CN108866177A - hsa-miRNA-423-5p和hsa-miRNA-423-5p抑制剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了hsa‑miRNA‑423‑5p在制备自噬成熟抑制剂中的用途，以及hsa‑miRNA‑423‑5p抑制剂在制备治疗肺结核药物中的用途。本发明提供的hsa‑miRNA‑423‑5p在肺结核患者血清中的表达量明显高于健康对照者，并且证实hsa‑miRNA‑423‑5p高表达时，可以导致明显的自噬成熟受阻现象；hsa‑miRNA‑423‑5p表达被抑制时，自噬成熟受阻现象解除，因此，hsa‑miRNA‑423‑5p可以作为治疗肺结核病的良好的靶点。而且hsa‑miRNA‑423‑5p是一种自身就存在的小分子，所以在副作用上比化学药物更具优越性，而且不会引起因重复用药导致耐药肺结核的产生。

Description

hsa-miRNA-423-5p和hsa-miRNA-423-5p抑制剂的用途
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，特别是指hsa-miRNA-423-5p和 hsa-miRNA-423-5p抑制剂的用途。
背景技术
肺结核病是由结核分枝杆菌感染引起的一种肺部疾病。在抗结核分枝杆菌过程中，巨噬细胞起着非常重要的作用，包括吞噬作用和自噬作用等等。而文献(Ponpuak M,etal.Delivery of Cytosolic Components by Autophagic Adaptor Protein p62EndowsAutophagosomes with Unique Antimicrobial Properties. Immunity 32,329-341(2010).)表明，吞噬了结核分枝杆菌的巨噬细胞中自噬溶酶体的形成是一种比吞噬更加有效的清除结核分枝杆菌的途径。在结核病的巨噬细胞研究中，已有文献报道过ESX-1(Romagnoli A,et al.ESX-1dependent impairment of autophagic flux byMycobacterium tuberculosis in human dendritic cells.Autophagy 8,1357-1370(2012))，ESAT-6(Zhang L,et al.Effects of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6/CFP-10Fusion Protein on the Autophagy Function of Mouse Macrophages.DNA CellBiol 31,171-179(2012).)和 TBK-1(Pilli M,et al.TBK-1Promotes Autophagy-MediatedAntimicrobial Defense by Controlling AutophagosomeMaturation.Immunity 37,223-234(2012)) 在干扰自噬溶酶体形成并消灭结核分枝杆菌这一过程中起作用。但是ESX-1、ESAT-6和TBK-1都是蛋白，如果作为药物，难免存在免疫排除和不易于储存运输之类的问题。miRNA作为一种稳定性较好的物质，近年来被广泛研究用来开发为药物。但是，在消灭结核分枝杆菌中起重要作用的自噬溶酶体形成阶段，尚未有人研究miRNA在这一阶段中的作用，并将其作为HDT疗法的靶点进行开发。
目前肺结核的诊断和治疗都是一个非常漫长的过程。1、关于诊断。目前的金标准是细菌培养，所以从病人去医院就诊到确诊需要花费两周甚至更长时间，而检测肺结核病人血清中高表达的miRNA只需2h，所以首先 miRNA-423-5p联合其他指标可以作为肺结核诊断的潜在标志物。2、关于治疗。目前临床治疗肺结核需要达到6个月的用药时间，甚至更长，重复用药会引起耐药肺结核；如果是耐多药肺结核，标准疗程则要达到24个月以上。而抗结核治疗药物对病人的肝肾损伤都比较严重，长时间服用副作用非常大。
Host-directed therapy(宿主导向的治疗，HDT)：就是通过调节改善感染性疾病的宿主细胞的功能，从而来达到治疗效果的一种治疗方法。我们认为可以利用hsa-miRNA-423-5p抑制剂降低吞噬了结核分枝杆菌的宿主细胞(巨噬细胞)的hsa-miRNA-423-5p的表达量至正常水平，从而解除结合分支杆菌对自噬溶酶体形成的抑制作用。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出hsa-miRNA-423-5p和 hsa-miRNA-423-5p抑制剂的用途，hsa-miRNA-423-5p能够阻碍自噬小体成熟， hsa-miRNA-423-5p抑制剂能够使自噬成熟受阻现象解除。
