CN110846419A - 用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的ssr引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用 - Google Patents

用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的ssr引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用，其包括正向引物P3‑89F和反向引物P3‑89R，其中正向引物P3‑89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物P3‑89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。本发明可以实现欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定，且鉴定结果准确。

Description

用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方 法及应用
技术领域
本发明属于水产动物种质鉴定领域，具体涉及用于欧鳇和闪光鲟种间鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用。
背景技术
鲟鱼，即鲟形目鱼类(Acipenseriformes)，是古老的软骨硬磷鱼类，起源于白垩纪时期，迄今已有2亿年的历史，素有“水中活化石”之称。其骨可成胶、肉质细腻、味道鲜美，营养价值高，尤其是鲟鱼子酱富含优质蛋白质、氨基酸和微量元素，被誉为“黑色黄金”，与鹅肝、松露并称为世界三大美食。随着鲟鱼养殖业的快速发展，我国已经成为世界鲟鱼养殖第一大国。目前生产鱼子酱的养殖品种主要以杂交鲟和外来鲟为主，其中外来鲟欧鳇(Husohuso)和闪光鲟(Acipenser stellatus)生产的鱼子酱价值最高，在我国人工养殖的比重逐年增加，进一步的，随着鱼子酱进出口贸易的法制化，鱼子酱品种鉴定越来越收到重视。
此外，欧鳇和闪光鲟等外来鲟的大范围养殖中可能会出现，导致其与我国特有的中华鲟、长江鲟、施氏鲟等进行杂交繁殖，造成遗传污染。
综上所述，对欧鳇和闪光鲟等进行快速、准确的物种鉴定具有重要的意义。但由于欧鳇和闪光鲟属于多倍体鲟鱼，遗传鉴定较二倍体鱼类更为复杂，截止目前，有关欧鳇和闪光鲟种质、种间和相关的副产品等的简便、快速和有效的鉴定方法尚未建立。
发明内容
本发明针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种用于欧鳇和闪光鲟种间鉴定的SSR引物对组、试剂盒、鉴定方法及应用，其可以实现欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定，且鉴定结果准确。
本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：
一方面，提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组，其包括正向引物P3-89F和反向引物P3-89R，其中正向引物P3-89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物P3-89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
优选的，所述正向引物P3-89F可用荧光染料进行标记。
一方面，提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的试剂盒，其包括上述SSR引物对组。
优选的，所述试剂盒还包括：水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液中的一种或多种。
一方面，提供了一种欧鳇和闪光鲟间的物种鉴定方法，其包括如下步骤：
S1、提取待鉴定的欧鳇和闪光鲟的DNA样本；
S2、合成上述SSR引物对组，且利用所述SSR引物对组、以步骤S1中获取的DNA样本为模板进行PCR扩增；
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行检测，以获得PCR扩增产物多态性原始数据；
以及S4、对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析，以得出测序峰图数据，并根据所述测序峰图数据对欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
优选的，在进行PCR扩增时，所述正向引物P3-89F的退火温度为50～60℃；所述反向引物P3-89R的退火温度为50～58℃。
优选的，在进行PCR扩增时，所述正向引物P3-89F与反向引物P3-89R的退火温度均为52℃。
另一方面，还提供一种上述SSR引物对组和/或上述试剂盒和/或上述鉴定方法在欧鳇和闪光鲟的种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
另一方面，还提供一种分离的SSR标志物，其通过上述SSR引物对组扩增获得。
优选的，所述SSR标志物包括1个微卫星核心序列TAG。
本发明可实现欧鳇和闪光鲟间的快速种间鉴定，且鉴定结果准确。
附图说明
图1为本发明的SSR引物在欧鳇1号个体的扩增结果；
图2为本发明的SSR引物在欧鳇2号个体的扩增结果；
图3为本发明的SSR引物在欧鳇3号个体的扩增结果；
图4为本发明的SSR引物在欧鳇4号个体的扩增结果；
图5为本发明的SSR引物在欧鳇5号个体的扩增结果；
图6为本发明的SSR引物在欧鳇6号个体的扩增结果；
图7为本发明的SSR引物在闪光鲟1号个体的扩增结果；
图8为本发明的SSR引物在闪光鲟2号个体的扩增结果；
图9为本发明的SSR引物在闪光鲟3号个体的扩增结果；
图10为本发明的SSR引物在闪光鲟4号个体的扩增结果；
图11为本发明的SSR引物在闪光鲟5号个体的扩增结果；
图12为本发明的SSR引物在闪光鲟6号个体的扩增结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组，其包括正向引物P3-89F和反向引物P3-89R，其中P3-89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列(即TAGCCACCACTGCAAAACAG)，P3-89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列(即GCTTCCAGGAAACAGTGGAA)；进一步的，所述正向引物P3-89F可用荧光染料进行标记。
实施例2：
本实施例提供了一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的试剂盒，其包括实施例一所述的引物对组、水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液和分子量标记物中的一种或多种。
实施例3：
本实施例提供了一种欧鳇和闪光鲟间的物种鉴定方法，其包括如下步骤：
S1、采用经典的高盐法提取待鉴定的至少一个(优选为6个)欧鳇和至少一个(优选为6个)闪光鲟的DNA样本，稀释至100ng/ul，备用；所述DNA样本来自粘液、鳍条、鱼肉、鱼子酱中的一项或几项；
S2、通过primer premier 5.0等软件设计出如实施例1所述的SSR引物对组，且其中正向引物P3-89F添加通用M13接头序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)，同时另外合成带T AMRA荧光基团的M13荧光接头引物；如实施例1所述的SSR引物对组、M13荧光接头引物合成后，以步骤S1中获取的DNA样本为模板，按照下述PCR反应体系和扩增程序进行P CR扩增：
A.PCR反应体系：
Figure BDA0002288165870000031
Figure BDA0002288165870000041
B.PCR扩增程序：
Figure BDA0002288165870000042
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，根据电泳结果进行浓度鉴定；再使用DNA测序仪ABI 3730xl对所述PCR扩增产物进行毛细管荧光电泳检测，以获得PCR扩增产物多态性原始数据；
以及S4、使用genemarker软件对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析，以得出测序峰图数据，并根据所述测序峰图数据对欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
同时，同样采用上述正向引物P3-89F和反向引物P3-89R对俄罗斯鲟
(Acipenser gueldenstaedti)和中华鲟(Acipenser sinensis)，参照实施例4中的方法获得俄罗斯鲟和中华鲟PCR扩增产物多态性原始数据，并根据PCR扩增产物多态性原始数据得出测序峰图数据，表1示出通过所述正向引物P3-89F和反向引物P3-89R对欧鳇、闪光鲟、俄罗斯鲟和中华鲟样品进行PCR扩增后的扩增结果，图1-6示出了6个欧鳇个体的测序峰图，图7-12示出了6个闪光鲟个体的测序峰图。
表1正向引物P3-89F和反向引物P3-89R扩增结果
Figure BDA0002288165870000051
Figure BDA0002288165870000061
Figure BDA0002288165870000081
其中，H表示欧鳇个体；ASt表示闪光鲟个体；AG表示俄罗斯鲟个体；AS表示中华鲟个体，※表示该等位基因存在。
从表1，图1-12中可以看出，通过P3-89F、P3-89R扩增所获得的产物中，俄罗斯鲟和中华鲟均具有多个等位基因，而欧鳇为单态，只有一个等位基因，大小为265bp，闪光鲟为单态，只有一个等位基因，大小为262bp，二者之间相差一个微卫星核心序列TAG，由此，对于欧鳇和闪光鲟而言，其扩增结果简单易读，且结果精确，可利用上述P3-89F、P3-89R引物对组进行欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定或种质鉴定或家系管理。
实施例5：
本实施例提供了实施例1中所述SSR引物对组和/或实施例2中所述试剂盒和/或实施例3中所述鉴定方法在欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
实施例6：
本实施例还提供了一种分离的SSR标志物，其通过实施例1中的引物对组扩增获得，且所述SSR标志物包括1个微卫星核心序列TAG。
需要说明的是，上述实施例1至5中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。
综上所述，本发明具有以下优点：
1)本发明提供的引物对组可用于欧鳇和闪光鲟的种间鉴定，从而在对外贸易、人工繁殖、野外监测等过程中对两个物种进行种质鉴定，保证遗传物质或副产品鱼子酱或鱼肉的纯度。
2)通过本发明提供的引物对组获得PCR扩增结果简单易读，从中可获知欧鳇等位基因片段长265bp，闪光鲟等位基因片段长262bp，且成本低，易操作，可实现欧鳇和闪光鲟的快速种间鉴定，可大大节约鉴定的时间和测序的成本，且鉴定结果准确。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002288165870000091

