CN107151695A - 用于检测急性心肌缺血疾病的piRNA组合及其检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测急性心肌缺血疾病的piRNA组合及其检测方法和应用，所述组合包括如SEQ ID NO：1‑4所示的4种piRNA序列中的两种或两种以上。本发明通过建立小鼠心脏急性缺血模型来研究急性心肌缺血疾病这一疾病，并通过试验证明这些piRNA能够用于区分正常人和心脏疾病患者；为找到在心肌缺血损伤和心肌梗死中起到关键调节作用的piRNA，研究他们的调控机理提供了一套完整的方法。本发明的研究方法有助于阐明急性心肌缺血疾病发病机制及为急性心肌缺血疾病的预防和诊断提供了新的思路，特别是开发piRNA作为治疗心脏疾病的药物具有重要的意义。

Description

用于检测急性心肌缺血疾病的piRNA组合及其检测方法和 应用

技术领域

本发明涉及医药生物工程领域，特别涉及一种piRNA组合及其用途，尤其涉及一种用于检测急性心肌缺血疾病的piRNA组合及其检测方法和应用。

背景技术

随着社会的进步，人们生活水平越来越高，心血管疾病的发病率逐年增加，临床流行病调查发现，其发病年龄正逐步年轻化。其中冠心病(coronary heart disease,CHD)发病急骤，预后较差。在美国，35-84岁人群中发病率男性为71‰，女性为22‰，每年有80万人发生心肌梗死，45万人再梗死。在我国虽没有欧美多见，但发病率呈逐年上升趋势。多数患者是在家中或在公共场所突发致命性心律失常或急性心肌梗死(acutemyocardialischemia，AMI)而丧生。冠心病患者常因急性心肌缺血而表现为胸痛，但实际临床中许多非心肌缺血性疾病也可表现为急性胸痛。并且早期心肌缺血如能早期发现并予以干预，能避免发生不可逆的心肌坏死，因此早期心肌缺血的诊断极为重要。但是如何从众多疑似患者中尽早鉴别出真正的急性心肌缺血患者一直是困扰急诊科和心脏科医师的重要问题。因此，对于分散在社会上的心脏病患者进行有效的早期诊断，减少CHD的院前猝死，及时发现致死性心律失常，以便及早诊断、尽早干预至关重要，也是目前国内外医学界高度重视的研究课题。

目前急性心肌缺血的诊断主要依靠以下三点：①临床表现；②心电图的特异性改变；③生化标志物的出现。在临床实践中仅凭症状很难做出最终的诊断，心电图对心肌梗死的诊断特异性高，但敏感性低，生化指标如肌钙蛋白(cardiac troponinI/T,cTnI/T)、肌红蛋白(myoglobin,Gb)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)和乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)等都在心肌发生损伤或坏死后4-6h才开始升高，对心肌缺血的早期诊断很困难，临床急需敏感的标志物，以便辅助医师在心肌缺血后发生不可逆损伤前做出早期诊断。