基于上述目的，本发明提供的hsa-miRNA-423-5p在制备自噬成熟抑制剂中的用途；以及hsa-miRNA-423-5p抑制剂在作为治疗肺结核的潜在靶向药物中的用途。
在本发明的一些实施例中，hsa-miRNA-423-5p的核苷酸序列为：5’ -ugaggggcagagagcgagacuuu-3’，其如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的一些实施例中，包括但不限于hsa-miRNA-423-5p能够抑制自噬小体和溶酶体的融合。
本发明的发明人研究发现，hsa-miRNA-423-5p在肺结核病人血清和血液单核细胞(PBMCs)中高表达，通过hsa-miRNA-423-5p mimic转染巨噬细胞发现，miRNA-423-5p高表达时，可以导致明显的自噬成熟受阻现象， hsa-miRNA-423-5p是第一次在miRNA类分子中被发现能够阻碍自噬小体成熟这一现象的。
hsa-miRNA-423-5p是作用于自噬的成熟阶段，自噬成熟阶段形成的自噬溶酶体在消灭结核分支杆菌中具有重要性。本发明的发明人研究还发现： hsa-miRNA-423-5p高表达时，可以导致明显的自噬成熟受阻现象， hsa-miRNA-423-5p能够通过抑制巨噬细胞的自噬溶酶体形成从而影响巨噬细胞对它的清除；hsa-miRNA-423-5p表达被抑制时，自噬成熟受阻现象解除。将hsa-miRNA-423-5p抑制剂溶液转染到肺结核患者的宿主细胞(巨噬细胞)中，hsa-miRNA-423-5p抑制剂可以解除宿主细胞中自噬溶酶体形成的抑制作用。所以该hsa-miRNA-423-5p可以作为自噬成熟抑制剂开发为肺结核的治疗靶点。
在本发明的一些实施例中，hsa-miRNA-423-5p抑制剂可以是直接下调 hsa-miRNA-423-5p表达量的miRNA类物质，也可以是解除自噬溶酶体形成受抑制的其他物质，包括但不限于hsa-miRNA-423-5p的下游靶标基因或相对应的蛋白。
在本发明的一些实施例中，hsa-miRNA-423-5p抑制剂的成分为：5’ -aaagucutcgcucucugccccuca-3’，其如SEQ ID NO:2所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明提供的hsa-miRNA-423-5p在肺结核患者血清中的表达量明显高于健康对照者，并且证实hsa-miRNA-423-5p高表达时，可以导致明显的自噬成熟受阻现象，巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除能力下降；hsa-miRNA-423-5p 表达被抑制时，自噬成熟受阻现象解除，巨噬细胞对结核分枝杆菌的清除能力回升因此，hsa-miRNA-423-5p在作为治疗肺结核病的靶点上具有重要的理论价值和潜在的实用意义。而且hsa-miRNA-423-5p是一种人体自身存在的小分子，所以在副作用上比化学药物更具优越性，而且不会引起因重复用药导致耐药肺结核的产生。
附图说明
图1为hsa-miRNA-423-5p在肺结核患者和健康对照者血清中的表达水平比较图；
图2为hsa-miRNA-423-5p mimic处理巨噬细胞效果图；
图3为hsa-miRNA-423-5p抑制剂处理巨噬细胞效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
实施例1肺结核病患者和健康对照者中的血清hsa-miRNA-423-5p表达水平
1材料
1.1病例样本
1.1.1肺结核病诊断标准
临床诊断依据中国卫生部发布的肺结核病诊断标准和修订的国际结核病控制条例。
凡符合下列项目的肺结核病患者纳入本实施例：①所有病例均依据临床表现、细菌培养和影像学检查，按照国家制定的肺结核诊断标准诊断为肺结核病；②HIV检测为阴性，无结核病史，无慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺炎、肺癌、糖尿病、高血压等并发症，肝肾功能正常，无其他先天性疾病，并排除慢性炎症、自身免疫病等其他疾病，不存在其他手术史，年龄18-65岁。
；符合下列情况之一者为初治：1、从未因结核病应用过抗结核药物治疗的患者。2、不规则化疗未满个月者。
1.1.2病例分组
肺结核患者组：2014年2月-2017年3月，绍兴市立医院收集70例肺结核患者血液样本，其中男43例，女27例，年龄范围在18-72岁，平均37岁；
