CN103370424A - 作为心脏状况药物功效的替代标志物的血载miRNA - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于评估或监测对于治疗心脏病症的治疗性干预的功效的方法。这类方法包括测量或检测至少一种来自接受治疗性干预的患者的生物学样品中的miRNA的水平，并将该水平与在对照样品中的所述至少一种miRNA的水平对比，其中所述至少一种miRNA的测得的水平指示治疗性干预的治疗功效。还公开了通过测量来自患者的生物学样品中的一种或多种miRNA以预测或评价患者中的心力衰竭的严重性或进展的方法。

Description

作为心脏状况药物功效的替代标志物的血载miRNA

优先权

本发明要求2011年9月23日提交的美国临时申请号61/538,585、2011年6月9日提交的美国临时申请号61/495,220、以及2010年12月15日提交的美国临时申请号61/423,456的优先权，通过对其每一个的提述将其全文并入本文。

发明领域

本发明涉及用于评估或检测对心脏病症的治疗性干预的功效，或用于评价患者中的心力衰竭的疾病进展的严重性的水平的微RNA检测。本发明进一步涉及治疗患者的心脏病症。

发明背景

现在的对心脏病症，包括心力衰竭的治疗，包括药理学方法、心室辅助装置(ventricular assist device，VAD)等装置、心脏再同步化治疗(cardiacresynchronization therapy，CRT)、以及心脏移植。药理学方法可以包括但不限于正性肌力药(inotropic agents)(即，提高心脏收缩性的化合物)、神经体液阻滞剂(neurohumoral blockers)(例如，beta-阻滞剂、血管紧张素(angiotensin)转化酶抑制剂)、醛固酮拮抗剂(aldosterone antagonists)、利尿剂(diuretics)、和血管扩张药(vasodilators)。然而，这些药物无论是单独还是组合都不是完全有效的。移植体的可得性高度受限，并且由于许多患有心力衰竭的个体健康状况很差，他们往往不是好的外科手术候选者。由于这些原因，心力衰竭依然是主要的致病和致亡原因，尤其是在发达国家。除此之外，心力衰竭的病因可能很难确定，这是阻碍更加特异性的治疗的开发的一个因素。而且，普遍缺乏分子水平的诊断技术。因此，本领域内需要发现其它的诊断标志物，来帮助评估心力衰竭的严重性和其对治疗的反应(包括现有的和尚未得到描述的)。本发明试图解决前述的需求，以及其他需求。

微RNA(miRNA、微小RNA或miR)是一类调控性RNA，其转录后调控基因表达。miRNA是进化保守的、大约18到25个核苷酸长的小型非编码RNA分子。miRNA与特异性“靶物”mRNA碱基配对并通过此抑制翻译或促进mRNA降解(Bartel,Cell,116,281-297(2004))。miRNA在序列与靶mRNA完美互补时促进其的降解，或在序列含有错配时抑制翻译。

已发现微RNA涉及多数生物学过程，包括心脏功能的调控与维持(见EvaVan Rooij和Eric Olson,microRNAs:Powerful new regulators of heart diseaseand proactive therapeutic targets,J.Clin.Invest.117(9):2369-2376(2007);和Chien KR,Molecular Medicine:microRNAs and the tell-tale heart,Nature447,389-390(2007))。也报道miRNA参与器官的发育(Ambros,Cell 113:673-676)并在多数器官中差异表达(Xu等,2003Curr.Biol.13:790-795;Landgraf et al.,2007Cell129:1401-14)、参与在病毒感染过程中(Pfeffer等,2004Science304:734-736)、并与肿瘤形成相关联(Calin等,2004Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:2999-3004;Calin等,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(24):15524-15529)。因此，对于心脏肥大、心肌梗死、心力衰竭、血管损坏、和病理性心脏纤维化等状况而言，miR是一类相对较新的治疗靶物。本发明部分基于以下令人惊讶的发现：miRNA的检测可以用于评估和检测心脏病症的治疗的治疗功效，以及用于指导治疗决策。

发明概述

本发明提供了用于评估或监测治疗心脏病症的治疗性干预的功效的方法。这类方法包括测量或检测来自接受治疗性干预的患者的生物学样品中的至少一种miRNA(或检测一组miRNA)的水平。在一些实施方案中，将所述生物学样品中的至少一种miRNA的水平与参考水平对比，或与对照样品中的至少一种miRNA的测得的水平对比。所述至少一种miRNA的测得的水平指示治疗性干预的治疗功效。在一些情况中，miRNA的水平的提高或降低指示治疗性干预的功效。在一些实施方案中，所述至少一种miRNA选自在表2-4中任一个中列出的miRNA。在一些实施方案中，测量来自表2-4中的多种miRNA，并与参考水平或对照样品中的水平比较，以评价或检测疗法。在测定患者样品中的一组miRNA的情况下，可以基于分类算法将患者样品分类为指示有效的干预或非有效的干预。在一些实施方案中，所述治疗性干预是靶向miR-208a和/或miR-208b的化学修饰的反义寡核苷酸，或标准护理治疗，如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂。基于测量的miRNA水平，可以继续或改变疗法，例如，通过改变剂量或给药频率、或通过添加其它的活性剂、或完全改变治疗方案。

在一些实施方案中，测得的所述至少一种miRNA的水平相对于在治疗之前或治疗方案中早先自患者取得的样品的改变指示治疗性干预的治疗功效。

在一些实施方案中，所述心脏病症是心肌梗死，病理性心脏肥大、心力衰竭、或高血压。

本发明还提供了用于改变治疗实体的治疗方案的方法，其包括检查来自接受治疗性干预的患者的生物学样品中的至少一种miRNA的水平，并根据所述生物学样品中至少一种miRNA的水平的提高或降低改变治疗方案。

本发明进一步提供了为评估或监测用于治疗心脏病症的治疗性干预的功效提供有用信息的方法，所述方法包括测定患者的生物学样品中的至少一种miRNA的水平，并将所述至少一种miRNA的水平提供给根据所述至少一种miRN的水平的提高或降低提供关于功效的判断的实体。

本发明还包括用于预测或评价患者中心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平的方法。在一个实施方案中，所述方法包含测量来自患者的生物学样品中的选自表1的至少一种miRNA的水平；并将测得的水平与参考水平或对照样品中的所述至少一种miRNA的水平比较，其中所述至少一种miRNA的测得的水平指示患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。在一些实施方案中，所述miRNA水平的提高或降低指示患者中心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

在另一些方面，本发明提供了用于治疗患者的心力衰竭的方法，所述患者具有升高水平的miR-223、miR-16、miR-93、miR-106(b)、和/或miR-423-5p中的一种或多种(例如，血清或血浆水平)，或表1中列出的上调的或下调的标志物的其它组合(例如，至少两种的组合)。根据该方面，以常规疗法(如ACE抑制剂)、或以本文描述的抗-miR治疗策略(例如，抗-miR-208(b))治疗心力衰竭。miR-223、miR-16、miR-93、miR-106(b)和/或miR-423-5p的水平可以在治疗之前测定，和/或在治疗期间测定以监测治疗方案的功效。在一些实施方案中，所述治疗是抗-miR-208(b)，并且在治疗期间监测miR-19(b)的水平或在表2-4中的一或多个表中列出的标志物的组合的水平。

本发明的另一个方面是试剂盒，其含有用于测量生物学样品中至少一种miRNA的试剂、用于测量至少一种miRNA的说明书、和用于基于所述至少一种miRNA的水平而评估或监测用于治疗患者中的心脏病症的治疗性干预的功效的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒含有用于测量两种到大约二十种人miRNA的试剂，所述人miRNA包括来自表2-4的至少一种、两种、三种、或更多种。用于评价或预测受试者中心力衰竭的进展的严重性的试剂盒可以包含用于测量生物学样品中的至少一种miRNA的试剂、并且关于基于所述至少一种miRNA的水平评价心力衰竭的严重性或进展的说明书也包含在本发明中。在一些实施方案中，所述试剂盒包含用于反转录本文描述的一种或多种miRNA、扩增本文描述的一种或多种miRNA、和/或与本文描述的一种或多种miRNA杂交的miRNA特异性引物和/或探针。这类试剂盒可以进一步包含一种或多种标准化对照和/或特异于试剂盒中每种miRNA的TaqMan探针。

附图简述

图1.miRNA-208a的治疗性沉默在心力衰竭期间是有益的。A.在Dahl高血压大鼠模型中的Kaplan-Meier存活曲线显示，HS/盐水和HS/对照组响应于8%高盐(HS)饮食生存率显著降低，而该降低响应于抗miR-208a处理被显著地改善。自HS饮食1周后开始对大鼠给药，每2周25mg/kg。B.体重分析指示了接受8%HS饮食的Dahl高血压大鼠相比于接受低盐(LS)饮食的动物展示了降低的体重增益(weight gain)，而HS/抗miR-208a-处理的大鼠显示了体重增益的维持显著更好。对于A和B，对于LS/盐水n=6；对于HS/盐水和HS/对照n=15；和对于HS/抗miR-208a n=14。图上的“n”代表了在饮食后第八周剩余的总存活者。C.接受4%HS饮食的Dahl大鼠的体重分析显示了相比于LS饮食对照的体重增益的显著的降低，而每两周5和25mg/kg的注射足以维持与普通饮食的动物可比的体重增益。D.超声心动图显像(echocardiography)测量指示，响应于4%HS饮食的等容舒张时间(isovolumic relaxation time，IVRT)的提高和二尖瓣早期与主动充盈率比值(mitral valve early to activefilling velocity ratio，MV E/A)的降低响应所述饮食开始后8周的抗miR-208a处理显著地改善了。对于C和D，对所有的组n=10。E.苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，H&E)和苦味酸天狼猩红(Picrosirius Red)染色的左心室组织切片的代表图指示响应于4%HS饮食8周的心肌细胞肥大和血管周围纤维化（perivascular fibrosis），而这两个参数都响应于抗miR-208a处理降低了。F.组织学定量的柱状图示显示，在抗miR-208a的存在下肥大和纤维化显著更少。在D和F中，误差棒描述SEM，*p<0.05相对于HS盐水,#p<0.05相对于LS盐水。

图2.抗miR-208a处理在Dahl盐敏感性大鼠中降低了miR-499和Myh7。所有分析均在4%高盐(HS)饮食开始8周后，以及抗miR处理开始7周后进行(对于所有A和C中的组n=10)。在B和D中，每条电泳道是来自n=10的组中的一只代表性的动物。从HS饮食后1周开始，每2周对大鼠给药25mg/kg(对照)或标示剂量的抗-miR-208a。图上的红线分隔各组。A.实时PCR分析指示了在左心室(LV)中和右心室中(RV)的miR-208a剂量依赖性的减少，其对应于miR-499的剂量依赖性减少。虽然miR-208b响应于HS饮食提高了，但抗miR-208a显著地钝化了该响应。施用乱序的对照化合物对miR-208a、miR-499或miR208b的表达没有影响。B.Northern印迹法分析显示的响应于抗miR-208a处理的miR-499和miR-208b调控。C.实时PCR分析显示了HS饮食可减少Myh6和提高Myh7。抗miR-208a处理剂量依赖性地增加Myh6表达并降低Myh7b表达。抗miR-208a剂量依赖性地降低HS饮食诱导的Myh7的提高。D.对来自心室组织的Myh7的Western印迹法分析确认了响应于抗miR-208a处理的剂量依赖性的降低。使用GAPDH作为加载对照。E.对HP1β的Western印迹的定量显示了在抗-miR-208a的存在下miR-208a靶物的去阻遏。在A和C中，误差棒描述了SEM，*p<0.05对HS盐水,#p<0.05对LS盐水。

图3.血浆中的miR-499作为抗miR-208a功效的生物标志物。A.对血浆样品的实时PCR分析指示了响应高盐(HS)饮食的miR-499提高，而在4%HS饮食开始后8周和抗miR处理开始后7周，抗miR-208a显著地降低了血浆中miR-499在血浆中的检出。B.进一步的miRNA分析还指示响应于抗miR-208a的血浆中的可检测的miR-423-5p的降低。从血浆样品中使用带糖原辅助RNA沉淀(Invitrogen)的Trizol-LS分离RNA，并使用来自Applied Biosystems的商业miRNA Taqman测定法进行RT-PCR。在RNA纯化之前，将5fmol的合成秀丽隐杆线虫lin-4和miR-2添加至样品，并将血浆miRNA值相对于合成输入序列的平均回收标准化。*P<0.05对HS盐水(每组n=10)。

图4.Dahl盐敏感性大鼠的食物摄取。基于摄入的饮食的量，在处理组之间没有显著的差异，从而排除了在Dahl高血压大鼠中体重增益和健康状况的差异是由于摄入HS饮食所致的可能性。显示了第4周(A)、第5周(B)、第6周(C)、和第7周(D)。

图5.肌肉特异性miRNA的血浆检测。miR-208a(A)和miR-1(B)，两周肌肉-特异性miRNA的血浆检测，揭示了在Dahl高血压大鼠中这些miRNA不显示响应抗miR-208a处理。

图6.在抗miR处理之后展现分子功效的心脏组织标志物。所有分析都是在4%高盐(HS)饮食开始后8周和抗miR处理后7周进行的。A.在标示的组中对心脏组织中的miR-208a的实时PCR分析。B.实时PCR分析显示了HS饮食降低了Myh6表达，且抗miR-208a处理防止了该降低。用对照寡核苷酸处理对HS饮食诱导的Myh6表达的降低没有效果。C.实时PCR分析显示了HS饮食可提高Myh7表达，且用抗miR-208a寡核苷酸处理可降低该提高。

图7.时间过程数据，显示了在具有高血压诱导的心力衰竭并以抗miR-208a寡核苷酸(10101)、对照寡核苷酸(10591)或盐水处理的大鼠中，随疾病进展的由实时PCR所测量的miR-16(A)、miR-19b(B)、miR-423-5p(C)、和miR-499(D)的血浆miRNA水平。

图8.描绘对于每一个标示的处理组，体重相对于接受高盐饮食的周数的线图。A图显示了对于所有处理组的体重随时间的变化，而B图显示了处理组的一个子集。#指示由ANOVA确定的p≤0.05的显著性。体重图是通过将在研究结束前死亡的大鼠的最终体重结转而生成的。

图9.抗miR-208a处理在接受高盐饮食的Dahl盐敏感大鼠中改善了存活率。在暴露于标示的处理的Dahl高血压大鼠模型中的Kaplan-Meier存活曲线。对于HS/盐水和HS/1.5mg/kg卡托普利组，响应于6%高盐(HS)饮食均观察到了明显的生存率降低，而该降低响应于抗miR-208a(M-10101)处理得到了显著的改善。在低盐(LS)对照或HS/M-10101处理的大鼠中没有观察到死亡。*p<0.05相对于单独M-10101。

图10.标示的处理组中大鼠的心脏组织中的miR-208a(A)、miR-499(B)、和miR-208b(C)的实时PCR分析。#p<0.05相对于LS/盐水,*p<0.05相对于HS/盐水。

图11.标示的处理组中的大鼠心脏组织中的αMHC(Myh6,A)、Myh7b(B)、和βMHC(Myh7,C)的实时PCR分析。#p<0.05相对于LS/盐水,*p<0.05相对于HS/盐水。

图12.标示的处理组中的大鼠中心脏组织中的miR-208的直接靶基因Dynlt1(A)、Vcpip(B)、和Tegt(C)的实时PCR分析。#p<0.05相对于LS/盐水,*p<0.05相对于HS/盐水。

图13.标示的处理组中的大鼠中的miR-423-5p(A)、miR-106b(B)、miR-16(C)、miR-92a(D)、miR-378(E)、miR-210(F)、miR-378*(G)、miR-20b(H)、和miR-93(I)的血浆水平的实时PCR分析。这些miRNA的血浆水平与抗miR-208a和卡托普利处理的功效相关。

图14.标示的处理组中的大鼠中的miR-19b(A)、miR-223(B)、miR-21(C)、和miR-150(D)的血浆水平的实时PCR分析。miR-19b和miR-223的血浆水平似乎与抗miR-208a寡核苷酸治疗的功效相关，而miR-21和miR-150的血浆水平似乎出与卡托普利治疗的功效相关。

发明详述

本发明的方法部分地基于以下令人吃惊的发现：可以将一种或多种miRNA的水平用于作为对心脏病症的治疗性干预的治疗功效的指示，或将其用于评价心脏病症(，例如心力衰竭，)的严重性或疾病进展。在一些实施方案中，本发明提供了用于评估和/或监测用于治疗心脏病症的治疗性干预的功效的方法。这些方法可以包括以下步骤：测量来自接受治疗性干预的患者的生物学样品中的至少一种miRNA的水平，和将测得的水平与参考水平或在对照样品中的至少一种miRNA的水平比较。所述至少一种miRNA的测得的水平指示治疗的治疗功效。在一些实施方案中，该方法进一步包含基于测得的所述生物学样品中的至少一种miRNA的水平对治疗性干预进行改变。

