CN112210612A - 一种区分克氏原螯虾特定地理群体的ssr分子标记及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物分子标记检测技术领域。具体涉及一种区分克氏原螯虾特定地理群体的SSR分子标记及其应用。本发明特征为：分别提取来自中国14个地域群体的克氏原螯虾基因组DNA；根据克氏原螯虾基因组测序数据设计克氏原螯虾SSR引物，利用设计的SSR引物对采集样本进行PCR扩增并得到目的片段，利用琼脂糖胶电泳检测目的片段是否被扩增出；进一步利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳检测其PCR产物的带型，对群体进行带型统计分析；利用在PCM2076位点含有的等位基因A或含有的纯合等位基因B的信息，比较样本之间存在的基因型分布差异，从而用于不同地理群体克氏原螯虾的分型。

Description

一种区分克氏原螯虾特定地理群体的SSR分子标记及其应用
技术领域
本发明属于养殖及分子生物学领域，具体涉及一种区分克氏原螯虾特定地理群体的SSR分子标记及其应用。本发明适用于我国鄱阳湖及附近地域与长江其他地域与微山湖地域的克氏原螯虾群体的地理区分，应用本发明可鉴定未知群体的来源是否属于中国特定地理区域克氏原螯虾群体。
技术背景
克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、螯虾科(ambaridae)，是存活于淡水中的一种甲壳类动物，俗称淡水小龙虾。原产于美国南部和墨西哥东北部，经由日本引入中国南京地区，后逐步向整个长江流域等地区扩散；目前，克氏原螯虾已成为长江中下游乃至全国范围内的重要经济水产品。
克氏原螯虾由中国江苏南京地区向长江流域等地区扩散的过程中，由于不同地域的环境条件差异，经过90年的演变逐步形成了不同的地理群体。近年来，克氏原螯虾人工养殖业的迅速发展，形成了以江苏盱眙和湖北潜江为中心的克氏原螯虾养殖中心，继而向全国扩散的格局，由于不同地域相互引种，通过基因渐渗，导致各地的克氏原螯虾野生种质资源群体趋于同质化。我国鄱阳湖地域的克氏原螯虾野生种质资源保存相对完整，通过遗传分析得知该地域水系的克氏原螯虾群体具有较独特的遗传结构(谭云飞等，2020)，该地域种质资源对克氏原螯虾的遗传育种尤为重要。前述(谭云飞等，2020)，该文章的数据与结果使用的是前人公布的SSR标记对采集的样本进行的遗传多样性分析；而本发明涉及的标记PCM-2076属于自主开发的分子标记，与前文无关。再者前文并没有对克氏原螯虾分子标记或者形态特征将其区别开来。
本发明的目的是开发了一个用于区分鄱阳湖地域克氏原螯虾群体的分子标记。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种不同地域克氏原螯虾鉴别的分子标记，本发明建立一种SSR(Simple Sequence Repeats)标记特异鉴定鄱阳湖地域克氏原螯虾群体的方法，利用本发明制备的分子标记和方法可以准确区分中国部分区域例如鄱阳湖地域及周边地域，以及长江流域其他地域的克氏原螯虾群体，为特异鉴定我国不同地理群体小龙虾群体提供了新的标记和方法。
本发明的技术方案如下所述：
一种区分克氏原螯虾特定地理群体的SSR分子标记的方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)分别提取来自中国14个地域群体的克氏原螯虾基因组DNA，每个群体至少提取22尾克氏原螯虾的基因组DNA。
(2)设计引物：根据克氏原螯虾基因组测序数据，利用Primer3软件设计正向引物PCM2076 F 5’-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3’，以及反向引物PCM2076R 5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3’。
(3)对14个中国地域群体的克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测，具体步骤为：
利用正向引物PCM2076 F 5'-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3'，和反向引物PCM2076 R5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3'扩增目的片段，利用琼脂糖电泳检测目的片段是否被扩增出。PCR条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸7min；4℃保存。