2006年，Aravin等人通过吸附柱方法分离出雄性小鼠睾丸中的小RNA，长度范围在24到30个核苷酸长度的位置，这些小RNA的表达特别高，由此发现了一类新的小RNA，他们根据这些小RNA与Piwi蛋白家族的成员MILI相互作用，从而被命名为Piwi相互作用RNAs(Piwi-interacting RNAs)，即piRNAs。除了特征性的长度外，这些小RNA还有许多其他特点，比如它的作用不依赖Dicer而是和Piwi蛋白结合而发挥调控作用，此外它还有自我正反馈的特点。关于Piwi蛋白在许多研究中包括斑马鱼、埃及伊蚊等不同类型的动物中发现大量的同源蛋白，并行使类似的功能。起初的研究表明这些piRNA序列主要源于转座子和重复序列元件，后来发现除外rasiRNA以外，复杂的DNA序列也可以转录出piRNA。功能上研究一直是piRNA研究中最重要的一环，由于生殖细胞RNA表达库的特异性，在小鼠、斑马鱼和果蝇中关于piRNA对于发育的影响走在了相关研究的最前列，在临床上，也开始有人试图探索piRNA和生育疾病的关系，这是piRNA功能应用前景最重要的一面。此外，参与piRNA功能的蛋白也被发现在体细胞中有调控基因表达的功能，甚至有研究表明它可能参与学习和记忆等高等生物的功能调节，最近研究毫无异议地证明piRNA对生殖支持细胞确实有影响。由于小RNA的表达可能有很强的组织和时间特异性，而piRNA和进化密切相关，所以从功能学方面进行研究，对于探索piRNA在人体生殖疾病病因与机制研究中把握组织特异性，尤其是时间表达特异性方面有很大的意义。在果蝇的卵巢，piRNA的基因定位位于端粒偏中心位置和端粒位点，这些位点和转座子高度相关。piRNA和Piwi蛋白以及Aubergine蛋白高度相关，此外，Agonaute3参与piRNA的循环，剪切点位于第10个核苷酸。“Ping-Pong”模型是现在接受的piRNA模型。小鼠的卵巢piRNA的研究基本确定了在哺乳动物中也有类似的piRNA模型。最近的研究在不同成度上揭示piRNA结合蛋白的辅助蛋白也有调节作用。

piRNA与生殖干细胞的分裂有关，Gillespie等最早在1995年对RNA调控作用的信号路径的基因突变的研究表明这种突变可以影响卵子的生成和胚胎的分化。卵巢支持细胞(nurser cell)提供卵子发育的大部分蛋白成分，同时它们本身必须保证静止状态。在果蝇胚胎发育过程中，对称的轴式发育是源于RNA的区隔(compartmentation)，这种影响从支持细胞到卵子，该区隔的控制是由细胞骨架来完成的，微管起了一个很重要的作用，它控制着体细胞和生殖细胞的转化。RNA区隔的突变对以上功能有着重要的影响。Piwi蛋白的突变可以使得干细胞分化和卵子生成终止。但是在生殖细胞中，piwi蛋白的突变可以减少干细胞的分裂能力，但是不会完全阻滞卵细胞的演进。如果突变其它的piRNA信号途径的蛋白，比如zucchini、squash也可以导致生殖细胞系分化能力的丧失，这个途径在支持细胞和生殖细胞的发育过程的意义还不很清楚。除此以外，在基因Aubergine、spindle、armitage、maelstrom等中的突变会影响细胞发育分化过程中的RNA的区隔，但是不影响卵子的发育，因此这些基因起初被看做是影响细胞前后定位的信息，后来的进一步研究表明这些基因实际是影响细胞的中轴化，这个问题是和DNA的完整化相关，并且是和转座子这一很重要的生物现象相关。piRNA和DNA损伤之间有两重关系，一种是通过Spot11核酶，另一个是通过转座子的大量表达。而转座子在哺乳动物细胞进化中扮演着最重要的作用，它和细胞的Chk2密切联系，虽然没有证据表明piRNA可以直接引起转座子的移动，但现在的研究明显提示它们之间的关系是很值得探究的。Oskar蛋白对于细胞膜极性和胚胎发育模式非常重要，piRNA的突变可以扰乱这个过程。Osk mRNA和细胞胞质环流的后极性密切相关。piRNA的突变诱导oskar蛋白在卵子发生早期过表达，Chk2不能抑制osk mRNA翻译。因此，早期的oskar蛋白不是DNA damage信号途径的结果。Oskar是一个单基因表达，而piRNA和多核糖体密切相关。

piRNA与生殖功能有关，很多的piRNA蛋白突变可以降低雄性的生育能力，被认为星状蛋白(stellate protein)的过表达有关，而星状蛋白的功能现在是未知的。而星状蛋白抑制因子(suppressor)可以在突变的情况下大量表达，piRNA的基因定位就在星状蛋白抑制因子的两侧。现在对于他们之间的关系到底是在转录还是转录后是不太明了的。星状蛋白的过表达可以直接和生育相关，其它一些基因也是这样。piRNA通路的突变对于雄性的转座子的影响是确定的。

