CN116042843A - 一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，所述标记套件由10对微卫星引物组成，每对引物的正向引物的5’端进行了荧光基团修饰。本发明还提供了基于微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的方法，包括以下步骤：提取亲本与子代的基因组DNA，与荧光标记后的引物进行PCR反应，然后进行基因分型，计算子代个体与候选亲本的似然率对数值从而判断亲子关系。本发明利用高度多态的四碱基微卫星位点的荧光标记引物和荧光基因分型进行家系的亲缘关系鉴定，为克氏原螯虾的遗传选育和防止近亲交配提供了一套可靠高效的检测平台。
Description
技术领域
本发明属于水产动物繁殖育种技术领域，具体涉及一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法。
背景技术
克氏原螯虾(Procambarus clarkii),隶属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属，俗称小龙虾、淡水小龙虾等。由于其适应性强、肉质鲜美、营养丰富等突出特点而受到人们的青睐。目前，克氏原螯虾已成为我国重要的淡水经济养殖品种。尽管克氏原螯虾在我国已经得到广泛的养殖，但其种业的发展相较于产业发展仍相对滞后。当前克氏原螯虾的苗种繁育以自繁为主，自繁自育、多代同田(塘)导致长期近亲繁殖及捕大留小的逆向选择，造成克氏原螯虾规格小、生长速度缓慢、抗逆性下降等种质退化问题。在家系选育或综合选育的过程中，保持完整、准确的系谱信息可以有效地指导育种亲本的选择和配对，从而促进亲本配合力的提高和避免近交衰退。而为了更准确地评价家系生长性能、杂交优势和遗传参数，需要进行不同家系的混养，以减少环境因素的影响，但最终还是需要对混养的家系进行区分。传统的通过物理标记进行家系区分的方法存在成本高、费时费力、标记后易脱落、难以弥补、持续时间短等缺点。因此，建立有效的亲缘关系鉴定和谱系管理技术，是保护克氏原螯虾种质资源、避免选育过程中出现近交衰退的迫切技术手段。
微卫星DNA是由2-6个核苷酸串联组成的重复序列，广泛分布在真核生物的基因组中。由于其具有稳定性好、多态信息含量丰富、孟德尔分离、共显性遗传和易于基因分型等优点，被认为是理想的分子标记。目前，微卫星标记已广泛应用于种群结构的研究、谱系追踪、亲子鉴定等方面。文献中报道的克氏原螯虾的大多数微卫星是二核苷酸重复序列，其在PCR扩增反应过程中可因链滑脱而产生比目的片段少2bp的杂带，电泳时会产生“影子带”，它的存在使基因型的表征复杂化。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件及应用方法。本发明利用高度多态的四碱基微卫星位点的荧光标记引物和荧光基因分型进行家系的亲缘关系鉴定，为克氏原螯虾的遗传选育和防止近亲交配提供了一套可靠高效的检测平台。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，由10对微卫星引物对组成，所述微卫星引物对的序列如下：
进一步地，所述微卫星引物对的核心序列均为四碱基重复。
进一步地，所述微卫星引物对的正向引物5’端进行荧光基团修饰，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX。
进一步地，所述微卫星引物对的核心序列重复单元、最适退火温度、产物大小和每对正向引物5’端的荧光基团修饰如下表：
表1克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件所包含的微卫星引物信息
本发明还提供了一种基于微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，包括以下步骤：
(1)克氏原螯虾亲本与子代基因组DNA提取；
(2)以提取的DNA为模板，进行荧光引物的PCR扩增；
(3)基因分型：PCR扩增产物在ABI 3730XL遗传分析仪上进行分离，利用GeneMarker v1.75软件读取各个体在各微卫星位点的基因型；
(4)亲子鉴定：采用Cervus v3.0软件计算子代个体与候选亲本的似然率对数值(LOD)，LOD值最高的候选亲本被认为是最可能的亲本。
作为优选方案，所述步骤(1)中，采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA。
作为优选方案，所述步骤(2)中，PCR反应体系为：总体积10μL：PCR Mix 5μL，正反引物(10μM)各0.25μL，DNA模板(100ng/μL)0.5μL，ddH2O 4μL。
作为优选方案，所述步骤(2)中，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，最适退火温度(表1)下退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明所选的微卫星位点具有高度的多态性，利用少数位点即可在克氏原螯虾亲子鉴定中得到较好的鉴定效果；
(2)本发明所选用的均为四碱基重复标记，PCR扩增过程中不易产生“影子带”，稳定性高，具有更好的检测准确度；
(3)本发明采用了荧光基因分型的方法，等位基因判读更加准确，且可将不同荧光修饰引物的PCR扩增产物混合后检测，极大地节省了基因分型的费用；
(4)本发明克服了传统物理标记的局限性，为克氏原螯虾的遗传选育和防止近亲交配提供了一套可靠高效的检测平台。
附图说明
图1为本发明实施例2中部分位点的基因分型峰图。
图2为本发明实施例2中亲子鉴定实际累积鉴定准确率。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样在本申请所列权利要求书限定范围之内。
