CN102154500A - 一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法，它包括设计和合成六重PCR引物；提取基因组DNA；六重PCR反应；检测PCR产物，六重PCR反应包括六重PCR反应体系和六重PCR反应程序。本发明建立了进行三疣梭子蟹家系和亲子鉴定的六重PCR反应体系，实现了在一个PCR反应中同时检测6个微卫星位点，因此与原有的PCR方法相比效率提高了6倍左右。本发明具有高效、经济、简便易行等特点，可以在三疣梭子蟹遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用。

Description

一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法

技术领域

本发明涉及三疣梭子蟹微卫星标记的PCR检测方法，具体涉及一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法。

背景技术

微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)是指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传，易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。多重PCR(Multiplex PCR)是在同一个反应中同时扩增两个或多个位点的聚合链式反应。它具有提高效率，避免样品浪费，快速周转时间，并可大大节约实验成本的优点。

微卫星多重PCR技术在水产动物中已有广泛应用，主要进行亲子鉴定和遗传多样性分析，Patricia Novel等已在狼鲈(Dicentrarchus labrax)、Lerceteau-

等在褐鳟(Salmo trutta)、GAO Huan等在中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)、Javier Porta等在塞内加尔鳎(Solea senegalensis)、Yan Wang等在牡蛎(Crassostrea virginica Gmelin)、Yutao Li等在斑节对虾(Penaeus monodon)等等海洋经济动物中有相关报道。

随着三疣梭子蟹人工养殖业的迅速发展，对优良品种的需求量逐年增大。因此，三疣梭子蟹的育种工作在国家的资助下逐渐开展起来，在以往的育种研究中，优良品种的获得主要是通过系统选育或杂交育种等传统育种技术，但这些传统的育种技术往往存在操作复杂且耗时较长等缺点。在三疣梭子蟹未见有微卫星多重PCR体系建立和在育种应用等方面的技术。

发明内容

针对现有技术中三疣梭子蟹传统育种所存在的操作复杂和耗时较长的缺点，本发明提供了一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法，本发明在多个多态性微卫星标记的基础上进行标记间组合和搭配以及实验方法优化，获得更简便、快捷的检测方法，大大缩短实验时间，与常规的PCR方法相比效率提高了6倍左右，所得结果可同时反映出三疣梭子蟹在多个微卫星位点的遗传变异。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法，它包括：(1)设计和合成六重PCR引物；(2)提取基因组DNA；(3)六重PCR反应；(4)检测PCR产物，其特征在于所述六重PCR反应包括六重PCR反应体系和六重PCR反应程序，所述六重PCR反应体系的引物为Ptr33a、Ptr95、Pot34、Pot42、Pot44和Pot57的组合，所述各引物序列如下：

Ptr33a：F：ACAACGCCAACAATAGCA

R：CACCGCACTTTACAGCAC；

Ptr95：F：CCTTGCCTTTCACTATACAC

R：GACCCACTTGTTATCGTTTT

Pot34：F：AGGAATGGTTGCAAAGATCG

R：TGCGACTTGACACTCACCTC

Pot42：F：TCATCACACAGGCTCACTCA

R：CATCTTCCACCTTCCTCCAA

Pot44：F：ATTCACTTATTCGCACTGCT

R：GCAAGGGAAAATAGAAGACA

Pot57：F：TCTCATTTTCTCCCCCTCCT

R：TCCTCCTTTCTGCTGACCAC

进一步的，所述六重PCR反应体系为：10×Buffer 1.5μL；15mmol/LMgCl₂ 1.2μL；2.5mmol/L dNTP 1.5μL；所述引物Ptr33a，Ptr95，Pot42，Pot44和Pot57分别为0.4μL，Pot34正反引物各0.5μL，各引物浓度均为10pmol/μL；50ng/μL三疣梭子蟹基因组DNA 0.6μL；5U/μL Taq聚合酶0.12μL；ddH₂O补充至15μL。

再进一步的，所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共进行25次循环；最后72℃延伸5min；4℃保存并结束反应。

其中，本发明采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、微卫星标记由于其多态性丰富、易于检测、呈孟德尔共显性遗传等优点，是进行系谱分析和群体研究的一种比较理想的工具，但常规PCR扩增在一个三疣梭子蟹检测中只能获得1～2个点位基因。本发明的方法是在多个多态性微卫星标记的基础上进行标记间组合、搭配以及实验方法优化，获得更简便、快捷的PCR检测方法，大大缩短了实验时间，它与常规的PCR方法相比效率提高了6倍左右，且所得结果可同时反应出三疣梭子蟹在多个微卫星位点的遗传变异。