piRNA与生殖细胞的发育有关，小鼠有三种piwi蛋白：Miwi、Miwi2和Mili(也被称作Piwil1、Piwil4和Piwil2)。这三个蛋白全部在小鼠的睾丸中高表达，并且都和生育有关。Mili和Miwi都和piRNA结合。敲除这两个基因可以阻滞piRNA的产生。仅仅这一个突变就可以导致小鼠不育。在精子的产生过程中，第一个过程是有丝分裂，第二过程是减数分裂，染色体要倍增，配对，然后分离，最后成熟。Mili和Miwi的突变不影响倍增，但是对染色体分离有着巨大的影响。Mili和Miwi2的突变对减数分裂有影响，而Miwi的突变则影响成熟。Miwi的表达贯穿生殖细胞发育的全程，而Mili则短一些，Miwi2只在成熟阶段一过性的表达。piwi蛋白中，任一个蛋白突变都会影响生殖细胞，但对于生殖细胞的支持细胞影响较小。类似的现象在生殖细胞出现联合障碍和DNA修复障碍的时候会出现。除此以外，Miwi2的突变可以导致H2AX的染色，这表明DNA断裂。所有以上的实验结果表明piRNA的相关蛋白突变都会导致DNA受损和生殖细胞的凋亡。在piRNA途径中的突变，DNA受损和转座子的大量表达相关。已有的观察表明DNA受损和转座子的移动相关。所以piRNA有使转座子沉默的作用并且能阻碍DNA受损。有意思的是，单个的蛋白突变不影响雌性的生育能力，这就意外着雌性可能有另外的一条通路，例如ago3可以影响雌性合子的倍数。

piRNA与性别决定的关系，斑马鱼有两个已知的Piwi蛋白：ziwi和zili。Ziwi和Miwi是同源的，Zili和Wili同源。只有Ziwi既在雄性中表达又在雌性中表达。Ziwi在斑马鱼中似乎兼有Ago3和Aubergine的功能，是一个胞内蛋白。Ziwi水平的降低对生殖细胞影响没有小鼠那么大，但会导致凋亡。更有意思的是Ziwi在斑马鱼中会决定性别发展方向，这表明piRNA在一些种属的动物中可能是性别决定的重要因素。

piRNA与体细胞的关系，Argonaute3对于piRNA的产生是已经被证明的，argo3通过循环方式产生大量的piRNA，但是最近的研究表明piRNA还有新的产生通路，并且是在生殖细胞旁的体细胞内，也有同样的flemco片段。

Morrow等认为反映心肌缺血的理想标志物应具备以下特点：①最重要的是灵敏度和特异性高；②心肌缺血后迅速增高；③循环中稳定性好；④24h内血中浓度恢复基础水平；⑤容易检测，可很快得到结果；⑥具有较好的分析特性(批内变异性低)。microRNA是近来研究较多的检测项目，引起临床医生的关注始于二十一世纪初期，国外一实验室在检测急性胸痛患者血清标本时，缺血病人和非缺血病人的microRNA表达水平存在差异。这一发现提示microRNA可作为急性心肌缺血诊断指标。有文献报道在脑缺血患者中发现piRNA表达的差异，但是在急性心肌缺血中关于piRNA的表达还没有相关的报道和研究。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于检测急性心肌缺血疾病的piRNA组合及其检测方法和应用，能够用于早期诊断心脏疾病，为诊断和预后心脏疾病提供了更为广泛的手段。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，本发明提供一种用于区分正常人和心脏疾病患者的piRNA组合，所述piRNA组合包括如SEQ ID NO：1-4所示的4种piRNA序列中的两种或两种以上。

优选地，所述心脏疾病为急性心肌缺血疾病。

另一方面，本发明提供一种所述的piRNA组合的检测方法，该检测方法选自反转录聚合酶链式反应方法、实时定量PCR反应方法、Northern印迹杂交方法、芯片检测方法和Solxa测序方法。

优选地，所述检测方法为反转录聚合酶链式反应方法或实时定量PCR反应方法。

另一方面，本发明提供一种用于检测本发明所述的piRNA组合的引物组合，所述引物组合包含一种或多种本发明piRNA组合中的piRNA的正向特异引物和通用引物，或所述引物组合包含如SEQ ID NO：9-12所示的核苷酸序列中的一种或多种。