实施例1
用于克氏原螯虾亲子鉴定的微卫星位点的筛选
从本实验室开发的克氏原螯虾微卫星标记中选择具有较高多态性的四碱基重复位点16个，分别为：PC4-G98、PC4-G123、PC4-T1、PC4-G110、PC4-G97、PC4-G119、PC4-G81、PC4-G48、PC4-G28、PC4-G10、PC4-G6、PC4-G2、PC4-G4、PC4-G19、PC4-G13、PC4-G40。从已发表的文章中选择四碱基重复位点2个，分别为：PclG-03、PclG-07。上述微卫星位点引物对的正向引物5’端分别用FAM、HEX、ROX进行荧光修饰并合成。
合成的18对荧光引物在90个个体上得到扩增并进行基因分型，以评估这些位点用于亲子鉴定的效率。PCR反应体系为10μL，包括PCR Mix(翌圣，上海，中国)5μL，正反引物(10μM)各0.25μL，DNA模板(100ng/μL)0.5μL，ddH2O 4μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，最适退火温度下退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物在ABI 3730XL遗传分析仪上进行分离，利用Gene Marker v1.75软件读取各个体在各微卫星位点的基因型。校准后的基因分型数据导入Cerves v3.0软件利用allelefrequency analysis功能分析每个位点的等位基因数(NA)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、多态信息含量(PIC)、无效等位基因频率(FN)和Hardy-Weinberg平衡(HWE)(表2)。最后，综合考虑无效等位基因频率低于5％和鉴定成本，选择多态性排名前十的10对引物用于克氏原螯虾的亲子鉴定，引物信息见表1。
表2 18个候选克氏原螯虾微卫星位点在90个个体中的遗传信息
注：NS表示非显著偏离(P＞0.05)，***表示极显著偏离(P＜0.001)。
实施例2
克氏原螯虾微卫星亲子鉴定的方法
1.克氏原螯虾母系半同胞家系的建立
收集已抱卵的雌性克氏原螯虾并进行单独孵化。每个家系孵化的子代在单独的圆桶内进行幼体培育，收集了15个家系的母本和每个家系5尾幼体的组织样，保存于无水乙醇中，作为亲子鉴定的样本。
2.亲本与子代基因组DNA的提取
采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA。取少量样品，经滤纸充分吸干，放入1.5mL的离心管中，加入600μL的SDS裂解液，用剪刀将样品充分剪碎；每管加入10μL蛋白酶K，混匀后放入55℃水浴锅中水浴3h，期间不定时拿出摇晃，直至组织裂解完全；取出离心管冷却至室温，每管加入200μL7.5M的醋酸铵，充分摇匀后，4℃条件下12000rpm离心15min；吸取500μL上清液至新的1.5mL离心管中，加入等量异丙醇，缓慢混匀后，4℃条件下12000rpm离心13min；弃上清，加入1mL 75％乙醇，12000rpm，4℃离心5min，弃上清，重复该步骤；弃上清，加入1mL无水乙醇，12000rpm，4℃离心3min；弃上清，离心管倒扣于滤纸上干燥10min，加入适量蒸馏水进行溶解，检测浓度和质量后，稀释至100ng/μL保存在-20℃备用。
3.荧光引物的PCR扩增
对实施例1中选择的10对引物在所有样本中进行PCR扩增。PCR反应体系为10μL，包括PCR Mix(翌圣，上海，中国)5μL，正反引物(10μM)各0.25μL，DNA模板(100ng/μL)0.5μL，ddH2O 4μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，最适退火温度(表1)下退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
4.基因分型和亲子鉴定
扩增产物在ABI 3730XL遗传分析仪上进行分离，利用Gene Marker v1.75软件读取各个体在各微卫星位点的基因型。校准后的基因分型数据导入Cerves v3.0软件利用simulation of parentage analysis功能进行10000次模拟亲子鉴定，并用parentageanalysis功能对75尾子代与15尾母本进行比对鉴定。图1为本实施例中母本M5及其两尾子代在位点PclG-07、PC4-G28、PC4-G6的基因分型峰图，符合孟德尔遗传定律。
5.亲子鉴定结果
在Cerves的亲子鉴定中，具有最高LOD值的候选母亲被认为是真正的母亲。通过将鉴定结果与实际结果进行比较，有4尾子代没有找到真正的母本，鉴定准确率为94.67％。图2为本实施例中10个微卫星位点按照PIC值从高到低的顺序被依次纳入亲子鉴定标记套件中所获得的累积鉴定准确额率。
总结：本发明公开的基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，所述标记套件由10对微卫星引物组成，每对引物的正向引物的5’端进行了荧光基团修饰。本发明还提供了基于微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的方法，包括以下步骤：提取亲本与子代的基因组DNA，与荧光标记后的引物进行PCR反应，然后进行基因分型，计算子代个体与候选亲本的似然率对数值从而判断亲子关系。本发明利用高度多态的四碱基微卫星位点的荧光标记引物和荧光基因分型进行家系的亲缘关系鉴定，为克氏原螯虾的遗传选育和防止近亲交配提供了一套可靠高效的检测平台。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述标记套件由10对微卫星引物对组成，所述微卫星引物对的序列如下：
