JP6796290B2 - バクテリアル・トランスロケーションの防止又は抑制のための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、被験体内でバクテリアル・トランスロケーション（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を防止（もしくは予防）又は抑制するための組成物に関する。具体的には、当該組成物は、有効成分として水素ガス又は溶存水素を含むことを特徴とする。

バクテリアル・トランスロケーションは、腸管内に存在する細菌やその死菌が何らかの原因で腸管壁（もしくは腸管上皮）を通過し、腸管膜リンパ節から遠隔臓器に移行することである。バクテリアル・トランスロケーションが起こる原因として、腸管内常在細菌叢の変化、腸管上皮細胞の防御能低下、宿主免疫機能の低下などが挙げられている。

バクテリアル・トランスロケーションが原因又は一部原因となって発症する又は憎悪する疾患には、感染源の特定ができない感染症、敗血症、高度侵襲時の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、多臓器機能不全症候群（ＭＯＦ）などが含まれる（非特許文献１）。

このため、バクテリアル・トランスロケーションを抑制するための臨床的な管理が、上記疾患等を予防するうえで重要である。しかしながら、バクテリアル・トランスロケーションを抑制する薬剤としては、グルタミン（非特許文献２）などわずかな物質が知られているに過ぎない。

このような状況において、本発明者らは、バクテリアル・トランスロケーションを抑制するための物質として水素に注目してきた。

これまで水素ガス（もしくは水素分子）又は水素溶存水を治療に用いる試みとして、例えば皮膚疾患、癌、敗血症などの治療用途に用いる提案が報告されている（特許文献１、特許文献２、非特許文献３）。例えば非特許文献３には、敗血症動物モデルに分子状水素又は水素溶存水を吸入又は給与し、炎症性サイトカインやケモカインが減少したこと、また敗血症関連の臓器損傷に対する有益な効果があることなどが記載されている。しかしながら、実際に水素による臨床効果についての報告は極めて少ない。

特開２０１６−１９０８３３号公報 特開２０１６−１１３４２５号公報

Ｍｏｏｒｅ ＦＡ ｅｔ ａｌ， Ｊ Ｔｒａｕｍａ １９８９； ２９：９１６−９２３ Ｃｈｕｎ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９９７； ３２（２）：１８９−１９５ Ｘｉｅ Ｋ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｖｏｌ． ２０１４， Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ８０７６３５， ９ ｐａｇｅｓ

上記のとおり、もしバクテリアル・トランスロケーションが防止（もしくは予防）又は抑制することができるならば、敗血症などの上記疾患の発症又は憎悪抑制につながることが期待される。

本発明は、バクテリアル・トランスロケーションの防止（もしくは予防）又は抑制のための薬剤として水素を使用することを目的とする。

本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）水素ガス又は溶存水素を有効成分として含む、被験体内でバクテリアル・トランスロケーションを防止又は抑制するための組成物。
（２）敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）又は多臓器機能不全症候群（ＭＯＦ）の発症もしくは悪性化をさらに防止又は抑制する、上記（１）に記載の組成物。
（３）被験体の腸組織の損傷を改善する、上記（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）被験体の腸内細菌叢における悪玉菌の異常増殖を抑制する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）悪玉菌がエンテロバクテリア科である、上記（４）に記載の組成物。
（６）水素ガス含有気体又は水素溶存液体の形態である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）水素ガス含有気体の水素濃度が、０．５〜１８．５体積％である、上記（６）に記載の組成物。
（８）水素溶存液体の水素濃度が、１〜１０ｐｐｍである、上記（６）に記載の組成物。
（９）被験体への組成物の投与が、経肺投与又は経口投与である、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）経肺投与が、１．０２〜７．０気圧の高気圧環境下で行われる、上記（９）に記載の組成物。
（１１）投与時に水素ガス供給装置又は水素添加器具を用いてその場で作製される、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の組成物。

本発明により、溶存水素又は水素ガスの投与によって、腸バリア障害（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｒｒｉｅｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）及び腸内細菌叢の細菌種組成異常（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）の低減とともに、バクテリアル・トランスロケーション（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を防止又は抑制することを可能にし、それによって敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）又は多臓器機能不全症候群（ＭＯＦ）の発症もしくは悪性化をさらに防止又は抑制するために、また患者の応急処置や予後改善のために、極めて有用な新規療法が提供される。