优选地，所述引物组合包含两种或多种本发明piRNA组合中的piRNA的正向特异引物和通用引物，或所述引物组合包含如SEQ ID NO：9-12所示的核苷酸序列中的两种或两种以上。

还优选地，当通过实时定量PCR反应方法检测本发明所述的piRNA组合时，所述引物组合包含一种或多种本发明piRNA组合中的piRNA的正向特异引物和通用引物，所述piRNA的正向特异引物优选如SEQ ID NO：5-8所示的核苷酸序列的中一种或多种，或所述通用引物为如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，更优选地，所述引物组合包含的两种或两种以上本发明所述的piRNA的正向特异引物和通用引物。

还优选地，当通过反转录聚合酶链式反应方法检测本发明所述的piRNA组合时，所述引物组合包含如SEQ ID NO：9-12所示的核苷酸序列中的一种或多种；更优选地，所述引物组合包含如SEQ ID NO：9-12所示的核苷酸序列中的两种或两种以上。

优选地，所述引物组合中还包含内参引物，所述内参引物为如SEQ ID NO：15-16所述的核苷酸序列。

再一方面，本发明提供一种用于区分正常人和心脏疾病患者的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组合。

优选地，所述心脏疾病为急性心肌缺血疾病。

又一方面，本发明提供一种本发明所述的引物组合在制备用于区分正常人和心脏疾病患者的产品中的应用；优选地，所述产品为药物或试剂盒。

优选地，所述心脏疾病为急性心肌缺血疾病。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过建立小鼠心脏急性缺血模型来研究急性心肌缺血疾病这一疾病，并通过试验证明这些piRNA能够用于区分正常人和心脏疾病患者；为找到在心肌缺血损伤和心肌梗死中起到关键调节作用的piRNA，研究他们的调控机理提供了一套完整的方法。本发明的研究方法有助于阐明急性心肌缺血疾病发病机制及为急性心肌缺血疾病的预防和诊断提供了新的思路，特别是开发piRNA作为治疗心脏疾病的药物具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明的试验流程图；

图2为实施定量PCR法检测心肌缺血再灌小鼠模型及正常小鼠piRNA表达量的比较，其中，1为心肌缺血再灌小鼠模型及正常小鼠的心脏中SEQ ID NO:1所示的piRNA的表达，2为心肌缺血再灌小鼠模型及正常小鼠的心脏中SEQ ID NO:2所示的piRNA的表达，3为心肌缺血再灌小鼠模型及正常小鼠的心脏中SEQ ID NO:3所示的piRNA的表达，4为心肌缺血再灌小鼠模型及正常小鼠的心脏中SEQ ID NO:4所示的piRNA的表达，N表示正常小鼠的心脏，MI表示心肌缺血再灌小鼠模型的心脏，图中，纵坐标表示以正常小鼠的心脏中SEQ IDNO:1所示的piRNA的表达为基准，心肌缺血再灌小鼠模型及正常小鼠的心脏中piRNA的表达。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

除非特别指明，以下实施例中所用的小鼠均购自北京维通利华实验生物技术有限公司。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。

实施例1心肌缺血再灌小鼠模型的构建

乙醚呼吸麻醉小鼠，连接心电图机，选用标准肢体导联。对小鼠进行心电图检测，记录标Ⅱ导联心电图各1分钟(min)，有异常者弃之。选取成年健康、心电图无异常、雄性C57小鼠10只，小鼠用乙醚麻醉后，固定，沿胸骨左缘剪开皮肤，用止血钳游离小鼠左侧胸大肌，暴露第2、3、4肋后，可以清晰看到心脏的暗影，用弯头止血钳迅速沿胸骨左缘3、4肋间分开肋骨，挤出心脏，充分暴露心脏及其表面的血管，用4/0医用缝合线在冠状动脉前降支挂线，然后迅速将心脏送回胸腔，医用缝合线的两端留置体外备用。用长嘴止血钳把胸部皮肤和肌肉以及心脏挂线夹紧，防止气胸，观察心电图变化，T波高耸或者倒置为心肌缺血标志，构建成心肌缺血再灌小鼠模型。