2.根据权利要求1所述的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述微卫星引物对的核心序列均为四碱基重复。
3.根据权利要求1所述的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述微卫星引物对的正向引物5’端进行荧光基团修饰，所述荧光基团选自FAM、HEX、ROX。
4.根据权利要求1所述的一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件，其特征在于：所述微卫星引物对的核心序列重复单元、最适退火温度、产物大小和每对正向引物5’端的荧光基团修饰如下表：
表1克氏原螯虾亲子鉴定的标记套件所包含的微卫星引物信息
5.一种基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，采用如权利要求1-4任一项所述的标记套件，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)克氏原螯虾亲本与子代基因组DNA提取；
(2)以提取的DNA为模板，进行10对微卫星引物对的PCR扩增；
(3)基因分型：PCR扩增产物在ABI 3730XL遗传分析仪上进行分离，利用GeneMarker软件读取各个体在各微卫星位点的基因型；
(4)亲子鉴定：采用Cervus软件计算子代个体与候选亲本的似然率对数值(LOD)，LOD值最高的候选亲本被认为是最可能的亲本。
6.根据权利要求5所述的基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA。
7.根据权利要求5所述的基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，PCR反应体系为：总体积10μL：PCR Mix 5μL，正反引物(10μM)各0.25μL，DNA模板(100ng/μL)0.5μL，ddH2O 4μL。
8.根据权利要求5所述的基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，最适退火温度下退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸5min，4℃保存。
9.根据权利要求8所述的基于四碱基微卫星标记的克氏原螯虾亲子鉴定方法，其特征在于：所述的最适退火温度见权利要求4中的表1。
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Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001009317A1 (fr) * | 1999-07-29 | 2001-02-08 | Helix Research Institute | Gene associe au cancer de l'estomac |
| US20020155449A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-10-24 | Abdelmajid Belouchi | Method for genotyping microsatellite dna markers |
| CN104726554A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-06-24 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种克氏原螯虾ssr引物的制备方法 |
| CN109355363A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-02-19 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法 |
| CN111793701A (zh) * | 2019-09-05 | 2020-10-20 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种用于克氏原螯虾亲子鉴定的双重pcr微卫星引物及应用 |
| CN112210612A (zh) * | 2020-11-07 | 2021-01-12 | 华中农业大学 | 一种区分克氏原螯虾特定地理群体的ssr分子标记及其应用 |
| CN113930523A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-01-14 | 华中农业大学 | 一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记及其筛选方法和应用 |
| CN113981103A (zh) * | 2021-09-18 | 2022-01-28 | 华中农业大学 | 罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法 |
| CN114292925A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 华中农业大学 | 克氏原螯虾生长性状相关的ssr分子标记引物及其在辅助选择中的应用 |
| CN114959056A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-08-30 | 华中农业大学 | 一种鉴定雌性克氏原螯虾的ssr标记及其应用 |
| CN114959050A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-08-30 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种基于四碱基微卫星荧光多重pcr的红螯螯虾亲子鉴定方法 |
