018-12-03
Publication date: 2019-03-08

Abstract

本发明公开了一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物及其应用。本发明以28S rDNA‑D2D3区为靶标序列设计得到一组环介导等温扩增引物组，包括引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP；引物序列依次如SEQ ID NO.1～4所示；并进一步以该引物组建立了环介导等温扩增检测方法，检测肾形肾状线虫的特异性强、灵敏度高、重复性好、检测种群范围广，且对仪器设备和检测人员要求低，反应结果的可视化，准确可靠，安全、简单、快速、成本低，为肾形肾状线虫的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，非常适合基层快速检测工作使用，具有很好的推广应用价值。

Description

一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物及其应用

技术领域

本发明属于植物病原检测技术领域。更具体地，涉及一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物及其应用。

背景技术

肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)，是肾状线虫属的模式种，也是肾状属内具有重要经济意义的农业线虫，对农业生产危害严重。主要发生在热带、亚热带和温暖潮湿的地区，最早发现于大豆根部，如今寄主范围广泛分布于世界各地，已发现其寄主多达300多种，在葫芦科、茄科和豆科等各种蔬菜作物，以及菊科、棕榈科和木棉科等观赏植物和其它多种经济作物上侵染寄主。我国已陆续在广东、上海、湖北、海南、四川、广西、安徽、湖北、福建、山东等地发现有肾形肾状线虫的分布，是肾状属内在我国广为分布的优势种群，主要发生地集中在广东、福建、海南、广西气候比较炎热的热带和亚热带地区。肾形肾状线虫会对棉花、凤梨和荔枝等造成严重损失，因此在许多国家及地区，将其列为检疫性对象，在美国该线虫被称为是A类有害生物。

肾形肾状线虫属于固着性半内寄生线虫，侵染植物根部，通过口针穿刺植物根部的表皮细胞，在中柱内诱导形成包括中柱组织在内的专性取食位点。导致寄主植物根部肿大、皮层细胞解离，根系脱色、腐烂、坏死等症状，地上部植株矮小、黄化、叶色异常等，使植物生长发育不良，作物减产甚至导致植株死亡。由于其症状类似缺素、缺水等症状，故容易被忽视而造成不可小觑的危害。另外，肾状线虫侵染寄主植物时，会通过口针造成根部机械损伤，从而为细菌和真菌的侵染提供了便利，导致植物根部坏死和复合病害的发生。例如，肾形肾状线虫常与枯萎病、立枯病、黄萎病等土传病害形成复合侵染，加重病害损失。

目前，对肾形肾状线虫的鉴定主要是依据传统形态学，但是，该方法需要电镜观察和测量形态，专业要求很高、效率低，不适用于同时鉴定和定量检测大批的土样。Sayler等以rDNA-ITS序列为靶基因设计特异引物和探针，构建了实时荧光定量PCR检测体系，实现了对肾状属线虫的定量检测。但是，由于ITS序列在种内变异很大，基于rDNA-ITS序列设计的特异和探针，不适用于检测国内外所有种群的肾形肾状线虫，稳定性差，检测范围受限。Lawrence以靶向β-微管蛋白基因为靶标序列设计引物和探针，运用探针法从直接在土壤中提取的宏基因组DNA中定量肾形肾状线虫的数量。但是，由于元基因组包含了环境中多种微生物的基因，需要人为计数出肾形肾状线虫以及其他属线虫的数量，效率较低。

以上方法均不利于在基层检测单位中推广和使用，因此，需要一种能够简单、快速、准确鉴定肾形肾状线虫的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有肾形肾状线虫检测技术的不足，提供一种安全、简单、快速、特异性好、灵敏性高的检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增方法。本发明以28S rDNA-D2D3区为靶标序列设计环介导等温扩增引物组，特异性好，检测种群范围广，且灵敏度高，可简单、快速、准确和特异的检测出肾形肾状线虫。