实施例2深度测序筛选到心肌缺血再灌小鼠模型心脏中差异表达的piRNA

采用苯酚混合液(Trizol)法提取实施例1构建的心肌缺血再灌小鼠模型和正常对照小鼠(品系为C57小鼠)心脏的组织总RNA，具体步骤参照Trizol试剂操作说明进行，步骤如下：

(1)将装有Tirzol和组织样品的离心管从液氮中取出，用研磨棒反复研磨至细胞呈均匀悬浮于Trizol液体中无小块聚集；

(2)向研磨好的离心管内再加入500微升(μl)的Trizol，上下颠倒离心管数次，然后室温放置15min；

(3)于4℃，12 000转/分钟(r/min)离心15min；

(4)吸取上清至另一新的离心管中，向其中按Trizol总体积1/5的量加入氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡15秒(s)，待溶液充分乳化且无分相现象后，再于室温静置5min；

(5)于4℃，12000r/min离心15min；

(6)从离心机里轻轻取出离心管，将上清液吸取至另一新的离心管中，切勿吸取中间白色的中间层物质；

(7)加入等体积的异丙醇，充分混匀后，于室温静置10min；

(8)于4℃，12000r/min离心10min；

(9)轻轻弃去上清，缓慢加入75％预冷的乙醇lml，轻柔颠倒离心管数次，于4℃，12000r/min离心5min；

(10)小心弃去上清，再重复步骤(7)一次；

(11)弃净上清并于室温干燥2～5min；

(12)用适量的不含RNA酶(RNase)的水将沉淀溶解；

(13)将所提取的总RNA进行分装，一部分于-80℃保存备用，另一部分用于进行紫外分光光度仪测定，在波长260处吸光值在0.01以上。

将经过上述实验分离到的总RNA样品送到深圳华大基因公司进行测序。通过小RNA高通量深度测序筛选差异表达的piRNA，确定筛选的目的序列，筛选到的高表达的piRNA序列见表1：

表1心肌缺血动物模型中深度表达的piRNA

实施例3通过实时定量(real time)PCR法鉴定心肌缺血再灌小鼠模型心肌细胞中 高表达的piRNA

已报道的检测piRNA的方法包括Northern blotting，mirVanaTM miRNADetection microarray等方法，这些基于分子杂交的方法敏感性低，需要的RNA量较大。RT-PCR方法是目前检测基因表达最灵敏、可靠的方法，但piRNAs分子太小，不能采用常规的RT-PCR检测，需要特殊的设计。

我们参考了miRNAs的设计方案，并加以改进。首先在piRNAs分子反向引物3′末端加带颈环结构和目的片段3端5-6个碱基反向互补的序列作为引物进行反转录，得到约30nt的cDNA，然后用piRNA正向特异引物和反向带有部分颈环结构的引物(即通用引物，SEQ IDNO:13)进行SYBRGreen实时定量PCR扩增，具体引物如下述表7所示。我们用此方法对小鼠心肌缺血成鼠心脏的原代心肌细胞中SEQ ID NO:1-4所示的piRNA的表达量进行了检测。

具体实验方法如下：

1.小鼠心肌缺血成鼠心脏的原代心肌细胞的分离和培养

1.1.溶液配制

A、5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)(Sigma B5002)

储液(Stock)10^-2M工作浓度10^-4M将100mg 5-溴脱氧尿嘧啶溶于DMEM中，至体积32.6ml，过滤灭菌后得到10^-2M的Brdu DMEM溶液。该溶液于4℃保存备用(一般一个月内用)

B、胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠培养基补充物(Insulin-transferrin-sodiumselenite media supplement)[Sigma I-1884(1vial可配5L)]

储液(Stock)的配制：将1小瓶(vial)溶于5ml H₂O中(加入100冰醋酸)，得储液；使用时，每升DMEM/F12加入1ml储液。

C、胶原酶Ⅱ型(Collagenase TypeⅡ)(worthington Ls 041 76 1g,charge40B3800)

