CN101638692A - 大菱鲆荧光标记微卫星六重pcr家系识别方法 - Google Patents
大菱鲆荧光标记微卫星六重pcr家系识别方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101638692A CN101638692A CN200910203303A CN200910203303A CN101638692A CN 101638692 A CN101638692 A CN 101638692A CN 200910203303 A CN200910203303 A CN 200910203303A CN 200910203303 A CN200910203303 A CN 200910203303A CN 101638692 A CN101638692 A CN 101638692A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- turbot
- primers
- pairs
- pcr reaction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种大菱鲆荧光标记微卫星六重PCR家系识别方法,利用三种荧光(6FAM,HEX和NED)对六对引物根据其PCR扩增产物大小进行了两两标记;利用引物设计软件排除这六对引物在PCR反应过程中形成二聚体的可能,组合这六对引物于同一个PCR反应体系中,反应体系中包括ROX荧光分子内标;调整PCR反应体系,建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数和合适的PCR反应程序;PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行大菱鲆六个微卫星位点分析。此六重PCR技术可提高大菱鲆微卫星标记的检测效率,单亲排除率为99.63%,个体识别力99.99%,可以对大菱鲆不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定。
Description
技术领域:
本发明属于分子生物学遗传育种的分子标记辅助技术,是一种大菱鲆荧光标记微卫星六重PCR家系识别方法。
背景技术:
大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)又名多宝鱼,是原产欧洲的一种优质海水养殖品种。我国于1992年引进养殖,为我国重要的海水养殖对象。利用分子标记辅助育种是大菱鲆良种选育重要途径之一,目前应用最为广泛的分子标记为微卫星。常规微卫星检测技术为单对引物进行单个位点的PCR扩增,其产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测,效率低,周期长。微卫星多重PCR是基于常规PCR技术,在一个PCR反应体系中加入多对特异性的微卫星引物,针对特定模板进行多个微卫星目的片段的PCR技术。大菱鲆多重PCR检测技术的特点是效率高、周期短,可以有效利用少量模板,提高微卫星标记大菱鲆遗传多样性分析、个体系谱识别及遗传连锁图谱构建的效率。目前国内外尚未见有大菱鲆微卫星多重PCR技术的发明及相关报道。与本发明类似的专利申请有“中国对虾微卫星三重PCR家系识别技术”(孔杰,高焕,申请号:200510042402、9)。该专利将开发的三对中国明对虾微卫星引物纳入到一个PCR反应体系中,利用片段大小区分不同产物。其优点在于三重PCR提高了效率;缺点在于三重PCR提高的效率有限,不同目的片段的PCR产物靠目测难以区分。
发明内容:
本发明的目的是通过不同荧光标记的引物组合,结合优化PCR反应条件,建立一个大菱鲆六重微卫星PCR反应及检测体系。为大菱鲆分子标记辅助育种提供高效、准确的微卫星标记检测技术。
本发明是通过如下技术方法实现的:本发明利用三种荧光(6FAM,HEX和NED)对六对引物根据其PCR扩增产物大小进行了两两标记。利用引物设计软件排除这六对引物在PCR反应过程中形成二聚体的可能,组合这六对引物于同一个PCR反应体系中,反应体系中包括ROX荧光分子内标。调整PCR反应体系,建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数和合适的PCR反应程序。PCR产物经ABI 3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行大菱鲆六个微卫星位点分析。相同荧光标记的产物通过片段大小进行判断,对大菱鲆不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定。六对微卫星引物的序列如下:
YSKr01正向序列为(5‘-3’)CGAGTCAACAGCCATCAAGC,反向序列为(5‘-3’):AGGTGGTGGACCGTTCAAGT;
YSKr02正向序列为(5‘-3’)TCGTTGCCGTAGAAACCATC,反向序列为(5‘-3’):CTGTCTGGAGCCCAAACCT;
YSKr19正向序列为(5‘-3’)TTGTGGTGCTGTGAATGTGTG,反向序列为(5‘-3’):AGTGTTATGATATGTGGAGGC;
YSKr29正向序列为(5‘-3’)GCCTTGCTGTGATTCTTTG,反向序列为(5‘-3’):AGTGCTGCTTGTCTCTTGTG;
YSKr 39正向序列为(5‘-3’)GAGGGTTGTTATTGTGGAG,反向序列为(5‘-3’):GAGGACAAAGTGACGACG;
YSKr61正向序列为(5‘-3’)CACCTCACTGCCCACTGA,反向序列为(5‘-3’):TCTGGATGTTTCTCTGACTT;
本发明的特点和效果:本方法将需要分别进行六次的大菱鲆微卫星PCR扩增和检测,整合为一次的六重PCR反应体系和一次的产物检测,可大大提高大菱鲆微卫星标记的检测效率,组合的六重PCR技术的大菱鲆单亲排除率为99.63%,个体识别力99.99%。结合三种荧光标记,可提高产物分辨程度,避免常规检测中由于不同位点产物片段大小接近时无法有效区分的弊病。利用该六重PCR反应体系进行大菱鲆微卫星标记检测,可以大大节约包括PCR实验耗材、PCR试剂、电泳检测及时间成本等各项内容。
具体实施方式:
大菱鲆微卫星标记的开发是我们利用“菌落富集-探针杂交”策略测序获得的,对重复序列进行引物设计从而实现对大菱鲆特定微卫星位点的PCR扩增。首先利用引物设计软件分析排除这六对引物彼此形成引物二聚体、发荚结构的可能,对于检测到的严重影响复合PCR反应进行的二聚体及发荚结构的引物进行修改,使其完全适合复合PCR反应体系。对扩增产物大小差异显著的(≥50bp)任意两对引物进行相同的单引物荧光标记,具体为YSKr01和YSKr19两条引物进行6FAM荧光标记;YSKr02和YSKr29两条引物进行HEX荧光标记;YSKr39和YSKr61两条引物进行NED荧光标记。组合这六对引物于同一个PCR反应体系,并在其中增加ROX荧光分子内标。调整PCR反应体系,建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数,这些参数是:10×Buffer 3μl(内含750mM Tris-HCl(pH8.8),200mM(NH4)2SO4,0.1%Tween 20),0.9mM Mg2+,0.2mM dNTP,六对引物正向及反向序列各0.20μM,2.0unit DNA聚合酶,补充灭菌双蒸水使PCR反应体系达到30μl。PCR反应程序为:95℃预变性5min,随后的25个PCR循环为95℃变性45s、61℃退火45s、72℃延伸45s,最后于72℃延伸5min。PCR反应过程在常规PCR仪上进行。PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行微卫星位点分析。相同荧光标记的产物通过片段大小进行判断。
六对微卫星引物的序列如下:
YSKr01正向序列为(5‘-3’):CGAGTCAACAGCCATCAAGC,反向序列为(5‘-3’):AGGTGGTGGACCGTTCAAGT;
YSKr02正向序列为(5‘-3’)TCGTTGCCGTAGAAACCATC,反向序列为(5‘-3’):CTGTCTGGAGCCCAAACCT;
YSKr19正向序列为(5‘-3’):TTGTGGTGCTGTGAATGTGTG,反向序列为(5‘-3’):AGTGTTATGATATGTGGAGGC;
YSKr29正向序列为(5‘-3’):GCCTTGCTGTGATTCTTTG,反向序列为(5‘-3’):AGTGCTGCTTGTCTCTTGTG;
YSKr39正向序列为(5‘-3’):GAGGGTTGTTATTGTGGAG,反向序列为(5‘-3’):GAGGACAAAGTGACGACG;
YSKr61正向序列为(5‘-3’):CACCTCACTGCCCACTGA,反向序列为(5‘-3’):TCTGGATGTTTCTCTGACTT;
技术指标YSKr01,YSKr02,YSKr19,YSKr29,YSKr39和YSKr61位点的目的片段分别为244bp,84bp,232bp,133bp,240bp和157bp,具有的等位基因数分别为8,7,5,3,5和5个,由此组合的六重PCR技术的大菱鲆单亲排除率为99.63%,个体识别力99.99%。
应用范围可以通过此六重PCR技术,经过常规方式PCR扩增,结合基因分析仪一次性获得六个微卫星位点上的大菱鲆个体的遗传信息,通过这些不同个体间显示的遗传信息差异来进行个体和家系系谱识别。育种中的应用:1)获得了家系个体六个微卫星位点的遗传信息,可以推测缺失的父本或母本的基因型或父母本的基因型组合;2)获得群体六个微卫星位点的遗传信息,可以对该群体按照家系组成进行归类;3)获得亲本之一或父母本六个微卫星位点的遗传信息,可以对混养的后代进行遗传分析,确定或排除后代是否为检测亲本的子代个体。
Claims (1)
1、一种大菱鲆荧光标记微卫星六重PCR家系识别方法,其特征在于它的方法是:利用三种荧光6FAM,HEX和NED对六对引物根据其PCR扩增产物大小进行了两两标记;利用引物设计软件排除这六对引物在PCR反应过程中形成二聚体的可能,组合这六对引物于同一个PCR反应体系中,反应体系中包括ROX荧光分子内标;调整PCR反应体系,建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数和合适的PCR反应程序;PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行大菱鲆六个微卫星位点分析,相同荧光标记的产物通过片段大小进行判断,对大菱鲆不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定;
所述的六对微卫星引物序列是:
YSKr01正向序列为(5‘-3’)CGAGTCAACAGCCATCAAGC,反向序列为(5‘-3’):AGGTGGTGGACCGTTCAAGT;
YSKr02正向序列为(5‘-3’)TCGTTGCCGTAGAAACCATC,反向序列为(5‘-3’):CTGTCTGGAGCCCAAACCT;
YSKr19正向序列为(5‘-3’)TTGTGGTGCTGTGAATGTGTG,反向序列为(5‘-3’):AGTGTTATGATATGTGGAGGC;
YSKr29正向序列为(5‘-3’)GCCTTGCTGTGATTCTTTG,反向序列为(5‘-3’):AGTGCTGCTTGTCTCTTGTG;
YSKr39正向序列为(5‘-3’)GAGGGTTGTTATTGTGGAG,反向序列为(5‘-3’):GAGGACAAAGTGACGACG;
YSKr61正向序列为(5‘-3’)CACCTCACTGCCCACTGA,反向序列为(5‘-3’):TCTGGATGTTTCTCTGACTT。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009102033032A CN101638692B (zh) | 2009-05-25 | 2009-05-25 | 大菱鲆荧光标记微卫星六重pcr家系识别方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009102033032A CN101638692B (zh) | 2009-05-25 | 2009-05-25 | 大菱鲆荧光标记微卫星六重pcr家系识别方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101638692A true CN101638692A (zh) | 2010-02-03 |
CN101638692B CN101638692B (zh) | 2011-08-31 |
Family
ID=41613872
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2009102033032A Expired - Fee Related CN101638692B (zh) | 2009-05-25 | 2009-05-25 | 大菱鲆荧光标记微卫星六重pcr家系识别方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101638692B (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101880719A (zh) * | 2010-07-16 | 2010-11-10 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重pcr方法 |
