TW202023588A

TW202023588A - 戈氏副擬桿菌用於治療慢性腎臟疾病之用途

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Publication number: TW202023588A
Application number: TW108131394A
Authority: TW
Inventors: 吳柏毅; 張志榮; 蔡佑靈
Original assignee: 星聚樊生物科技有限公司
Priority date: 2018-09-04
Filing date: 2019-08-30
Publication date: 2020-07-01
Also published as: CN110870877A; CN110870877B; US20200069745A1; US11235009B2; TWI721549B

Abstract

本發明提供一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)之用途，該戈氏副擬桿菌可改善動物或人類因慢性腎臟疾病導致之腎小球硬化的現象、及腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象，並可有效提升個體的腎功能，以抑制慢性腎臟疾病的發生；同時，該戈氏副擬桿菌能藉由降低腎臟組織中MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現，以降低腎臟發炎及腎臟纖維化之情況，並可同時藉由提升腎臟組織中ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量，以提升腎臟細胞中粒線體之活性；因而可利用於慢性腎臟疾病之抑制或治療以及相關醫藥組成物的製備。

Description

戈氏副擬桿菌用於治療慢性腎臟疾病之用途

本發明係關於一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)之用途，尤其是一種關於利用戈氏副擬桿菌抑制或治療慢性腎臟疾病的應用；其中，該戈氏副擬桿菌可改善慢性腎臟疾病患者的腎臟功能、腎小球硬化的現象、腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象、及提升腎臟細胞中粒線體之活性。

依據2012年公布的國際指引中，改善全球腎臟病預後組織(Kidney Disease Improving Global Outcomes,KDIGO)將慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)定義為腎臟功能受損超過3個月，導致其結構或功能無法恢復正常之症狀；其中，主要以年齡、性別、血清肌酸酐等指標，以綜合計算出腎絲球過濾率值(Glomerular filtration rate,GFR)來判斷腎功能，當腎絲球過濾率值過低(<60ml/min/1.73m²)或出現蛋白尿、血尿等腎臟損傷狀況，且持續三個月以上，即被判定為慢性腎臟病。

慢性腎臟疾病共分為五期，分期的依據主要係依照腎絲球過濾率值；第一期係指腎絲球過濾率值為90mL/min/1.73m²以上，且合併有腎臟結構和尿液檢測的異常、第二期係指腎絲球過濾率值介於60-89mL/min/1.73m²之間，且合併有腎臟結構和尿液檢測的異常、第三期則係指腎絲球過濾率值介於30-59mL/min/1.73m²之間、第四期係指腎絲球過濾率值介於15-29mL/min/1.73m²之間、第五期則屬於慢性腎臟疾病之末期，係指腎絲球過濾率值為15mL/min/1.73m²以下；不過，在無合併其他腎臟受損之狀況下，若腎絲球過濾值大於60mL/min/1.73m²，則不符合慢性腎臟病的診斷，因此無需過度的驚慌。

腎臟是排泄體內廢物及代謝藥物的重要器官，若有全身系統性疾病或是不適當使用藥物，皆可能會導致腎臟的損傷，其中慢性腎臟疾病的成因相當多，包括腎臟本身之先天性疾病、尿路阻塞、泌尿道感染、腎絲球病變等，而它種常見慢性疾病例如高血壓、糖尿病、痛風等，若控制不好亦有可能導致慢性腎臟疾病的發生；因此，隨著人口的老化與高血壓、高血脂及高血糖等慢性疾病發生率的增加，慢性腎臟疾病的患者亦持續的增加，根據2007年國民健康署統計中顯示，慢性腎臟疾病在台灣的盛行率達11.3%，而在2016年台灣十大死因統計中，腎臟病則排名第九大死因，足見慢性腎臟疾病對台灣民眾健康有一定的影響。

然而，慢性腎臟疾病是沉默的殺手，在疾病初期並無明顯的症狀，以致於不容易被發現，除非藉由早期的篩檢發現，否則往往到了末期才會出現明顯症狀，若腎臟功能持續下降，最後變成尿毒症，就必須依賴洗腎或腎臟移植代替腎臟功能；因此，定期檢查，早期篩檢發現，早期接受治療就更顯重要。