(4)利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶)电泳检测并进行统计分析：将扩增出的PCR产物用4％的PAGE胶进行电泳检测，电泳胶板用0.2％的硝酸银溶液进行染色，用含有0.5％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液进行显影、漂洗和晾干，对上述各个群体进行带型统计分析。
(5)校测到中国鄱阳湖及附近地域的群体样本显示超过35％以上的样本在PCM2076位点含有等位基因A，在长江流域的其他10个地域群体与山东微山湖群体中有超过90％的样本的基因型为纯合等位基因B；样本之间存在显著的基因型分布差异。
特定地域克氏原螯虾群体(江西鄱阳湖和九江地区，安徽安庆地区)单个群体采样至少22尾，从其他地域克氏原螯虾采样群体数至少3个，单个群体采样至少22尾。
本发明的分子标记适用于鉴定鄱阳湖地域的克氏原螯虾群体，还可以用于其他地域的群体的检测，通过鉴定已经筛选出具有鄱阳湖地域遗传特性的克氏原螯虾个体。
根据克氏原螯虾的基因组序列(Shi et al.,2018)，通过分析微卫星特征序列，设计了2873对SSR标记引物。通过对14个地域的克氏原螯虾群体样本采集，并提取基因组DNA，利用上述PCR扩增条件对2873对引物进行扩增与多态性筛选，得到多态性标记PCM2076。
通过对SSR标记PCM2076的PCR产物的带型分析，归纳与总结，得出被测群体是否为鄱阳湖地域克氏原螯虾群体。
本发明主要解决了以下技术问题：
近年来，我国克氏原螯虾养殖业面临种质退化，个体变小，病害频发等一系列问题。良种繁育是解决这些问题的关键，为此，挖掘各大湖泊野生种质资源是遗传育种的首要任务。然而，没有分子标记或形态特征可用于区分不同地域的克氏原螯虾群体。本方法能够利用分子标记将鄱阳湖地域的群体特异鉴定出来，进而用于育种。
本发明具有以下优点：
(1)本发明鉴定结果准确；鄱阳湖地域克氏原螯虾群体与长江流域其他地域克氏原螯虾群体之间在SSR标记PCM2076位点的基因型差异显著。
(2)本发明的可重复性高。
(3)本发明不依赖外形指标，其结果可靠，可用于鉴定我国鄱阳湖地域克氏原螯虾群体与长江流域其他地域克氏原螯虾群体的混杂情况。
附图说明
图1：PCM2076标记引物设计与目的片段序列表。
图2：以2018年采集的鄱阳湖群体与长江流域其他群体样本DNA为模板，用PCM2076标记PCR扩增的产物的PAGE电泳胶图。
图3：以2019年取样鄱阳湖群体与长江流域其他群体的DNA为模板，用PCM2076标记PCR扩增的产物PAGE电泳胶图。附图标记说明：图3中的第一行带型(图中标记为“1”)为长江流域其他群体样本的扩增带型，第二行带型(图3中标记为“2”)为鄱阳湖群体样本的扩增带型。图4：以2020年取样鄱阳湖群体与长江流域其他群体的DNA为模板，用PCM2076标记PCR扩增的产物PAGE电泳胶图；图中的第一行带型(图中标为“1”)为长江流域其他群体样本的扩增带型，第二行带型(图中标记为“2”)为鄱阳湖群体样本的扩增带型。
具体实施方式
对序列表的说明：
序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的DNA序列是本发明筛选的分子标记引物组合。
序列表SEQ ID NO:3本发明筛选的分子标记引物组合扩增的PCR产物的核苷酸序列。
实施例1：
(1)提取来自中国14个地域群体的克氏原螯虾基因组DNA，每个群体收集不少于22尾的基因组DNA。
(2)根据克氏原螯虾基因组测序的序列片段，利用Primer3软件设计引物PCM2076 F5'-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3'，PCM2076 R 5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3'。所述分子标记为SSR标记，其核心序列为(CT)8扩增产物目的片段大小为127bp(序列见序列表SEQ IDNO:1和图1)。
(3)PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后；72℃再延伸7min；4℃保存。
(4)对14个地域群体的克氏原螯虾DNA样本进行PCR检测：利用引物PCM2076扩增目的片段，并用琼脂糖电泳检测其目的片段是否被扩出。
(5)利用PAGE胶进行电泳检测并进行统计分析：将扩增出的PCR产物用4％的PAGE胶电泳后，再用0.2％硝酸银对胶板进行染色，最后用含有0.5％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液对胶板进行显影、漂洗和晾干，之后对各个群体进行带型分析。