本发明的目的是提供一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物。

本发明另一目的是提供一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一组快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物，包括引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP；引物RrF3的序列如SEQ ID NO.1所示，引物RrB3的序列如SEQ ID NO.2所示，引物RrFIP的序列如SEQ ID NO.3所示，引物RrBIP的序列如SEQ ID NO.4所示。

该引物组对肾形肾状线虫的检测具有很好的特异性、灵敏性，在肾形肾状线虫的检测方面具有很好的应用前景，因此，上述环介导等温扩增引物在检测肾形肾状线虫方面的应用，以及在制备检测肾形肾状线虫的试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。

基于上述引物组，本发明还构建了一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增方法，以待测样品核酸(DNA、cDNA等)为模板，利用所述引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP进行环介导等温扩增反应，根据反应结果判定待测样品中是否含有肾形肾状线虫。

具体地，所述环介导等温扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定待测样品中含有肾形肾状线虫；或者向扩增产物中加入SYBR green I或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定待测样品中含有肾形肾状线虫。

另外，优选地，所述环介导等温扩增反应的反应体系为：1μLDNA，引物RrFIP和RrBIP各1.6μM，引物RrF3和RrB3各0.2μM，dNTP 0.35μM，2.5μL 10×BST2.0DNA聚合酶缓冲液，0.8M甜菜碱，1.5μL MgSO₄(100mM)，1μL BST2.0DNA聚合酶，ddH₂O补足25μL。

优选地，所述环介导等温扩增反应的反应条件为：66℃反应54min。

另外，一种含有所述引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP的检测肾形肾状线虫的试剂盒，也应在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒的使用方法即为上述环介导等温扩增方法。

另外，上述环介导等温扩增方法或上述试剂盒在检测肾形肾状线虫方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明通过大量的研究和探索，得到一组快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物，引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP。所述引物配合使用，建立的环介导等温扩增方法，不仅能够非常特异的检测肾形肾状线虫，特异性强，而且灵敏度很高，检测灵敏性达到了0.1条，灵敏度是普通PCR方法的10倍。

而且，上述引物组及其环介导等温扩增检测方法具有很好的重复性，检测种群范围广，适用于国内常见多种群的检测。

另外，环介导等温扩增方法不需要依赖于任何昂贵的仪器，仅需使用简单的恒温仪器(恒温水浴)就能完成全部的检测，对实验检测人员的要求也低，可通过裸眼观察直接判断样品中是否含有靶标的肾形肾状线虫，并且检测时间仅为54min，比普通的PCR快了2～3h，是一种安全、简单、快速、对环境要求低、无需大型仪器、成本低的检测方法，非常适合在基层检测单位中使用。

再者，本方法检测结果的判定方法多样，可根据实际情况进行选择。本方法还可以实现扩增反应结果的可视化，准确可靠，无需电泳检测，不使用溴化乙锭，保障了工作人员的安全，为肾形肾状线虫的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。

附图说明

图1为不同退火温度对5组引物扩增效率的影响；M：Marker 2000；图1-A中，1-12代表引物对1-F3/1-B3和引物对1-FIP/1-BIP，13-24代表引物对4-F3/4-RrB3和引物对4-RrFIP/4-RrBIP，反应温度分别为58℃、58.5℃、59℃、60℃、61℃、62℃、64℃、65℃、66℃、67℃、67.5℃、68℃；图1-B中，1-8代表引物对17-F3/17-B3和引物对17-FIP/17-BIP，9-16代表引物对22-F3/22-B3和引物对22-FIP/22-BIP，17-24代表引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP，反应温度分别为58℃、60℃、62℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃。

图2为不同退火温度对引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP扩增效率的影响；M：Marker 2000；1-8分别代表反应温度为58℃、60℃、62℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃；CK表示在66℃的反应温度下，以灭菌水为模板的阴性对照。