超過飽和濃度水素溶存生食水（Ｓｕｐｅｒ ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｓａｌｉｎｅ）による敗血症マウスモデルの生存率の改善を示す。図中、「ｓｈａｍ」は、擬似群（ｎ＝６）であり、「Ｈ２」は、超過飽和濃度水素溶存生食水群（ｎ＝２６）であり、「ｓａｌｉｎｅ」は、生理食塩水（「生食水」ともいう）群（ｎ＝２６）である。^＊ｐ＜０．０５、^＃ｐ＜０．０１（「ｐ」はｌｏｇ−ｒａｎｋテストによる危険率を表す。）。 超過飽和濃度水素溶存生食水による敗血症マウスモデルの腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）内でのバクテリアル・トランスロケーションの抑制を示す。図中、（Ａ）は、ＭＬＮを、盲腸結紮・破裂（ＣＬＰ）の２４時間後に無菌的に取り出し、ＭａｒＣｏｎｋｅｙアガープレート及びＴＳＡアガープレート上で２４時間平板培養したときの培養物を示す。また、（Ｂ）は、ＭａｒＣｏｎｋｅｙアガープレートの細菌数を、コロニー形成単位（ｌｏｇＣＦＵ）／ｇの平均±ＳＤとして表した（ここで「ＳＤ」は標準偏差である。）。また、図中、「ｓｈａｍ」は、擬似群であり、「Ｈ２」は、超過飽和濃度水素溶存生食水群であり、「ｓａｌｉｎｅ」は、生理食塩水（「生食水」ともいう）群である。１群あたりｎ＝３〜６である。^＊ｐ＜０．０５、^＃ｐ＜０．０５（「ｐ」はｌｏｇ−ｒａｎｋテストによる危険率を表す。）。 超過飽和濃度水素溶存生食水による、敗血症に関連した腸上皮過透過性の減衰を示す。図中、「ｓｈａｍ」は、擬似群であり、「Ｈ２」は、超過飽和濃度水素溶存生食水群であり、「ｓａｌｉｎｅ」は、生理食塩水（「生食水」ともいう）群である。１群あたりｎ＝８である。^＊ｐ＜０．０５（「ｐ」はｌｏｇ−ｒａｎｋテストによる危険率を表す。）。 超過飽和濃度水素溶存生食水による、敗血症マウスモデルの腸形態学的障害からの保護と密着結合タンパク質（ＺＯ−１）の局在を示す。盲腸結紮・破裂（ＣＬＰ）の２４時間後の小腸（回腸末端部）のヘマトキシリン−エオシン（Ｈ−Ｅ）染色顕微鏡像（倍率×２００）及び蛍光抗体染色顕微鏡像（倍率×４００；ＺＯ−１が緑であり、核が青である）である。図中、「ｓｈａｍ」は、擬似群であり、「Ｈ２」は、超過飽和濃度水素溶存生食水群であり、「ｓａｌｉｎｅ」は、生理食塩水（「生食水」ともいう）群である。 超過飽和濃度水素溶存生食水による、敗血症マウスモデルの腸内でのエンテロバクテリアの過剰増殖の抑制を示す。図中、（Ａ）は、盲腸結紮・破裂（ＣＬＰ）後０日目（Ｄａｙ ０）、１日目（Ｄａｙ １）及び７日目（Ｄａｙ ７）の腸内細菌組成の連続的変化を示す。また、（Ｂ）は、盲腸結紮・破裂（ＣＬＰ）後の０日目及び１日目のマウス糞便１ｇあたりのエンテロバクテリアの菌数の定量結果（ｌｏｇ（細胞数）／ｇ-糞便）を示す。データは、平均±ＳＤとして表し、１群あたりｎ＝８である。図中、「Ｈ２」は、超過飽和濃度水素溶存生食水群であり、「ｓａｌｉｎｅ」は、生理食塩水（「生食水」ともいう）群である。 超過飽和濃度水素溶存生食水による、敗血症マウスモデル腸の酸化ストレスの低減を示す。腸のマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベル（ｎｍｏｌ／ｍｇ−腸組織）の定量によって酸化ストレスの程度を表した。データは、平均±ＳＤとして表し、１群あたりｎ＝４〜５である。^＊ｐ＜０．０５（「ｐ」はｌｏｇ−ｒａｎｋテストによる危険率を表す。）。図中、「ｓｈａｍ」は、擬似群であり、「Ｈ２」は、超過飽和濃度水素溶存生食水群であり、「ｓａｌｉｎｅ」は、生理食塩水（「生食水」ともいう）群である。 超過飽和濃度水素溶存生食水による、敗血症マウスモデルの腸組織内での炎症反応の低減を示す。小腸（回腸末端部）内の誘導型一酸化窒素合成酵素（inducible nitric oxide synthase（ｉＮＯＳ））、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β）の炎症メディエーターの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析による発現レベル（任意単位）を示す。データは、平均±ＳＤとして表し、１群あたりｎ＝５〜６である。^＊ｐ＜０．０５、^＃ｐ＜０．０５、^†ｐ＜０．０５（ここで、「ｐ」はｌｏｇ−ｒａｎｋテストによる危険率を表す。）。図中、「ｓｈａｍ」は、擬似群であり、「Ｈ２」は、超過飽和濃度水素溶存生食水群であり、「ｓａｌｉｎｅ」は、対照としての生理食塩水（「生食水」ともいう）群である。