(6)统计分析显示：鄱阳湖地域的三个地方的群体(安徽安庆，江西九江和南昌市建新区南矶乡)样本在标记PCM2076位点含有A、B两个等位基因，且含有A等位基因个体占比超35％，长江流域其他10个地域群体与微山湖群体超过90％的样本为等位基因B的纯合基因型；形成了显著的基因型差异。
(7)特定地域克氏原螯虾群体(江西鄱阳湖，江西九江，安徽安庆)单个群体采样至少22尾；其他群体采样地点不少于3个，每个点采样数目不少于22尾。
(8)本标记适用于鉴定鄱阳湖地域的克氏原螯虾群体，还可以在其他地域的群体中，鉴定筛选出具有鄱阳湖地域遗传特性的克氏原螯虾个体。
(9)引物设计与筛选：根据克氏原螯虾的基因组序列(Shi et al.,2018)，通过分析微卫星特征序列，设计了2873对SSR标记引物。通过对14个地域的克氏原螯虾群体样本采集，并提取基因组DNA，利用上述PCR扩增条件对2873对引物进行扩增与多态性筛选得到多态性标记PCM2076。
(10)通过对SSR标记PCM2076的PCR产物的带型分析，归纳与总结，得出被测群体是否为鄱阳湖地域克氏原螯虾群体。
本发明2018年8月至10月到鄱阳湖及周边流域(如江西鄱阳湖、九江和安徽安庆)进行种质资源调研并采集了克氏原螯虾样本，其中，鄱阳湖23尾，九江26尾，安庆24尾，总计73尾；鉴定结果见表1所示。
此外，本发明也收集了长江流域的其他11个地域克氏原螯虾样本，每个地域采集至少22尾，总计11个地域为274尾。本发明采集的群体按不同群体分开取样，剪取克氏原螯虾的下部肌肉于无水乙醇中-20℃保存，利用上述分子标记的方法对鄱阳湖地域克氏原螯虾进行群体鉴定。
表1全国14个地域克氏原螯虾采样点的经纬度
Figure BDA0002766447500000051
一种鉴定克氏原螯虾鄱阳湖地域群体的分子标记，其步骤为：
1、基因组DNA提取：
(1)剪取克氏原螯虾肌肉样品50-100mg于1.5mL离心管内，用剪刀剪碎。
(2)向剪碎样本中加入蛋白酶K(20mg/mL)10μL，组织裂解液600μL混匀，55℃水浴4h，每隔30min颠倒混匀一次，待肌肉组织完全裂解后取出，于冰上静置冷却至室温。
(3)向裂解样品加入7.5M的乙酸铵溶液200μL，上下颠倒使乙酸铵溶液与裂解样品溶液充分混匀后冰上静置10min；在4℃,12000r/min条件下离心10min，转移750μL上清液于新离心管内，加入等体积的异丙醇上下颠倒混匀2min并做好标记。
(4)在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃上清液留沉淀，向含有沉淀的离心管内加入75％乙醇1mL洗涤沉淀。
(5)在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃上清液留沉淀，向含有沉淀的离心管内加入无水乙醇1mL再次洗涤沉淀。
(6)在4℃、12000r/min条件下离心10min，弃上清液晾干沉淀，向含有沉淀的离心管内加入超纯水(d2H2O)100μL溶解沉淀，待沉淀完全溶解后得到克氏原螯虾总DNA溶液。
(7)组织裂解液每100mL组分如下：1M Tris-HCL 1mL；0.5M EDTA 20mL；十二烷基硫酸钠2g。蛋白酶K(20mg/mL)于生工生物订购，其他化学试剂为国药订购保存使用。
2、引物设计：根据克氏原螯虾基因组测序的片段序列，利用Primer3软件设计SSR标记PCM2076的引物组合，其中引物组合的正向引物为5’-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3’反向5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3’。
3、PCR扩增：PCR扩增体系为20μL，包括4μL 10×Buffer，0.2μL dNTPs(10mM),0.1μLrTaq酶，微卫星上下游引物(10μmol/L)各1μL，提取的DNA模板2μL，无菌水11.7μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
4、对扩增产物的检测：扩增产物用5×TBE(每1000mL中含54g Tris·base、27.5g硼酸、4.75g Na2EDTA·2H2O)缓冲液配制的4％丙烯酰胺电泳胶，电泳液为1×TBE，电泳条件为2000V，200mA，100W，电泳过程每隔5min点一道样品，最后一道点样后电泳30min。取出电泳胶板用0.2％硝酸银染色10min，用含有0.3％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液显影后清水冲洗干净、晾干、读带。