储存液：将100mg胶原酶Ⅱ型溶于10ml PBS中，制成100mg/10ml的溶液，过滤除菌，700μl/支分装，-20℃保存。

D、胰液素(Pancreatin)(P-3292 Sigma，25g，批号39H10945)

将3g胰液素溶于100ml三蒸水中，制成30mg/ml的溶液，再将其在1500rpm下离心5min，去上清，用双层滤纸过滤两遍，滤纸要经过高压除菌然后2ml/支分装，-20℃保存。

F、10×洗涤缓冲液(10×ADS buffer)配制500m、200ml和250ml l所需各试剂的量如下，配好后过滤除菌

G、消化时的工作液

50ml 1×ADS缓冲液+700μl胶原酶储液+2ml胰液素储液，用于原代心肌细胞的消化，每次消化约使用10-20ml。

H、明胶(Gelatin)(Sigma G-1890，A型，粉末)

将1g明胶溶于100ml三蒸水中，三蒸水的作用是使细胞易于贴壁。

I、层粘连蛋白(Laminin)(Sigma L2020)1g

用PBS溶将1g层粘连蛋白，使其终浓度为10μg/ml。

J、半完全培养基每500ml DMEM/F12培养基Gibcl21331-020

加入：15ml 100mM丙酮酸钠(Na-Pyruvat)(终浓度3.0mM),4℃(Gibco 11360-020)

5ml 200mM L-谷氨酰胺(L-Glutamin)(终浓度2.0mM)，-20℃(Gibco 25030-024)

5ml青链霉素(PenStrep aliquot)-20℃Gibco 15140-114

0.5ml 100mM抗坏血酸(Ascorbic acid)(终浓度0.1mM),-20℃(Sigma A-7506)

K、完全培养基

使用时：50ml半完全培养基+500μl Brdu(100倍的)+2.5ml马血清

L、将3.3g丙酮酸钠(Na-Pyruvat)溶于100ml完全培养基中，使其浓度为300mM丙酮酸钠(Na-Pyruvat)的储液(100×)，分子量110.05g/mol。

M、将0.18g抗坏血酸100ml完全培养基中，使浓度为100mM的储液。

N、DMEM/F12溶解时加1.2g NaHCO₃，调pH值到7.2。

2.实验步骤：

A.提前将杀鼠用的剪刀、镊子、放有小转子的三角瓶和平皿高压灭菌，各种储存液过滤或高压参考上述溶液配制中操作，开始工作前准备好消化液、洗涤缓冲液(1×ADSbuffer)、冰盒和冰台。将加热搅拌器调到37℃，并准备一个500ml烧杯，加入100ml左右的自来水，放在搅拌器上。

B.取雌雄不分的1-3天新生的SD乳鼠，20-30只，及实施例1制备的心肌缺血再灌小鼠模型10只，放入大烧杯中，用75体积％酒精洗1-2次，然后注入75体积％酒精将乳鼠淹没直至其全部淹死。

C.于灭菌超净台中用眼科剪将乳鼠开胸暴露心脏，用小弯镊取心尖大部放入盛有1×ADS缓冲液的小平皿中，并放在冰台上。

D.用镊子夹住心尖在1×ADS缓冲液中充分洗涤心脏残留的血块，并移至另一盛有1×ADS缓冲液的平皿中。

E.进一步洗净残存的血块，一般要洗3-4次。

F.用手术刀片将组织切碎(约1mm³)，加入10-15倍体积的消化液。

G.用吸管将上述含组织块的消化液转移到放有小转子的三角瓶中(50ml)，用锡箔纸封好口，放到预热的烧杯中，一起放到磁力搅拌器上消化10分钟，然后换一个烧杯，再消化10分钟。

H.取出三角瓶，静置片刻，将上清吸出，转移到一个50ml离心管中，管内加入2ml血清，以终止消化，放到冰盒中，再将三角瓶中加入新的消化液3-5ml，继续消化，方法同7、中所述，反复消化直到组织块几乎没有为止。