相应地，本发明的方法的一个方面是为测量或检测生物学样品中的至少一种miRNA的水平提供条件。在一些实施方案中，其水平被测量或检测的微RNA是内含子植入miRNA(intron-embedded miRNA)。在一些实施方案中，其水平被测量或检测的微RNA是在心脏组织中表达的。在特定的实施方案中，其水平被测量或检测的微RNA选自表1-4任一个中列出的微RNA。在某些实施方案中，测量选自表2-4的任一个表中的一组微RNA中的每种微RNA的水平。例如，在该方法的一些实施方案中，测量选自表1-4中一个或多个表的两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、十种或更多种、十五种或更多种、二十种或跟多种、二十五种或更多种、三十种或更多种、三十五种或跟多种、四十种或更多种、五十种或更多种、六十种或更多种、七十种或更多种、八十种或更多种、或者九十种或更多种微RNA。在特定的实施方案中，测量选自表4的一种或多种微RNA或一组微RNA。

在一些实施方案中，测试一组少于二十种、少于十五种、少于十种、或少于五种miRNA，所述组包括选自表1-4中任一个表的一种、两种、三种、四种、或五种miRNA。在怀疑患者有心力衰竭、和/或怀疑患者需要治疗的情况下，所述组可以包含表1中列出的miRNA。在患者正在接受对心力衰竭的治疗的情况下，所述组可以包含选自表2、3、或4的miRNA。

可以以任何本领域技术人员所知晓的方式测量或检测样品中的微RNA的量，这类用于测量或检测miRNA的水平的技术是为人所熟知的并可以容易地使用。已经描述了多种用于检测miRNA的方法，包括Northern印迹法、微阵列、电化学方法(氧化miRNA连接的纳米颗粒)、生物发光、生物发光蛋白重组装、基于BRET(生物发光共振能量转移bioluminescence resonance energytransfer)、RT-PCR、荧光相关光谱和表面增强拉曼光谱(见，例如，Cissell,K.A.和Deo,S.K.,Trends in microRNA detection,Anal.Bioanal.Chem.,394:1109-1116(2009)；通过对其的提述将其全文并入本文)。

还有可商购的试剂盒，如可从美国Ambion获得的qRT-PCR miRNA检测试剂盒，其可以用于使用定量反转录聚合酶链式反应检测和定量微RNA。TaqMan microRNA测定法，其使用靶物特异性茎-环反转录引物以补偿成熟miRNA的较短的长度，也可从Applied Biosystems (Life Technologies,Inc.，美国)获得。也可以使用qSTAR microRNA 测定法，其可从OriGene,Inc.(美国)商购。

其它的可商购的试剂盒，如PAXgene血液miRNA试剂盒(其使用基于二氧化硅的RNA纯化技术，可以从美国Qiagen获得)，可以用来分离18个核苷酸或更长的miRNA。miScript PCR系统，一种将miRNA和mRNA转化为cDNA并允许使用基于SYBR Green的实时PCR以检测miRNA的三组分系统，可以用于仅从单一样品中定量成熟miRNA、前体miRNA、和mRNA(其也可以从美国Qiagen获得)。GeneCopoeia有商品化试剂盒，其基于与SYBR Green组合的RT-PCR来定量miRNA (All-in-One^TM miRNA qRT-PCR检测试剂盒，其可从美国GeneCopoeia,Inc.获得)。可从Life Technologies,Inc.(美国)获得的mirVANA，使用基于玻璃纤维过滤(glass fiber filter，GFF)的方法以分离小RNA。

用于检测miRNA的方法还可以包括基于杂交技术的平台(hybridization-based technology platforms)和大规模并行下一代小RNA测序(massively-parallel next generation small RNA sequencing)，其允许同时检测多种微RNA。一种可商购的基于杂交的技术利用带有由标记的支链DNA提供的信号增强的夹心杂交测定法(Panomics)。另一种基于杂交的技术可以从Nanostring Technology获得(nCounter miRNA Expression Assay)，其中以荧光标记的序列标签检测和分辨多种miRNA序列。下一代测序的例子可以从LifeTechnologies(SOLiD平台)和Illumina,Inc.获得。

还可以由本技术描述的用于分离小RNA分子的方法(见，例如，美国专利公开号20100291580、美国专利公开号20100222564、美国专利公开号20060019258、美国专利公开号20110054009和美国专利公开号20090023149；通过对它们的提述将它们全部整体并入本文)分离miRNA。

其它用于从样品中分离miRNA的方法包括使用包括以下步骤的方法：a)获得有miRNA的样品；b)向样品添加提取溶液；c)向提取的样品中添加醇溶液;d)将样品施加到矿物或聚合物载体；e)以离子溶液从矿物或聚合物载体洗脱含有miRNA的RNA。其它的用于从样品中分离miRNA分子的程序可以牵涉：a)向样品添加醇溶液；b)将样品施加到矿物或聚合物载体；c)以离子溶液从所述载体洗脱miRNA分子；和，d)使用或表征所述miRNA分子(见，美国专利公开号20100222564；通过对其的提述将全文并入本文)。

还可以通过牵涉从mRNA中分离miRNA的方法分离miRNA，如那些在美国专利公开号20060019258中所描述的；通过对其的提述将其全文并入本文。这些方法包含步骤a)提供包含具有5’帽结构的mRNA和具有5’磷酸的小RNA的生物学分离物；b)使所述分离物与具有标记部分的磷酸反应性试剂在标记部分优先添加到5’磷酸而非5’帽结构的条件下接触，由此产生标记的小RNA；以及c)根据标记的存在将小RNA与mRNA区分。

分离和/或定量微RNA的方法的例子也可以包括但不限于使微RNA的至少一部分与荧光核酸(荧光探针)杂交，并使杂交的微RNA与荧光试剂反应，其中杂交的微RNA发射荧光；或使微RNA的至少一部分与放射性标记的互补核酸杂交。有可商购的用于miRNA的荧光标记和检测的产品。NCode miRNA Rapid Labeling System和NCode Rapid Alexa Fluor3miRNALabeling System都可以从Life Technologies,Inc.(美国)商购。另外，荧光标记物是可商购的，可以包括分子探针Alexa Flour染料，其可从LifeTechnologies,Inc.获得，其包括Alexa Fluor3、Alexa Fluor5、Alexa Fluor350、Alexa Fluor405、Alexa Fluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor500、Alexa Fluor514、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor555、AlexaFluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor610、Alexa Fluor633、Alexa Fluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、Alexa Fluor700、和Alexa Fluor750。发光探针Cy染料，包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7。DyLight荧光团，可以从ThermoScientific(美国)获得，包括DyLight350、DyLight405、DyLight488、DyLight550、DyLight594、DyLight633、DyLight650、DyLight680、DyLight750和DyLight800。Fluoprobes包括FluoProbes390、FluoProbes488、FluoProbes532、FluoProbes547H、FluoProbes594、FluoProbes647H、FluoProbes682、FluoProbes752和FluoProbes782。

还可以使用锁定核酸探针。例如，miRCURY LNA微RNA ISHOptimization Kits(FFPE)为微RNA的检测提供条件。该试剂盒使用双DIG*-标志物的miRCURY LNA^TM微RNA探测，其可以用于原位杂交并可从Exiqon(美国和丹麦)商购。

在一些实施方案中，用于检测miRNA的探针可以包括单链分子，其包括单链脱氧核糖核酸分子、单链核糖核酸分子、单链肽核酸(PNA)、或单链锁定核苷酸(LNA)。在一些实施方案中，所述的探针是基本上互补的，例如与要检测的miRNA的互补序列80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%，或100%相同，使得该探针能够检测miRNA。在一些实施方案中，所述探针是基本上与所述miRNA相同的，例如80%、85%、90%、95%,96%、97%、98%、99%、或100%相同，使得探针能够检测所述miRNA的互补物。在一些情况中所述探针是至少5个核苷酸、至少10个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸、或至少40个核苷酸。在一些情况中，所述探针的长度可以不长于25个核苷酸、不长于35个核苷酸、不长于50个核苷酸、不长于75个核苷酸、不长于100个核苷酸、或不长于125个核苷酸。在一些实施方案中，所述探针与miRNA的至少5个连续的核苷酸，例如至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21和22个，或更多个连续的核苷酸基本上互补或者基本上相同。在一些实施方案中，所述探针可以是5-20、5-25、5-50、50-100、或超过100个连续的核苷酸长。

在一些优选的实施方案中，用于检测miRNA的方法包括实时PCR、miRNA Taqman阵列卡、和Northern印迹法分析。在一些实施方案中，检测的miRNA包括hsa-miR-542-3p、hsa-miR-185、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-20b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-451、hsa-miR-140-5p、hsa-miR-93、hsa-miR-27a、hsa-miR-365、hsa-miR-148a、hsa-miR-20a、hsa-miR-133a、hsa-miR-106b、hsa-miR-16、hsa-miR-18a、hsa-miR-26b、hsa-miR-192、hsa-miR-320a、hsa-miR-223、hsa-miR-744、hsa-miR-301a、hsa-miR-188-5p、hsa-miR-195、hsa-miR-122、hsa-miR-197、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-484、hsa-miR-184、hsa-miR-17、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-182、hsa-miR-181c、hsa-miR-29c、hsa-miR-25、hsa-miR-218、hsa-miR-30a、hsa-miR-30b、hsa-miR-92a、hsa-miR-340-5p、hsa-miR-27b、hsa-miR-24、hsa-miR-103a、hsa-miR-203、hsa-miR-222、hsa-miR-101a、hsa-let-7b、hsa-miR-335-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-196b、hsa-miR-143、hsa-miR-28、hsa-miR-107、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-19b、hsa-miR-199a-3p、hsa-let-7g、hsa-miR-181a、hsa-miR-449a、hsa-miR-29b、hsa-miR-487b、hsa-miR-99b、hsa-miR-130a、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-339-5p、hsa-miR-302a、hsa-miR-145、hsa-miR-152、hsa-miR-126-5p(miR-126*)、hsa-miR-142-5p、hsa-let-7d、hsa-miR-19a、hsa-miR-340-3p、hsa-miR-186、hsa-miR-128a、hsa-miR-155、hsa-miR-532-3p、hsa-let-7e、hsa-miR-187、hsa-miR-214、hsa-let-7c、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-31、hsa-miR-26a、hsa-miR-30c、hsa-miR-375、hsa-miR-29a、hsa-miR-30d、hsa-miR-126、hsa-miR-130b、hsa-miR-191、hsa-miR-146a、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-138、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-30e、或其组合。在其它的实施方案中，检测的miRNA包括hsa-miR-16、hsa-miR-320、hsa-miR-223、hsa-miR-93、hsa-miR-106b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185、hsa-miR-92a、hsa-miR-210、hsa-miR-140、hsa-miR-27a、hsa-miR-20b、hsa-miR-150、hsa-miR-20a、hsa-miR-378、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-378*、hsa-miR-122、hsa-miR-126、hsa-miR-133a、hsa-miR-499、hsa-miR-19b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-145、hsa-miR-195、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-214、或其组合。在另外的其它实施方案中，检测的miRNA包括miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、miR-93、miR-19b、miR-223、miR-21、miR-150、或其组合。

为了将其用作对心脏病症的治疗性干预的治疗功效的指示物，必须测定miRNA的水平。可以将在患者样品中的微RNA的量与有心脏病症(例如，心力衰竭)的患者中存在的微RNA的量或是健康人群中存在的微RNA的量(例如，任一者均可称为参考水平)进行比较。在其它实施方案中，将所述水平与对照样品中(不是来自心脏病症受试者的样品)的微RNA的量进行比较，或与治疗之前从患者取出的样品或从未治疗的患者取出的样品中的微RNA的量进行比较。可以通过测定获得自正常、健康的对照受试者的足够大数量的样品中的微RNA的水平而确定微RNA的标准水平，以获得预定的参考值或阈值。如本文中使用的，“参考值”指从已知样品确定的miRNA的水平或浓度的预定的值。

可以通过测定来自以治疗性干预治疗之前的患者的样品中的微RNA而测定标准水平。进一步的，标准水平的信息和用于测定标准水平的方法可以从公开可得的数据库，以及其它来源(见，例如，Bunk,D.M.,"ReferenceMaterials and Reference Measurement Procedures:An Overview from aNational Metrology Institute,"Clin.Biochem.Rev.,28(4):131-137(2007);和Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Twenty First Edition(2005))获得。在一些实施方案中，向样品添加已知量的另一种一般不存在于样品中的miRNA(即向样品中掺入已知量的外源miRNA)并且基于所述掺入的miRNA的已知的量而计算一种或多种有兴趣miRNA的水平。将所述一种或多种miRNA的测得的水平与参考量或对照样品中的一种或多种miRNA的水平的比较可以由任何本领域技术人员所知的方法完成。例如，将样品中的微RNA的量与标准量比较可以包含将5S rRNA(或掺入的miRNA)和样品中的miRNA之间的比例与公开的或已知的5S rRNA(或掺入的miRNA)和对照样品中的miRNA之间的比例比较。在将微RNA的量与对照比较的情况中，所述对照样品可以从任何已知不受心脏病症所影响的来源获得。还可以将从施用治疗性干预之后的患者取得的样品中的miRNA的水平与从施用治疗性干预之前的患者取得的样品中的miRNA的水平相比较。

根据本发明，在一些实施方案中，所述miRNA的测得的水平相对于对照样品(例如，治疗之前的患者或未治疗的患者中的样品)中miRNA的水平，或相对于预定的参考值的差别(提高或降低)指示治疗性干预的治疗功效。在一些实施方案中，所述miRNA的测得的水平相对于对照样品中的miRNA的水平或预定的参考值的提高指示治疗性干预的治疗功效。例如，在这类实施方案中，当选自表3或4中列出的miRNA中的一种或多种miRNA的水平响应治疗性干预而相对于对照样品的水平或预定的参考值提高时，该提高指示治疗性干预的治疗功效。在一些实施方案中，当选自hsa-miR-19b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-145、hsa-miR-195、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、和hsa-miR-214中的一种或多种miRNA的水平响应治疗性干预而相比于对照样品中的水平或预定的参考值提高时，该提高指示治疗性干预的治疗功效。

根据本发明，在一些实施方案中所述miRNA的水平相对于对照样品(例如，治疗之前的患者或未治疗的患者中的样品)中的miRNA的水平，或相对于预定的参考值的减少或降低指示治疗性干预的治疗功效。例如，在这类实施方案中，当选自在表2或4中列出的一种或多种miRNA的水平响应治疗性干预而与对照样品中的水平或预定的参考值相比降低时，该降低指示治疗性干预的功效。在一些实施方案中，当一种或多种miRNA的水平响应治疗性干预而与对照样品中的水平或预定的参考值相比降低时，该降低指示治疗性干预的功效，其中所述一种或多种miRNA选自hsa-miR-16、hsa-miR-320、hsa-miR-223、hsa-miR-93、hsa-miR-106b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185、hsa-miR-92a、hsa-miR-210、hsa-miR-140、hsa-miR-27a、hsa-miR-20b、hsa-miR-150、hsa-miR-20a、hsa-miR-378、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-378*、hsa-miR-122、hsa-miR-126、hsa-miR-133a、和hsa-miR-499。

取样方法是领域内技术人员所熟知的，任何种类的任何用于获得生物学样品的适用的技术都是预期的，并且可以用于本发明的方法(见，例如，Clinical Proteomics:Methods and Protocols,Vol.428in Methods inMolecular Biology,Ed.Antonia Vlahou(2008))。样品可以包括任何可以从其中分离miRNA的生物学样品。这类样品可以包括血清、血液、血浆、全血和其衍生物、心脏组织、皮肤、毛发、毛囊、唾液、口腔黏膜、阴道黏膜、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精液(semen)、精液(seminal fluid)、精浆(seminalplasma)、前列腺液、预射精液(pre-ejaculatory fluid，Cowper液)、排泄物、活检(biopsy)、腹水、脑脊液、淋巴、心脏组织、以及其它组织提取样品或活检。在一些实施方案中，所述生物学样品是血浆或血清。在其它实施方案中，所述生物学样品是心脏组织。