5、结果分析：鄱阳湖及周边水域(江西九江、安徽安庆、江西南昌市建新区南矶乡)出现等位基因A的带型的个体为39(取样量73)占比为53.42％；其他地域群体出现等位基因A的带型的个体为7(总体样本274)占比2.55％。根据电泳图与统计数据可以发现检测群体中PCM2076位点的基因型差异明显，可以区分鄱阳湖地域和其他地域的克氏原螯虾群体(见图2)。
实施例2：
为验证PCM2076可以鉴定鄱阳湖地域克氏原螯虾群体的特异性，因此进行第一次重复验证实验。
2019年5月到鄱阳湖(南昌市建新区南矶乡)流域采集野生克氏原螯虾群群体总计90尾(雌性48尾，雄性42尾)。在长江下游的太湖、中游洪湖、洞庭湖采集样品各30尾(雌、雄各15尾)，总计非鄱阳湖样本90尾；按群体分开取样，剪取尾部肌肉于无水乙醇中-20℃保存，利用分子标记按下述方法进行鄱阳湖地域群体鉴定。
一种鉴定克氏原螯虾鄱阳湖地域群体的分子标记，其步骤如下：
1、基因组DNA提取：步骤同实施例1
2、引物设计：根据克氏原螯虾基因组测序的片段序列，利用Primer3软件设计SSR标记PCM2076的引物，正向5’-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3’反向5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3。
3、PCR扩增：PCR扩增体系为20μL，包括4μL 10×Buffer，0.2μL dNTPs(10mM),0.1μLrTaq酶，微卫星上下游引物(10μmol/L)各1μL，提取的DNA模板2μL，无菌水11.7μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
4、产物检测：扩增产物用5×TBE(每1000mL中含54g Tris·base、27.5g硼酸、4.75g Na2EDTA·2H2O)缓冲液配制的4％丙烯酰胺电泳胶，电泳液为1×TBE，电泳条件为2000V，200mA，100W，电泳过程每隔5min点一道样品，最后一道点样后电泳30min。取出电泳胶板用0.2％硝酸银染色10min，取出用含有0.3％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液显影，清水冲洗干净、晾干、读带。
5、结果：鄱阳湖地域群体中，SSR标记PCM2076位点出现A等位基因的个体为35(取样量90)占比为38.89％；其他地域群体中，A等位基因的个体为7(总体样本90)占比7.78％。根据电泳图与统计数据可以发现检测群体中PCM2076位点的基因型差异明显，可以区分鄱阳湖地域和其他地域的克氏原螯虾群体(见图3)。
实施例3：
为验证PCM2076可以鉴定鄱阳湖地域克氏原螯虾野生群体的特异性，因此进行第二次重复验证实验。
2020年7月到鄱阳湖(南昌市建新区南矶乡)采集野生群体，总计样品96尾(雌、雄性各48尾)；与长江下游太湖、中游监利、洞庭湖各采集30尾(雌、雄各15尾)；按不同群体分开取样，剪取虾尾部肌肉于无水乙醇中并于-20℃保存，利用分子标记按下述方法进行鄱阳湖地域群体鉴定。
一种鉴定克氏原螯虾鄱阳湖地域群体的分子标记方法，其步骤如下：
1、DNA提取：同实施例1
2、引物设计：根据克氏原螯虾基因组测序的片段序列，利用Primer3软件设计SSR标记PCM2076的正向引物为，5’-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3’；反向引物为5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3。
3、PCR扩增：PCR扩增体系为20μL，包括4μL 10×Buffer，0.2μL dNTPs(10mM),0.1μLrTaq酶，微卫星上下游引物(10μmol/L)各1μL，提取的DNA模板2μL，无菌水11.7μL。反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min。
4、产物检测：扩增产物用5×TBE(每1000mL中含54g Tris·base、27.5g硼酸、4.75gNa2EDTA·2H2O)缓冲液配制的4％丙烯酰胺电泳胶，电泳液为1×TBE，电泳条件为2000V，200mA，100W，电泳过程每隔5min点一道样品，最后一道点样后电泳30min。取出电泳胶板用0.2％硝酸银染色10min，取出用含有0.3％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液显影，清水冲洗干净、晾干、读带。
5、结果与分析：鄱阳湖地域群体出现A等位基因的个体为42(取样总量96)占比为43.75％；其他地域群体出现A等位基因的个体为4(总体样本90)占比4.44％。根据电泳图与统计数据可以发现检测群体中PCM2076位点的基因型差异明显，可以区分鄱阳湖地域和其他地域的克氏原螯虾群体(见图4)。