I.将收集的消化产物离心，800转/分钟，5min，弃上清，收集沉淀，再用DMEM/F12洗两次，然后加入一定量的含有5％马血清的DMEM/F12培养基充分重悬，260目过滤网过滤，将液体收集到平皿中。

J.分装到易贴壁的培养皿或细胞瓶中进行差速贴壁1-1.5小时，由于心肌纤维细胞易贴壁，心肌细胞在如此短的时间内不能贴壁，所以此方法可以起到浓缩心肌细胞的作用，同时通过贴壁收集大量心肌纤维细胞。

K.然后小心吸出悬浮的细胞悬液，加入Brdu使终浓度为10^-4M，以抑制非心肌细胞的增殖，细胞浓度调到0.5～1×10⁵/ml，24孔板，每孔加入1ml，6孔板，每孔加入3ml，放入二氧化氮培养箱中培养。

L.次日换成无血清的培养基，并用1×ADS缓冲液洗一次，以去除血细胞或死细胞，换液24小时后，就可得到用于进行实验的正常小鼠和心肌缺血再灌小鼠模型的原代心肌细胞。

3.RNA逆转录-Oligo dT 15法RNA逆转录

(1)逆转录反应体系

表2

共20μl体系

(2)逆转录程序

温浴：于25℃反应10min，再于37℃反应1h，然后于4℃保温。

加入5μl 1.5M NaOH终止逆转录反应，70℃10min；

加入1μl 10N乙酸中和；

加灭菌水至50μl；

4℃低温保存。

4.实时定量(RealTime)RT-PCR反应(内参u6，其序列为：

5′-gtgctcgctt cggcagcaca tatactaaaa ttggaacgat acagagaaga ttagcatggcccctgcgcaa ggatgacacg caaattcgtg aagcgttcca tattttt-3′(SEQ ID NO:14))

表3实时定量(RealTime)RT-PCR反应体系

表4实时定量RT-PCR程序

表5所用试剂

表6所用仪器

表7引物

上述RT-P.no1-RT-P.no4中加粗斜体的序列为颈环结构的序列，其中加下划线的部分为loop-R的序列，即部分颈环结构的序列，其余部分为目的片段即piRNA的3端5-6个碱基反向互补的序列。并且，上述引物均由上海Invitrogen生物公司合成，具有特异性。

实验结果如图2所示，发现在心肌缺血再灌小鼠模型的原代心肌细胞中的piRNAs的表达明显高于正常小鼠的原代心肌细胞中piRNAs的表达。

实施例4通过实时定量PCR法鉴定心肌缺血患者血液中piRNA表达的差异

本研究选择经皮冠状动脉内介入治疗术(PCI术)的冠心病患者，观察其经PCI术中球囊扩张造成短暂心肌缺血后的和小鼠piRNA高表达同源性较高piRNA的动态变化，评价对诊断急性心肌缺血的敏感性。

一材料

1.正常对照组：30例，男性16例，女性14例，年龄42-75岁，来自北京大学附属第一医院健康体检人群，肝、肾功能均正常，血清白蛋白值在正常范围内，既往无心脏疾病史，无肝、肾、脑、肺等功能障碍及外周血管病变史，无恶性肿瘤和自身免疫性疾病。

2.PCI组：46例，男性34例，女性12例，年龄34-81岁，来自北京大学附属第一医院心内科住院确诊为冠心病并行择期PCI术的病人。入院后常规予冠心病的规范化治疗。这些患者同时符合以下条件:①心肌梗死距进入研究的时间必须大于2周；②术前3天内无心绞痛、恶性心律失常发作；③术前无心肌损伤标志物升高；④术前3周内心力衰竭无发作；⑤无心肌炎及心肌病病史；⑥无发热，急、慢性感染，恶性肿瘤及自身免疫性疾病；⑦无肝、肾、脑、肺等功能障碍及外周血管病变史；⑧除冠状动脉造影术(CAG)/PCI术外，近3周内无任何外伤及其他有创性操作；⑨血清白蛋白值在正常范围内。

