CN113186303B - 一种鸡的品种鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡的品种鉴定方法，包括以下步骤：提取鸡基因组DNA；通过15对微卫星位点对鸡基因组DNA进行STR基因分型测序，统计出测得的等位基因，与该微卫星位点特有等位基因型进行比对，从而鸡品种的品种鉴定；本发明通过使用分子标记技术对纯种和杂交品种实行科学的品种特异性鉴定，操作简单且结果可靠，可以为地方鸡遗传资源保护和合理利用提供科学依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种鸡的品种鉴定方法，针对15个中国地方鸡品种和5个越南地方鸡品种的品种鉴定方法，属于畜牧学、分子生物学领域技术领域。
背景技术
我国云南、广西，与越南毗邻，受热带季风气候影响，这些地区雨量充沛，温度适宜，是红色原鸡的主要栖息地之一。由于距离野生红色原鸡的栖息地点非常近，两国均有悠久的养鸡历史，在长期的选育过程中也衍生出了许多独具特色的优良地方鸡品种，遗传资源尤为丰富。
传统的品种鉴定方法是依据动物群体的形态学、生化及分子标记等。形态学鉴定是指动物品种具有的外貌特征，但是有许多动物品种仅仅依据外貌特征，无法辨别出是哪个品种，是纯系还是杂系。分子标记是依据蛋白质、核酸分子的突变来鉴定,这种标记分布广泛,多态性高,受环境影响较小,是目前进行品种鉴定过程中比较常用一种标记形式。
微卫星(Microsatellite)又称简单重复序列(Simple Sequence Repeat,SSR)，是一类广泛存在于真核生物基因组中的串联重复序列。微卫星由核心序列一般是2-6bp的重复，核心序列重复数的差异就形成了微卫星高度的多态性。微卫星具有分布广泛、多态性高、呈共显性遗传、受选择压力小、易于检测等优点，被认为是最理想的分子遗传标记，已大量应用于品种鉴定工作中。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足，传统的根据形态学标记对鸡种进行鉴别的方法受环境因素的影响较大，而且通过形态学进行鉴定出的结果容易出现错误。应用分子标记这种分子生物学手段可以根据不同鸡品种间的特有等位基因型对鸡品种进行精确的鉴定。为此，本发明提供了一种针对15个中国地方鸡品种和5个越南地方鸡品种的品种鉴定方法。
本发明的目的是这样实现的，步骤1)、提取鸡基因组DNA；
所述鸡包括15个中国地方鸡品种、5个越南地方鸡品种；15个中国地方鸡品种为：红色原鸡、茶花鸡、瑶鸡、广西麻鸡、龙胜凤鸡、瓢鸡、腾冲雪鸡、大围山微型鸡、武定鸡、西双版纳斗鸡、云龙矮脚鸡、兰坪绒毛鸡、霞烟鸡、无量山乌骨鸡、盐津乌骨鸡；
5个越南地方鸡品种为：
步骤2)、通过15对微卫星位点对鸡基因组DNA进行STR基因分型测序，统计出测得的等位基因，与该微卫星位点特有等位基因型进行比对，从而鸡品种的品种鉴定；
15对微卫星位点为：MCW0081、MCW0213、ADL0278、MCW0330、MCW0165、MCW0020、ADL0268、MCW0016、MCW0098、MCW0123、LEI0094、LEI0166、MCW0111、MCW0104、MCW0183。
步骤2)中，每个鸡品种在不同的微卫星位点测得的特有等位基因型均不相同，预先将每个鸡品种的特有等位基因型进行统计建库，并制作各品种的特有等位基因型标签。
本发明方法先进科学，通过使用特定的微卫星位点对样本DNA进行STR基因分型测序，统计出测得的等位基因，与该位点特有等位基因型进行比对，从而实现地方鸡品种的品种鉴定。根据每一个地方鸡品种在不同的微卫星位点测得的特有等位基因型均不相同，所以将每一个地方鸡品种的特有等位基因型进行统计建库，并制作各品种的特有等位基因型标签。
有益效果：我国广西、云南等与越南接壤的地区鸡遗传资源丰富，但普遍存在国内外资源混杂和基因交流频繁的现象，容易导致珍惜种质资源的流失与灭绝。本发明通过使用分子标记技术对纯种和杂交品种实行科学的品种特异性鉴定，操作简单且结果可靠，可以为地方鸡遗传资源保护和合理利用提供科学依据。
附图说明
图1为具体实施方式中的等位基因型库；
图2为品种鉴定标签。
具体实施方式
下面结合附图以及附图说明对本发明做进一步说明。
一种鸡的品种鉴定方法，针对15个中国地方鸡品种和5个越南地方鸡品种的品种鉴定方法，具体步骤如下：
1.材料与方法；
1.1实验材料；