本发明公开的方法中使用的生物学样品可以在治疗性干预开始之后的任何时间点自患者获得。在一些实施方案中，所述样品是在治疗性干预开始之后至少1、2、3、或6个月获得的。在一些实施方案中，所述样品是在治疗性干预开始之后至少1、2、3、4、6、或8周获得的。在一些实施方案中，所述样品是在治疗性干预开始后至少1、2、3、4、5、6、或7日后获得的。在一些实施方案中，所述样品是治疗性干预开始之后至少1小时、6小时、12小时、18小时、或24小时获得的。在其它的实施方案中，所述样品是在治疗性干预开始之后至少一周获得的。在一些实施方案中，在使用基于miRNA的治疗法之后1到8周之间测量选自表2-4的一种或多种miRNA，所述基于miRNA的治疗法如靶向miRNA的反义寡核苷酸(例如抗-miR治疗)。在一些实施方案中，在抗-miR治疗后2周和7周之间测量血浆样品中的一种或多种miRNA。在一些实施方案中，在抗-miR治疗后1、2、3、4、5、6、7、或8周测量血浆样品中的一种或多种miRNA。在一些实施方案中，在抗-miR治疗后7周测量血浆样品中的一种或多种miRNA。在一些实施方案中，在抗-miR治疗后2周测量血浆样品中的一种或多种miRNA。

对于由本发明的方法所预期的微RNA检测，在一些实施方案中，用于分析的样品可以包含，大约1ng和大约100ng之间的RNA。在一些实施方案中，样品含有大约10ng和大约90ng之间的RNA。在一些实施方案中，样品含有大约20ng和大约80ng之间。对于由本发明的方法所预期的微RNA检测，用于分析的样品可以含有0.1和10μl之间的血浆RNA当量(来自血浆体积的纯化的RNA)。在一些情况中，用于分析的样品可以含有0.5μl和5μl之间的血浆RNA当量(来自血浆体积的纯化的RNA)。在一些情况中，用于分析的样品可以含有大约0.1μl、0.5μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl或10μl的血浆RNA当量(来自血浆体积的纯化的RNA)。

本发明的方法还可以包括用于改变治疗性干预的治疗方案的方法。这类方法包括检测至少一种miRNA的水平，如来自接受治疗性干预的患者的生物学样品中的在表2-4中列出的一种或多种miRNA，并根据所述生物学样品中的至少一种miRNA的水平的提高或降低改变治疗方案。在一些实施方案中，所述方法包含检测在表2-4的一个或多个中列出的两种、三种、四种、五种、十种、或更多种miRNA(例如，包括所有的miRNA)。在一些这样的实施方案中，使用定制的检测平台检测miRNA，由此检测少于100种、少于50种、或少于25种miRNA，其包括来自表2至4的miRNA。改变治疗方案可以包括，但不限于改变和/或修改治疗性干预的种类、治疗性干预施用的剂量、治疗性干预施用的频率、治疗性干预施用的途径、以及其它为医师所熟知的要改变和/或修改的参数。例如，当表2的miRNA在治疗期间降低或与参考水平一致，和/或表3的miRNA在治疗期间提高或与参考水平一致时，继续治疗性干预。在表2的miRNA在治疗期间不降低或与参考水平一致，和/或表的miRNA在治疗期间不提高或与参考水平一致时，改变治疗性干预。

在一些实施方案中，测定来自表1-4中一个的一组miRNA，并基于分类算法(classifier algorithm)将该组分类。例如，可以基于如描述的阈值将样品分类，或基于一个群体中的或相对于另一个的平均和/或中位miRNA水平(例如，健康的对照群体和有心力衰竭的患者的群体，或基于有效治疗性对于无效治疗的水平)。

已知多种用于在两个或更多个类或组之间分类样品的分类方法，这些方法包括并不限于：主成分分析(Principal Components Analysis)、朴素贝叶斯(

Bayes)、支持向量机(Support Vector Machines)、最近邻(NearestNeighbors)、决策树(Decision Trees)、Logistic算法、人工神经网络(ArtificialNeural Networks)、惩罚回归(Penalized Logistic Regression)、和基于规则的方法。另外，可以组合来自多种模型的预测以生成总体预测。因此，可以构建分类算法或“分类预测机”以分类样品。在R. Simon, Diagnostic andprognostic prediction using gene expression profiles in high-dimensionalmicroarray data,British Journal of Cancer(2003)89,1599-1604中综述了用于准备合适的分类预测机的过程，通过对该综述的提述将其全文并入本文。

在一些实施方案中，有关于所述至少一种miRNA的水平的提高或降低的信息可以用于测定以治疗性干预治疗的治疗功效，以及用于修正治疗性干预的治疗方案。在一些实施方案中，所述治疗可以用于决定是否继续进行某种治疗性干预。在一些实施方案中，所述治疗功效可以用于决定是否不继续进行某种治疗性干预。在一些实施方案中，所述治疗功效可以用于决定是否修改治疗性干预。在一些实施方案中，所述治疗功效可以用于决定是否提高或降低治疗性干预的剂量。在一些实施方案中，所述治疗功效可以用于决定是否改变治疗性干预的给药频率。在一些实施方案中，所述治疗功效可以用于决定是否改变治疗性干预的施用数目或频率。在一些实施方案中，所述治疗功效可以用于决定是否改变每天、每周的剂量数目，每天给予剂量的次数。在一些实施方案中，所述治疗功效可以用于决定是否改变给药量(dosage amount)。

本发明的方法还提供了用于为评估或检查对治疗心脏病症的治疗性干预的功效提供有用的信息的方法。这些方法可以包括测定患者的生物学样品中的至少一种miRNA的水平，如在表2-4中任一个中列出的一种或多种miRNA，并将所述至少一种miRNA的水平提供给基于所述至少一种miRNA的水平的提高或降低提供功效的判断的实体。

短语“指示治疗功效”以及其变体可以包括任何用于判断治疗性干预正在向患者提供益处的方法。术语“治疗功效”以及其变体一般地由一种或多种与心脏病症相关联的征候或症状的缓解所指示，而正在治疗的心脏病症的一种或多种征候或症状的缓解可以由本领域技术人员容易地确定。“治疗功效”还可以指通常与用于心脏病症的标准治疗性干预相关联的毒性的征候和症状的预防或缓和。用于测定治疗功效的方法可以特异于正在治疗的心脏病症，并可以包括任何本领域内公知的用于判断治疗正在向心脏病症患者提供有益效果的方法。例如，治疗功效的证据可以包括，但不限于受试者中心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一种或多种症状的改善或缓解，或者从心脏肥大到心力衰竭的转变的延迟。所述一种或多种改善或缓解的症状可以包括，例如，提高的运动能力，提高的心脏射血体积(cardiac ejection volume)、降低的左心室舒张期末压(left ventricular enddiastolic pressure)、降低的肺毛细血管楔压(pulmonary capillary wedgepressure)、提高的心输出量(cardiac output)、提高的心脏指数(cardiac index)、下降的肺动脉压(pulmonary artery pressures)、降低的左心室收缩末期和舒张末期内径(left ventricular end systolic and diastolic dimensions)、降低的心脏纤维化、降低的心肌内胶原沉着(collagen deposition in cardiac muscle)、降低的左右心室壁应力(left and right ventricular wall stress)、降低的管壁张力(wall tension)、提高的生活质量、以及降低的疾病相关的患病率和死亡率。进一步的，治疗功效可以包括一般性的患者的总体健康状况的改进，例如但不限于患者生活质量的提高、预测的生存率的提高、抑郁(depression)的降低或适应证的再发率(rate of recurrence of the indication)的降低。(见，例如Physicians' Desk Reference(2010))。

治疗性干预的功效还可以包括评估或监测受试者中心脏肥大、心力衰竭、或心肌梗死的一种或多种症状的改善，或评估或检测从心脏肥大到心力衰竭的转变的延迟。所述一种或多种改善的症状可以包括，例如，提高的运动能力，提高的心脏射血体积、降低的左心室舒张期末压、降低的肺毛细血管楔压、提高的心输出量、提高的心脏指数、下降的肺动脉压、降低的左心室收缩末期和舒张末期内径、降低的心脏纤维化、降低的心肌内胶原沉着、降低的左右心室壁应力、降低的管壁张力、提高的生活质量、以及降低的疾病相关的患病率和死亡率。在一些实施方案中，测得的血浆miRNA(例如，表2-4中列出的任意miRNA)的水平可作为治疗性干预的功效的替代标志物。

本文描述的任意的组合物都可以包含在试剂盒中。在一个实施方案中，所述试剂盒含有用于测量生物学样品中的选自表2-4的任意一个的至少一种miRNA的试剂、用于测量所述至少一种miRNA的说明书、以及用于基于所述至少一种miRNA的水平评估或监测患者中治疗心脏病症的治疗性干预的功效的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒含有用于测量来自表2或3之一，或来自表2和3二者的至少两种、三种、四种、五种、十种、或二十种(或更多种)miRNA的水平的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒是定制用于确定心力衰竭的治疗的功效的，因此提供用于测定包括表2和3的miRNA在内的50种或更少、40种或更少、30种或更少、或二十五种或更少种miRNA的试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒含有用于测量选自hsa-miR-16、hsa-miR-320、hsa-miR-223、hsa-miR-93、hsa-miR-106b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185、hsa-miR-92a、hsa-miR-210、hsa-miR-140、hsa-miR-27a、hsa-miR-20b、hsa-miR-150、hsa-miR-20a、hsa-miR-378、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-378*、hsa-miR-122、hsa-miR-126、hsa-miR-133a、hsa-miR-499、hsa-miR-19b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-145、hsa-miR-195、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、和hsa-miR-214中一种或多种miRNA的试剂；用于测量这些miRNA中的一种或多种的说明书；以及用于基于这些miRNA的一种或多种的水平在患者中评估或监测治疗心脏病症的治疗性干预的功效的说明书。在特定的实施方案中，所述试剂盒含有用于测量选自miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、miR-93、miR-19b、miR-223、miR-21、miR-150的一种或多种miRNA的试剂；用于测量这些miRNA的一种或多种的说明书；以及用于基于这些miRNA的一种或多种的水平在患者中评估或检测治疗心脏病症的治疗性干预的功效的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒含有miRNA特异性的用于反转录或扩增miRNA的引物，所述miRNA选自hsa-miR-16、hsa-miR-320、hsa-miR-223、hsa-miR-93、hsa-miR-106b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185、hsa-miR-92a、hsa-miR-210、hsa-miR-140、hsa-miR-27a、hsa-miR-20b、hsa-miR-150、hsa-miR-20a、hsa-miR-378、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-378*、hsa-miR-122、hsa-miR-126、hsa-miR-133a、hsa-miR-499、hsa-miR-19b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-145、hsa-miR-195、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-214、以及其组合。

在一些实施方案中，所述试剂盒含有用于测量生物学样品中一种或多种miRNA的试剂，所述miRNA指示基于miRNA治疗法的治疗功效。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒含有用于测量选自miR-19b、miR-223、miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、和miR-93的一种或多种miRNA的试剂；用于测量这些miRNA的一种或多种的说明书；以及用于基于这些miRNA中的一种或多种的水平评估或监测患者中靶向用于治疗心脏病症的miR-208a和/或miR-208b的化学修饰的反义寡核苷酸的功效的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒含有用于测量来自表2或3之一，或来自表2和3二者的至少两种、三种、四种、十种、或二十种(或更多种)miRNA的水平。在一些实施方案中，所述试剂盒是定制用于测定心力衰竭的治疗的功效的，因此提供用于测定包括表2和3的miRNA在内的50种或更少、40种或更少、30种或更少、或二十五种或更少种miRNA的试剂。

在其它实施方案中，所述试剂盒含有用于在生物学样品中测量一种或多种miRNA的试剂，所述miRNA指示标准护理治疗(standard of caretherapeutic)，如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂的治疗功效。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒含有用于测量生物学样品中的选自miR-150、miR-21、miR-223、miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、和miR-93的一种或多种miRNA的试剂，用于测量这些miRNA中的一种或多种的说明书，以及用于基于这些miRNA中的一种或多种的水平评估或监测患者中的用于治疗心脏病症的ACE抑制剂的功效的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒含有用于测量来自表2或3之一，或者表2和3二者的至少两种、三种、四种、五种、十种、或二十种(或更多种)miRNA的水平的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒是定制用于测定对心力衰竭的治疗的功效的，因此提供用于测量包括表2和3的miRNA在内的50种或更少、40种或更少、30种或更少、或二十五种或更少种miRNA的试剂。

在一些实施方案中，所述试剂盒进一步含有一种或多种标准化对照。在一些其它的实施方案中，所述一种或多种标准化对照作为一种或多种分开的试剂提供，用于掺入样品或反应。可将标准化对照以从大约0.1fmol到大约5mol的范围添加。在一些实施方案中，以大约0.1fmol、0.5fmol、1fmol、2fmol、3fmol、4fmol、或5fmol添加所述标准化对照。在一些实施方案中，所述至少一种标准化对照是非内源性RNA或miRNA，或者在样品中未表达的miRNA。在一些实施方案中，所述至少一种标准化对照是秀丽隐杆线虫(C.elegans)miRNA。在一些实施方案中，所述至少一种标准化对照是cel-miR-2、cel-lin-4或ath-miR-159a。在一些实施方案中，使用的秀丽隐杆线虫序列是cel-miR-2(UAUCACAGCCAGCUUUGAUGUGC,SEQ ID NO:5)、和cel-lin-4(UCCCUGAGACCUCAAGUGUGA;SEQ IDNO:6)。使用的ath-miR159a的序列是(UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA,SEQ ID NO:7)。

在一些实施方案中，所述试剂盒可以进一步含有特异于试剂盒的每种miRNA的TaqMan探针。在一些实施方案中，所述TaqMan探针特异于选自下组的miRNA：hsa-miR-16、hsa-miR-320、hsa-miR-223、hsa-miR-93、hsa-miR-106b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185、hsa-miR-92a、hsa-miR-210、hsa-miR-140、hsa-miR-27a、hsa-miR-20b、hsa-miR-150、hsa-miR-20a、hsa-miR-378、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-378*、hsa-miR-122、hsa-miR-126、hsa-miR-133a、hsa-miR-499、hsa-miR-19b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-145、hsa-miR-195、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、和hsa-miR-214。

在一些实施方案中，预期所述试剂盒用于来自接受心脏病症的治疗的患者的生物学样品。在进一步的实施方案中，所述生物学样品是获得自接受心脏病症的治疗的患者的血浆或血清。在更进一步的实施方案中，所述心脏病症是心肌梗死、病理性心脏肥大、心力衰竭或高血压。

所述试剂盒的组分可以包装在水性介质中，或以冻干形式包装。所述试剂盒的容器一般地包含至少一个小瓶(vial)、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器，可以将组分放置于其中，并且优选地，合适地等分。当试剂盒中有多于一种组分时，所述试剂盒一般也将含有第二个、第三个或其它额外的容器，可以将额外的组分分开地放置于其中(例如，无菌的、药学可接受的缓冲液和/或其它稀释剂)。然而，小瓶中可以包含多种组分的组合。本发明的试剂盒还将通常地含有用于容纳核酸的手段，以及任意其它紧密封闭的试剂容器，其用于商业上的销售。这类容器可以含有注射容器或吹成型塑料容器(blow molded plastic containers)，意欲的小瓶保留在其中。

当以一种和/或多种液体溶液的形式提供所述试剂盒的组分时，所述液体溶液是水性溶液，无菌水性溶液是特别优选的。

然而，可以以干粉的形式提供所述组分。当以干粉形式提供试剂和/或组分时，粉末可以通过添加合适的溶液来复原。可以预见，还可以以其它容器的手段提供所述溶剂。

这类试剂盒还可以包含保存或维持试剂的组分或保护其不受降解的组分。这类组分可以是无DNA酶、无RNA酶的，或保护其不受核酸酶(例如，RNA酶和DNA酶)。这类试剂盒一般会以合适的方式包括用于每一种单独的试剂或溶液的不同的容器。

试剂盒还会含有用于使用试剂盒的说明书，以及使用任意其它未包括在试剂盒中的试剂的说明书。说明书可以包括可以实现的变化。

可以预见，这类试剂是本发明的试剂盒的实施方案。然而，这类试剂盒不限于上面指明的项目，并可以包括任何用于操作或表征miRNA的试剂。

本发明的治疗性干预可以包含任何用于治疗心脏病症的治疗的组合。例子可以包括但不限于基于miRNA的治疗法(包括反义寡核苷酸)、抗高脂蛋白血症剂(antihyperlipoproteinemic agent)、抗动脉硬化剂(antiarteriosclerotic agent)、抗血栓/溶纤维蛋白剂(antithrombotic/fibrinolyticagent)、血液凝结剂(blood coagulant)、抗心律不齐剂(antiarrhythmic agent)、抗高血压剂(antihypertensive agent)、血管加压药(vasopressor)、对充血性心力衰竭的治疗剂、抗心绞痛剂(antianginal agent)、抗细菌剂(antibacterialagent)或其组合。(见，例如，美国专利申请号2010/0317713；通过对其的提述将其全文并入本文)。

