KR20130117435A - 분자표지자를 이용한 은행나무 암수나무 식별 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 은행나무의 암나무와 수나무를 식별하기 위한 분자표지자에 관한 것으로써, 은행나무 수나무를 식별하는 유전양상을 나타내는 RAPD 단편의 염기서열로부터 개발된 수나무 특이적인 SCAR-GBM 프라이머와 기존에 개발된 미토콘드리아 DNA의 atp1 프라이머를 동시에 이용하는 multiplex PCR 방법을 통하여 임의 프라이머를 이용하는 방법보다 향상된 안정성을 나타내고 우성 표지자의 제한된 정보 제공력을 향상시킬 수 있는 은행나무 암수나무 식별 방법에 관한 것이다.

Description

분자표지자를 이용한 은행나무 암수나무 식별 방법{The method of distinguishing the sex of ginkgo}

본 발명은 분자표지자를 이용한 은행나무의 암수나무 식별에 관한 것으로써 더욱 상세하게는 은행나무의 암수나무 식별이 가능한 분자표지자와 이를 이용한 식별과정에서 사용되는 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR) 조건에 관한 것이다.

은행나무는 살아 있는 화석으로 불릴 만큼 지구상에 나타난 역사가 길고 세계적으로 널리 퍼져 있는 수목으로서, 우리나라에서는 주로 가로수로 사용되며 은행을 수확하기 위한 용도로 주로 사용되고 있다. 은행나무는 결실을 위한 화분을 제공하는 수나무와 은행의 결실을 맺는 암나무가 각각의 다른 개체로 존재하는 암수 딴 그루(자웅이주) 식물이다. 그러나 은행나무가 가로수로 사용될 경우 가을철 은행 결실기에 은행의 독특한 악취와 낙과된 은행으로 인하여 도시 경관을 악화시키는 경우가 빈번하게 일어나고 있으며, 은행생산 농가에서는 암나무와 수나무의 식별이 어려워 은행생산용 암나무만을 생산하는데 어려움이 있는 실정이다. 지금까지는 은행나무의 성을 식별하기 위해서 꽃의 형태나 열매의 결실 여부를 확인하여 왔으나, 어린묘목에서는 확인하기가 어렵고 성목이 되어 개화가 가능한 시기가 되었을 때 확인이 가능하므로 시간이 오래 걸리며 성목이 되는 시간동안의 노동력과 경제적 기회비용의 증가로 은행나무 생산과 이용에 있어 효율성이 떨어지는 문제점이 발생되어 왔다.

상기한 문제를 해결하기 위한 기술은 국내에서는 아직까지 개발되어있지 않으며, 국외의 연구 사례를 살펴보면, Jiang et al (2003), Identification of a sex-associatied RAPD marker in Ginkgo biloba, Acta Botanica Sinica, 2003, 45:742-747 에서 은행나무의 암수나무가 식별되는 RAPD 유전양상을 보고하였으며, Liao et al (2009), Development and application of SCAR markers for sex identification in the dioecious species Ginkgo bilona L., Euphytica, 169: 49-55 에서는 은행나무의 암수나무 각각에 대한 SCAR 마커를 보고하였다. 그러나 상기 연구에서는 RAPD 기법상의 불안정성을 배제할 수 없으며, SCAR 마커의 우성 마커 성질을 보완할 수 없는 단점이 있었다. 또한, 상기 연구결과들은 본 발명의 분자표지자와 식별과정의 방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 문제점에 대한 해결 요구에 의해 안출된 것으로서, 임의 프라이머를 이용하는 RAPD 기법이 지니는 안정성에 대한 문제를 해결하고, RAPD 기법의 다형성으로부터 전환된 일반적인 SCAR 기법의 우성 표지자 형질을 해결하기 위하여, RAPD 기법에서 보고된 유전 염기서열을 기반으로 은행나무의 수나무에 대한 특이적인 SCAR 표지자를 개발하였으며, 미토콘드리아 DNA에서 은행나무의 성과 상관없이 모든 개체에서 안정적인 중합효소 연쇄반응 산물을 나타내는 프라이머인 atp1을 본 발명에서 개발된 은행나무의 수나무 특이 SCAR 표지자와 함께 동시 중합효소 연쇄반응(multiplex PCR)을 이용하여 안정성과 정보 제공력이 우수한 은행나무 암수나무 식별 방법을 제공하고자 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 은행나무 암수나무의 다형적 RAPD 단편의 염기서열을 바탕으로 개발된 수나무 특이 SCAR 표지자인 1쌍의 ‘SCAR-GBM’프라이머를 제공한다. 또한 본 발명은 상기 기술된 프라이머와 함께 기존에 개발된 미토콘드리아 DNA의 특정부분을 증폭하는 프라이머인 atp1 프라이머를 동시에 중합효소 연쇄반응을 수행하는 식별 시스템에 대한 방법을 제공한다.

요컨대, 본 발명에서는 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 구성된 SCAR-GBM 프라이머(primer)를 제공한다.

나아가, 본 발명에서는 상기 SCAR-GBM 프라이머와 미토콘드리아 DNA의 atp1 프라이머를 동시에 multiplex PCR에 이용하는 방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명에서는 상기 multiplex PCR에 이용하는 방법을 통해 은행나무의 암수를 식별하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 은행나무의 암수나무를 개발된 SCAR-GBM 표지자를 이용하여 안정적이고 확실하게 구분할 수 있어, 은행나무의 암수나무 식별에 대한 과학적 보증을 위한 분자표지자로 활용할 수 있을 것이다. 또한, 본 발병의 방법을 이용할 경우, 기존의 방법에 비하여 시간과 노력을 절약할 수 있으며, 은행나무 이용에 있어, 가로수용 수나무를 조기 선발하여 암나무를 가로수로 식재하는 것을 방지함으로써 암나무 가로수로부터 방치되는 은행열매의 악취와 얼룩으로 인한 도시 환경 악화를 예방할 수 있을 것이며, 은행 생산 농가에서 암나무만을 조기 선별하여 식재함으로써 효과적인 은행생산을 하는데 도움이 될 것이다.