2、本发明可以在三疣梭子蟹群体遗传多样性分析、亲子鉴定、家系管理和良种选育进行推广应用。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是本发明的微卫星标记六重PCR检测方法中针对常规PCR和Touchdown PCR反应后产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，1-4为4个个体采用Touchdown PCR六重聚丙烯酰胺凝胶电泳图，5-8为采用常规PCR扩增的六重聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2是本发明的微卫星标记六重PCR检测方法中Mg2+体积依次为0.8、1.0、1.2、1.4μL的反应体系的PCR反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3是本发明的微卫星标记六重PCR检测方法对三疣梭子蟹4个个体的检测图谱，1-4是4个三疣梭子蟹个体，M为MD206-pBR322DNA/MspI DNA分子Marker。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明的一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR构建方法如下：

1、以本发明提供的三疣梭子蟹微卫星富集文库中的微卫星核心序列为基础，使用Primer Premier 6.0软件在其微卫星核心序列的两端设计相应的PCR引物，获得一系列具有PCR扩增产物大小不等的SSR标记。

2、利用Primer Premier 6.0软件进行引物间的评价，对显示大部分的ΔG(能量变化的Gibbs)值在-4以上的引物选出备用，ΔG(能量变化的Gibbs)值在-4以上主要说明多重PCR体系中单对引物之间不易形成引物二聚体以及具有低发夹结构，以免影响PCR反应效率。通过对22对微卫星标记引物间的搭配、组合，对其进行多重PCR体系的构建及测试，并对PCR实验的反应条件和加样参数进行了优化，从而建立了1组六重微卫星PCR方法和六重PCR反应体系。

影响常规PCR反应结果的因素主要是退火温度和Mg²⁺浓度。本实施例对退火温度进行优化。

本发明的一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法具体步骤如下：

(1)本发明所选用的六种引物序列如下表1所示：

表1：六种引物序列及其退火温度和其核心序列的登陆号

所述登录号为各引物核心序列的GenBank号。

(2)、三疣梭子蟹基因组DNA提取：取三疣梭子蟹大螯肌肉组织，采用苯酚/氯仿的方法提取三疣梭子蟹基因组DNA。1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，利用RNA/DNA分光光度仪进行基因组DNA浓度的检测并稀释成50ng/μl终浓度，-20℃保存备用。

(3)、PCR反应体系为：10×Buffer 1.5μL；15mmol/L MgCl₂ 1.2μL；2.5mmol/L dNTP1.5μL；本发明的Ptr33a，Ptr95，Pot42，Pot44和Pot57引物分别为0.4μL、Pot34正反引物各0.5μL，各引物浓度均为10pmol/μL；50ng/μL三疣梭子蟹基因组DNA 0.6μL；5U/μL Taq聚合酶0.12μL；ddH₂O补充至15μL。

PCR反应程序：采用常规PCR和Touchdown PCR比对的方法对退火温度进行优化。

常规PCR的反应程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共循环25次。最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。

Touchdown PCR的反应程序：94℃预变性5min后进行循环1：94℃变性40s，63℃退火1min，72℃延伸1min，循环进行8次，随后进行循环2：94℃变性40s，63℃退火1min，退火温度每个循环降低0.5℃，72℃延伸1min，循环进行10次，随后进行循环3：94℃变性40s，58℃退火1min，72℃延伸1min，循环进行7次，最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。

(4)、PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离。将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应。

实验结果如图1所示。图1中1-4为4个个体采用Touchdown PCR六重聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图5-8为采用常规PCR扩增的六重聚丙烯酰胺凝胶电泳图，1和5是对应的同一个个体扩增结果，2和6是同一个个体，3和7是同一个个体，4和8是同一个个体，M为MarkerMD206--pBR322 DNA/MspI(天根生化有限公司)。从上图中可以看出，1-4扩增结果与5-8的扩增结果相比，1-4体系中至少有一对引物没有扩增出来，而且扩增的条带明显比5-8暗。因此采用常规的PCR体系。

实施例2

本实施例针对Mg²⁺浓度进行了优化实验，实验过程如下：

步骤(1)和(2)同实施例1。

步骤(3)中PCR反应体系为：10×Buffer 1.5μL；2.5mmol/LdNTP1.5μL；本发明的Ptr33a，Ptr95，Pot42，Pot44和Pot57引物分别为0.4μL、Pot34正反引物各0.5μL，各引物浓度均为10pmol/μL；50ng/μL三疣梭子蟹基因组DNA 0.6μL；5U/μL Taq聚合酶0.12μL；ddH₂O补充至15μL；15mmol/L MgCl₂体积按0.8、1.0、1.2、1.4μL梯度进行优化。

反应程序采用常规PCR的反应程序：94℃预变性5min，94℃变性40s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共循环25次。最后72℃延伸5min，4℃保存并结束程序。