本発明をさらに具体的に説明する。

上記のとおり、本発明は、水素ガス又は溶存水素を有効成分として含む、被験体内でバクテリアル・トランスロケーションを防止又は抑制するための組成物を提供する。

本明細書中、バクテリアル・トランスロケーションに関して「防止」という用語は、被験体において何らかの原因でバクテリアル・トランスロケーションが起こって敗血症などの疾患を発症することを防止もしくは予防することを意味する。また、バクテリアル・トランスロケーションに関して「抑制」とは、被験体がバクテリアル・トランスロケーションを介して敗血症などの疾患を発症したとき、バクテリアル・トランスロケーションを抑制することによって当該疾患の重症化（すなわち、症状の悪化）を回避することを意味する。

本明細書中、「バクテリアル・トランスロケーション」という用語は、腸管内に存在する細菌やその死菌が何らかの原因で腸管壁（もしくは腸管上皮）を通過し、腸管膜リンパ節から遠隔臓器に移行することを指す。バクテリアル・トランスロケーションによって生菌又は死菌、場合によりエンドトキシン等の毒素が血中に入り全身をめぐり敗血症を発症する。敗血症患者はさらに悪化すると全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）や多臓器機能不全症候群（ＭＯＦ）を発症し、場合により死に至る。敗血症の治療は、通常、原因となる細菌を特定し、その細菌に有効な抗生物質等の薬剤を患者に投与することによって行われる。

術後敗血症に罹患したヒト患者において、バクテリアル・トランスロケーションを介して腸管膜リンパ節に達する細菌群は、文献（Ｏ’Ｂｏｙｌｅ ＣＪ ｅｔ ａｌ．， Ｇｕｔ １９９８； ４２：２９−３５）によると、その全細菌のうち約６０％以上がエンテロバクテリア科（ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌であり、そのうち最も比率の高い細菌群がエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、特に大腸菌であり、その他、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属細菌、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属細菌、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌などが含まれる。

腸内細菌の腸管上皮透過性が起こる原因として、例えば応急手術、感染症、炎症性腸疾患、腸内細菌の異常増殖、腸粘膜組織の損傷、免疫機能の低下などに起因してバクテリアル・トランスロケーションが起こると言われている（上記Ｏ’Ｂｏｙｌｅ，１９９８）。実際に敗血症などの疾患が発症する割合は、１０〜１５％程度の患者であるが、そのような患者に対して本発明の組成物はバクテリアル・トランスロケーションを防止（もしくは予防）又は抑制する上で有効である。

このように本発明によれば、被験体に水素ガス又は溶存水素液体を投与することによってバクテリアル・トランスロケーションを防止又は抑制することができる。この事実は、図２に示されるようにマウスモデルでの腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）内での腸内細菌数の減少や、図３に示されるように腸管上皮からの腸内細菌の過透過性の低減の証拠からも明らかである。

これまで、水素ガス又は溶存水素液体が敗血症の治療剤になる可能性が指摘されており（非特許文献３）、具体的には、水素には、患者の血清や組織内で炎症性サイトカインやケモカインのレベルが低下することから抗炎症作用がある、組織の酸化性損傷を低減することから抗酸化作用があるなどが報告されている。しかし、これまで、水素自体がバクテリアル・トランスロケーションを防止又は抑制する能力を有することは知られていなかった。

上記のとおり、本発明によれば、バクテリアル・トランスロケーションを防止又は抑制することができるならば、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）又は多臓器機能不全症候群（ＭＯＦ）の発症もしくは悪性化をさらに防止又は抑制することが可能になるため、本発明の組成物は、このような疾患の発症を防止し、あるいは、敗血症がＳＩＲＳやＭＯＦに重症化することを防止又は抑制することができる。図１に示されるように、敗血症マウスモデルに溶存水素液体を投与することによって生存率が有意に改善される。

このように敗血症の発症や、敗血症発症後の重症化を防止又は抑制するうえで、本発明の組成物の有効成分としての水素がもつ、例えば、被験体の腸組織の損傷を改善する作用、被験体の腸内細菌叢における悪玉菌（例えばエンテロバクテリア科細菌）の異常増殖を抑制する作用などが有意に働くためであると考えられる。エンテロバクテリア科細菌の異常増殖は、図５に示されるように敗血症マウスモデルでも観察されている。