도 1은 은행나무 암수 식별 SCAR-GBM 분자표지자를 이용한 multiplex PCR 분획양상에 관한 것이다(♂: 수나무, ♀: 암나무)

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SCAR-GBM 으로 명명된 1쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 은행나무 암수식별 프라이머인 SCAR-GBM 분자표지자의 염기서열은 RAPD 단편의 염기서열을 바탕으로 개발되었으며, 본 발명에 의해 처음으로 개시되는 것이다.

본 발명에서 있어서, “프라이머”는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고튜클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 표적의 복합도, 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating angent)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 제작된 SCAR-GBM 프라이머와 기존에 개발된 atp1 프라이머를 이용하여 은행나무 시료를 대상으로 multiplex PCR 을 실행한 후 아가로스 겔에서 전기영동 하여 나타나는 유전적 다형성을 관찰하면, 수나무에서는 약 1050bp의 DNA 단편과 약 675bp의 DNA 단편이 동시에 관찰되었으며, 암나무에서는 약 1050bp의 DNA 단편만 관찰되었다. 증폭된 DNA 단편중 1050bp DNA 단편은 atp1 프라이머에 의해서 증폭된 단편이고, 675bp DNA 단편은 SCAR-GBM 프라이머에 의해 증폭된 단편을 나타낸다. 1050bp DNA 단편의 경우 PCR 증폭산물과 함께 전기영동 된 DNA size marker를 기준하여 시각적으로 관찰된 값이며 675bp의 DNA 단편은 DNA size marker와 프라이머 합성에 이용된 염기서열로부터 프라이머가 증폭하는 염기서열을 기준으로 하여 계산된 길이에 준하여 관찰된 값으로 전기영동 시 시각적 관찰에 의하여 관찰자에 따라 근소하게 상이한 값을 나타낼 수 있으나 큰 오차가 나지 않는 이상 목표로 하는 DNA 부위를 정확히 증폭해 내는 것으로 간주 할 수 있다.

상기 다형성을 관찰하기 위하여 수행한 multiplex PCR 반응 혼합물(12㎕)의 조성은 다음과 같다: 은행나무 게놈 DNA 10ng, 한쌍의 SCAR-GBM 프라이머 각 0.3μM, 한쌍의 atp1 프라이머 각 0.3μM,10×PCR 완충용액 1.2㎕, dNTP 0.25mM, BSA 25㎍/ml, 1 unit DNA 중합효소 및 나머지 증류수. PCR 반응의 온도 조건은 94℃에서 5분간 주형 DNA를 변성시킨후, 94℃에서 1분간 변성; 63℃에서 1분간 어닐링; 및 72℃에서 1분간 연장을 총 35회 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다. 증폭된 산물은 2% 아가로스겔에서 180volt 로 1시간 반 동안 전기영동 되었으며, UV 광선을 조사하여 밴드의 증폭양상을 확인하였다. 하기 표 1은 본 발명의 SCAR-GBM 프라이머 세트 및 multiplex PCR 을 위한 apt1 프라이머 세트의 염기서열 정보에 관한 것이다.

프라이머	염기서열(5′→3′)
	순방향	역방향
SCAR-GBM	GCTGATTAAATATGGGAGTATGC	GGTGCTGAGAAGGAACTTTTAC
atp1	TTTGCCAGCGGTGTGaAAAGG	CTTCGCGATATTGTGCCAAT

^aG or I= Inosine(2´-deoxy-Inosine)

이상 본 발명의 구체적 실시형태와 관련하여 본 발명을 설명하였으나 이는 예시에 불과하며 본 발명은 이에 제한되지 않는다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 설명된 실시형태를 변경 또는 변형할 수 있으며, 이러한 변경 또는 변형도 본 발명의 범위에 속한다. 또한, 본 명세서에서 설명한 각 구성요소의 물질은 당업자가 공지된 다양한 물질로부터 용이하게 선택하여 대체할 수 있다. 또한 당업자는 본 명세서에서 설명된 구성요소 중 일부를 성능의 열화 없이 생략하거나 성능을 개선하기 위해 구성요소를 추가할 수 있다. 뿐만 아니라, 당업자는 공정 환경이나 장비에 따라 본 명세서에서 설명한 방법 단계의 순서를 변경할 수도 있다. 따라서 본 발명의 범위는 설명된 실시형태가 아니라 특허청구범위 및 그 균등물에 의해 결정되어야 한다.

<110> The Republic of Korea <120> The method of distinguishign the sex of ginkgo <130> P12_8707 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> SCAR-GBM forward primer <400> 1 gctgattaaa tatgggagta tgc 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> SCAR-GBM reverse primer <400> 2 ggtgctgaga aggaactttt ac 22

Claims (3)

1. 서열번호 1의 포워드 프라이머와 서열번호 2의 리버스 프라이머로 구성된 SCAR-GBM 프라이머(primer).
   
2. 제1항의 SCAR-GBM 프라이머와 미토콘드리아 DNA의 atp1 프라이머를 동시에 multiplex PCR에 이용하는 방법.
   
3. 제2항의 multiplex PCR에 이용하는 방법을 통해 은행나무의 암수를 식별하는 방법.

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