在一些实施方案中，所述治疗性干预是基于miRNA的治疗。在一些实施方案中，基于miRNA的治疗是反义寡核苷酸。所述反义寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，所述基于miRNA的治疗是在靶向在心脏组织中表达的miRNA的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述治疗性干预是靶向miR-208a和/或miR-208b的反义寡核苷酸。在一些这类实施方案中，所述miRNA测得的水平相对于对照样品中的miRNA的水平或预定的参考值的改变指示心脏组织中的miR-208a和/或miR-208b的降低的表达。在这类实施方案中，选自miR-19b、miR-223、miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、和miR-93的一种或多种miRNA的水平相比于对照样品中的一种或多种miRNA的水平或预定的参考值指示靶向miR-208a和/或miR-208b的化学修饰的反义寡核苷酸的治疗功效。在一个特别的实施方案中，miR-19b和/或miR-223的水平相比于对照样品中的miR-19b和/或miR-223的水平或预定的参考值指示靶向miR-208a和/或miR-208b的化学修饰的反义寡核苷酸的治疗功效。在一些实施方案中，miR-19b的水平相比于对照样品中的miR-19b的水平或预定的参考值的提高指示心脏组织中miR-208a和/或miR-208b的降低的表达。在其它的实施方案中，miR-233的水平相比于对照样品中miR-233的水平或预定值的降低指示心脏组织中miR-208a和/或miR-208b的降低的表达。

优选地，所述反义寡核苷酸治疗法具有至少一种化学修饰(即，所述寡核苷酸是化学修饰的)。例如，合适的反义寡核苷酸可以由一种或多种“构象约束的(conformationally constrained)”或双环糖核苷(bicyclic sugarnucleoside)修饰形式，例如，“锁定核酸”所构成。在一些实施方案中，所述基于miRNA的治疗是靶向心脏组织中表达的miRNA的化学修饰的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，所述化学修饰的反义寡核苷酸靶向-208a和/或miR-208b。

miR-208a和miR-208b微RNA已经在WO2008/016924、WO2009/018492和WO2010/091204中描述。人miR-208a的pre-miRNA编码序列如下方SEQ ID NO:8所示，成熟miR-208a的序列在SEQ ID NO:9中提供(见，例如，PCT/US2010/023234，通过对其的提述将其全文并入本文)。人miR-208b的pre-miRNA编码序列如下方SEQ ID NO:10所示，成熟miR-208a的序列在SEQ ID NO:11中提供。

人pre-miR-208a (SEQ ID NO:8)

ACGGGCGAGC TTTTGGCCCG GGTTATACCT GATGCTCACGTATAAGACGA GCAAAAAGCT TGTTGGTCAG A

成熟miR-208a (SEQ ID NO:9)

AUAAGACGAGCAAAAAGCUUGU

人pre-miR-208b (SEQ ID NO:10)

CCUCUCAGGGAAGCUUUUUGCUCGAAUUAUGUUUCUGAUCCGAAUAUAAGACGAACAAAAGGUUUGUCUGAGGGCAG

成熟miR-208b (SEQ ID NO:11)

AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU

靶向miR-208a/miR-208b的反义寡核苷酸可以含有LNA或其它修饰的核苷酸和核糖核苷酸或脱氧核糖核酸的组合。或者，所述反义寡核苷酸可以包含肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)，其含有基于肽的主链而非糖-磷酸主链。其它的反义寡核苷酸可以包括的修饰包括，但不限于，糖修饰，如2’-O-烷基(例如2’-O-甲基,2’-O-甲氧乙基)、2’-氟代、和4’硫代修饰，以及主链修饰，例如一种或多种硫代磷酸酯(phosphorothioate)、吗啉代(morpholino)、或膦酰基羧酸酯(phosphonocarboxylate)键(见，例如，美国专利号6,693,187和7,067,641，通过对其的提述将其全文并入本文)。例如，反义寡核苷酸，特别是长度较短的那些(例如，短于15个核苷酸)可以包括一种或多种增强亲和力的修饰(affinity enhancing modification)，例如但不限于，LNA、双环核苷(bicyclic nucleoside)、磷酰基甲酸酯(phosphonoformate)、2’-O-烷基以及类似物。

在一些实施方案中，合适的反义寡核苷是2’-O-甲氧乙基“gapmer”，其在5’和3’端都含有2’-O-甲氧乙基修饰的核糖核苷酸，在中心有至少10个脱氧核糖核苷酸。这些“gapmer”能够触发RNA靶物的RNA酶H-依赖性降解机制。其它的反义寡核苷酸的增强稳定性和改善功效的修饰，如在美国专利号6,838,283中描述的那些，通过对其的提述将其全文并入本文，是本领域内已知并适合用于本发明的方法的。优选的可用于抑制miRNA的活性的反义寡核苷酸是大约5到大约50个核苷酸长、大约10到大约30个核苷酸长、或大约20到大约25个核苷酸长。在一些实施方案中，靶向miR-208a和/或miR-208b的反义寡核苷酸是大约8到大约18核苷酸长，在其它实施方案中是大约12到16个核苷酸长。特别的，任意与miR-208a或miR-208b互补的8聚体(8-mer)或更长者都可以使用，即，任意与miR-208a或miR-208b中从成熟序列的5’端起到3’端止的任何连续序列互补的抗mir序列。反义寡核苷酸在一些情况中可以包含与成熟miRNA序列至少部分互补的序列，例如，与成熟miRNA序列至少大约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸可以与成熟miRNA序列基本上互补，即与靶多核苷酸序列至少大约95%、96%、97%、98%、或99%互补。在一些实施方案中，所述反义寡核苷酸包含与成熟miRNA序列100%互补的序列。

“锁定核酸(Locked nucleic acids)”(LNA)是修饰的核糖核苷酸，其在核糖部分的2’和4’碳之间含有额外的桥连，导致“锁定的”构象，赋予了含有LNA的寡核苷酸增强的热稳定性。LNA在例如美国专利6,268,490、美国专利6,316,198、美国专利6,403,566、美国专利6,770,748、美国专利6,998,484、美国专利6,670,461、和美国专利7,034,133中描述，通过对其的提述将它们全部整体并入本文。LNA是修饰的核苷酸或核糖核苷酸，其在核糖部分的2’和4’碳之间含有额外的桥连，导致了“锁定的”构象。其它适合的可以并入本发明的寡核苷酸的锁定核苷酸包括在美国专利6,833,361中描述的那些，通过对其的提述将其全文并入本文。

在其它实施方案中，反义寡核苷酸是antagomir。“antagomir”是单链、化学修饰的核糖核苷酸，其至少部分地与miRNA序列互补。Antagomir可以包含一个或多个修饰的核苷酸，例如2’-O-甲基-糖修饰。在一些实施方案中，antagomir仅包含修饰的核苷酸。Antagomir还可以包含一个或多个硫代磷酸酯键，其导致部分或完全的硫代磷酸酯主链。为促进体内递送和稳定性，可以将antagomir的3’端连接至类固醇，例如胆固醇、脂肪酸、维生素、碳水化合物、肽或其它小分子配体。适合用于抑制miRNA的antagomir可以是大约15个到大约50个核苷酸长，更优选地大约18个到大约30个核苷酸长，并最优选地大约20个到大约25个核苷酸长。“部分地互补”是指序列与靶多核苷酸序列至少大约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补。Antagomir可以与成熟miRNA序列至少大约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互补。在一些实施方案中，所述atagomir可以与成熟miRNA序列基本互补，即与靶多核苷酸序列至少大约95%、96%、97%、98%、或99%互补。在其它实施方案中，antagomir是与成熟miRNA序列100%互补的。

除了上面描述的微RNA靶向治疗外，所述治疗性干预还包括其它标准心脏治疗。在这些实施方案中，本发明的治疗性干预可以包括抗高脂蛋白血症剂、抗动脉硬化剂、抗血栓/溶纤维蛋白剂、血液凝结剂、抗心律不齐剂、抗高血压剂、血管加压药、对充血性心力衰竭的治疗剂、抗心绞痛剂、抗细菌剂或其组合。见例如美国专利申请号2010/0317713，通过对其的提述将其全文并入本文。

在一个实施方案中，本发明提供了用于通过测量生物学样品中的至少一种miRNA的水平而评估或监测标准护理治疗(如ACE抑制剂)的功效的方法。在一些实施方案中，所述方法包含测量来自正接受ACE抑制剂的患者的生物学样品中的选自miR-150、miR-21、miR-223、miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、和miR-93中至少一种miRNA的水平，并将测得的水平与所述对照样品中的所述至少一种miRNA的水平或预定的参考值相比较，其中所述至少一种miRNA的测得的水平指示ACE抑制剂的治疗功效。在另一个实施方案中，所述方法包含测量来自接受ACE抑制剂的患者的生物学样品中的miR-21和/或miR-150的水平；并将测得的水平与对照样品中miR-21和/或miR-150的水平或预定的参考值相比较，其中所述至少一种miRNA的测得的水平指示ACE抑制剂的治疗功效。

在一些实施方案中，测得的一种或多种miRNA的相对于对照样品中的所述一种或多种miRNA的水平或预定的参考值的水平指示组合治疗的治疗功效。所述组合治疗法可以两种或更多种基于miRNA的治疗、两种或更多种标准护理治疗、或基于miRNA的治疗和标准护理治疗的组合。例如，所述组合治疗可以是靶向心脏中表达的miRNA的化学修饰的反义寡核苷酸与标准护理治疗，如ACE抑制剂。在一个特别的实施方案中，所述组合治疗是靶向miR-208a和/或miR-208b的化学修饰的反义寡核苷酸与ACE抑制剂，如卡托普利（captopril）。在这类实施方案中，选自miR-21、miR-150、miR-378、miR-378*、和miR-93的一种或多种miRNA相对于对照样品中的这些miRNA的一种或多种的水平或预定的参考值的水平指示抗miR-208寡核苷酸和ACE抑制剂(例如卡托普利)的组合治疗的治疗功效。在一些实施方案中，miR-378和/或miR-378*相对于对照样品中的miR-378和/或miR-378*的水平或预定的参考值的水平指示抗miR-208寡核苷酸和ACE抑制剂(例如卡托普利)的组合治疗的治疗功效。

在另外的其它方面，本发明提供了用于治疗患者的心力衰竭的方法，所述患者具有miR-223、miR-16、miR-93、miR-106(b)、和/或miR-423-5p中的一种或多种的升高的水平(例如，血清或血浆水平)，或在表1中列出的其它上调或下调的的标志物的组合(例如，至少两种的组合)。根据该方面，以常规治疗(如ACE抑制剂)、或以本文描述的抗-miR治疗策略治疗患者的心力衰竭。在一些实施方案中，所述治疗是以抗miR-208(a)反义抑制剂或抗miR-208(b)反义抑制剂治疗。可以在治疗之前、和/或治疗期间测定miR-223、miR-16、miR-93、miR-106(b)和/或miR-423-5p的水平以监测治疗的功效。在一些实施方案中，所述治疗是反义抗miR-208(b)抑制剂，并在治疗期间监测miR-19(b)的水平或在表2-4中的一个或多个中列出的标志物的组合。在一些实施方案中，抗miR-208(b)治疗是如本文所描述的或在美国临时申请号61/495,224中所描述的，通过对其的提述将其全文并入本文。例如，所述抑制剂可以是从10个到18个核苷酸(例如，16个核苷酸)、和/或除了其它化学基序外还含有九个锁定核酸的反义抑制剂。所述抑制剂可以是如美国临时申请号61/495,224中所描述的M-10101，并且可以皮下施用。

在一些实施方案中，所述治疗性干预包括施用使一种或多种血脂和/或脂蛋白的浓度降低的作用剂，其在本文中称作“抗高脂蛋白血症药(antihyperlipoproteinemics)”，其可以是根据本发明的治疗性干预的部分。

抗高脂蛋白血症药的例子可以包括但不限于阿昔呋喃(acifran)、阿扎胆醇(azacosterol)、苯氟雷司(benfluorex)、对苯甲基丁酰胺(p-benzalbutyramide)、卡尼汀(carnitine)、硫酸软骨素、氯雌酮甲醚(clomestrone)、右旋糖酐(detaxtran)、右旋糖酐硫酸酯钠(dextran sulfatesodium)、5,8,11,14,17-二十碳五烯酸(5,8,11,14,17-eicosapentaenoicacid)、香茹嘌呤(eritadenine)、夫拉扎勃(furazabol)、美格鲁托(meglutol)、甲亚油酰胺(melinamide)、双甲雌三醇(mytatrienediol)、鸟氨酸(ornithine)、y-谷维素(y-oryzanol)、泛硫乙胺(pantethine)、季戊四醇四醋酸酯(pentaerythritol tetraacetate)、α-苯基丁酰胺(α-phenylbutyramide)、吡扎地尔(pirozadil)、普罗布考(普罗布考片剂)(probucol(lorelco))、对谷甾醇(p-sitosterol)、磺托酸-哌嗪盐(sultosilic acid-piperazine salt)、硫地醇(tiadenol)、曲帕拉醇(triparanol)和联苯丁酸(xenbucin)。

在一些实施方案中，抗高脂蛋白血症剂可以进一步包含芳氧链烷酸/纤维酸(aryloxyalkanoic/fibric acid)衍生物，树脂酸/胆汁酸掩蔽剂(resin/bileacid sequesterant)、HMG CoA还原酶抑制剂、烟酸(nicotinic acid)衍生物、甲状腺激素或甲状腺激素类似物、杂类作用剂(miscellaneous agent)或其组合。

芳氧链烷酸/纤维酸衍生物的例子可以包括但不限于苄氯贝特(beclobrate)、苯扎贝特(enzafibrate)、比尼贝特(binifibrate)、环丙贝特(ciprofibrate)、克利贝特(clinofibrate)、氯贝丁酯(安妥明-S)(clofibrate(atromide-S))、氯贝酸(clofibric acid)、依托贝特(etofibrate)、非诺贝特(fenofibrate)、吉非贝齐(gemfibrozil(lobid))、尼可贝特(nicofibrate)、吡贝特(pirifibrate)、氯烟贝特(ronifibrate)、双贝特(simfibrate)和益多酯(theofibrate)。

树脂酸/胆汁酸掩蔽剂的例子可以包括但不限于考来烯胺(cholybar，消胆胺)(cholestyramine(cholybar,questran))、考来替泊(降脂树脂2号)(colestipol(colestid))和降胆葡胺(polidexide)。

HMG CoA还原酶抑制剂的例子可以包括但不限于洛伐他汀（美降脂）（lovastatin(mevacor)）、普伐他汀（pravochol）（pravastatin(pravochol)）和辛伐他汀（舒降之）（simvastatin(zocor)）。

烟酸衍生物的例子可以包括但不限于脑脉康(nicotinate)、aceplmox、戊四烟酯(niceritrol)、尼可氯酯(nicoclonate)、尼可莫尔(nicomol)和氧烟酸(oxiniacic acid)。

甲状腺激素和其类似物的例子可以包括但不限于etoroxate、甲状丙酸(thyropropic acid)和甲状腺素(thyroxine)。

抗动脉硬化药的例子可以包括但不限于吡醇氨酯(pyridinolcarbamate)。

在一些实施方案中，帮助去除或预防血凝块（blood clots）的作用剂的施用可以与调节物（modulator）的施用组合，特别是在动脉粥样化硬化（athersclerosis）和脉管系统的（例如，动脉的）阻断（blockage）的治疗中。抗血栓和/或溶解纤维蛋白剂的例子可以包括但不限于抗凝血药（anticoagulants）、抗凝血剂拮抗剂（anticoagulant antagonists）、抗血小板剂（antiplatelet agents）、血栓溶解剂（thrombolytic agents）、血栓溶解剂拮抗剂（thrombolytic agent antagonists）或其组合。

在一些实施方案中，可以包括的抗血栓剂是那些可以口腔施用的抗血栓剂，如阿司匹林和华法林（warfarin (coumadin)）。

抗凝血药可以包括但不限于醋硝香豆素（acenocoumarol）、安克洛酶（ancrod）、茴茚二酮（anisindione）、溴茚二酮（bromindione）、氯茚二酮（clorindione）、库美香豆素（coumetarol）、环香豆素（cyclocumarol）、右旋糖酐硫酸酯钠、双香豆素（dicumarol）、二苯茚酮（diphenadione）、双香豆乙酯（ethyl biscoumacetate）、乙叉双香豆素（ethylidene dicoumarol）、氟茚二酮（fluindione）、肝素、水蛭素（hirudin）、阿朴酸钠（lyapolatesodium）、奥沙二酮（oxazidione）、戊聚糖聚硫酸（pentosan polysulfate）、苯茚二酮（phenindione）、苯丙香豆素（phenprocoumon）、卵黄高磷蛋白（phosvitin）、吡考他胺（picotamide）、噻氯香豆素（tioclomarol）和华法林。