さらにまた、腸組織の損傷の改善については、図６に示されるように水素による処置後のＭＤＡレベルの低下、すなわち酸化ストレスの低減、図７に示されるように水素による処置後の腸組織における炎症メディエーター（ＴＮＦ−α、ｉＮＯＳ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６等）レベルの低下、ならびに、図４に示されるように敗血症マウスモデルの腸形態学的障害からの保護と密着結合タンパク質（ＺＯ−１）の局在が明確に証明されている。当該炎症メディエーターは、組織の炎症部位に浸潤したマクロファージや血管内皮細胞などから放出され、血管透過性亢進、アポトーシス、組織破壊などを引き起こす。

本発明の組成物の有効成分である水素ガス又は溶存水素の好ましい形態はそれぞれ、水素ガス含有気体又は水素溶存液体の形態である。

水素ガス含有気体は、具体的には、水素ガスを含む空気又は、水素ガスと酸素ガスを含む混合ガスである。水素ガス含有気体の水素ガスの濃度は、１８．５体積％以下、例えば０．５〜１８．５体積％であり、好ましくは１〜１０体積％、例えば２〜８体積％、３〜６体積％、より好ましくは４〜６体積％、例えば４〜５体積％である。水素ガス以外の気体が空気であるときには、空気の濃度は、例えば８１．５〜９９．５体積％の範囲であるし、また、水素ガス以外の気体が酸素ガスを含む気体であるときには、酸素ガスの濃度は、例えば２１〜９９．５体積％の範囲であり、その他の主気体として窒素ガスを含有させることができるし、さらに空気中に含有する気体である二酸化炭素などのガスを、空気中の存在量程度の量で含有させてもよい。いずれにしても水素は可燃性かつ爆発性ガスであるため、ヒトなどの被験体に安全なレベルになるように組成物に含有させ、被験体に投与させるべきである。

水素溶存液体は、具体的には、水素ガスを溶存させた水性液体であり、ここで、水性液体は、例えば水、生理食塩水、緩衝液（例えばｐＨ４〜７．４の緩衝液）、エタノール含有水（例えばエタノール含有量０．１〜２体積％）、などである。水素溶存液体の水素濃度は、１〜１０ｐｐｍ、好ましくは２〜８ｐｐｍ、さらに好ましくは３〜７ｐｐｍである。

水素ガス含有気体又は水素溶存液体は、所定の水素ガス濃度になるように配合されたのち、耐圧容器（例えばアルミ缶、ペットボトルなど）に充填される。あるいは、水素ガス含有気体又は水素溶存液体は、公知の水素ガス供給装置又は水素添加器具を用いてその場で作製されてもよい。

水素ガス供給装置は、水素発生剤（例えば金属アルミニウムなど）と水の反応により発生する水素ガスを、希釈用ガス（例えば空気、酸素など）と所定の比率で混合することを可能にする（特許第５２２８１４２号等）。あるいは、水の電気分解を利用して発生した水素ガスを、希釈ガスと混合する（特許第５５０２９７３号、特許第５９００６８８号など）。これによって０．５〜１８．５体積％の範囲内の水素濃度の水素ガス含有気体を調製することができる。

水素添加器具は、水素発生剤とｐＨ調整剤を用いて水素を発生し、水などの生体適用液に溶存させる装置である（特許第４７５６１０２号、特許第４６５２４７９号、特許第４９５０３５２号、特許第６１５９４６２号、特許第６１７０６０５号、など）。水素発生剤とｐＨ調整剤の組み合わせは、例えば、金属マグネシウムと強酸性イオン交換樹脂もしくは有機酸（例えばリンゴ酸、クエン酸など）、金属アルミニウム末と水酸化カルシウム粉末、などである。これによって１〜１０ｐｐｍの溶存水素濃度の水素溶存液体を調製できる。

本発明の組成物を被験体に投与する方法としては、水素ガスを有効成分とするとき、例えば吸入等による経肺投与が好ましい、また、溶存水素液体を有効成分とするとき経口投与が好ましい。ガスを吸入するときには、口と鼻を覆うマスク型の器具を介して口又は鼻からガスを吸入して肺に送り、血液を介して全身に送達することができる。経口投与する溶存水素液体は、好ましくは低温下に保存し、冷却した液体を被験体に投与する。