目前，僅能透過改善生活習慣、飲食習慣、養成運動習慣、以及避免接觸香菸過濫用藥物等危險因子等方式來預防腎臟之結構或功能的損傷，以預防慢性腎臟疾病的發生。若慢性腎臟疾病已發生，導致腎臟之結構或功能產生不可逆的受損，則僅能藉由藥物以及以上的方式減緩或抑制腎臟持續的病變。

因此，綜上所述，因應慢性腎臟疾病的高發生率，且基於現代人生活水平提高且對於保健概念提高，研發一種能方便又有效預防或治療慢性腎臟疾病之有效成分的組合物，著實有其必要性。

本發明之一目的在提供一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)、其代謝產物、或其細菌成分之用途，藉由戈氏副擬桿菌的作用，調整受施用者個體之生理作用，達到抑制或治療慢性腎臟疾病之目的。

為了達成前述的目的，本發明提供一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)、該代謝產物、或該細菌成分用於製備抑制或治療慢性腎臟疾病之醫藥組成物的用途，其中該醫藥組成物係包含該戈氏副擬桿菌之代謝產物。藉由對一個體施用該醫藥組成物，改善個體因慢性腎臟疾病導致之腎小球硬化的現象、及腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象，而能維持一個體腎臟組織之正常型態，並可同時改善個體之尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象、及血液中尿素氮上升現象，可有效提升個體尿液中尿蛋白回收量、血液中肌酸酐的排泄量、及血液中尿素氮的排泄量，而能效提升個體的腎功能，以減緩或抑制慢性腎臟疾病的發生；同時，該戈氏副擬桿菌係藉由降低腎臟組織中MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現，以降低腎臟發炎及腎臟纖維化之情況，並可同時藉由提升腎臟組織中ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量，以提升腎臟細胞中粒線體之活性；且該戈氏副擬桿菌之寄存編號為BCRC 910869。

在本發明的一實施例中，該戈氏副擬桿菌係一活菌；且該醫藥組成物可進一步包含除該戈氏副擬桿菌之外的它種細菌。

在本發明的一實施例中，該戈氏副擬桿菌之有效劑量係每一個體每日至少給予5×10¹⁰CFUs/kg，且其給藥期間可為10週。

利用本發明實施例之戈氏副擬桿菌於抑制或治療慢性腎臟疾病時，可為但不限於以口服方式給藥。其給藥時可與一般食物一同食用，因此製備包含戈氏副擬桿菌醫藥組成物時，該醫藥組成物可進一步包括蛋白質、單醣、雙醣、寡醣、低聚醣、多醣、碳水化合物、胺基酸、脂質、維他命或其任意組合的成分。

此外，於製備包含本發明實施例之戈氏副擬桿菌之醫藥組成物時，亦可進一步加入所屬技術領域所熟知之賦形劑、載劑、輔劑及/或食品添加劑。且其劑型可為但不限於一噴霧氣體、一溶液、一半固態、一固態、一明膠膠囊、一軟膠囊、一錠劑、一口含片、一口香糖及/或一冷凍乾燥粉末製劑。同時，本發明實施例之戈氏副擬桿菌或包含其他成分的醫藥組成物，亦可進一步用於製備食品、保健食品、膳食補充品或疫苗組合物。