抗血小板剂可以包括但不限于阿司匹林、右旋糖酐、双嘧达莫（潘生丁）（dipyridamole (persantin)）、肝素、磺吡酮（安特灵）（sulfinpyranone(anturane)）和噻氯匹定（抵克立得）（ticlopidine(ticlid)）。

血栓溶解剂可以包括但不限于组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tissueplasminogen activator (activase)）、纤溶酶（plasmin）、尿激酶前体（pro-urokinase）、尿激酶（雅激酶）（urokinase(abbokinase)）、链激酶（streptokinase(streptase)）和阿尼普酶(anistreplasel)APSAC(依米那酶，eminase)

在其它的实施方案中，其中受试者患有出血（hemorrhage）或提高的出血的可能性（increased likelihood of hemorrhaging），还可以使用可以增强血液凝固的作用剂。血液凝固促进剂的例子包括血栓溶解剂拮抗剂和抗凝血剂拮抗剂。

血栓溶解剂拮抗剂可以包括但不限于氨基己酸（amiocaproic acid(amicar)）和氨甲环酸（tranexamic acid (amstat)）。

抗凝剂拮抗剂可以包括但不限于鱼精蛋白（protamine）和维生素K。

在一些实施方案中，所述治疗性干预是抗血栓/溶纤维蛋白剂。抗血栓/溶纤维蛋白剂可以包括但不限于阿那格雷（anagrelide）、阿加曲班（argatroban）、西鲁唑啉（cilstazol）、达曲班（daltroban）、去纤苷（defibrotide）,依诺肝素（enoxaparin）、速碧林（fraxiparine）、吲哚布芬（indobufen）、lamoparan、奥扎格雷（ozagrel）、吡考他胺（picotamide）、普拉贝脲(plafibride)、替地肝素（tedelparin）、噻氯匹定（ticlopidine）和三氟柳（triflusal）。

在一些实施方案中，所述治疗性干预是抗心律不齐药（antiarrhythmic）。抗心律不齐剂可以包括但不限于I类抗心律不齐制剂(钠通道阻断剂(sodium channel blockers))、II类抗心律不齐制剂(β肾上腺素能阻断剂（beta-adrenergic blockers）)、III类抗心律不齐制剂(复极化延长药（repolarization prolonging drugs）)、IV类抗心律不齐制剂(钙通道阻断剂（calcium channel blockers）)和杂类抗心律不齐制剂。

钠通道阻断剂的例子可以包括但不限于IA类、IB类和IC类抗心律不齐制剂。IA类抗心律不齐剂的非限制性例子包括丙吡胺（disppyramide(norpace)）、普鲁卡因胺（procainamide(pronestyl)）和奎尼丁（硫酸奎尼丁）（quinidine(quinidex)）。IB类抗心律不齐剂可以包括但不限于利多卡因（lidocaine(xylocaine)）、妥卡尼（妥卡胺片）（tocainide(tonocard)）和美西律（脉舒律）（mexiletine(mexitil)）。IC类抗心律不齐制剂的例子可以包括但不限于恩卡尼（恩犬）（encainide(enkaid)）和氟卡尼（醋酸氟卡尼）（flecainide(tambocor)）。

β-阻断剂，也叫p-肾上腺素能阻断剂，是p-肾上腺素能拮抗剂或II类抗心律不齐剂，的例子可以包括但不限于醋丁洛尔（醋丁洛尔胶囊）（acebutolol(sectral)）、阿普洛尔（alprenolol）、氨磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、苯呋洛尔(befunolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比索洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布库洛尔(bucumolol)、布非洛尔(bufetolol)、丁呋洛尔(bufuralol)、布尼洛尔(bunitrolol)、布拉洛尔(bupranolol)、盐酸布替君（butidrine hydrochloride）、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、氯拉洛尔(cloranolol)、地来洛尔(dilevalol)、依泮洛尔(epanolol)、艾司洛尔(esmolol(brevibloc))、茚诺洛尔(indenolol)、拉贝洛尔(labetalol)、左布诺洛尔(levobunolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、萘肟洛尔(nadoxolol)、硝苯洛尔(nifenalol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普拉洛尔(practolol)、丙萘洛尔(pronethalol)、普萘洛尔(心得安)(propanolol(inderal))、索他洛尔(盐酸索他洛尔)(sotalol(betapace))、硫氧洛尔(sulfinalol)、他林洛尔(talinolol)、特他洛尔(tertatolol)、噻吗洛尔(timolol)、托利洛尔(toliprolol)和xibinolol。

在一些实施方案中，所述β-阻断剂可以包括芳氧丙醇胺衍生物（aryloxypropanolamine derivative）。芳氧丙醇胺衍生物的例子可以包括但不限于醋丁洛尔(acebutolol)、阿普洛尔(alprenolol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比索洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布尼洛尔(bunitrolol)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、依泮洛尔(epanolol)、茚诺洛尔(indenolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔(pindolol)、普萘洛尔(propanolol)、他林洛尔(talinolol)、特他洛尔(tertatolol)、噻吗洛尔(timolol)和托利洛尔(toliprolol)。

延长复极化的作用剂，也叫做III类抗心律不齐剂，其例子可以包括但不限于胺碘酮（可达龙）（amiodarone(cordarone)）和索他洛尔(盐酸索他洛尔)(sotalol(betapace))。

钙通道阻断剂，也叫做IV类抗心律不齐剂，的例子可以包括但不限于芳烷基胺（arylalkylamine）(例如，bepridile、地尔硫卓（diltiazem）、芬地林（fendiline）、戈洛帕米（gallopamil）、普尼拉明（prenylamine）、特罗地林（terodiline）、维拉帕米（verapamil）)；二氢吡啶衍生物（dihydropyridinederivative）(非洛地平（felodipine）、伊拉地平（isradipine）、尼卡地平（nicardipine）、硝苯地平（nifedipine）、尼莫地平（nimodipine）、尼索地平（nisoldipine）、尼群地平（nitrendipine）)；piperazinde衍生物(例如，桂利嗪（cinnarizine）、氟桂利嗪（flunarizine）、利多氟嗪（lidoflazine）)；或杂类钙通道阻断剂（micellaneous calcium channel blocker），如苄环烷（bencyclane）、依他苯酮（etafenone）、镁（magnesium）、咪拉地尔（mibefradil）或哌克昔林（perhexiline）。在一些实施方案中，钙通道阻断剂包括长效二氢吡啶（硝苯地平型）钙拮抗剂（long-acting dihydropyridine(nifedipine-type)calcium antagonist）。

杂类抗心律不齐剂可以包括但不限于腺苷（adenosine(adenocard)）、地高辛（digoxin(lanoxin)）、乙酰卡尼（acecainide）、阿义马林（ajmaline）、克冠吗啉（amoproxan）、阿普林定（aprindine）、溴苄胺甲苯磺酸盐（bretyliumtosylate）、丁萘夫汀（bunaftine）、布托苯定（butobendine）、卡泊酸（capobenicacid）、西苯唑啉（cifenline）、丙吡胺(disopyranide)、二氢奎尼丁（hydroquinidine）、英地卡尼（indecainide）、异丙托溴铵（ipatropium bromide）、利多卡因（lidocaine）、劳拉义明（lorajmine）、劳卡尼（lorcainide）、甲氧苯汀（meobentine）、莫雷西嗪（moricizine）、吡美诺（pirmenol）、普拉马林（prajmaline）、普罗帕酮（propafenone）、吡诺林（pyrinoline）、奎尼丁聚半乳糖醛酸盐（quinidine polygalacturonate）、硫酸奎尼丁（quinidinesulfate）和维喹地尔（viquidil）。

在一些实施方案中，所述治疗性干预是抗高血压剂。抗高血压剂的例子可以包括但不限于交感神经阻滞药(sympatholytic)、α/β阻断剂（alpha/betablockers）、α阻断剂（alpha blockers）、抗-血管紧张素II剂（anti- angiotensinII agents）、β阻断剂（beta blockers）、钙通道阻断剂、血管扩张药和杂类抗高血压剂。

α阻断剂，也叫做α-肾上腺素能阻断剂（α-adrenergic blocker）或α-肾上腺素能拮抗剂（α-adrenergic antagonist），的例子可以包括但不限于氨磺洛尔、阿罗洛尔、达哌唑(dapiprazole)、多沙唑嗪(doxazosin)、甲磺酰麦角碱(ergoloid mesylates)、芬司匹利(fenspiride)、吲哚拉明(indoramin)、拉贝洛尔、麦角溴烟酯(nicergoline)、哌唑嗪(prazosin)、特拉唑嗪(terazosin)、妥拉唑林(tolazoline)、曲马唑嗪(trimazosin)和育亨宾（yohimbine）。在一些实施方案中，α阻断剂可以包括喹唑啉衍生物（quinazoline derivative）。喹唑啉衍生物可以包括但不限于阿夫唑嗪（alfuzosin）、布那唑嗪（bunazosin）、多沙唑嗪、哌唑嗪、特拉唑嗪（terazosin）和曲马唑嗪。

在一些实施方案中，抗高血压制剂既是α也是β肾上腺素能拮抗剂。α/β阻断剂的例子可以包括但不限于拉贝洛尔（盐酸拉贝洛尔、盐酸柳胺心定制剂）（labetalol(normodyne,trandate)）。

抗血管紧张素II剂的例子可以包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素II受体拮抗剂。血管紧张素转化酶抑制剂（ACE抑制剂）可以包括但不限于阿拉普利（alacepril）、依那普利（enalapril(vasotec)）、卡托普利、西拉普利（cilazapril）、地拉普利（delapril）、依那普利拉（enalaprilat）、福辛普利（fosinopril）、赖诺普利（lisinopril）、moveltopril、培哚普利（perindopril）、喹那普利（quinapril）和雷米普利（ramipril）。血管紧张素II受体阻断剂，也叫做血管紧张素II受体拮抗剂、ANG受体阻断剂或ANG-II1型受体阻断剂（ARBS），其例子包括但不限于angiocandesartan、依普罗沙坦(eprosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)和缬沙坦（valsartan）。

交感神经阻滞药的例子包括中枢作用交感神经阻滞药（centrally actingsympatholytic）或外周作用交感神经阻滞药（peripherially actingsympatholytic）。中枢作用交感神经阻滞药，也叫做中枢神经系统（CNS）交感神经阻滞药，的例子可以包括但不限于可乐定(盐酸可乐定)(clonidine(catapres))、胍那苄(氯压胍)(guanabenz(wytensin))、胍法辛(盐酸胍法辛)(guanfacine(tenex))和甲基多巴（爱道美）（methyldopa(aldomet)）。

外周作用交感神经阻滞药的例子可以包括但不限于神经节阻断剂（ganglion blocking agent）、肾上腺素能神经阻断剂（adrenergic neuronblocking agent）、β-肾上腺素能阻断剂、或α1-肾上腺素能阻断剂。神经节阻断剂的例子包括美卡拉明（异坎胺）（mecamylamine(inversine)）和曲美芬（樟磺咪芬）(trimethaphan(arfonad))。肾上腺素能阻断剂可以包括但不限于胍乙啶（依斯迈林）（guanethidine(ismelin)）和利舍平（利血平）（reserpine(serpasil)）。

β-肾上腺素能阻断剂的例子可以包括但不限于醋丁洛尔（acenitolol(sectral)）、阿替洛尔（天诺敏）（atenolol(tenormin)）、倍他洛尔（卡尔仑）（betaxolol(kerlone)）、卡替洛尔（carteolol(cartrol)）、拉贝洛尔（labetalol(normodyne、trandate)）、美托洛尔（酒石酸甲氧乙心安）（metoprolol(lopressor)）、纳多洛尔（nadanol(corgard)）、喷布洛尔（penbutolol(levatol)）、吲哚洛尔（心得静）（pindolol(visken)）、普萘洛尔（心得安）（propranolol(inderal)）和噻吗洛尔（马来酸噻吗心安）（timolol(blocadren)）。

α-肾上腺素能阻断剂可以包括但不限于哌唑嗪（脉宁平）（prazosin(minipress)）、多沙唑嗪（可多华）（doxazocin(cardura)）和特拉唑嗪（高特灵）（terazosin(hytrin)）。

在一些实施方案中，治疗性干预可以包括血管扩张药（例如，脑血管扩张药（cerebral vasodilator）、冠状血管扩张药（coronary vasodilator）或外周血管扩张药（peripheral vasodilator））。在其它实施方案中，血管扩张药包含冠状血管扩张药。冠状血管扩张药的例子包括但不限于胺氧三苯（amotriphene）、地巴唑（bendazol）、琥珀苯呋地尔（benfurodilhemisuccinate）、苯碘达隆（benziodarone）、氯酚嗪（chloracizine）、卡波罗孟（chromonar）、氯苯呋醇（clobenfurol）、氯硝甘油（clonitrate）、地拉卓（dilazep）、双嘧达莫（dipyridamole）、氢普拉明（droprenilamine）、乙氧黄酮（efloxate）、erythrityl tetranitrane、依他苯酮（etafenone）、芬地林（fendiline）、夫洛地尔（floredil）、更利芬（ganglefene）、herestrolbis(p-diethylaminoethyl ether)、海索苯定（hexobendine）、硝乙醇胺对甲苯磺酸盐（itramin tosylate）、凯林（khellin）、lidoflanine、mannitol hexanitrane、美地巴嗪（medibazine）、nicorglycerin、硝酸戊四醇酯（pentaerythritoltetranitrate）、戊硝醇（pentrinitrol）、哌克昔林（perhexiline）、匹美茶碱（pimefylline）、曲匹地尔（trapidil）、3-甲色酮（tricromyl）、曲美他嗪（trimetazidine）、磷酸三硝乙醇胺(trolnitrate phosphate)和维司那定（visnadine）。

在一些实施方案中，血管扩张药可以包括慢性治疗血管扩张药（chronic therapy vasodilator）或高血压紧急血管扩张药（hypertensiveemergency vasodilator）。慢性治疗血管扩张药的例子可以包括但不限于肼屈嗪（阿普利素灵）（hydralazine(apresoline)）和米诺地尔（长压定）（minoxidil(loniten)）。高血压紧急血管扩张药的例子可以包括但不限于硝普盐（硝普钠）（nitroprusside(nipride)）、二氮嗪（降压嗪IV）（diazoxide(hyperstat IV)）、肼屈嗪（阿普利素灵）、米诺地尔（长压定）和维拉帕米。

在一些实施方案中，所述治疗性干预可以包括抗高血压药。杂类抗高血压药的例子包括但不限于阿义马林(ajmaline)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)、丁苯碘胺(bufeniode)、cicletainine、环西多明(ciclosidomine)、单宁酸绿藜安(a cryptenamine tannate)、非诺多泮(fenoldopam)、氟司喹南(flosequinan)、酮色林(ketanserin)、美布氨酯(mebutamate)、美卡拉明(mecamylamine)、甲基多巴(methyldopa)、甲基4-吡啶基酮氨硫脲（methyl4-pyridyl ketone thiosemicarbazone）、莫唑胺（muzo limine）、帕吉林（pargyline）、潘必啶（pempidine）、吡那地尔（pinacidil）、哌罗克生（piperoxan）、普立哌隆（primaperone）、原藜芦碱（a protoveratrine）、萝巴新（raubasine）、瑞西美托（rescimetol）、利美尼定(rilmenidene)、沙拉新（saralasin）、硝普钠(sodium nitrorusside)、替尼酸（ticrynafen）、樟脑磺酸替奥芬（trimethaphan camsylate）、酪氨酸酶（tyrosinase）和乌拉地尔。

在一些实施方案中，抗高血压药可以包含芳基乙醇胺衍生物（arylethanolamine derivative）、苯噻二嗪衍生物（benzothiadiazinederivative）、N-羰基烷基（肽/内酰胺）衍生物（N-carboxyalkyl(peptide/lactam)derivative）、二氢吡啶衍生物（dihydropyridine derivative）、胍衍生物（guanidine derivative）、肼/酞嗪（hydrazines/phthalazine）、咪唑衍生物（imidazole derivative）、季铵化合物（quaternary ammonium compound）、利舍平衍生物（reserpine derivative）或磺胺衍生物（suflonamide derivative）。

芳基乙醇胺衍生物的例子可以包括但不限于氨磺洛尔(amosulalol)、丁呋洛尔(bufuralol)、地来洛尔(dilevalol)、拉贝洛尔(labetalol)、丙萘洛尔(pronethalol)、索他洛尔(sotalol)和硫氧洛尔（sulfinalol）。