上記水素濃度の水素ガス含有気体又は上記溶存水素濃度の水素溶存液体を１日あたり１回又は複数回（例えば２〜３回）、1週間〜６か月又はそれ以上、好ましくは２週間〜３か月の期間にわたり被験体に投与することができる。水素ガス含有気体が投与されるときには、１回あたり例えば１０分〜２時間もしくはそれ以上、好ましくは２０分〜４０分かけて投与することができる。また、水素ガス含有気体を吸入によって経肺投与するときには、大気圧下で、或いは、例えば標準大気圧（約１．０１３気圧をいう。）を超える且つ７．０気圧以下の範囲内の高気圧、例えば１．０２〜７．０気圧、好ましくは１．０２〜５．０気圧、より好ましくは１．０２〜４．０気圧、さらに好ましくは１．０２〜１．３５気圧の範囲内の高気圧環境下で被験体に当該気体を投与することができる。高気圧環境下での投与によって被験体での水素の体内吸収が促進される。

上記高気圧環境は、例えば、内部に空気を圧入して標準大気圧を超える且つ７．０気圧以下の高気圧を内部に形成することが可能である、十分な強度をもつように設計された高気圧カプセルの使用によって作ることができる。高気圧カプセルの形状は、耐圧性であるため、全体的に角がない丸みを帯びていることが好ましい。また高気圧カプセルの材質は、軽量、高強度であることが好ましく、例えば強化プラスチック、炭素繊維複合材、チタン合金、アルミ合金などを挙げることができる。被験体は、上記高気圧カプセル内で酸素ガスもしくは空気とともに水素ガスを含む組成物の投与を受ける。

本明細書中、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば、ヒトを含む霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類、イヌ、ネコなどのペット動物、動物園などの観賞用動物などを含む。好ましい被験体はヒトである。

以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例に制限されないものとする。

[実施例１]
＜水素ガス溶存液の投与によるバクテリアル・トランスロケーションの抑制＞
Ｉ．実験
［１］敗血症動物モデル
体重２０〜２５ｇの６週齢雄Ｃ５７／ＢＬ６マウスに対し、盲腸結紮・破裂（ｃｅｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｎｃｔｕｒｅ；ＣＬＰ）を実施して敗血症モデルを作製した。簡単に説明すると、マウスを麻酔し、１ｃｍの腹部正中切開を行って盲腸を露出したのち、盲腸上端から１ｃｍ離れた部位を結紮し、２３ゲージの針を１箇所に刺して破裂させて中等度のＣＬＰ（（注）４０％が７日生存した。）を実施した。盲腸を腹部に戻し、切開部を縫合した。その直後に、すべてのマウスに生食水（５０ｍＬ／ｋｇ体重）を皮下注射して蘇生させた。

［２］実験プロトコル
この実験のプロトコルを、擬似群（ｓｈａｍ）と、生食水治療群（ｓａｌｉｎｅ）と、超過飽和濃度水素溶存生食水治療群（Ｈ２）とに分けた。擬似群は、ＣＬＰ手術を実施しなかった健常対照とした。生食水治療群では、１日あたり１５ｍｌ／ｋｇの生食水を７日間、強制的に給与された。Ｈ２群では、１日あたり同量の超過飽和濃度水素溶存生食水を７日間、強制的に給与された。この超過飽和濃度水素溶存生食水は、製造業者（ＭｉＺ株式会社）の製法に従って７ｐｐｍ水素ガス溶存液として作製された。

［腸透過性］
腸上皮透過性を決定するために、伝統的に腸粘膜透過を評価するために使用されている４．４ｋＤａのフルオレセインイソチオシアネート標識デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の血中への出現量を測定した。そのために、マウスに対し、擬似処置又はＣＬＰ処置の２１時間後に、リン酸緩衝化生食水（ＰＢＳ）中の２５ｍｇ／ｍＬ ＦＩＴＣ−デキストラン０．２ｍＬを強制的に給与した。３時間後、心臓刺針によってマウスから血液サンプルを採取した。この血液を４℃、３０００×ｇで１０分間遠心分離にかけ、血漿を、ＳＨ９０００Ｌａｂ蛍光マクロプレートリーダー（Ｃｏｒｏｎａ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）を用いて、励起波長４８０ｎｍ及び発光波長５２０ｎｍで測定した。血漿中のＦＩＴＣ−デキストランの濃度は、標準としてＦＩＴＣ−デキストランの希釈系列によって測定された。