图3为反应时间与LAMP产物的量的关系；图中100、80、40、20、10、1和0.1表示使用的DNA来自于100、80、40、20、10、1和0.1条肾形肾状线虫，CK表示以灭菌水作为模板；每个循环为2min；图中Y轴为荧光强度，X轴为反应的循环数。

图4为LAMP检测肾形肾状线虫的电泳检测图；图中M：Marker 2K Plus，1-4表示使用的DNA来自于100、10、1、0.1条线虫，CK是以灭菌水为模板的阴性对照。

图5为LAMP检测肾形肾状线虫的可视化检测效果图；图中1-4表示使用的DNA来自于100、10、1、0.1条肾形肾状线虫，5是以灭菌水为模板的阴性对照。

图6为LAMP反应后加入SYBR Green I染料检测肾形肾状线虫的特异性；图中1～21为不同种群的肾形肾状线虫，22～40为非靶标线虫(具体种类见表1)，41是以灭菌水为模板的阴性对照。各种群编号对应的线虫种类详见表1，具体为：1～21的种群编号分别为HBG、ZJ、ZG、XLM、ZSJ、YZH、JGH、CQL、JLH、QYSH、XB、ZYH、YCH、HYJLQ、FHM、MZL、LCH、JZT、HYR、JXDJ、LSL；22～40的种群编号分别为SDHd、GY、Cs1、SW、HNDa、A90、BM、BND、Dd、JXT、TL828、HL1、HZ9、PA28、PS8、MJ、Ce、MA、YDHs；41为以灭菌水为模板的阴性对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明中所述的“0.1条肾形肾状线虫的DNA模板”是指用1条线虫提取的DNA稀释10倍后的DNA模板。其中用1条线虫提取DNA的方法采用Subbotin等(2008)所述方法进行。

实施例1引物的设计

根据NCBI中肾形肾状线虫的28S rDNA序列(28SrDNA-D2D3区)设计引物。设计了多组引物组，经过初步筛选，得到以下五组引物：引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP、引物对1-F3/1-B3和引物对1-FIP/1-BIP、引物对4-F3/4-RrB3和引物对4-RrFIP/4-RrBIP、引物对17-F3/17-B3和引物对17-FIP/17-BIP、引物对22-F3/22-B3和引物对22-FIP/22-BIP共5组引物。