健康对照者组：2016年7月到2017年3月，体检健康志愿者51例，其中男27例，女24例，年龄范围在21-64岁，平均39岁。经过询问病史和体格检查抽血，血样检测排除肺结核、乙肝、艾滋病、白血病等常见传染病、自体免疫类疾病，排除不合格血样。
本项研究得到浙江大学医学院伦理委员会的批准，并与全部研究对象在实验前签订知情同意书。
1.1.3样本的收集
肺结核患者和健康对照者血样为晨起空腹抽取，釆用一次性真空采血管釆集外周血5.0ml，空腹。
血清的采集：全血采集5ml在釆血管中，4个小时以内4℃，3000rpm离心10分钟，吸取上清；再将上清于4℃，12000rpm离心5分钟后，再次吸取上清后为血清，在冰上将血清分装为200μl/管，保存于-80℃冰箱备用。
2方法
2.1总RNA样本制备
2.1.1血清样本中miRNA提取
(1)将肺结核病患者和健康对照者血清于-80℃中取出，待4℃自然溶解；
(2)应用miRNA提取试剂盒(Tiangen DP503)，按照说明书要求提取血清中的miRNA。
(3)每200μl血清或血浆中加入900μl裂解液MZA，振荡器振荡混匀30 sec至完全匀浆，颠倒混匀。
(4)室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
(5)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min。
(6)12,000rpm(～13,400×g)，4℃，离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，白色的中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作。
(7)量取转移液的体积，缓慢加入转移液2倍体积的无水乙醇(如：500μl 的转移液加1ml无水乙醇)，混匀(此时可能会出现沉淀)。将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱miRelute，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱miRelute。
(8)向吸附柱miRelute中加入700μl去蛋白液MRD(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
(9)向吸附柱miRelute中加入500μl漂洗液RW(请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液。
(10)重复步骤(9)一次。
(11)室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min，弃收集管miRelute转入一个新的RNase-Free 1.5ml离心管中，向吸附膜中心位置加15-30μl RNase-Free ddH2O，室温放置2min，室温12,000rpm(～13,400×g)离心2min。
将收集到的离心液保存于-80℃冰箱备用。
2.1.2总miRNA的c-DNA的制备
1)设计引物序列：
采用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒(Tiangen KR211)
miRNA-4X逆转录(RT)引物使用Oligo(dT)-Universal Tag通用逆转录引物。
2)c-DNA制备：
解冻2×miRNA RT Reaction Buffer并混匀，miRNA RT Enzyme Mix放于冰中备用，在冰上预冷RNase Free的反应管内加入以下试剂至总体积20μl(最后加入miRNA RTEnzyme Mix)，如表1所示。
表1反转录反应体系
组分 反应体系
total RNA 2μg
2×miRNA RT Reaction Buffer 10μl
miRNA RTEnzyme Mix 2μl
RNase-Free ddH2O 至20μl
移液器轻轻混匀上述配制的反应液，按下表程序进行miRNA的逆转录反应：
逆转录反应条件：
合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存。
2.1.3Real-time PCR法检测hsa-miRNA-423-5p的表达量
采用lightcycler 480SYBR Green I master(购自Roche公司4887352001) 检测hsa-miRNA-423-5p的表达量
1)设计引物序列如下：
hsa-miRNA-423-5p上游引物：5’-TGAGGGGCAGAGAGCGAGACTT-3’；