本發明提供一種戈氏副擬桿菌用於製備抑制或治療慢性腎臟疾病之醫藥組成物的用途；本發明之戈氏副擬桿菌可有效改善腎小球硬化的現象、及腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象，以能有效改善個體之慢性腎臟疾病之病理症狀；且本發明之戈氏副擬桿菌亦可有效改善個體之尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象，以及改善個體之血液中尿素氮上升現象，可有效提升個體尿液中尿蛋白回收量、有效提升個體血液中肌酸酐的排泄量、以及可有效提升個體血液中尿素氮的排泄量，而能效提升個體的腎功能，以減緩或抑制慢性腎臟疾病的發生；再者，本發明之戈氏副擬桿菌可有效降低腎臟組織中與腎臟發炎及/或腎臟纖維化相關之MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現量，以及有效提升與粒線體活性相關之ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量，能有效減緩腎臟發炎及腎臟纖維化的發生，並同時有效提升腎臟細胞的活性，以提高整體腎臟的正常功能，而減緩或抑制慢性腎臟疾病的發生；因此，本發明之戈氏副擬桿菌可應用於慢性腎臟疾病之抑制或治療以及相關醫藥組成物的製備。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1A係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)改善慢性腎臟疾病小鼠腎小球硬化及腎臟組織周圍單核白血球浸潤現象之組織學影像圖。

圖1B係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)改善慢性腎臟疾病小鼠腎小球硬化現象之長條圖。

圖1C係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)改善慢性腎臟疾病小鼠腎臟組織周圍單核白血球浸潤現象之長條圖。

圖2係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)改善慢性腎臟疾病之尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象之長條圖。

圖3係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)改善慢性腎臟疾病之血液中尿素氮上升現象之長條圖。

圖4係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中MCP-1基因表現量之長條圖。* p值<0.05；** p值<0.01。

圖5係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中IL-1β基因表現量之長條圖。*** p值<0.001。

圖6係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中ACAA2基因表現量之長條圖。* p值<0.05；** p值<0.01。

圖7係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中PPAR-γ基因表現量之長條圖。* p值<0.05；** p值<0.01。

圖8係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中CPT1基因表現量之長條圖。*** p值<0.001。

圖9係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中PGC-1α基因表現量之長條圖。* p值<0.05。

圖10係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中COL3A1基因表現量之長條圖。* p值<0.05。

圖11係本發明之一實施例的戈氏副擬桿菌(P.goldsteinii)降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中COL6A1基因表現量之長條圖。* p值<0.05；** p值<0.01。

使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差(SD)表示，各組之間的差異以單變量變異數分析(One-way ANOVA)進行統計分析。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

定義

本文所述之「有效劑量」係表示能改善哺乳動物或人類腎小球硬化的現象、腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象、尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象、及血液中尿素氮上升現象，或可有效降低腎臟組織中MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現量，以及有效提升ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量所需戈氏副擬桿菌的數量，以抑制或治療哺乳動物或人類慢性腎臟疾病。有效劑量依所抑制或治療的生物種類或個體差異而可能不同，但可藉由例如劑量遞增試驗(dose escalation)以實驗決定其有效劑量。

依據本發明，有關細菌培養的操作程序與參數條件等是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

如本文中所使用的，用語「代謝產物」意為培養細菌時，經該細菌代謝後所分泌至細菌培養液中之物質，包含培養該菌的培養液。

如本文中所使用的，用語「細菌成分」意為培養細菌時，該菌直接或間接相關之衍生物質，包括但不限於該細菌之代謝產物、該細菌之結構、細菌相關活性及非活性成分等。

本發明提供一種以戈氏副擬桿菌用於製備抑制或治療慢性腎臟疾病之醫藥組成物的用途。以下實驗顯示本發明之戈氏副擬桿菌對改善腎小球硬化的現象、腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象、尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象、及血液中尿素氮上升現象，或可有效降低腎臟組織中MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現量，以及有效提升ACAA2基因、 PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量之效用；以達到抑制或治療慢性腎臟疾病之功效。一般而言，每日給予一哺乳動物或一人類本發明之戈氏副擬桿菌之有效劑量為至少5x10¹⁰CFUs/kg，詳細說明如下。