［バクテリアル・トランスロケーションの測定］
バクテリアル・トランスロケーションは、文献記載の方法（Ｄｅｉｔｃｈ ＥＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ ８４：３６−４２， １９８９）によって評価された。簡単に説明すると、５〜６個の腸管膜リンパ節（ＭＬＮ）を、ＣＬＰの２４時間後に無菌的に取り出し、その重量を測り、ＰＢＳ中でホモジナイゼーションして、５０ｍｇ／ｍＬ濃度にした。１０倍連続希釈の懸濁液を、５％ヒツジ血液を含むトリプシン処理ダイズアガー（ＴＳＡ）プレート上で、及び、ＭａｒＣｏｎｋｅｙアガープレート上で平板培養して、それぞれ、全細菌及びグラム陰性細菌を増殖した。２つのプレートを、３７℃のインキュベーター内で２４時間嫌気培養したのち、コロニー数を計数した。ＭＬＮ中の細菌数を、ＭＬＮ組織１ｇあたりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）で表した。

［１６Ｓ ｒＲＮＡ配列決定によるマイクロバイオームの測定］
ＣＬＰ後０日目、１日目、３日目及び７日目に、マウスからの糞便サンプルを回収し、マイクロバイオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）を測定した。具体的には、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ ＤＮＡ抽出キット（ＭＯＢＩＯ）を用いて糞便サンプルからＤＮＡを抽出し、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ Ｒｅａｄｙ Ｍｉｘ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲに使用したプライマーセットは、７８４Ｆ：５'−ＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴ−３'（配列番号１）及び１０６１Ｒ：５'−ＣＲＲＣＡＣＧＡＧＣＴＧＡＣＧＡＣ−３'（配列番号２;ここでＲ＝Ａ又はＧ）であり、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ５−Ｖ６領域を標的とする（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ＡＦ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ３：ｅ２８３６，２００８）。ＤＮＡライブラリーは、製造業者の説明書に従いＩｏｎ ＰＧＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｈｉ−Ｑ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて作製された。また、配列決定は、Ｉｏｎ ＰＧＭ シークエンサー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で２つの３１８チップとＩｏｎ ＰＧＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｈｉ−Ｑ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行われた。決定された配列をＱＩＩＭＥ ｐｉｐｅｌｉｎｅ（Ｃａｏｒａｓｏ ＪＧ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：３３５−３３６，２０１０）を用いて解析した。

［エンテロバクテリア科の定量分析］
核酸抽出のための各糞便サンプルの重さを測り、９容量のＰＢＳ（−）に懸濁して糞便ホモジネート（１００ｍｇ糞便／ｍＬ）を作った。従来の記載のとおりに細菌ＤＮＡを抽出した（Ｍａｔｓｕｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７０：１６７−１７３，２００４）。簡単に説明すると、２００μＬの糞便ホモジネート又は細菌培養物に、ガラスビーズ（０．３ｇ；直径０．１ｍｍ；ＢｉｏＳｐｅｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、３００μｌ Ｔｒｉｓ−ＳＤＳ溶液及び５００μｌ ＴＥ飽和フェノールを加え、その混合物を、ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４ホモジナイザー（Ｍ．Ｐ． Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて、パワーレベル５．０で３０秒間激しくボルテックスした。４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離したのち、懸濁液４００μＬを回収し、等量（容量）のフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２４：１）を上清に加えた。さらに４℃、２０００×ｇで５分間遠心分離したのち、懸濁液２５０μＬを回収し、イソプロパノール沈降にかけた。最後に、２００μＬ ＴＥバッファーに懸濁し、−３０℃で保存した。リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて行い、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、細菌ｒＲＮＡ遺伝子の量を定量した。エンテロバクテリア科に特異的なプライマーセット、Ｅｎ−ｌｓｕ−３Ｆ： ５'−ＴＧＣＣＧＴＡＣＴＴＣＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＡ−３'（配列番号３）及びＥｎ−ｌｓｕ−３'Ｒ： ５'−ＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＣ−３'（配列番号４）を使用した（Ｋｕｒａｋａｗａ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１３；９２（２）：２１３−２１９）。各反応で、プライマーを１μＭの濃度で加えた。増幅プログラムは、９５℃５分を１サイクルと、その後の、９４℃２０秒、５５℃２０秒及び７２℃５０秒からなる。各サイクルの最後のステップで蛍光産物が検出された。融解曲線分析を増幅後に行い、標的指向されたＰＣＲ産物を非標的産物と区別した。融解曲線は、連続的蛍光コレクションを用い、０．２℃／秒の速度で６０〜９５℃の温度でゆっくり加熱することによって得られた。ｑＰＣＲ増幅及び検出を、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、３８４ウエル光学プレート内で行った。標準曲線は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＣＭ１６４９から抽出されたＤＮＡの定量サイクル（Ｃｑ）値を用いて作成された。この細菌株の細菌数は、文献記載のＤＡＰＩ染色法を用いて顕微鏡観察によって測定された（Ｊａｎｓｅｎ ＧＪ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７：２１５−２２１，１９９９）。このアッセイの直線範囲におけるＣｑ値を、同じ実験で作成された分析曲線に使用して、各核酸サンプル中の対応する細菌数を得、これをサンプルあたりの細菌数に変換した。