五组引物组的序列如下：

引物RrF3(如SEQ ID NO.1所示)：

GCGCAATGAAAGTGAAGGTC。

引物RrB3(如SEQ ID NO.2所示)：

CGGACTTCCACCAGAGTTTC。

引物RrFIP(如SEQ ID NO.3所示)：

GGACGGGACCATGTTGCTCCggatccCTTGTGGAGCTGATGTGTGA。

引物RrBIP(如SEQ ID NO.4所示)：

GAGACAGAGCGTACGCGCTGttttttCTCTGGCTTCGTCCTGCT。

引物1-F3(如SEQ ID NO.5所示)：

TGGGTAGGCCTTTTCCAGAT

引物1-B3(如SEQ ID NO.6所示)：

CGCCACCAGTTGTTAGCT

引物1-FIP(如SEQ ID NO.7所示)：

CCTCAGCGCACTCCACTTGC-GGACAGGCAATCCAACTGTT

引物1-BIP(如SEQ ID NO.8所示)：

CAGCCCCTCGGGGTATGGTA-CGGACCCGATACCATTTCC

引物4-F3(如SEQ ID NO.9所示)：

GGCAATCCAACTGTTTGGGA

引物4-B3(如SEQ ID NO.10所示)：

CGCCACCAGTTGTTAGCT

引物4-FIP(如SEQ ID NO.11所示)：

GCCTCAAACCCGAGATCAAGCA-AGTGCATTTGCAAGTGGAGT

引物4-BIP(如SEQ ID NO.12所示)：

CAGCCCCTCGGGGTATGGTA-CGGACCCGATACCATTTCC

引物17-F3(如SEQ ID NO.13所示)：

GGAGTTTAGCGTGTGCGC

引物17-B3(如SEQ ID NO.14所示)：

TCCTCTGGCTTCGTCCTG

引物17-FIP(如SEQ ID NO.15所示)：

GGTGACCCGGGTCACACATC-TGGGTGTTGGAAACCCAAAG

引物17-BIP(如SEQ ID NO.16所示)：

CGGAGCAACATGGTCCCGTC-CACCATCTTTCGGGTCTCAG

引物22-F3(如SEQ ID NO.17所示)：

CCCAAAGGCGCAATGAAAG

引物22-B3(如SEQ ID NO.18所示)：

CAGAATCGCTTCGGACTTCC

引物22-FIP(如SEQ ID NO.19所示)：

ATCAGGACGGGACCATGTTGC-GAAGGTCTCTCTTGTGGAGC

引物22-BIP(如SEQ ID NO.20所示)：

GAGACAGAGCGTACGCGCTG-CCAGAGTTTCCTCTGGCTTC

以下实施例进一步对上述引物组进行优化筛选。

实施例2引物反应条件优化

1、反应温度(引物温度)优化

使用肾形肾状线虫DNA作为模板，优化上述引物的退火温度。

(1)提取DNA

所述DNA的提取按照本领域常规方法进行。本实施例是采用Subbotin等(2008)所述方法进行，具体如下：通过离心法收集线虫或在体视镜下挑取1条线虫，然后加入有16μL灭菌双蒸水、2μL 10×PCRbuffer(无Mg²⁺)(购于Takara)、2μL蛋白酶K(600mAnson U/mL)(购于Takara)的裂解液中，接着用针头切割线虫，随后把该混合物置于65℃中1h和95℃中15min。

(2)环介导等温PCR反应

PCR反应体系为：1μLDNA，外引物对(如引物RrFIP/RrBIP)各1.6μM，内引物对(如引物RrF3/RrB3)各0.2μM，dNTP 0.35μM，2.5μL 10×BST2.0DNA聚合酶缓冲液(BST2.0DNApolymerase buffer)，0.8M甜菜碱，1.5μLMgSO₄(100mM)，1μLBST2.0DNA聚合酶(BST2.0DNApolymerase)和余量ddH₂O，共25μL。

环介导等温PCR反应条件：引物对1-F3/1-B3和引物对1-FIP/1-BIP、引物对4-F3/4-RrB3和引物对4-RrFIP/4-RrBIP的退火温度设置12个梯度，分别为58℃、58.5℃、59℃、60℃、61℃、62℃、64℃、65℃、66℃、67℃、67.5℃、68℃；引物对17-F3/17-RrB3和引物对17-RrFIP/17-RrBIP、引物对22-F3/22-B3和引物对22-FIP/22-BIP、引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP的退火温度设置8个梯度，分别为58℃、60℃、62℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃；反应时间均为90min。

(3)反应结束后，各组分别取10μL环介导等温PCR产物用2％琼脂糖电泳分离，结果如附图1中A图、B图所示，引物对4-F3/4-RrB3和引物对4-RrFIP/4-RrBIP、引物对22-F3/22-B3和引物对22-FIP/22-BIP未扩增出任何条带，引物组不可用；引物对1-F3/1-B3和引物对1-FIP/1-BIP、引物对17-F3/17-RrB3和引物对17-RrFIP/17-RrBIP扩增出与退火温度无关系的非典型条带，引物组不可用；引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP扩增出典型的梯形条带，引物组可用。

综上所述，筛选引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP为环介导等温扩增体系引物组。

(4)另外，如附图2所示，表明特异引物组RrF3/RrB3、RrFIP/RrBIP在温度为62℃～67℃时扩增出典型LAMP产物。其中，反应温度为66～67℃时，合成效率最高，再综合考虑其他因素，选择66℃作为最佳反应温度。