戈氏副擬桿菌菌株

本發明實施例中所用之戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii,P.goldsteinii)MTS01是一種能抑制或治療慢性腎臟疾病的益生菌株(Probiotic bacteria)。該戈氏副擬桿菌係寄存於德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)；民國107年10月29日；編號DSM 32939；以及寄存於食品工業發展研究所；民國108年2月15日；編號BCRC 910869。戈氏副擬桿菌為絕對厭氧細菌，需於37℃之無氧培養箱培養約48小時；其中，該系統包含10%的二氧化碳、10%的氫氣、及80%的氮氣。該菌之液態培養液為NIH thioglycollate broth(TGC II)(購自BD，美國，編號為225710)，固態培養基則為Anaerobic blood agar plate(Ana.BAP)(購自啟新生物科技公司，台灣)。該菌長期保存於-80度冰箱，保護液為25%之甘油，無須特殊降溫處理，且可經由冷凍乾燥進行保存，以穩定其活性。

本發明之實施例中經由動物實驗證實餵食本發明之戈氏副擬桿菌活菌株能夠有效減緩腎小球硬化的現象、及腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象，以能有效改善個體之慢性腎臟疾病之病理症狀；且本發明之戈氏副擬桿菌亦可有效改善個體之尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象，以及改善個體之血液中尿素氮上升現象，可有效提升個體尿液中尿蛋白回收量、有效提升個體血液中肌酸酐的排泄量、以及可有效提升個體血液中尿素氮的排泄量，而能效提升個體的腎功能，以減緩或抑制慢性腎臟疾病的發生；再者，本發明之戈氏副擬桿菌可有效降低腎臟組織中與腎臟發炎及/或腎臟纖維化相關之MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現量，以及有效提升與粒線體活性相關之ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量，能有效減緩腎臟發炎及腎臟纖維化的發生，並同時有效提升腎臟細胞的活性，以提高整體腎臟的正常功能，而減緩或抑制慢性腎臟疾病的發生；顯示，本發明之戈氏副擬桿菌可用於慢性腎臟疾病之抑制或治療以及相關醫藥組成物的製備。

益生菌株(Probiotic或Probiotic bacteria)係為一微生物，其菌體、混合菌株、萃取物或代謝產物對於宿主本身係具有正面影響，通常源自於人體內、有益於腸道健康的活菌，亦可指外來補充、對身體可能有益的某些微生物；其中，該益生菌株的代謝產物係為培養該益生菌株時，經該細菌代謝後所分泌至細菌培養液中之物質，包含培養該菌的培養液等。

實驗小鼠

本發明實施例中使用8週齡且無特定病原體的C57BL/6雄性小鼠，該小鼠係購自國家實驗研究院(National Applied Research Laboratories,NARLab，台灣)，且該所有小鼠隨意餵食食物和水，並以每籠五隻的數量，將小鼠飼養於室溫(19-23℃)、12小時白天黑暗周期(12-hour day-dark cycle)的環境中。該小鼠係飼養在無特定病原體的設施中，並按照美國國立衛生研究院的指導原則進行治療。

慢性腎臟疾病之動物模型

為得到慢性腎臟疾病的動物模型，以餵食高脂飲食的方式誘導小鼠成為慢性腎臟疾病的模型；由過去許多研究顯示，以餵食高脂飲食的方式能夠成功誘導實驗動物產生慢性腎臟疾病，因此常以此方式製造模擬慢性腎病的動物模型；其中，又以C57BL/6J小鼠最常被使用作為該種動物模型的實驗動物；經誘導為慢性腎臟疾病的實驗動物中，會存在慢性腎臟疾病患者之腎臟組織病理學的典型特徵，例如腎小球肥大及局灶性節段性腎小球硬化等；因此，本發明實施例中使用高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠，作為慢性腎臟疾病的動物模型，並用以評估用本發明之戈氏副擬桿菌MTS01用於預防、抑制或治療慢性腎臟疾病的功效測試。

首先，將8週齡的C57BL/6Narl雄性小鼠經過1週的飼養期後，分為以下三組(各組n=5)：(1)餵食標準食物飼料(standard chow diet，其中含有13.5%來自脂肪的能量來源，購買自LabDiet，美國，編號為LabDiet 5001)，並於開始餵食後的第6週起，每日以胃內灌食(Intragastric gavage)方式給予200μL之無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS,Vehicle)持續至第16週之控制組、(2)餵食高脂肪食物飼料(High-fat diet,HFD，其中含有60%來自脂肪的能量來源，購買自LabDiet，美國，編號為TestDiet 58Y1)，並於開始餵食後的第6週起，每日以胃內灌食方式給予200μL之無菌磷酸鹽緩衝生理鹽水持續至的16週之比較組、及(3)餵食高脂肪食物飼料，並於開始餵食後的第6週起，每日以胃內灌食方式給予200μL之含有5x10¹⁰CFUs/kg之P.goldsteinii的PBS持續至第16週之實驗組。