-
2022
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Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001009317A1 (fr) * | 1999-07-29 | 2001-02-08 | Helix Research Institute | Gene associe au cancer de l'estomac |
| US20020155449A1 (en) * | 2001-04-23 | 2002-10-24 | Abdelmajid Belouchi | Method for genotyping microsatellite dna markers |
| CN104726554A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-06-24 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种克氏原螯虾ssr引物的制备方法 |
| CN109355363A (zh) * | 2018-10-26 | 2019-02-19 | 中国水产科学研究院长江水产研究所 | 一种区分克氏原螯虾不同群体的分子标记方法 |
| CN111793701A (zh) * | 2019-09-05 | 2020-10-20 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种用于克氏原螯虾亲子鉴定的双重pcr微卫星引物及应用 |
| CN112210612A (zh) * | 2020-11-07 | 2021-01-12 | 华中农业大学 | 一种区分克氏原螯虾特定地理群体的ssr分子标记及其应用 |
| CN113981103A (zh) * | 2021-09-18 | 2022-01-28 | 华中农业大学 | 罗氏沼虾微卫星亲子鉴定的微卫星引物对及检测试剂盒和鉴定方法 |
| CN113930523A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-01-14 | 华中农业大学 | 一种克氏原螯虾遗传性别鉴定的分子标记及其筛选方法和应用 |
| CN114959050A (zh) * | 2021-12-15 | 2022-08-30 | 浙江省淡水水产研究所 | 一种基于四碱基微卫星荧光多重pcr的红螯螯虾亲子鉴定方法 |
| CN114292925A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-08 | 华中农业大学 | 克氏原螯虾生长性状相关的ssr分子标记引物及其在辅助选择中的应用 |
| CN114959056A (zh) * | 2022-05-13 | 2022-08-30 | 华中农业大学 | 一种鉴定雌性克氏原螯虾的ssr标记及其应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| JUNXIAO SUN等: "GENOME-WIDE SSR MARKER DEVELOPMENT AND APPLICATION IN GENETIC DIVERSITY ANALYSIS OF THE RED SWAMP CRAYFISH, PROCAMBARUS CLARKII (GIRARD, 1852) IN CHINA", CRUSTACEANA, vol. 94, 28 February 2021 (2021-02-28), pages 189 - 205 * |
| QISHUAI WANG等: "Isolation of tetrameric microsatellite markers and its application on parentage identification in Procambarus clarkii", AQUACULTURE INTERNATIONAL, vol. 31, 2 February 2023 (2023-02-02), pages 2099 * |
| 彭刚等: "长江流域3个克氏原螯虾野生群体遗传结构的微卫星分析", 江苏农业学报, no. 05, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 1115 - 1117 * |
| 王长忠等: "长江下游地区4个克氏原螯虾群体的遗传多样性分析", 生物多样性, vol. 17, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 518 - 523 * |
| 王齐帅: "克氏原螯虾出肉率形态预测模型构建与微卫星标记开发及其应用", 中国优秀硕士学位论文, 27 September 2023 (2023-09-27), pages 1 - 80 * |
| 谭云飞等: "长江中下游流域13个克氏原螯虾群体遗传多样性和遗传结构分析", 华中农业大学学报, no. 02, 31 March 2020 (2020-03-31), pages 33 - 39 * |
| 黄羽等: "长江中下游地区6个克氏原螯虾群体遗传多样性分析", 南昌大学学报(工科版), no. 03, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 243 - 247 * |
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| Publication number | Publication date |
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