hsa-miRNA-423-5p下游引物：Tiangen,Cat.No.CD109。
表2hsa-miRNA-423-5p Real-time PCR反应体系
组分 反应体系
RNase-Free ddH2O 3μl
PCR primer-F 1μl
PCR primer-R 1μl
Master Mix(2x) 10μl
Template(cDNA) 5μl
Total volume 20μl
充分混匀，简要离心后放置冰上。
Real-time PCR反应条件
在Roch480II Real-time PCR System中进行荧光定量PCR反应，反应参数设置为：
反应结束后进行数据分析。
2.1.4数据处理及统计分析
miRNAs荧光定量PCR数据分析是以在血清样本中存在稳定表达的 miR-16作为内参对照，miRNAs相对表达量用2-ΔΔCt方法进行计算，-ΔΔCt＝ (Ct miRNA-Ct hsa-miRNA-423-5p)实验组-(Ct miRNA-Ct hsa-miRNA-423-5p) 对照组平均值；实验设立阴性对照和重复实验，阴性对照反应体系中加ddH2O，所有荧光定量PCR均做3次重复。NonparametricMann-Whitney test方法统计 miRNAs在不同组之间的差异表达水平(统计学上认为p<0.05时，具有显著性差异；p<0.01时，具有极显著性差异)。
由试验结果(图1)可知，与健康对照组相比，hsa-miRNA-423-5p在肺结核患者血清中的水平显著升高，差异具有统计学意义。
实施例2hsa-miRNA-423-5p阻断自噬小体成熟
hsa-miRNA-423-5p模拟物(简称hsa-miRNA-423-5p mimic)，其为体外合成核酸片段5’-ugaggggcagagagcgagacuuu-3’，真空冷冻干燥粉剂-20℃保存。将hsa-miRNA-423-5p模拟物粉剂用RNase free ddH2O常温溶解至20uM，并分装保存。该hsa-miRNA-423-5p溶液，以100nM浓度体外转染人巨噬细胞THP-1。
激光共聚焦显微镜检测自噬小体和溶酶体共定位情况。试验结果见图2。在图2中，与对照相比，黄点/(黄点+绿点)的比例低，说明自噬成熟受阻，由图2可知，hsa-miRNA-423-5p mimic可以导致明显的自噬成熟受阻现象。进一步地，检测了一种介导自噬小体成熟的蛋白VPS33A的表达量，发现在 hsa-miRNA-423-5p mimic处理组中明显下降(VPS33A蛋白表达量下降约 40％)。
实施例3hsa-miRNA-423-5p抑制剂解除自噬成熟受阻现象
hsa-miRNA-423-5p抑制剂，其为体外合成核酸片段5’ -aaagucutcgcucucugccccuca-3’，将hsa-miRNA-423-5p抑制剂粉剂用RNase free ddH2O常温溶解至20uM，并分装保存。该hsa-miRNA-423-5p抑制剂溶液，以100nM浓度体外转染人巨噬细胞THP-1。
激光共聚焦显微镜检测自噬小体和溶酶体共定位情况。试验结果见图3。在图3中，与hsa-miRNA-423-5p mimic处理组相比，黄点/(黄点+绿点)的比例回升，说明自噬成熟受阻被解除，由图3可知，hsa-miRNA-423-5p抑制剂可以导致自噬成熟受阻现象解除。进一步地，检测了一种介导自噬小体成熟的蛋白VPS33A的表达量，发现在hsa-miRNA-423-5p抑制剂处理组中明显回升(VPS33A蛋白表达量上调约20％)。
实施例4hsa-miRNA-423-5p抑制剂对结核分支杆菌的清除作用
以下试验在浙江大学附属第一医院传染病诊治国家重点实验室进行。
第一部分结核分枝杆菌体外浸染巨噬细胞
1.试验方法
1.1活菌与灭活结核分枝杆菌的菌液的制备
将结核分枝杆菌H37Rv接种于米氏7H9液体培养基，37℃震荡培养2-3 周至对数生长期，500g离心20min用含有0.05％Tween-80的灭菌生理盐水重悬，小心混匀，用细菌浓度比浊仪测定其浊度，配制成含菌量为5×108CFU/mL 的菌悬液，-20℃临时保存备用。-80℃长期保存。
把培养好的活菌H37Rv通过热杀死转变成灭活菌，用上述方法制成灭活的菌液。
1.2结核分枝杆菌浸染巨噬细胞
将实验分成两组，即活菌H37Ra组和灭活菌H37Rv组，向巨噬细胞 THP-1中加入等量活菌H37Ra或灭活菌H37Rv，结核分支杆菌和巨噬细胞的比例为10：1，37℃培养24h。
1.用抗酸染色法对细菌进行染色计数，在显微镜下观察吞噬情况并计算结核分枝杆菌的被清除率。2.同时采用激光共聚焦显微镜检测自噬小体和溶酶体共定位情况。3.荧光定量PCR测定hsa-miRNA-423-5p的表达量。
2.试验结果