實施例1 戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠之腎臟病理狀況的功效

本發明之一實施例為觀察本發明之戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠之腎臟病理狀況的功效。首先，將前述之動物模型的小鼠分組進行實驗，並於餵食16週後，將各組小鼠犧牲後將腎臟組織取出，並以10%的福馬林液(Formalin solution)反應16-18小時進行固定後，進行脫水並包埋於石蠟中，接著以4μm的厚度製作組織切片，並以蘇木精(Hematoxylin)及曙紅(Eosin,H&E)進行染色，再以光學顯微鏡(Olympus，日本)觀察與記錄各組小鼠腎臟組織染色切片中，周圍單核白血球浸潤、及腎小球硬化的現象，並使用Image J軟體(National Institutes of Health，美國)分析各組的組織學影像，其中該影像是選自各組在50倍的放大倍率下，10-15個切片中50個隨機的區域。

本發明之戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠之腎臟病理狀況之功效的實驗結果如圖1A、圖1B、及圖1C所示。由圖1A及圖1B中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎小球硬化的現象會顯著地增加；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎小球硬化的現象會顯著地減少；而由圖1A及圖1C 中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象亦會顯著地增加；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象亦會顯著地減少。此結果顯示，本發明之戈氏副擬桿菌可有效減緩腎小球硬化的現象、及腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象，以能有效改善個體之腎臟病理狀況。

實施例2 戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠尿蛋白與肌酸酐比值上升現象的功效

本發明之一實施例為觀察本發明之戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠之尿蛋白與肌酸酐比值上升現象的功效；其中，血液中的蛋白若經由腎絲球基底膜漏出至尿液中，並且未被腎小管上皮細胞進行再吸收，即為尿蛋白；早期蛋白尿的檢測主要應用在一般篩檢，以期及早發現腎臟異常，其排出量也與發展為嚴重腎病變的危險性呈線性相關；而血液中的肌酸酐主要是來自於身體肌肉活動的代謝產物，每天所產出的肌酸酐全部都會經腎臟由尿液排泄出體外，因此若腎功能有問題，無法完全排出每日所產生肌酸酐，即會造成血液中肌酸酐濃度上升的現象，而上升的數值越高，或是尿液中肌酸酐濃度的數值降低越多，表示腎功能越不好；因此，藉由小便中的白蛋白及肌酐酸比值(Urine albumin-creatinine ratio,UACR)，可用於判斷個體腎功能的好壞，即小便中的白蛋白及肌酐酸比值上升，代表腎臟功能越差。

首先，將前述之動物模型的小鼠分組進行實驗，並於餵食16週後，蒐集各組小鼠的尿液樣本，並分別使用二不同的免疫分析套組(ELISA kit)分別定量各組小鼠的尿液樣本中尿蛋白(購自Exocell,Philadelphia,PA,USA)、以及肌酸酐(購自Wako Pure Chemical Industries,Osaka,Japan)的量，再將兩者相除後，得到各組尿液樣本的尿蛋白與肌酸酐比值。

本發明之戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠之尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象之功效的實驗結果如圖2所示。由圖2中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其小便中的白蛋白及血清肌酐酸的比值會顯著地增加；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之小便中的白蛋白及血清肌酐酸的比值會顯著地減少。此結果顯示，本發明之戈氏副擬桿菌可有效改善個體之尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象，可有效提升個體尿液中尿蛋白回收量、及有效提升個體血液中肌酸酐的排泄量，以有效提升個體的腎功能。