15个中国地方鸡品种：红色原鸡、茶花鸡、瑶鸡、广西麻鸡、龙胜凤鸡、瓢鸡、腾冲雪鸡、大围山微型鸡、武定鸡、西双版纳斗鸡、云龙矮脚鸡、兰坪绒毛鸡、霞烟鸡、无量山乌骨鸡、盐津乌骨鸡。
5个越南地方鸡品种：
1.2实验材料中地方鸡品种基因组DNA提取；
每个鸡品种于鸡翅静脉处采血，用传统酚-氯仿法提取基因组总DNA，测DNA浓度和纯度，将DNA稀释到100ng/L，-20℃冰箱保存。
(1)2ml离心管中加入800μl禽全血裂解液，取50μl血液(如有血凝块，应将血凝块吹打散开或优先吸取血凝块)加入禽全血裂解液中，静置1h。
(2)加入30μl蛋白酶K，震荡20min，放入水浴锅55℃，每20min取出震荡10min，震荡4～6次后放入水浴锅55℃，过夜消化。
(3)向已经过夜消化好的样本溶液中加入600μlTris酚，震荡10min，放入离心机12000rpm离心10min。
(4)吸取上清液至新的2ml离心管(弃下层浑浊液)，加入混合溶液(Tris酚25：氯仿24：异戊醇1)500μl，震荡10min，放入离心机12000rpm离心10min。
(5)吸取上清液，加入1ml混合溶液(氯仿24：异戊醇1)，震荡10min，放入离心机12000rpm离心10min。
(6)吸取上清液至新的2ml离心管(弃下层浑浊液)，加入无水乙醇1ml，轻微震荡10min可见白色絮状沉淀，放入离心机12000rpm离心10min。
(7)弃上清溶液，留存白色沉淀，加入75％乙醇300μl，放入离心机8000rpm离心5min。
(8)重复操作步骤5。
(9)弃上清，静置20min。
(10)加入200μL ddH2O或TE溶解，-20℃保存DNA。
(11)溶解好的DNA，使用NANODROP ND-1000核酸分析仪检测DNA的质量与浓度，并将DNA母液分装稀释至50ng/μl备用。
1.3PCR扩增上述地方鸡品种基因组DNA中的微卫星位点；
1.3.1 15对微卫星位点信息
文献提供的15对微卫星位点：MCW0081、MCW0213、ADL0278、MCW0330、MCW0165、MCW0020、ADL0268、MCW0016、MCW0098、MCW0123、LEI0094、LEI0166、MCW0111、MCW0104、MCW0183作为试验位点，引物合成序列如下表所示。
15对荧光引物的序列信息
1.3.2上述15对荧光引物的最优反应条件及分组
15对荧光引物的最优化反应条件及分组如下表所示，其中每一组中的三个荧光引物扩增出的产物可以混在一起进行STR基因分型检测。
15对荧光引物的最优化反应条件
1.3.3上述15对荧光引物PCR反应体系及反应条件；
a.PCR具体反应体系见下表：
PCR反应体系
每个反应体系为20μL，加至BBHM023型普通PCR96孔加样板(由扬州必帮生物有限公司提供)中，使用BBHM06896型96孔板硅胶垫密封好，放入PCR仪中。因为涉及荧光引物，整个过程应在避光环境下进行操作。
b.PCR具体反应条件见下表：
反应条件
反应完成后应在避光条件下取出PCR扩增产物样板，表面用记号笔对应引物及模板标注好样板号，使用锡箔纸密封好产物样板，使用保鲜膜及胶带包裹好(过程中应避免加样板弯折)，可委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行STR分型检测。
1.4针对上述PCR扩增产物进行STR分型测序；
(1)取96孔反应板，使用记号笔标明板名、实验日期。
(2)制作电子版STR检测表，并自动生成上机表。
(3)使用连续加样器，吸取990μl HIDI和10μl ROX500或LIZ500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10μl。
(4)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。
(5)使用12排10μl排枪，对照STR检测表，在96孔板对应的孔中加入50pg的样品。
(6)将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。
(7)使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500g即停。置于PCR仪。
(8)变性程序为98℃，5min，不加热热盖，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却。
(9)将96孔板置于平板离心机中，离心2000g即停。