CN102154500A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-08-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重pcr检测方法 |
CN103882144A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-06-25 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种大菱鲆家系育种值评估方法 |
CN104267009A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-01-07 | 北京金诺美生物技术有限公司 | 六色实时荧光定量pcr分析仪 |
-
2009
- 2009-05-25 CN CN2009102033032A patent/CN101638692B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101880719A (zh) * | 2010-07-16 | 2010-11-10 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重pcr方法 |
CN101880719B (zh) * | 2010-07-16 | 2012-09-05 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 大菱鲆亲子鉴定的微卫星多重pcr方法 |
CN102154500A (zh) * | 2011-03-25 | 2011-08-17 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重pcr检测方法 |
CN102154500B (zh) * | 2011-03-25 | 2012-10-10 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种三疣梭子蟹微卫星标记的六重pcr检测方法 |
CN103882144A (zh) * | 2014-04-14 | 2014-06-25 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种大菱鲆家系育种值评估方法 |
CN103882144B (zh) * | 2014-04-14 | 2016-01-20 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 一种大菱鲆家系育种值评估方法 |
CN104267009A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-01-07 | 北京金诺美生物技术有限公司 | 六色实时荧光定量pcr分析仪 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101638692B (zh) | 2011-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107810275A (zh) | 用于鉴定病毒性出血败血症病毒的区域特异性基因型的探针及其用途 | |
CN101638692A (zh) | 大菱鲆荧光标记微卫星六重pcr家系识别方法 | |
CN101974649A (zh) | 一种鉴别建鲤的分子标记方法 | |
CN102399776A (zh) | 中国对虾家系识别微卫星标记四重pcr引物与识别方法 | |
CN101407835B (zh) | 检测鼠李糖乳杆菌的遗传标记和方法 | |
KR101796306B1 (ko) | 말전복 탐지용 마이크로새틀라이트 마커 및 이를 이용한 말전복 탐지 방법 | |
CN107475414B (zh) | 一种筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法 | |
CN102226220A (zh) | 一种鉴别尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其杂交鱼的分子标记方法 | |
CN105803083B (zh) | 梨果实单果重主效qtl位点msf的分子标记及应用 | |
CN102321752A (zh) | 一种同时分析犬基因组dna 17个基因座的荧光标记检测试剂盒及其检测方法和应用 | |
CN101921857A (zh) | 一种中国地方黄牛Pax7基因的单核苷酸多态性的PCR-RFLP检测方法 | |
CN107760798B (zh) | 葡萄果实无核主效qtl位点的ssr分子标记 | |
CN106868198B (zh) | 一种同时检测鲇形目鱼类四种致病菌的多重pcr引物组及监测方法 | |
CN112725427B (zh) | 一种基于荧光pcr鉴定鲟鱼性别的引物、荧光探针及试剂盒 | |
US9926609B2 (en) | Compositions and methods for detection of Mycobacterium avium paratuberculosis | |
CN110747280B (zh) | 与马寒冷适应性相关的te标记及其应用 | |
CN106636427B (zh) | 一种鉴定脊尾白虾近交家系的微卫星标记引物及方法 | |
CN101705297B (zh) | 一种基于微卫星指纹图谱的湖羊和无角陶塞特羊鉴别方法 | |
KR100532592B1 (ko) | 일당증체량, 등지방두께, 등심단면적이 우수한 돼지 조기선발 분석 기법 | |
CN112522422A (zh) | 一种基于coi基因片段的飘鱼和寡鳞飘鱼的分子鉴别方法 | |
CN102978292B (zh) | 一种不基于GC夹板策略的特定18S rDNA片段的DGGE/TGGE分析方法 | |
CN104342497A (zh) | 缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法 | |
CN102758023B (zh) | 水产养殖鲇鱼杂种的ch4分子标记dgge鉴定方法 | |
KR101700622B1 (ko) | 개의 품종 식별을 위한 dna 마커 및 이를 이용한 개 품종 식별방법 | |
CN109652579A (zh) | 水稻抗稻瘟病基因Pi2的共显性分子标记及其检测方法与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C17 | Cessation of patent right | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20110831 Termination date: 20120525 |