2、反应时间优化

由于LAMP反应时间过长会增加假阳性机会，然而反应时间过短则会产生假阴性的结果，因此我们使用实时荧光定量PCR仪来优化反应时间。

PCR反应体系为：1μLDNA，引物RrFIP/RrBIP各1.6μM，引物RrF3/RrB3各0.2μM，dNTP0.35μM，2.5μL 10×BST2.0DNA聚合酶缓冲液(BST2.0DNApolymerase buffer)，0.8M甜菜碱，1.5μLMgSO₄(100mM)，1μLBST2.0DNA聚合酶(BST2.0DNApolymerase)，另外再加入1.5μL20×EvaGreen荧光染料(购于广州美津生物)，余量ddH₂O补足，共25μL。

反应在66℃下进行，每2min采集一次荧光信号。

结果如附图3所示，反应到达平台期的时间与靶标线虫的数量成负相关，在肾形肾状线虫数量较多时(100条)反应36min中荧光强度达到最大值，在线虫数量较小时(0.1条)，反应54min能达到最大值。

综上所述，我们选择的反应条件为66℃反应54min。

实施例3LAMP反应的可视化检测及检测灵敏性

1、综上所述，本发明建立的快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增方法如下：

PCR反应体系为：1μLDNA，引物RrFIP/RrBIP各1.6μM，引物RrF3/RrB3各0.2μM，dNTP0.35μM，2.5μL 10×BST2.0DNA聚合酶缓冲液(BST2.0DNApolymerase buffer)，0.8M甜菜碱，1.5μLMgSO₄(100mM)，1μLBST2.0DNA聚合酶(BST2.0DNApolymerase)，余量ddH₂O补足，共25μL。

反应条件：66℃反应54min。

2、根据上述反应体系和优化后的反应条件进行LAMP反应，反应结束后，不仅能通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，还能够通过添加SYBR Green I染料或钙黄绿素进行可视化检测，结果判断方法更灵活、更方便。

3、分别以不同浓度的肾形肾状线虫DNA为模板，以上述反应体系和反应条件进行LAMP反应，反应结束后，使用2％琼脂糖凝胶电泳对上述产物进行检测，结果如附图4所示。

同时，在LAMP反应产物中加入1μL 5000×SYBR Green I染料(购自鼎国生物，使用前加入灭菌水稀释至5000X的浓度)混匀后观察结果，阳性产物呈现出由橘红色变为荧光黄或荧光绿色的颜色变化(如附图5所示)(具体颜色的深浅由产物的含量决定)，说明验证可视化结果的准确。

电泳检测与可视化的结果一致，也说明了本发明检测方法结果的稳定性和可靠性。

同时上述结果也说明了本发明所述的LAMP反应方法能检测到0.1条肾形肾状线虫的DNA模板，具有非常好的检测灵敏性。

实施例4LAMP反应的特异性和适用种群范围

1、为验证本发明引物和LAMP反应体系的有效性和特异性，我们同时使用了21个种群的肾形肾状线虫和19种其他非靶标的线虫DNA作为模板进行检测，具体线虫种类如表1所示。

表1实验使用的线虫种群及对应的可视化检测结果

2、PCR反应体系和条件与实施例3相同。DNA模板分别提取自表1中各个种群的单条线虫。

3、结果如附图6所示，有且只有1～21的靶标线虫(肾形肾状线虫)颜色变化，即出现了橘红色变为浅绿色。说明本发明所述的LAMP反应方法能有效的检测不同种群的靶标线虫(肾形肾状线虫)，并且对非靶标线虫不会有非特异性的扩增，即对非靶标线虫均呈现阴性。

同时也说明了本发明所述的LAMP反应方法能有效的检测到单条的靶标线虫，不仅特异性和灵敏性非常好，还适用多种种群的检测，能够满足实际检测和定量工作的需要。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东生态工程职业学院

<120> 一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物RrF3(primer RrF3)

<400> 1

gcgcaatgaa agtgaaggtc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物RrB3(primer RrB3)