［ＲＴ−ＰＣＲによる腸内炎症メディエーターのｍＲＮＡ発現］
小腸（回腸末端部）内のｉＮＯＳ、定量サイクル腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン１β（ＩＬ−１β）などの炎症メディエーターを評価するために、それらのｍＲＮＡ発現をＣＬＰの６時間後に得た。全ＲＮＡが組織サンプルから抽出され、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造業者のプロトコルに従ってｃＤＮＡに逆転写された。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて行われた。使用した特異的プライマーのそれぞれは、表１にまとめて示した。

ＰＣＲ産物を増幅（９５℃３秒、６０℃３０秒、４５サイクル）し、Ｓｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で検出した。ｍＲＮＡ発現レベルは、β−アクチンレベルに対するものである。

［酸化ストレスの評価］
酸化ストレスを測定するために、ＣＬＰ後６時間の時点で組織マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）レベルを測定した。ＭＤＡレベルは、チオバルビツール酸反応性物質レベルを測定することによって観察される脂質過酸化産物についてアッセイされた。組織サンプルを−８０℃に急速凍結し、５０μｇずつのサンプルに小分けした。そのサンプルをＲＩＰＡバッファー（和光純薬工業）中でホモジナイゼーションし、サンプル酸化を防止した。全サンプルを遠心分離（４℃、１０，０００×ｇ、１０分）にかけて、上清を回収し、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ ＴＢＡＲＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製造業者の説明書に従って評価した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて５３２ｎｍの吸光度を測定した。ＭＤＡ濃度は、タンパク質１ｍｇあたりのｎｍｏｌ（ｎｍｏｌ／ｍｇ）で表した。

［組織学的分析］
ＣＬＰの２４時間後にマウスの首を切り、ＰＢＳ、そしてその後０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ）中の４％パラホルムアルデヒドを、経心腔的に灌流した。小腸（回腸末端部）を切除し、同じ定着液に浸漬し、一連のスクロース溶液（０．１Ｍ ＰＢ中１５％、２０％及び２５％スクロース）の中で４℃、３日間冷却保護した。検体をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｃｈｎｉｃａｌ）中で冷凍したのち、それらをクリオスタット（ＣＭ３０５０Ｓ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって厚さ８２μｍの切片にスライスし、その冷却切片をヘマトキシリン・エオシンで染色した。

［蛍光抗体法］
冷却切片を、０．００５％サポニンを含む０．１Ｍ ＰＢ中の２０％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本住友製薬）によってブロックし、閉鎖帯−１（ＺＯ−１）に対するラットモノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と一緒に４℃で一晩インキュベーションした。このとき、この抗体は、ＰＢＳ中１％正常ヤギ血清で１：２００に希釈された。ＰＢＳ中で３回洗浄後、切片を、５００倍希釈のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ヤギ抗家兎ＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と一緒に室温で１時間インキュベーションした。各反応後、切片をＰＢＳで洗浄した。最後に、切片をＳｌｏｗＦａｄｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて固定した。そのあと、蛍光顕微鏡装置（オリンパス）を用いて画像を観察した。

［統計分析］
データは、平均±標準偏差（ＳＤ）として表した。実験群間の差は、Ｔｕｋｅｙのポストホック（Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ）比較テストを用いるＡＮＯＶＡによって決定された。生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析法で分析され、グループ間の差を、ｌｏｇ−ｒａｎｋテストで比較した。統計分析を、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を用いて行い、ｐ＜０．０５を有意であるとした。

ＩＩ．結果
［超過飽和濃度水素溶存生食水による生存の改善］
超過飽和濃度水素溶存生食水が敗血症マウスの生存率を改善することが可能であるか否かを調べるために、超過飽和濃度水素溶存生食水１５ｍｌ／ｋｇを、ＣＬＰ術後７日間、毎日マウスに給与した。図１に生存曲線を示した。７日の実験期間の生存率は、擬似群（ｎ＝１０）で１００％、生食水群（ｎ＝２６）で３１％、Ｈ２群（ｎ＝２６）で６９％であった。Ｈ２群の生存率は、生食水群より有意に高くなった（ｐ＜０．０１）。