主要参考文献：
1.谭云飞,蓬国辉,熊礼静,彭波,吴毅博,宋朝伟,白旭峰.长江中下游流域13个克氏原螯虾群体遗传多样性和遗传结构分析[J].华中农业大学学报,2020,39(02):33-39.
2.SHI,L.L.,YI,S.K.&LI,Y.H.,2018.Genome survey sequencing of red swampcrayfish Procambarus clarkii.Molecular Biology Reports,45:799-806。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种区分克氏原螯虾特定地理群体的SSR分子标记及其应用
<141> 2020-11-07
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
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<222> (1)..(23)
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atgttacatg ttgtctccac tca 23
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<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 2
ggtgagaatg gcagaggaaa 20
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<211> 127
<212> DNA
<213> 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)
<400> 3
atgttacatg ttgtctccac tcattctccc cccctctctc tctctctctc cttcccacgc 60
ccctcttcct ctcttccttc ccatcccatt ttccccctcc tggcttcttt cctctgccat 120
tctcacc 127

Claims (2)

1.一种鉴定克氏原螯虾特定地理群体基因型的SSR分子标记引物，所述分子标记引物的DNA序列如下所示：
正向引物PCM2076 F：5'-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3'，
反向引物PCM2076 R：5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3'。
2.一种鉴定克氏原螯虾特定地理群体基因型的SSR分子标记的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)分别提取来自中国14个地域群体的克氏原螯虾基因组DNA，每个群体至少提取20尾克氏原螯虾的基因组DNA；
(2)根据克氏原螯虾基因组测序数据，设计正向引物PCM2076 F 5’-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3’，以及反向引物PCM2076R 5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3’；
(3)对步骤(1)的克氏原螯虾的DNA样本进行PCR检测，具体步骤为：
利用正向引物PCM2076 F 5'-ATGTTACATGTTGTCTCCACTCA-3'，和反向引物PCM2076 R5'-GGTGAGAATGGCAGAGGAAA-3'扩增目的片段，该片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，该片段即为PCR产物，利用琼脂糖电泳检测所述目的片段是否被扩增出；
PCR检测条件为：95℃预变性3min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸7min；4℃保存；
(4)将扩增出的PCR产物用4％的PAGE胶进行电泳检测，电泳胶板事先用0.2％的硝酸银溶液进行染色，用含有0.5％甲醛溶液的0.5M氢氧化钠溶液进行显影、漂洗和晾干，对步骤(1)所述群体进行带型统计分析；
(5)校测样本在PCM2076位点含有等位基因A的鉴定为鄱阳湖及附近地域群体，以样本基因型为纯合等位基因B的鉴定为长江流域的其他10个地域群体和微山湖群体。
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