步骤(4)中检测方法同实施例1。实验结果如图2所示，1，5，1’，5’为个体1在Mg²⁺体积依次为0.8、1.0、1.2、1.4μL的扩增结果；2，6，2’，6’为个体2在Mg²⁺体积依次为0.4、0.8、1.2、1.4μL的扩增结果；3，7，3’，7’为个体3在Mg2+体积依次为0.8、1.0、1.2、1.4μL的扩增结果；4，8，4’，8’为个体4在Mg²⁺体积依次为0.8、1.0、1.2、1.4μL的扩增结果，M为Marker MD206--pBR322 DNA/MspI(天根生化有限公司)。由图2可以看出，Mg²⁺体积在0.8、1.0μL时，六对引物未全扩增出来；Mg²⁺体积在1.6μL时，引物二聚体增多。通过对比，取Mg²⁺体积在1.2μL时有最佳的扩增结果。

实施例3

本实施例选用上述优化后的反应程序和Mg²⁺体积，本发明的一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法具体步骤如下：

(1)本发明所选用的六种引物序列如下表2所示：

表2：六种引物序列及其退火温度和其核心序列的登陆号

(2)、三疣梭子蟹基因组DNA提取：取三疣梭子蟹大螯肌肉组织，采用苯酚/氯仿的方法提取三疣梭子蟹基因组DNA。1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA完整性，利用RNA/DNA分光光度仪进行基因组DNA浓度的检测并稀释成50ng/μl终浓度，-20℃保存备用。

(3)、PCR反应体系为：10×Buffer 1.5μL；15mmol/L MgCl₂ 1.2μL；2.5mmol/L dNTP1.5μL；本发明的Ptr33a，Ptr95，Pot42，Pot44和Pot57引物分别为0.4μL、Pot34正反引物各0.5μL，各引物浓度均为10pmol/μL；50ng/μL三疣梭子蟹基因组DNA 0.6μL；5U/μL Taq聚合酶0.12μL；ddH₂O补充至15μL。

PCR反应程序：由于体系中各引物的退火温度相差不大，采用常规PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共进行25次循环；最后72℃延伸5min；4℃保存并结束反应。

(4)、PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1-1.5小时进行分离。将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到三疣梭子蟹Ptr33a、Pot34、Pot42、Pot44、Pot57和Ptr956个基因位点的组合的具有高度多态性的图谱，如图3所示。本发明对三疣梭子蟹4个个体进行了应用，效果良好。

依据本发明提供的三疣梭子蟹微卫星标记六重PCR的引物组合和检测方法可以快速地检测三疣梭子蟹单个个体在6个微卫星区的遗传变异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱直观地表现出个体的指纹图谱，本发明可用于三疣梭子蟹的亲子鉴定和遗传多样性分析等。本发明可广泛应用于三疣梭子蟹群体遗传标记筛选、系谱认证、遗传图谱构建等方面。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法，它包括：(1)设计和合成六重PCR引物；(2)提取基因组DNA；(3)六重PCR反应；(4)检测PCR产物，其特征在于所述六重PCR反应包括六重PCR反应体系和六重PCR反应程序，所述六重PCR反应体系的引物为Ptr33a、Ptr95、Pot34、Pot42、Pot44和Pot57的组合，所述各引物序列如下：

Ptr33a：F：ACAACGCCAACAATAGCA

        R：CACCGCACTTTACAGCAC；

Ptr95：F：CCTTGCCTTTCACTATACAC

       R：GACCCACTTGTTATCGTTTT

Pot34：F：AGGAATGGTTGCAAAGATCG

       R：TGCGACTTGACACTCACCTC

Pot42：F：TCATCACACAGGCTCACTCA

       R：CATCTTCCACCTTCCTCCAA

Pot44：F：ATTCACTTATTCGCACTGCT

       R：GCAAGGGAAAATAGAAGACA

Pot57：F：TCTCATTTTCTCCCCCTCCT

       R：TCCTCCTTTCTGCTGACCAC

2.根据权利要求1所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法，其特征在于所述六重PCR反应体系为：10×Buffer 1.5μL；15mmol/L MgCl₂ 1.2μL；2.5mmol/L dNTP 1.5μL；所述引物Ptr33a，Ptr95，Pot42，Pot44和Pot57分别为0.4μL，Pot34正反引物各0.5μL，各引物浓度均为10pmol/μL；50ng/μL三疣梭子蟹基因组DNA 0.6μL；5U/μL Taq聚合酶0.12μL；ddH₂O补充至15μL。

3.根据权利要求1或2所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法，其特征在于所述PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共进行25次循环；最后72℃延伸5min；4℃保存并结束反应。

4.根据权利要求1所述的一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重PCR检测方法，其特征在于采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。

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