(10)使用3730XL型仪器毛细管电泳进行STR基因分型检测。
1.5使用GeneMapper4.0软件针对上述STR分型结果进行统计分析；
GeneMapper4.0软件生成独立的图谱文件并读出、峰值的大小、片段长度的大小、峰面积的大小，同时判断纯合子(单峰)或杂合子(双峰)。将检测出的等位基因型与等位基因库中的等位基因型进行比对，做出品种鉴定标签，与标签图谱进行比对实现品种鉴定。
2.结果；
本研究使用15个微卫星位点，将每个微卫星位点检测出的基因型排列赋值，构建等位基因型库(图1)。每个地方鸡品种所具有的特有等位基因型均不相同，可以利用每个品种的特有等位基因型进行品种鉴定。本实验所运用的20个地方鸡品种所对应的品种标签如图2所示，每个圆圈数字(表示一个微卫星位点)与后方一个字符(表示该位点下的一个等位基因型)组成一个品种标签，在品种鉴定过程中如果有地方鸡群体检测过程中出现一个或多个与表中相对应的品种标签，在表型一致的情况下，则可以认定鸡群为品种标签相对应的地方鸡品种，对应的标签越多，品种鉴定就越精确。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种鸡的品种鉴定方法
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 22
tctcacactg taacacagtg c 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 23
ctcctgccct tagctacgca 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 24
tatcccctgg ctgggagttt 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 25
gctccatgtg aagtggttta 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 26
atgtccactt gtcaatgatg 20
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 27
tagcacaact caagctgtga g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 28
agacttgcac agctgtgtac c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 29
atcccagtgt cgagtatccg a 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 鸡(Gallus gallus)
<400> 30
tgagatttac tggagcctgc c 21
Claims (1)
1.一种鸡的品种鉴定方法，其特征是，包括以下步骤：
步骤1)、提取鸡基因组DNA；
所述鸡为15个中国地方鸡品种、5个越南地方鸡品种；15个中国地方鸡品种为：红色原鸡、茶花鸡、瑶鸡、广西麻鸡、龙胜凤鸡、瓢鸡、腾冲雪鸡、大围山微型鸡、武定鸡、西双版纳斗鸡、云龙矮脚鸡、兰坪绒毛鸡、霞烟鸡、无量山乌骨鸡、盐津乌骨鸡；
5个越南地方鸡品种为：洪鸡、马匹鸡、黑发鸡、胡鸡、绿壳蛋鸡；
步骤2)、通过15个微卫星位点的引物对鸡基因组DNA进行STR基因分型测序，统计出测得的等位基因，将检测出的等位基因型与等位基因型库中的等位基因型进行比对，做出品种鉴定标签，与标签图谱进行比对实现品种鉴定；
15个微卫星位点为：MCW0081、MCW0213、ADL0278、MCW0330、MCW0165、MCW0020、ADL0268、MCW0016、MCW0098、MCW0123、LEI0094、LEI0166、MCW0111、MCW0104、MCW0183；15个微卫星位点的引物为：
15个微卫星位点引物的序列信息
其中，将每个微卫星位点检测出的基因型排列赋值，构建等位基因型库，构建得到如下等位基因型库：
20个地方鸡品种所对应的品种标签如下所示：其中，每个圆圈数字表示一个微卫星位点，与后方表示该位点下的一个等位基因型的一个字符组成一个品种标签；
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