<400> 2

cggacttcca ccagagtttc 20

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 引物RrFIP(primer RrFIP)

<400> 3

ggacgggacc atgttgctcc ggatcccttg tggagctgat gtgtga 46

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物RrBIP(primer RrBIP)

<400> 4

gagacagagc gtacgcgctg ttttttctct ggcttcgtcc tgct 44

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物1-F3(primer 1-F3)

<400> 5

tgggtaggcc ttttccagat 20

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物1-B3(primer 1-B3)

<400> 6

cgccaccagt tgttagct 18

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物1-FIP(primer 1-FIP)

<400> 7

cctcagcgca ctccacttgc ggacaggcaa tccaactgtt 40

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物1-BIP(primer 1-BIP)

<400> 8

cagcccctcg gggtatggta cggacccgat accatttcc 39

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物4-F3(primer 4-F3)

<400> 9

ggcaatccaa ctgtttggga 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物4-B3(primer 4-B3)

<400> 10

cgccaccagt tgttagct 18

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物4-FIP(primer 4-FIP)

<400> 11

gcctcaaacc cgagatcaag caagtgcatt tgcaagtgga gt 42

<210> 12

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物4-BIP(primer 4-BIP)

<400> 12

cagcccctcg gggtatggta cggacccgat accatttcc 39

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物17-F3(primer 17-F3)

<400> 13

ggagtttagc gtgtgcgc 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物17-B3(primer 17-B3)

<400> 14

tcctctggct tcgtcctg 18

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物17-FIP(primer 17-FIP)

<400> 15

ggtgacccgg gtcacacatc tgggtgttgg aaacccaaag 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物17-BIP(primer 17-BIP)

<400> 16

cggagcaaca tggtcccgtc caccatcttt cgggtctcag 40

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物22-F3(primer 22-F3)

<400> 17

cccaaaggcg caatgaaag 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物22-B3(primer 22-B3)

<400> 18

cagaatcgct tcggacttcc 20

<210> 19

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物22-FIP(primer 22-FIP)

<400> 19

atcaggacgg gaccatgttg cgaaggtctc tcttgtggag c 41

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物22-BIP(primer 22-BIP)

<400> 20

gagacagagc gtacgcgctg ccagagtttc ctctggcttc 40

Claims

1.一组快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增引物，其特征在于，包括引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP；引物序列依次如SEQ ID NO.1～4所示。

2.权利要求1所述环介导等温扩增引物在检测肾形肾状线虫方面的应用。

3.权利要求1所述环介导等温扩增引物在制备检测肾形肾状线虫的试剂或试剂盒方面的应用。

4.一种快速检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增方法，其特征在于，该方法是以待测样品核酸为模板，利用权利要求1中所述引物对RrF3/RrB3和引物对RrFIP/RrBIP进行环介导等温扩增反应，根据反应结果判定待测样品中是否含有肾形肾状线虫。

5. 根据权利要求4所述环介导等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定待测样品中含有肾形肾状线虫；或者向扩增产物中加入SYBR green I或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定待测样品中含有肾形肾状线虫。

6. 根据权利要求4所述环介导等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应体系为：1 μL DNA，引物RrFIP和RrBIP各1.6 μM，引物RrF3和RrB3各0.2 μM，dNTP0.35 μM，2.5 μL 10×BST2.0 DNA聚合酶缓冲液，0.8 M甜菜碱，1.5 μL MgSO₄(100 mM)，1μL BST2.0 DNA聚合酶，ddH₂O补足25 μL。

7. 根据权利要求4所述环介导等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应的反应条件为：66℃反应54 min。

8. 一种快速检测肾形肾状线虫的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1中所述引物对RrF3/ RrB3和引物对RrFIP/RrBIP。

9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为权利要求4所述环介导等温扩增方法。

10.权利要求4所述环介导等温扩增方法或权利要求8所述试剂盒在检测肾形肾状线虫方面的应用。