苯噻二嗪衍生物的例子可以包括但不限于阿尔噻嗪（althizide）、苄氟噻嗪（bendroflumethiazide）、苄噻嗪（benzthiazide）、苄氢氯噻嗪（benzylhydrochlorothiazide）、布噻嗪（buthiazide）、氯噻嗪（chlorothiazide）、氯噻酮（chlorthalidone）、环戊噻嗪（cyclopenthiazide）、环噻嗪（cyclothiazide）、二氮嗪（diazoxide）、依匹噻嗪（epithiazide）、乙噻嗪（ethiazide）、芬喹唑（fenquizone）、双氢氯噻嗪（hydrochlorothizide）、氢氟噻嗪(hydroflumethizide)、甲氯噻嗪（methyclothiazide）、美替克仑（meticrane）、美托拉（metolazone）、对氟噻嗪（paraflutizide）、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪（tetrachlormethiazide）和三氯噻嗪（trichlormethiazide）。

N-羰基烷基（肽/内酰胺）衍生物的例子可以包括但不限于阿拉普利（lacepril）、卡托普利、西拉普利、地拉普利、依那普利、依那普利拉、福辛普利、赖诺普利、莫维普利(moveltipril)、培哚普利、喹那普利和雷米普利。

二氢吡啶衍生物的例子可以包括但不限于氨氯地平(amlodipine)、非洛地平、伊拉地平、尼卡地平、硝苯地平、尼伐地平(nilvadipine)、尼索地平和尼群地平。

胍衍生物的例子可以包括但不限于倍他尼定(bethanidine)、胍喹啶(debrisoquin)、胍那苄(guanabenz)、胍那克林(guanacline)、胍那决尔(guanadrel)、胍那佐定(guanazodine)、胍乙啶(guanethidine)、胍法辛(guanfacine)、guanochlor、胍诺沙苄(guanoxabenz)和胍生（guanoxan）。

肼/酞嗪的例子可以包括但不限于布屈嗪(budralazine)、卡屈嗪(cadralazine)、双肼屈嗪(dihydralazine)、恩屈嗪(endralazine)、肼卡巴嗪(hydracarbazine)、肼屈嗪(hydralazine)、苯异丙肼(pheniprazine)、匹尔屈嗪(pildralazine)和托屈嗪（todralazine）。

咪唑衍生物的例子可以包括但不限于可乐定(clonidine)、洛非西定(lofexidine)、酚妥拉明(phentolamine)、噻美尼定(tiamenidine)和托洛尼定（tolonidine）。

季铵化合物的例子可以包括但不限于阿扎溴铵(azamethoniumbromide)、松达氯铵(chlorisondamine chloride)、六烃季铵(hexamethonium)、二（甲基硫酸）喷他铵（pentacynium bis(methylsulfate)）、五甲溴铵（pentamethonium bromide）、酒石酸戊双吡胺（pentolinium tartrate）、芬托氯铵（phenactropinium chloride）和甲硫曲美替定（trimethidiniummethosulfate）。

利舍平衍生物的例子可以包括但不限于比他舍平(bietaserpine)、地舍平(deserpidine)、瑞西那明(rescinnamine)、利舍平和昔洛舍平（syrosingopine）。

磺胺衍生物的例子可以包括但不限于安布赛特（ambuside）、氯帕胺（clopamide）、呋塞米（furosemide）、吲达帕胺（indapamide）、喹乙宗（quinethazone）、曲帕胺（trip amide）和希帕胺（xipamide）。

用于治疗充血性心力衰竭的作用剂的例子可以包括但不限于抗血管紧张素II制剂、后负荷-前负荷减少治疗(afterload-preload reductiontreatment)、利尿剂和正性肌力药。

利尿剂的例子可以包括但不限于噻嗪或苯噻二嗪衍生物（例如，阿尔噻嗪、苄氟噻嗪、苄噻嗪、苄氢氯噻嗪、布噻嗪、氯噻嗪、氯噻嗪、氯噻酮、环噻嗪、依匹噻嗪、乙噻嗪、乙噻嗪、芬喹唑、双氢氯噻嗪、hydroflumethiazide、甲氯噻嗪、美替克仑、美托拉、对氟噻嗪、polythizide、四氯噻嗪、三氯噻嗪）；有机汞（organomercurial）（例如，氯汞君(chlormerodrin)、美拉鲁利(meralluride)、汞罗茶碱(mercamphamide)、硫汞林钠(mercaptomerin sodium)、汞香豆酸(mercumallylic acid)、汞香豆林钠(mercumatilin dodium)、氯化亚汞(mercurous chloride)、汞撒利(mersalyl)）；蝶啶（pteridine）（例如，呋氨蝶啶（furterene）、氨苯蝶啶（triamterene））；嘌呤（例如，茶碱乙酸(acefylline)、7-吗啉甲茶碱(7-morpholinomethyltheophylline)、帕马溴(pamobrom)、丙可可碱(protheobromine)、可可碱(theobromine)）；包括醛固酮拮抗剂的类固醇（例如，坎利酮（canrenone）,夹竹桃苷（oleandrin）,螺内酯（spironolactone））；磺胺药物衍生物（例如，乙酰唑胺(acetazolamide)、安布赛特、阿佐塞米(azosemide)、布美他尼(bumetanide)、布他唑胺(butazolamide)、氯米非那胺(chloraminophenamide)、氯非那胺(clofenamide)、氯帕胺、氯索隆(clorexolone)、二苯基甲烷-4,4’-亚硫胺(diphenylmethane-4,4'-disulfonamide)、二磺法胺(disulfamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)、呋塞米、吲达帕胺、美夫西特(mefruside)、醋甲唑胺(methazolamide)、吡咯他尼(piretanide)、喹乙宗、托拉塞米(torasemide)、曲帕胺、希帕胺）；尿嘧啶（例如，氨美啶（aminometradine）、阿米美啶（amisometradine））；保钾剂拮抗剂（potassium sparing antagonist）（例如，阿米洛利（amiloride）、氨苯蝶啶）；或杂类利尿剂如aminozine、熊果甙(arbutin)、氯拉扎尼(chlorazanil)、依他尼酸(ethacrynic acid)、依托唑啉(etozolin)、肼卡巴嗪(hydracarbazine)、异山梨醇(isosorbide)、甘露醇(mannitol)、美托查酮(metochalcone)、莫唑胺(muzo limine)、哌克昔林(perhexiline)、ticmafen和尿素。

正性肌力药物（positive inotropic agent），也叫做强心药（cardiotonic），其例子可以包括但不限于acefylline、醋洋地黄毒苷(an acetyldigitoxin)、2-氨基-4-甲吡啶（2-amino-4-picoline）、氨力农（amrinone）、琥珀苯呋地尔（benfurodil hemisuccinate）、布拉地新（bucladesine）、cerberosine、樟吡他胺（camphotamide）、铃兰毒苷（convallatoxin）、磁麻甙（cymarin）、地诺帕（denopamine）、去乙酰毛花苷(deslanoside)、洋地黄苷(digitalin)、洋地黄(digitalis)、洋地黄毒苷(digitoxin)、地高辛(digoxin)、多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、多培沙明(dopexamine)、依诺昔酮(enoximone)、红皮素(erythrophleine)、非那可明(fenalcomine)、吉他林(gitalin)、羟基洋地黄毒甙(gitoxin)、胍基乙酸(glycocyamine)、辛胺醇(heptaminol)、北美黄莲次碱(hydrastinine)、异波帕胺(ibopamine)、毛花甙(alanatoside)、metamivam、米力农(milrinone)、黄夹次甙B(nerifolin)、夹竹桃苷(oleandrin)、哇巴因(ouabain)、奥昔非君(oxyfedrine)、普瑞特罗(prenalterol)、proscillaridine、残余蟾蜍配基(resibufogenin)、海葱苷(scillaren)、海葱甙元(scillarenin)、绿毒毛旋花子苷(strphanthin)、硫马唑(sulmazole)、可可碱和扎莫特罗（xamoterol）。

在一些实施方案中，正性肌力药是强心苷（cardiac glycoside）、β-肾上腺素能激动剂（beta-adrenergic agonist）、或磷酸二酯酶抑制剂（phosphodiesterase inhibitor）。强心苷的例子可以包括但不限于地高辛（digoxin(lanoxin)）和洋地黄毒苷（digitoxin(crystodigin)）。β-肾上腺素能激动剂可以包括但不限于沙丁胺醇(albuterol)、班布特罗(bambuterol)、比托特罗(bitolterol)、卡布特罗(carbuterol)、克仑特罗(clenbuterol)、氯丙那林(clorprenaline)、地诺帕明(denop amine)、双羟乙麻黄碱(dioxethedrine)、多巴酚丁胺(独步催)(dobutamine(dobutrex))、多巴胺(盐酸多巴胺)(dopamine (intropin))、多培沙明(dopexamine)、麻黄碱(ephedrine)、乙非君(etafedrine)、乙基去甲肾上腺素(ethylnorepinephrine)、非诺特罗(fenoterol)、福莫特罗(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、异波帕胺(ibopamine)、新异丙肾上腺素(isoetharine)、异丙肾上腺素(isoproterenol)、马布特罗(mabuterol)、间羟异丙肾上腺素(metaproterenol)、甲氧那明(methoxyphenamine)、奥昔非君(oxyfedrine)、吡布特罗(pirbuterol)、丙卡特罗(procaterol)、普罗托醇(protokylol)、瑞普特罗(reproterol)、利米特罗(rimiterol)、利托君(ritodrine)、索特瑞醇(soterenol)、特布他林(terbutaline)、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特罗(tulobuterol)和扎莫特罗（xamoterol）。磷酸二酯酶抑制剂的例子可以包括但不限于氨力农（amrinone(inocor)）。

抗心绞痛制剂可以包含有机硝酸盐（organonitrates）、钙离子通道阻断剂、β-阻断剂和其组合。有机硝酸盐，也叫做硝基血管扩张剂（nitrovasodilators），的例子可以包括但不限于硝酸甘油（硝酸甘油注射剂、耐绞宁）（nitroglycerin(nitro-bid,nitrostat)）、硝酸异山梨酯（isosorbidedinitrate(isordil,sorbitrate)）和亚硝酸异戊酯（amyl nitrate(aspirol,vaporole)）。

内皮素（Endothelin，ET）是一种21个氨基酸的肽，具有强力的生理学和病理生理学作用，似乎参与心力衰竭的发展。ET的作用是通过两类细胞表面受体的相互作用介导的。抑制ET刺激细胞的能力牵涉到使用阻断ET与其受体的相互作用的作用剂。内皮素受体拮抗剂（endothelin receptorantagonists，ERA）的例子可以包括但不限于波生坦(Bosentan)、恩拉生坦(Enrasentan)、安立生坦(Ambrisentan)、达卢生坦(Darusentan)、替唑生坦(Tezosentan)、阿曲生坦(Atrasentan)、Avosentan、克拉生坦(Clazosentan)、Edonentan、西他生坦(sitaxsentan)、TBC3711、BQ123、和BQ788。

在一些实施方案中，治疗性干预可以包括第二治疗方面，如例如某些种类的外科手术，其包括，例如，预防性（preventative）、诊断和分级性（diagnostic or staging）、治愈性（curative）和姑息性（palliative）外科手术。外科手术，特别是治愈性外科手术，可以与其它治疗一起使用，所述其它治疗包括本文描述的一种或多种其它作用剂。这类用于血管和心血管疾病和病症的外科手术治疗剂是本领域技术人员所熟知的，可以包括但不限于对生物体进行外科手术、提供心血管机械修复（providing acardiovascular mechanical prostheses）、血管成形术（angioplasty）、冠状动脉再灌注（coronary artery reperfusion）、导管法部分切除术（catheterablation）、向受试者提供可植入复律器-除颤器（providing an implantablecardioverter defibrillator to the subject）、机械循环支持（mechanicalcirculatory support）或其组合。可以用在本发明中的机械循环支持的例子包括主动脉内球囊反搏（intra-aortic balloon counterpulsation）、左心室辅助装置或其组合。

本发明还包括用于预测或评价患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平的方法和试剂盒。在一个实施方案中，本发明提供了用于预测或评价患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平的方法，其包含测量来自患者的生物学样品中的选自表1的至少一种miRNA的测量的水平；并将测得的水平与对照样品中的所述至少一种miRNA的水平比较（例如，获得自健康、年龄符合的受试者的样品，或获得自不患有或诊断为心力衰竭的受试者的样品），或与预定的参考值比较，其中所述至少一种miRNA的测得的水平指示患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。所述生物学样品可以是本文描述的任何样品。在一些实施方案中，血浆或血清样品是优选的。

在一些实施方案中，所述miRNA的测得的水平相对于对照样品中的miRNA的水平或预定的参考值的提高指示患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。例如，在这类实施方案中，当选自hsa-miR-16、hsa-miR-223、hsa-miR-320、hsa-miR-150、hsa-miR-378、hsa-miR-92a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-133a、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-210、hsa-miR-20b、hsa-miR-499、hsa-miR-378*、hsa-miR-106b、hsa-miR-155、和hsa-miR-93中的一种或多种miRNA的水平相比于对照样品或预定的参考值的水平提高时，该提高指示患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

在其它的实施方案中，所述miRNA的测量的水平相对于对照样品（例如，获得自健康、年龄符合的受试者的样品或获得自不患有或诊断为心力衰竭的受试者的样品）中的miRNA的水平或预定的参考值的减少或降低指示患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。例如，在这类实施方案中，当选自hsa-miR-204、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、和hsa-miR-195中的一种或多种miRNA的水平相比于对照样品中的水平或预定的参考值降低时，该降低指示患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

本发明还涵盖用于预测或评价患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于测量生物学样品中选自表1的至少一种miRNA的试剂、以及用于为了预测或评价患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平而测量所述至少一种miRNA的说明书。例如，在一些实施方案中，该试剂盒包含用于反转录或扩增选自hsa-miR-204、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-195、hsa-miR-16、hsa-miR-223、hsa-miR-320、hsa-miR-150、hsa-miR-378、hsa-miR-92a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-133a、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-210、hsa-miR-20b、hsa-miR-499、hsa-miR-378*、hsa-miR-106b、hsa-miR-155、和hsa-miR-93中的miRNA的miRNA特异性引物；以及为了预测或评价患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平而用于测量所述至少一种miRNA的说明书。所述试剂盒可以进一步包含额外的用于评估或检测心脏治疗的治疗功效的本文所描述的用于试剂盒的试剂，如标准化对照和特异于试剂盒中的每种miRNA的Taqman探针。

心脏病症可以包括任何影响心血管系统的病症，所述心血管系统包括心脏和/或血管，如动脉和静脉。本发明的方法所预期的心脏病症可以包括心脏疾病以及心脏衰竭（cardiac failure）。心脏病症还可以包括影响肾脏的病症。心脏病症可以包括但不限于心力衰竭、心脏肥大、冠心病（coronaryheart disease）、心血管疾病、心肌病（cardiomyopathy）、缺血性心脏病（ischaemic heart disease）、高血压性心脏病（hypertensive heart disease）、炎性心脏病（inflammatory heart disease）、瓣膜性心脏病（valvular heartdisease）、动脉粥样硬化、心肾疾病（cardiorenal disease）、肾病和其它肾脏病症。在一些实施方案中，所述心脏病症是心肌梗死、病理性心脏肥大、心力衰竭或高血压。

心血管疾病可以包括但不限于糖尿病（diabetes mellitus）、高血压、高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia）和血胆脂醇过多（hypercholesterolemia）。

心肌病可以包括但不限于酒精中毒性心肌病(alcoholiccardiomyopathy)、冠心病、先天性心脏病(congenital heart disease)、缺血性心肌病（ischemic(或ischaemic)cardiomyopathy）、高血压性心肌病（hypertensive cardiomyopathy）、瓣膜性心肌病（valvular cardiomyopathy）、炎性心肌病（inflammatory cardiomyopathy）和心肌营养不良（myocardiodystrophy）。

高血压性心脏病可以包括但不限于左心室肥大（left ventricularhypertrophy）、冠心病、心力衰竭(包括缺血性心力衰竭)、高血压性心肌病、心律失常（cardiac arrhythmias）和肾脏病症。

炎性心脏病可以包括但不限于心内膜炎（endocarditis）、炎性心脏扩大症（inflammatory cardiomegaly）和心肌炎（myocarditis）。

以下的实施例仅仅是为了例示本发明的多个方面而包含在本文中。然而，参照本发明的公开内容，本领域技术人员应该理解本发明同样地使用于任何人或其它动物。

实施例

实施例1：作为用于心脏病症的药物的替代标志物的血载(blood-borne)miRNA

miRNA对于心脏功能和功能障碍的重要性提示了在心脏疾病的环境中治疗性利用miRNA的生物学的机会。单链RNA寡核苷酸已经显示出通过互补性碱基配对而对于体内灭活miRNA有效（Elmen,J.等(2008)Nature452,896-899;Elmen,J.etal.(2008)Nucleic Acids Res36,1153-1162;Krutzfeldt,J.等(2007)Nucleic Acids Res35,2885-2892;Krutzfeldt,J.等.(2005)Nature438,685-689;Lanford,R.E.等.(2010)Science327,198-201），并代表了灭活病理性miRNA的潜在的有效手段。