Claims (10)

1.一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的SSR引物对组，其特征在于，包括正向引物P3-89F和反向引物P3-89R，其中正向引物P3-89F具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，反向引物P3-89R具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的SSR引物对组，其特征在于，所述正向引物P3-89F可用荧光染料进行标记。
3.一种用于欧鳇和闪光鲟物种鉴定的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的SSR引物对组。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：水、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、上样缓冲液中的一种或多种。
5.一种欧鳇和闪光鲟间的物种鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、提取待鉴定的欧鳇和闪光鲟的DNA样本；
S2、合成如权利要求1所述的SSR引物对组，且利用所述SSR引物对组、以步骤S1中获取的DNA样本为模板进行PCR扩增；
S3、对经步骤S2获得的PCR扩增产物进行检测，以获得PCR扩增产物多态性原始数据；
以及S4、对PCR扩增产物多态性原始数据进行分析，以得出测序峰图数据，并根据所述测序峰图数据对欧鳇和闪光鲟进行鉴定。
6.如权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，所述正向引物P3-89F的退火温度为50～60℃；所述反向引物P3-89R的退火温度为50～58℃。
7.如权利要求6所述的鉴定方法，其特征在于，在进行PCR扩增时，所述正向引物P3-89F与反向引物P3-89R的退火温度均为52℃。
8.如权利要求1所述的SSR引物对组和/或如权利要求3所述的试剂盒和/或如权利要求5中所述的鉴定方法在欧鳇和闪光鲟的种间鉴定/种质鉴定/家系管理中应用。
9.一种分离的SSR标志物，其特征在于，其通过权利要求1所述的SSR引物对组扩增获得。
10.如权利要求9所述的SSR标记物，其特征在于，所述SSR标志物包括1个微卫星核心序列TAG。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436610A (zh) * 2013-08-20 2013-12-11 徐鹏 一种常见鲟鱼类的pcr-rflp快速检测方法
CN105734143A (zh) * 2016-03-31 2016-07-06 刘淑艳 一种欧鳇实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN108913778A (zh) * 2018-05-14 2018-11-30 中国水产科学研究院 用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103436610A (zh) * 2013-08-20 2013-12-11 徐鹏 一种常见鲟鱼类的pcr-rflp快速检测方法
CN105734143A (zh) * 2016-03-31 2016-07-06 刘淑艳 一种欧鳇实时荧光pcr特异性检测体系及应用
CN108913778A (zh) * 2018-05-14 2018-11-30 中国水产科学研究院 用于欧鳇苗种鉴定的生物传感检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREEA DUDU: "Microsatelitte DNA variation in the Black sea beluga sturgeon (Huso huso)" *
董传举: "四种鲟鱼线粒体PCR-RFLP 鉴定方法的研究" *

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