二研究方法

PCI组患者于球囊扩张前、最后一次球囊扩张后5分钟、2小时、6小时测定piRNA，正常对照患者均来自医院且有典型症状时抽血测定piRNA。

1.血液样本采集

(1)在由患者签订了知情同意书之后，PCI组患者分别于球囊扩张前、最后一次球囊扩张后5分钟、2小时、6小时自外周静脉抽取5毫升血液，正常对照症患者均于来医院且有典型症状时抽取5毫升外周静脉血，均置于硅胶管(不含任何抗凝剂、防腐剂)内。将标本保存于-200℃的冰箱。

(2)用冻存标本测定时，先在冷藏温度(2-8℃)或室温(18-27℃)下使标本融化，低速振荡或轻柔颠倒混匀后测定，此方法处理的冻存标本测定结果与新鲜标本无显著差异。标本自冰箱取出至测定完成时间不超过1.5小时。

2.piRNA的检测

piRNA(SEQ ID NO:2：

UAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAAGG)的检测方法同实施例3。

三实验结果

PCI组各时段piRNA值的比较

术前、术后5分钟、术后2小时、术后6小时piRNA(SEQ ID NO:2：UAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAAGG)表达量。

用单因素方差分析比较，P<0.001，各组间差别有统计学意义。用SNK法进行两两比较，术后5分钟(76.966±5.402μg/mL)、术后2小时(77.349±5.571μg/mL)与术前(67.235±6.060μg/mL)及术后6小时的值(69.344±5.217μg/mL)比较均明显升高，且差别有统计学意义(P值均<0.001)，术后2小时piRNA值(77.349±5.571μg/mL)较术后5分钟(76.966±5.402μg/mL)亦增高，但两者差异无统计学意义(P＝0.742>0.05)，术后6小时IMA(缺血修饰白蛋白)值(69.344±5.217U/mL)较术前仍有升高(67.235±6.060μg/mL)，但两者差别无统计学意义(P＝0.069>0.05)。

结果分析

采用SPSS10.0进行统计学分析。连续变量服从正态分布的以均数±标准差表示，方差齐者两样本均数比较采用t检验，多个样本均数比较采用方差分析。计数资料采用χ2检验，配对计数资料采用配对χ2检验显著性水平设为α＝0.05。

本研究以择期行经皮冠状动脉内介入治疗术(PCI术)的冠心病患者为研究对象，观察了PCI术中球囊扩张时短暂阻断血流后引起短暂心肌缺血前后piRNA(SEQ ID NO:2，UAAACAAAUAAUCUGCGCAUGUGCCAAGG)的动态变化，研究确定了该piRNA表达量对诊断急性心肌缺血的敏感性，对全面评价piRNA对诊断急性心肌缺血的价值和意义。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种用于检测急性心肌缺血疾病的piRNA组合，所述piRNA组合包含SEQ ID NO：1-4所示的4种piRNA序列中的两种或两种以上。

2.根据权利要求1所述的piRNA组合的检测方法，其特征在于，所述检测方法选自反转录聚合酶链式反应方法、实时定量PCR反应方法、Northern印迹杂交方法、芯片检测方法和Solxa测序方法。

3.根据权利要求2所述的piRNA组合的检测方法，其特征在于，所述检测方法为反转录聚合酶链式反应方法或实时定量PCR反应方法。

4.一种用于检测权利要求1所述的piRNA组合的引物组合，所述引物组合包含SEQ IDNO：9-12所示的核苷酸序列的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的引物组合，其特征在于，当通过实时定量PCR反应方法检测权利要求1所述的piRNA组合时，所述piRNA的正向特异引物为SEQ ID NO：5-8所示的核苷酸序列中的一种或多种，或所述通用引物为SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的引物组合，其特征在于，当通过反转录聚合酶链式反应方法检测权利要求1所述的piRNA组合时，所述引物组合包含如SEQ ID NO：9-12所示的核苷酸序列中的一种或多种。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合中还包含内参引物，所述内参引物序列如SEQ ID NO：15-16所示。

8.一种区分正常人和急性心肌缺血患者的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求4至7中任一项所述的引物组合。

9.根据权利要求4至7中任一项所述的引物组合在制备用于区分正常人心脏疾病患者的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述产品为药物或试剂盒。