本实施例描述了靶向miR-208a的反义寡核苷酸在心力衰竭的模型中的治疗功效。具体地，我们显示锁定核苷酸（LNA）-修饰的针对miR-208a的反义寡核苷酸的系统递送足以诱导心脏中的miR-208a的特异性、强力、且持续的沉默。而且，抗-miR-208a在剂量依赖性地钝化了胁迫诱导的重塑（remodeling）、功能退化（functional deterioration）、和心脏肌球蛋白转换（cardiac myosin switching）的同时在舒张期心力衰竭（diastolic heartfailure）的大鼠模型（Dahl盐敏感性大鼠）中改善了一般健康和生存。有趣地，我们显示在高血压大鼠中的抗miR-208a的生理学效果与循环miRNA的血浆水平的显著改变照映，提示这些循环miRNA是药物功效的替代标志物。

为了体内测定miRNA-208a抑制的治疗潜力，我们设计了抗miR，其靶向成熟miR-208a的5’区域的碱基2至17位，并且含有通过硫代磷酸酯键连接的LNA和DNA的组合。抗miR-208a(称为M-10101)的序列是5’-CTTTTTGCTCGTCTTA-3’(SEQ ID NO:12)。为了测试miR-208a抑制的治疗意义，我们使用了从8周龄开始喂食低盐（LS）饮食（0.25%NaCl）或高盐（HS）饮食（8.0%NaCl）的Dahl盐敏感性大鼠。在Dahl盐敏感性大鼠中启动HS饮食可导致慢性高血压，该慢性高血压可进展成为主要伴随舒张期功能障碍的充血性心力衰竭模型（Rodenbaugh等(2007)Am JPhysiol Heart Circ Physiol.293,H1705–H1713）。在接受HS饮食一周后，向大鼠每两周皮下施用盐水、25mg/kg抗miR-208、或25mg/kg乱序的对照寡核苷酸。在3-4周HS饮食后，用盐水处理的动物和用对照处理的动物开始显示不适的征候以及死亡，而抗miR-208a的皮下递送显著地缓和了这些症状（图1A）。作为健康状况的指示，我们在研究的期间监测了体重。注射盐水或对照寡核苷酸的接受HS饮食的大鼠与接受LS饮食的对照相比展示了体重增益的显著下降。然而，HS/抗miR-208a处理的大鼠显示了相似的重量增益（图1B）。为了排除抗miR-208a处理的动物通过更少地摄取8%HS饮食而维持体重的可能性，我们监测了食物摄入，显示所有HS喂养的组之间摄取是相似的（图4）。

为了进一步了解响应于抗miR-208a而出现的保护效果的原理，接下来使用4.0%NaCl饮食进行了研究，在研究期间，大鼠每两周接受盐水、5或25mg/kg的抗miR-208a、或25mg/kg的抗miR对照。体重分析指示了接受HS饮食的大鼠相比于接受LS饮食的对照展示了体重增益的显著降低，而HS/抗miR-208a处理的大鼠维持了其体重增益的增加（图1C）。使用超声心动图显像的功能评价指示，在HS饮食八周后，抗miR-208a处理的大鼠展示了等容舒张时间(IVRT)以及二尖瓣早期与主动充盈率比值（MV E/A）相对于HS/盐水对照的显著的剂量依赖性降低（图1D）。在HS饮食后每2周进行的时间依赖性超声心动图显像显示了抗-miR208a处理的大鼠相对于HS/盐水对照的等容舒张时间的显著降低（数据未显示）。对心肌细胞大小的定量显示了以抗miR-208a处理后心肌细胞肥大的显著降低（图1E-F）。另外，如由苦味酸天狼猩红染色的定量所评价的，miR-208a处理降低了由HS饮食所诱导的微动脉周围纤维化（periarteriolar fibrosis）（图1E-F）。

最后一次注射抗miR-208a2周后，抗miR-208a在左心室和右心室中导致了剂量依赖性的miR-208a抑制，而对照寡核苷酸显示相比于盐水并无差别（图2A）。在miR-208a的持续抑制后miR-499也显示了表达的剂量依赖性降低。在HS/盐水处理的动物和HS/对照处理的动物中都诱导出了miR-208b，其与β-肌球蛋白重链的上调相并行；然而，抗miR-208a处理导致了miR-208b水平的剂量依赖性降低（图2A）。这样的miR-499和miR-208b的调控由Northern印迹法分析所确认（图2B）。

为了评价肌球蛋白宿主基因的调控，我们检查了Myh6、Myh7、和Myh7b mRNA水平。在HS/盐水和HS/对照组中Myh7均响应于HS而显著地提高。该提高响应于抗-miR-208a被剂量依赖性地钝化。另外，抗-miR-208a处理使得了在HS/盐水和HS/对照组中所观察到的Myh6mRNA的表达的降低正常化（图2C）。Myh7b的表达与miR-499水平照映，展示了受到抗-miR-208a处理时剂量依赖性的降低。此外，Myh7的剂量依赖性调控由Western印迹法所确认（图2D）。此外，抗-miR-208a处理导致了一种之前表征的miR-208a靶物——HP1的去阻遏（derepression），进一步提示了抗-miR-208a的作用是通过miR-208a的抑制而出现的（图2E）。

在多种疾病背景期间对血浆中的miRNA的检测正显示出越来越大的诊断前景（Cortez MA和Calin GA(2009)Expert Opin Biol Ther.9,703–711）。为了确定是否存在与抗miR-208a功效相关的特异性miRNA，我们在HS处理期间检测了一组肌肉相关的miRNA。惊人地，miR-499虽然在高盐下仅显示了血浆检出略有提高，但其在抗miR-208a-处理的动物中显著地降低了，提示了miR-499可以作为用于抗miR-208a功效的基于血浆的标志物物（图3）。此外，发现miR-423-5p的血浆水平——其之前被与人心力衰竭相关联（Tijsen,A.J.,et al.(2010)Circ Res106,1035-1039）——在以抗miR-208a处理的动物中降低了（图3）。其它肌肉特异性miRNA在测试的组之间没有显示出显著的差异（图5）。

本研究的结果指示了miR-208的治疗抑制导致了心脏重塑的降低，其与心脏疾病期间的生存和心脏功能的显著改善相符。心脏中的miR-208a抑制的功效可以通过测量miR-499和miR-423-5p的血浆水平来监测，因为这些miRNA的血浆水平与心脏组织中抗miR-208寡核苷酸对miR-208a的敲低相关。具体地，血浆miRNA分析显示了抗-miR-208a处理导致了血清中miR-499和miR-423-5p的下降，其与响应于抗-miR-208a处理的Myh7b/miR-499心脏表达的降低相并行。考虑到基于血浆的miR-499/miR-423-5p水平和抗miR-208a的功效之间的关联，这些数据提示了血浆miR-499和miR-423-5p水平可以作为抗-miR-208a转入患者时向心脏递送的效率的生物标志物。

具体方法

动物与LNA修饰的抗miR的递送。LNA-抗miR寡核苷酸是在miRagenTherapeutics,Inc.合成的，其是未缀合和完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸，与成熟miR-208a的序列的5’区域完美互补。LNA对照寡核苷酸由针对秀丽隐杆线虫特异性miRNA的序列组成。除非另外指示，寡核苷酸化合物的体内递送是经由尾静脉低压静脉注射(i.v.)或皮下注射成年雄性C56Bl6小鼠或成年雄性Dahl盐敏感性大鼠（Harlan,Indianapolis）而达成的。所有的化合物都溶解在相近终体积的盐水中并以之注射，此后检验动物是否有明显的化合物的副作用。在指示的时间点收集组织样品用于分子或组织学检查。Dahl大鼠以0.25NaCl维持，或在8周龄时饲以4%或8%NaCl饮食（Harlan,Indianapolis）。

定量实时PCR分析。对于体内实时PCR分析，使用Trizol(Invitrogen)从心脏组织中提取RNA，其后使用来自每一个组织样品的2μgRNA以使用Super Script II反转录酶根据制造商的说明书(Invitrogen)生成cDNA。为检测miR-208的水平，使用Taqman微RNA测定法(Applied Biosystems,ABI)根据制造商的推荐进行RT-PCR，其中使用了10-100ng的总RNA。使用购买自ABI的Taqman探针以定量实时PCR分析了一个亚组的基因的表达。

Northern印迹法分析。通过使用Trizol试剂(Gibco/BRL)从心脏组织样品中分离总RNA。进行了如之前描述的检测微RNA的Northern印迹法。将U6探针作为加样对照（IDT）。将来自心肌细胞或心脏组织的10μg总RNA加载于20%丙烯酰胺变性凝胶上，并通过电泳转移至Zeta-probe GT基因组印迹膜（Bio-Rad）上。在转膜后，将印迹交联并在80℃烘烤1hr。为了最大化miRNA检测的灵敏度，将寡核苷酸探针以Starfire Oligos Kit(IDT,Coralville,IA)和α-³²P dATP(Amersham或Perkin Elmer)标记。将探针在Rapid-hyb缓冲液（Amersham）中在39℃过夜杂交至膜，其后将其以含有0.1%SDS的0.5x SSC在39℃清洗两遍，每遍10分钟。将印迹曝光并以PhosphorImager analysis(GE HealthCare Life Sciences)定量，以U6探针作为上样对照(ABI)。使用放射性信号的强度使用phosphorimager和ImageQuant(Bio-Rad)来定量表达的倍数改变。

Western印迹法分析。对于Western印迹法分析，如所描述的（Hamalainen,N.和Pette,D.Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal musclefibres.Microsc Res Tech30,381-389(1995)）从心脏细胞或组织提取肌球蛋白。通过将0.1ug蛋白裂解物上样于4-15%的梯度凝胶上并通过SDS PAGE而分离，以小鼠单克隆抗-肌球蛋白(慢型,骨骼M8421)(Sigma,MO)进行Western印迹法，所述单克隆抗体对Myh7高度特异。

对来自血浆的定量实时PCR分析。使用制造商的规程，使用Trizol LSReagent(Invitrogen)从血浆样品分离RNA。在RNA分离之前，添加250pmol的两种不同的合成秀丽隐杆线虫miRNA序列以作为用于靶物miRNA的标准化的内部对照。使用的秀丽隐杆线虫序列是cel-miR-2(UAUCACAGCCAGCUUUGAUGUGC,SEQ ID NO:5)、和cel-lin-4(UCCCUGAGACCUCAAGUGUGA;SEQ ID NO:6)(Dharmacon)。将最终RNA离心沉淀重悬在与初始血浆体积相等的终体积中，并将5μl使用在后继的RT-PCR反应中，如上面所描述的。

统计学分析。使用One-way ANOVA和Newman-Keuls MultipleComparison Post-test以测定显著性。认为P<0.05为统计学显著。

实施例2：血浆miRNA是心力衰竭的疾病进展和抗miR-208寡核苷酸的治疗功效的生物标志物物。

为了依时评估血浆生物标志物物，使用了外科手术植入的导管，用于在实施例1中描述的充血性心力衰竭的Dahl盐敏感性大鼠模型中非侵入性地每两周抽血。评估了以靶向miR-208a的LNA修饰的反义寡核苷酸（M-10101;SEQ ID NO:12）治疗处理的血浆miRNA生物标志物随着疾病进展的改变。测试了以下的实验组：

组	品系	饮食	处理
				组1	Dahl SS	常规饲料	皮下盐水
组2	Dahl SS	4%NaCl饮食	皮下盐水
				组3	Dahl SS	4%NaCl饮食	皮下M-10101抗miR(25mg/kg)
组4	Dahl SS	4%NaCl饮食	皮下M-10591对照(25mg/kg)

M-10591寡核苷酸(SEQ ID NO:13)靶向来自秀丽隐杆线虫的miR-67，其不在哺乳动物组织中表达，因此将其用作对照。在第零周对Dahl盐敏感性大鼠植入导管并取基线血液。在导管植入手术后，启动高盐饮食。在启动4.0%NaCl饮食后一周，每2周皮下地（s.c.）向大鼠给药25mg/kg的盐水或抗miR。在间隔周（不注射的周），从导管取1.5ml的血液用于分离血浆。在注射启动后8周处死动物。

使用Taqman RT-PCR测定法评估血浆和组织分子终点（serum and tissuemolecular endpoints）。具体地，使用Trizol LS(Invitrogen)将RNA从血浆样品中分离。以恒定浓度向每一个样品中加入lin-4和miR-2的合成秀丽隐杆线虫miRNA序列以监测纯化效率和用于标准化。使用标准Trizol RNA分离法分离组织RNA。使用标准ABI Taqman miRNA测定法规程以检测相对miRNA水平。

为评估抗miR-208处理的功效，测量了心脏组织标志物。高盐饮食（HS）导致了miR-208a水平的显著降低。以M-10101抗miR-208a寡核苷酸处理导致了心脏组织中相对于HS/盐水组更强的miR-208a的抑制（图6A）。对miR-208a的宿主基因Myh6的表达的检查揭示了接受盐水或M-10591对照寡核苷酸的HS饮食动物中相对于低盐（LS）/盐水组中的动物的显著的降低（图6B）。与之形成对比，以抗miR-208a处理预防了高盐诱导的Myh6表达的降低。在HS/盐水和HS/对照寡核苷酸组中的动物中的Myh7基因的表达相比于LS/盐水组显著地提高了（图6C）。抗miR-208a处理钝化了高血压诱导的Myh7表达（图6C）。这些结果显示了抗miR-208寡核苷酸处理可有效地在分子水平降低由高血压状况诱导的基因表达的改变。

在8周低盐或高盐饮食后，通过miRNA Taqman阵列卡片分析法（miRNATaqman array card analysis）测量了Dahl盐敏感性大鼠（低盐饮食/盐水对高盐/盐水组）中高血压的进展期间血浆中的多种miRNA的水平的改变，并通过实时PCR分析法确认（表1）。这些血浆miRNA可以作为随时间变化评价疾病严重性和心力衰竭进展的生物标志物。

表1：健康大鼠中相对于具有高血压诱导的心力衰竭的大鼠中的血浆miRNA的倍数改变（LS-盐水对HS-盐水）。

在8周时通过miRNA Taqman阵列分析（表2和3）和实时PCR分析法评价患有高血压诱导的心力衰竭的大鼠（HS/盐水组）和以抗miR-208a寡核苷酸（HS/M-10101）处理的大鼠之间的血浆miRAN水平的改变（表4）。

表2.由miRNA Taqman阵列卡分析法测得的具有高血压诱导的心力衰竭（HS-盐水/HS-10101）的大鼠中响应于治疗处理而降低的血浆miRNA的倍数改变。

表3.由miRNA Taqman阵列卡分析法测得的具有高血压诱导的心力衰竭（HS-10101/HS-盐水）的大鼠中响应于治疗处理而提高的血浆miRNA的倍数改变。

表4.通过实时PCR分析法确认的、具有高血压诱导的心力衰竭的大鼠相对于经处理的大鼠中如血浆miRNA的倍数改变

有趣的是，本研究的结果显示，存在有心力衰竭进展的血浆miRNA生物标志物、抗miR-208a处理的治疗功效的血浆miRNA生物标志物、以及心力衰竭进展和抗miR-208a处理的治疗功效两者的血浆miRNA生物标志物。所有的疾病进展标志物也是抗miR-208处理的治疗功效的标志物。然而，有几种血浆miRNA，如miR-19b、miR-199、miR-145、miR-214、miR-185、miR-140、miR-27a、miR-20a、miR-122、和miR-126，仅仅是抗miR-208a寡核苷酸的治疗功效的生物标志物。将miR-423-5p、miR-19b、miR-499、和miR-16的时间过程相对于实验的过程显示在图7中。

来自这些实验的结果显示了特定miRNA的血浆水平（例如丰度）可以作为心脏治疗，特别是抗miR-208治疗功效的替代标志物，以及心力衰竭进展和严重性的标志物。

实施例3：抗miR处理和卡托普利处理影响循环的miR

使用充血性心力衰竭的Dahl盐敏感性大鼠模型（见实施例1）评估不同治疗途径的对于血浆miRNA水平的效果。具体地，以含有LNA的抗miR-208a寡核苷酸（M-10101）、卡托普利（一种血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂）或其两者的组合（M-10101+卡托普利）处理大鼠。