2.1hsa-miRNA-423-5p的表达水平
试验结果表明，与无毒力组相比，hsa-miRNA-423-5p在有毒力组中的表达水平显著升高，差异具有统计学意义。
2.2自噬溶酶体形成情况
激光共聚焦显微镜检测自噬小体和溶酶体共定位情况。与吞噬了灭活菌 H37Rv的巨噬细胞(无毒力组)相比，吞噬了活菌H37Ra的巨噬细胞(有毒力组)中，黄点/(黄点+绿点)的比例低，说明自噬溶酶体形成受阻。
2.3结核分枝杆菌的残留量
抗酸染色后，单位体积中，有毒力组中结核分枝杆菌的被清除率比无毒力组下降了60％，差异具有统计学意义。
第二部分hsa-miRNA-423-5p抑制剂对结核分支杆菌的清除作用
hsa-miRNA-423-5p抑制剂，其为体外合成核酸片段5’-aaagucutcgcucucugccccuca-3’，将hsa-miRNA-423-5p抑制剂粉剂用RNase free ddH2O常温溶解至20uM，并分装保存。将hsa-miRNA-423-5p抑制剂溶液，以100nM浓度体外转染有毒力组中。用抗酸染色法染色计数，在显微镜下观察吞噬情况并计算结核分枝杆菌的被清除率。同时采用激光共聚焦显微镜检测自噬小体和溶酶体共定位情况。荧光定量PCR测定hsa-miRNA-423-5p的表达量。
试验结果表明，与没有转染hsa-miRNA-423-5p抑制剂的对照组相比，转染了hsa-miRNA-423-5p抑制剂的毒力组中hsa-miRNA-423-5p表达水平回落。同时，与没有转染hsa-miRNA-423-5p抑制剂的对照组相比， hsa-miRNA-423-5p抑制剂转染组中，黄点/(黄点+绿点)的比例显著回升，说明自噬成熟受阻被解除。抗酸染色后，与没有转染hsa-miRNA-423-5p抑制剂的对照组相比，hsa-miRNA-423-5p抑制剂转染组中，结核分支杆菌的残留量下降(被清除率上升)。
从上述内容可知，本发明提供的hsa-miRNA-423-5p在肺结核患者血清和PBMCs中的表达量明显高于健康对照者，并且证实hsa-miRNA-423-5p高表达时，可以导致明显的自噬成熟受阻现象，巨噬细胞中VPS33A表达下调； hsa-miRNA-423-5p表达被抑制时，自噬成熟受阻现象解除，巨噬细胞中 VPS33A表达升高，因此，hsa-miRNA-423-5p可以作为治疗肺结核病的良好的靶点，并具有重要的理论价值和潜在的实用意义。而且hsa-miRNA-423-5p是一种自身就存在的小分子，所以在副作用上比化学药物更具优越性，而且不会引起因重复用药导致耐药肺结核的产生。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 李继承
<120> hsa-miRNA-423-5p和hsa-miRNA-423-5p抑制剂的用途
<130> FI180113
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> 人工序列
<223> hsa-miRNA-423-5p
<400> 1
ugaggggcag agagcgagac uuu 23
<210> 2
<211> 24
<212> 人工序列
<223> hsa-miRNA-423-5p抑制剂
<400> 2
aaagucutcg cucucugccc cuca 24

Claims (6)

1.hsa-miRNA-423-5p在制备自噬成熟抑制剂中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，hsa-miRNA-423-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，包括但不限于hsa-miRNA-423-5p能够抑制自噬小体和溶酶体的融合。
4.hsa-miRNA-423-5p抑制剂在作为治疗肺结核的潜在靶向药物中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，hsa-miRNA-423-5p抑制剂可以是直接下调hsa-miRNA-423-5p表达量的miRNA类物质，也可以是解除自噬溶酶体形成受抑制的其他物质，包括但不限于hsa-miRNA-423-5p的下游靶标基因或相对应的蛋白。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，hsa-miRNA-423-5p抑制剂的成分为：5’-aaagucutcgcucucugccccuca-3’，其如SEQ ID NO:2所示。
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