［超過飽和濃度水素溶存生食水によるバクテリアル・トランスロケーションの防止］
ＭＬＮ培養の分析において、ＴＳＡアガープレート及びＭａｃＣｏｎｋｅｙアガープレート上のコロニーの数を、ＣＬＰの２４時間後に計数して、バクテリアル・トランスロケーションが起こったか否かを決定した。擬似群では、コロニーは全く観察されなかった。生食水群では、ＴＳＡ及びＭａｃＣｏｎｋｅｙアガープレート上にコロニーが生じたが、Ｈ２群では、コロニーは存在したものの抑制された（図２Ａ）。生食水群と比較してＨ２群では、ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガープレート上に存在するコロニー数の大きな減少が観察された（ｐ＜０．０５）（図２Ｂ）。

［超過飽和濃度水素溶存生食水による腸からの過透過性の減衰］
ＣＬＰの２４時間後、血漿中のＦＩＴＣ−デキストランの出現を測定することによって腸透過性を評価した。その結果、擬似群と比べて生食水群で、有意に高いレベルのＦＩＴＣ−デキストランが観察され、またＨ２群では減衰された（図３）。

［超過飽和濃度水素溶存生食水による腸の形態学的障害の軽減と密着結合の防止］
図４（上）に、腸粘膜障害の組織学的知見を示した。腸絨毛の短縮化又は欠損などの特徴が、生食水群で認められたが、Ｈ２群では軽減された。さらにまた、腸密着結合タンパク質ＺＯ−１の発現を蛍光抗体染色で調べた。図４（下）に示されるように、ＺＯ−１は、腸上皮密着結合部に局在しており、これは、図中、細胞結合部の頂端コンパートメントに一連の明るい緑色スポットとして現れている。ＺＯ−１の局在は、生食水群で破壊されており、明るい緑色スポットが欠損しているが、一方、Ｈ２群ではＺＯ−１の局在が認められた。

［超過飽和濃度水素溶存生食水による腸マイクロバイオーム変化の制御］
図５Ａに、１６Ｓ ｒＲＮＡ分析により決定された糞便サンプルからの多数の細菌分類群を示した。菌叢は、健康状態のマウスで、Ｓ２４−７群又はクロストリジウム科、ラクトバシラス科、及びラクノスピラ科である。これに対し、ＣＬＰの１日目に、生食水群で、微生物組成が著しく変化し、特にエンテロバクテリア科の動的な増加がみられた。Ｈ２群では、エンテロバクテリア科の過剰増殖は大きく抑制された。定量分析の結果、エンテロバクテリア科の菌数は、生食水群で、１日目に約１０^５まで増加したが、Ｈ２群では、当該菌数は相当に抑制された（図５Ｂ）。

［超過飽和濃度水素溶存生食水による酸化ストレスの低減］
ＣＬＰの６時間後のＭＤＡの組織レベルが酸化ストレスの分析のために測定された。３つの群の間でＭＤＡレベルに有意な差はなかったが、Ｈ２群では他の２つの群と比べて低い傾向がみられた（図６）。

［超過飽和濃度水素溶存生食水による腸組織内の炎症反応の低減］
ＣＬＰの６時間後の腸組織内の炎症メディエーターのｍＲＮＡ発現が定量ＲＴ−ＰＣＲによって測定された結果、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６のレベルは、擬似群と比べて生食水群でかなり高くなった（図７）。生食水群では、ｉＮＯＳレベルもまた高い傾向がみられた。しかし、Ｈ２群では、これらの炎症メディエーターのｍＲＮＡ発現は有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。

本発明により、バクテリアル・トランスロケーションを防止又は抑制することができるため、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）又は多臓器機能不全症候群（ＭＯＦ）の発症もしくは悪性化をさらに防止又は抑制することが可能になる。

配列番号１〜１２： プライマー

Claims (7)

1. 溶存水素を有効成分として含み、かつ水素溶存液体の形態である、被験体の腸内細菌叢における悪玉菌の異常増殖を抑制し、かつ、被験体内でバクテリアル・トランスロケーションを防止又は抑制するための組成物であって、前記悪玉菌がエンテロバクテリア科であることを特徴とする組成物。
2. 敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）又は多臓器機能不全症候群（ＭＯＦ）の発症もしくは悪性化を防止又は抑制することを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
3. 被験体の腸組織の損傷を改善することを特徴とする、請求項１又は２に記載の組成物。
4. 水素溶存液体の水素濃度が、１〜１０ｐｐｍであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
5. 水素溶存液体の水素濃度が、３〜１０ｐｐｍ又は７〜１０ｐｐｍであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 被験体への組成物の投与が、経口投与であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 投与時に水素添加具を用いてその場で作製されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。