评估了以下的实验组：

组	品系	N	饮食	处理
					组1	Dahl SS	6	常规食物	盐水sc/水po
组2	Dahl SS	10	6%NaCl饮食	盐水sc/水po
					组3	Dahl SS	9	6%NaCl饮食	M-10101(25mg/kg)sc/水po
组4	Dahl SS	9	6%NaCl饮食	盐水sc/卡托普利(1.5mg/kg)po
					组5	Dahl SS	9	6%NaCl饮食	盐水sc/卡托普利(15mg/kg)po
组6	Dahl SS	9	6%NaCl饮食	M-10101(25mg/kg)sc/卡托普利(1.5mg/kg)po
					组7	Dahl SS	9	6%NaCl饮食	M-10101(25mg/kg)sc/卡托普利(15mg/kg)po
组8	Dahl SS	9	6%NaCl饮食	M-10591(25mg/kg)sc/卡托普利(15mg/kg)po

在启动6.0%NaCl饮食后一周，每2周以25mg/kg向大鼠皮下地（sc）给药盐水或寡核苷酸（M-10101,5’-CTTTTTGCTCGTCTTA-3’(SEQ ID NO:12)或M-10591,5’-TCCTAGAAAGAGTAGA-3’(SEQ ID NO:13)）。通过口腔强饲法（oral gavage）每日给药卡托普利或水。从iv给药后一周开始每2周进行超声心动图显像。选择大鼠的卡托普利剂量以符合标准男性人体剂量（standardhuman dose in man）。使用Taqman RT-PCR测定法评估血浆和组织分子终点。

以抗miR-208a寡核苷酸（M-10101）处理部分地预防了由高盐饮食所诱导的体重损失（图8A）。与之形成对比，以对照寡核苷酸（M-10591）的处理对体重增益没有明显的效果。以15mg/kg卡托普利处理的大鼠展示了相比于常规、低盐（LS）饮食的动物更低的，但相比于高盐（HS）饮食的动物更高的体重（图8B）。因此，卡托普利轻微地减少了高盐（HS）诱导的体重降低，但不如抗miR-208a处理有效。通过结转在研究结束之前死亡的大鼠的最终体重生成了体重图。如在图9中所示，在给予动物高盐饮食后仅有以单独的抗miR-208a（M-10101）处理显著地改善了生存（*p<0.05;M-10101,水相对高盐饮食,盐水处理的大鼠）。在LS，盐水对照，或HS、M-10101-处理的大鼠中没有观察到死亡。

对myomiR（miR-208a、miR-499和miR-208b）的实时PCR分析显示了6%HS饮食降低了miR-208a的心脏水平，并且miR-208a水平由于以M-10101抑制miR-208a而进一步地降低了（图10A）。以抗miR-208a寡核苷酸的处理还导致了miR-499和miR-208b的心脏水平的降低（图10B和C）。对肌球蛋白基因的实时PCR分析显示了6%HS饮食减少了心脏中的α-MHC（Myh6），而该降低被抗miR-208a寡核苷酸（M-10101）处理、卡托普利处理、或抗miR-208a和卡托普利处理的组合处理所正常化（图11A）。在接受抗miR-208a寡核苷酸的动物中Myh7b水平特异性地降低（图11B）。然而，单独卡托普利处理对Myh7b表达没有明显的影响。虽然卡托普利处理和抗miR-208a寡核苷酸处理都减少了由HS饮食（例如，心脏胁迫物）诱导的βMHC(Myh7)表达的提高，但是抗miR-208a寡核苷酸是更有效的（图11C）。事实上，抗miR-208a-处理的动物中的βMHC的水平与接受LS饮食的动物的水平并无显著的差别。如图12所示，对miR-208a的直接靶物基因的实时PCR分析揭示了以抗miR-208a寡核苷酸M-10101处理的动物产生了这些基因的提高的表达，指示了M-10101有效地抑制了miR-208a功能。

上面描述的结果证明了抗miR-208a和标准护理治疗——卡托普利，对减少由高血压所产生的生理和分子改变是都是有效的。然而，抗miR-208a对于在Dalt盐敏感性大鼠模型中治疗高血压诱导的心力衰竭比卡托普利显得更加有效。

因为多种miRNA的血浆水平与抗miR-208a寡核苷酸处理的功效相关（见实施例2），我们测量了来自不同的处理组的每一个中的大鼠的血浆miRNA水平以测定血浆miRNA水平是否受其他心脏治疗，如卡托普利的影响。几种miRNA的血浆水平显示出与抗miR-208a寡核苷酸和卡托普利治疗的功效都相关（图13A-I）。例如，实时PCR分析显示出miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、和miR-93响应抗miR-208a和卡托普利的处理而降低了。有趣的是，miR-378和miR-378*的血浆水平显示出与抗miR和ACE抑制剂的组合治疗特异性地相关（图13E和G）。其他miRNA的血浆水平与抗miR-208a寡核苷酸治疗或卡托普利治疗相关。例如，miR-19B的血浆水平在接受抗miR-208a寡核苷酸处理的动物中显著地提高了（图14A）。虽然miR-233的血浆水平响应两种的处理都显著地降低，在接受抗miR-208a寡核苷酸的动物中观察到的降低更加显著（图14B）。与之形成对比，miR-21和miR-150在血浆中的水平特异性地随着卡托普利处理而降低（图14C-D）。

这些结果显示了有这样一组miRNA，可以观察到它们在血浆中的水平响应于不同心脏治疗法而改变。有趣的是，似乎有特定的血浆miRNA，它们的水平与特定种类的心脏治疗（例如，miR-208a治疗或ACE抑制剂）相关，而其它的血浆miRNA的水平显示出与两种治疗都相关。还有另外的亚组的血浆miRNA，它们显示出仅是组合治疗的功效的标志物。因此，miRNA水平不但可以用于一般性监测心脏治疗的功效，也可以用于监测特定的治疗性干预或组合治疗的功效。

具体方法

动物与LNA修饰的抗miR的递送。在miRagen Therapeutics,Inc.合成LNA-抗miR寡核苷酸，它们是非缀合和完全硫代磷酸酯化的寡核苷酸，与成熟miR-208a序列的5’区域完美互补。LNA对照寡核苷酸由针对一种秀丽隐杆线虫特异性miRNA的序列组成。除非另外指示，寡核苷酸化合物的体内递送是经由尾静脉由低压静脉（i.v.）注射或皮下注射成年雄性Dahl盐敏感性大鼠（Harlan,Indianapolis）。将所有的化合物溶解在相近的终体积的盐水中并以之注射，此后检验动物是否有明显的化合物的副作用。在指示的时间点收集组织样品用于分子或组织学检验。Dahl大鼠以0.25NaCl维持，或在8周龄时给予4%、6%、或8%NaCl饮食（Harlan,Indianapolis）。

定量实时PCR分析。对于体内实时PCR分析，使用Trizol(Invitrogen)从心脏组织中提取RNA，然后使用来自每一个组织样品的2μgRNA，使用Super Script II反转录酶根据制造商的说明书(Invitrogen)生成cDNA。为检测miR-208的水平，使用Taqman微RNA测定法(Applied Biosystems,ABI)根据制造商的推荐进行RT-PCR，其使用10-100ng的总RNA。使用购买自ABI的Taqman探针通过定量实时PCR分析了一个亚组的基因的表达。

对来自血浆的定量实时PCR分析。使用制造商的规程，使用Trizol LS试剂(Invitrogen)从血浆样品分离RNA。在RNA分离之前，添加250pmol的两种不同的合成秀丽隐杆线虫miRNA序列以作为用于靶物miRNA的标准化的内部对照。使用的秀丽隐杆线虫序列是cel-miR-2(UAUCACAGCCAGCUUUGAUGUGC,SEQ ID NO:5)、和cel-lin-4(UCCCUGAGACCUCAAGUGUGA;SEQ ID NO:6)(Dharmacon)。将最终RNA离心沉淀重悬在与初始血浆体积相等的终体积中，并将5μl用于后继的RT-PCR反应，如上面所描述的。

统计学分析。使用单因素方差分析和Newman-Keuls多重比较事后检验(Multiple Comparison Post-test)以测定显著性。认为P<0.05为统计学显著。

将所有讨论和引用的出版物通过提述整体并入本文。应该理解，不应将公开的发明限定至所描述特定的方法、规程和材料，因为这些是可以变化的。还应该理解，本文所使用的术语仅仅是为了描述特别的实施方案的目的，而非意图限定本发明的范围，本发明的范围仅仅由所附的权利要求书所限定。

本领域技术人员将会认可，或能够通过使用不超过常规的实验而确定，本发明中描述的特定的实施方案的许多等同物。这类的等同物是意图由所附的权利要求书所涵盖的。

Claims (49)

1.一种用于评估或监测用于治疗心脏病症的治疗性干预的功效的方法，包括：

测量来自接受所述治疗性干预的患者的生物学样品中的至少一种miRNA的水平，其中所述至少一种miRNA的测得的水平指示所述治疗性干预的治疗功效。

2.权利要求1的方法，其中所述生物学样品是血浆或血清。

3.权利要求1的方法，其中所述生物学样品是心脏组织。

4.权利要求1的方法，其中所述至少一种miRNA选自表2-4的任一个中列出的miRNA。

5.权利要求4的方法，其中所述miRNA的测得的水平相对于对照样品中所述miRNA的水平的降低指示所述治疗性干预的治疗功效。

6.权利要求5的方法，其中所述至少一种miRNA选自hsa-miR-16、hsa-miR-320、hsa-miR-223、hsa-miR-93、hsa-miR-106b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185、hsa-miR-92a、hsa-miR-210、hsa-miR-140、hsa-miR-27a、hsa-miR-20b、hsa-miR-150、hsa-miR-20a、hsa-miR-378、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-378*、hsa-miR-122、hsa-miR-126、hsa-miR-133a、和hsa-miR-499。

7.权利要求4的方法，其中所述miRNA的测得的水平相对于对照样品中的所述miRNA的水平的提高指示所述治疗性干预的治疗功效。

8.权利要求7的方法，其中所述至少一种miRNA选自hsa-miR-19b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-145、hsa-miR-195、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、和hsa-miR-214。

9.权利要求1的方法，其中所述治疗性干预是基于miRNA的治疗。

10.权利要求9的方法，其中所述基于miRNA的治疗是靶向心脏组织中表达的miRNA的化学修饰的反义寡核苷酸。

11.权利要求10的方法，其中所述化学修饰的反义寡核苷酸靶向miR-208a和/或miR-208b。

12.权利要求11的方法，其中所述至少一种miRNA选自miR-19b、miR-223、miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、和miR-93。

13.权利要求12的方法，其中所述至少一种miRNA是miR-19b或miR-223。

14.权利要求12的方法，其中所述至少一种miRNA是在所述反义寡核苷酸施用之后一周到六周之间测量的。

15.权利要求11的方法，其中所述miRNA测得的水平相对于参考水平或对照样品中的所述miRNA的水平的改变指示心脏组织中miR-208a和/或miR-208b的降低的表达。

16.权利要求1的方法，其中所述治疗性干预是血管紧张素转化酶抑制剂。

17.权利要求16的方法，其中所述至少一种miRNA选自miR-150、miR-21、miR-223、miR-423-5p、miR-106b、miR-16、miR-92a、miR-378、miR-210、miR-378*、miR-20b、和miR-93。

18.权利要求17的方法，其中所述至少一种miRNA是miR-21或miR-150。

19.权利要求1的方法，其中所述心脏病症是心肌梗死、病理性心脏肥大、心力衰竭、或高血压。

20.权利要求1的方法，其中所述生物学样品是在所述治疗性干预开始后至少一周时从所述患者获得的。

21.权利要求1的方法，其中将所述至少一种miRNA的测得的水平与对照样品中的所述至少一种miRNA的水平对比，其中该对比指示所述治疗性干预的治疗功效。

22.权利要求1的方法，其中将所述至少一种miRNA的测得的水平与预定的参考值对比，其中该对比指示所述治疗性干预的治疗功效。

23.权利要求1的方法，进一步包括基于所述生物学样品中的所述至少一种miRNA的测得的水平来改变所述治疗性干预。

24.一种为评估或监测用于治疗心脏病症的治疗性干预的功效提供有用信息的方法，其包括测定患者的生物学样品中的至少一种miRNA的水平，和将所述至少一种miRNA的水平提供给基于所述至少一种miRNA的水平的提高或降低提供功效的判断的实体。

25.一种试剂盒，其包含用于测量生物学样品中选自表2-4中任一个的至少一种miRNA的试剂，以及关于测量所述至少一种miRNA以评估或监测用于治疗患者中的心脏病症的治疗性干预的功效的说明书。

26.权利要求25的试剂盒，其中所述试剂包含用于反转录或扩增miRNA的miRNA特异性引物，所述miRNA选自：hsa-miR-16、hsa-miR-320、hsa-miR-223、hsa-miR-93、hsa-miR-106b、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-185、hsa-miR-92a、hsa-miR-210、hsa-miR-140、hsa-miR-27a、hsa-miR-20b、hsa-miR-150、hsa-miR-20a、hsa-miR-378、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-378*、hsa-miR-122、hsa-miR-126、hsa-miR-133a、hsa-miR-499、hsa-miR-19b、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-204、hsa-miR-145、hsa-miR-195、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、和hsa-miR-214。

27.权利要求25的试剂盒，其还包含一种或多种标准化对照。

28.权利要求27的试剂盒，其中所述一种或多种标准化对照是以用于掺入样品或反应的一种或多种分别的试剂的形式提供的。

29.权利要求28的试剂盒，其中至少一种标准化对照是非内源性RNA或miRNA，或在所述样品中不表达的miRNA。

30.权利要求29的试剂盒，其中至少一种标准化对照是秀丽隐杆线虫(C.elegans)miRNA。

31.权利要求30的试剂盒，其中至少一种标准化对照是cel-miR-2、cel-lin-4或ath-miR-159a。

32.权利要求25到29中任一项的试剂盒，还包含特异于试剂盒中的每一种miRNA的TaqMan探针。

33.权利要求25的试剂盒，其中所述生物学样品是从接受心脏病症治疗的患者获得的血浆或血清。

34.权利要求33的试剂盒，其中所述心脏病症是心肌梗死、病理性心脏肥大、心力衰竭、或高血压。

35.一种用于预测或评价患者中心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平的方法，包括：

测量来自患者的生物学样品中的选自表1的至少一种miRNA的水平，其中所述至少一种miRNA的测得的水平指示所述患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

36.权利要求35的方法，其中所述对照样品是从不患有或未诊断为心力衰竭的健康受试者获得的。

37.权利要求35的方法，其中将所述至少一种miRNA的测得的水平与对照样品中所述至少一种miRNA的水平对比，其中该对比指示所述患者中心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

38.权利要求35的方法，其中将所述至少一种miRNA的测得的水平与预定的参考值对比，其中该对比指示所述患者中心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

39.权利要求37或38的方法，其中所述miRNA的测得的水平相对于对照样品中所述miRNA的水平或预定的参考值的降低指示所述患者中心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

40.权利要求39的方法，其中所述至少一种miRNA选自hsa-miR-204、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、和hsa-miR-195。

41.权利要求37或38的方法，其中所述miRNA的测得的水平相对于对照样品中的所述miRNA的水平或预定的参考值的提高指示患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平。

42.权利要求41的方法，其中所述至少一种miRNA选自hsa-miR-16、hsa-miR-223、hsa-miR-320、hsa-miR-150、hsa-miR-378、hsa-miR-92a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-133a、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-210、hsa-miR-20b、hsa-miR-499、hsa-miR-378*、hsa-miR-106b、hsa-miR-155、和hsa-miR-93。

43.权利要求35的方法，其中所述生物学样品是血浆或血清。

44.一种试剂盒，其包含用于测量生物学样品中的选自表1的至少一种miRNA的试剂，以及关于测量所述至少一种miRNA以预测或评价患者中的心力衰竭或心力衰竭进展的严重性的水平的说明书。

45.权利要求44的试剂盒，其中所述试剂包含用于反转录或扩增miRNA的miRNA特异性引物，所述miRNA选自hsa-miR-204、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-195、hsa-miR-16、hsa-miR-223、hsa-miR-320、hsa-miR-150、hsa-miR-378、hsa-miR-92a、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-133a、hsa-miR-22、hsa-miR-21、hsa-miR-210、hsa-miR-20b、hsa-miR-499、hsa-miR-378*、hsa-miR-106b、hsa-miR-155、和hsa-miR-93。

46.一种用于治疗患者的心力衰竭的方法，所述患者具有升高水平的或低水平的一种或多种表1中列出的miRNA，所述方法包括向患者施用miR-208(a)抑制剂或miR-208(b)抑制剂。

47.权利要求46的方法，其中所述患者具有升高水平的miR-223、miR-16、miR-93、miR-106(b)和/或miR-423-5p。

48.权利要求46的方法，其中在治疗心力衰竭之前测定miR-223、miR-16、miR-93、miR-106(b)和/或miR-423-5p的水平。

49.权利要求46到48中任一项的方法，其中在治疗的过程期间监测miR-19(b)的水平至少一次。

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