實施例3 戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠血液中尿素氮上升現象的功效

本發明之一實施例為觀察本發明之戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠之血液中尿素氮(Blood urine nitrogen,BUN)上升現象的功效；其中，蛋白質代謝的廢物會以尿素氮的型式回到血液中，即為血液中尿素氮，其會經由腎臟過濾後和小便一起排出體外，因此若腎功能有問題，無法有效地排出血液中尿素氮，即會造成血液中尿素氮濃度上升的現象，因此血液中尿素氮亦為一種評斷腎功能好壞的指標。

首先，將前述之動物模型的小鼠分組進行實驗，並於餵食16週後，蒐集各組小鼠的血液樣本，並使用血液中尿素氮專用晶片(BUN specific chip，購自Fuji Dry-Chem 4000i,Fuji Film Medical)測量各組小鼠血液樣本中尿素氮的含量。

本發明之戈氏副擬桿菌改善慢性腎臟疾病小鼠之血液中尿素氮上升現象之功效的實驗結果如圖3所示。由圖3中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其血液中尿素氮會顯著地增加；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之血液中尿素氮會顯著地減少。此結果顯示，本發明之戈氏副擬桿菌可有效改善個體之血液中尿素氮上升現象，可有效提升個體血液中尿素氮的排泄量，以有效提升個體的腎功能。

實施例4 戈氏副擬桿菌調控慢性腎臟疾病小鼠腎臟中與慢性腎臟疾病相關之基因表現量的功效

本發明之一實施例為觀察本發明之戈氏副擬桿菌調控慢性腎臟疾病小鼠腎臟中與慢性腎臟疾病相關之基因表現量的功效。首先，如前述之動物模型將小鼠分組進行實驗，並於餵食16週後，自各組小鼠之腎臟組織中以核醣核酸分離試劑套組(RNA isolation kit，購自Geneaid，台灣)萃取出總核醣核酸(Total RNA)，接著利用Quant II快速反轉錄酶試劑套組(購自Tools，台灣)，以等量所萃取之總核醣核酸作為模板及表1之引子進行反轉錄反應，以產生該些特定基因之mRNA所相應的cDNA產物，再將1μL所得到的cDNA與1μL之特定基因的引子、5μL之2xqPCRBIO SyGreen Blue Mix Lo-ROX(購自PCR Biosystems，英國)、以及3μL之蒸餾水混合均勻後，點入384孔培養盤中，以LightCycler 480定量即時聚合酶連鎖反應系統(Roche Diagnostics，德國)進行定量即時聚合酶連鎖反應(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)；其中，每組基因進行三重複測試，且該qPCR條件為以94℃反應15秒，60℃反應30秒，72℃反應30秒，總共重複40個迴圈後，再進行1個熔化曲線循環，以偵測與慢性腎臟疾病相關之MCP-1基因、IL-1β基因、ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、PGC-1α基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現量。其中，定量數值係取由閾值循環數(Ct)，而目標基因的mRNA相對量係推導自方程式2^-△△Ct，其中△C_T=C_{T比較組或實驗組目標基因/控制組目標基因}-C_{T GAPDH}(甘油醛-3-磷酸脫氫酶，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)；△△C_T=C_{T比較組或實驗組目標基因}-C_{T控制組目標基因}；各組中各基因的fold change 則為2^-△△Ct，該些數據分析係以Roche LightCycler software(version 1.5.0,Roche Diagnostics)進行。接著，再利用Excel軟體決定變異係數與是否在統計上具有顯著差異(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本發明之戈氏副擬桿菌降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中MCP-1基因表現量的實驗結果如圖4所示。由圖4中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中MCP-1基因的表現量會顯著地增加；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中MCP-1基因的表現量會顯著地減少。

本發明之戈氏副擬桿菌降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中IL-1β基因表現量的實驗結果如圖5所示。由圖5中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中IL-1β基因的表現量會顯著地增加；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中IL-1β基因的表現量會顯著地減少。

本發明之戈氏副擬桿菌提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中ACAA2基因表現量的實驗結果如圖6所示。由圖6中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中ACAA2基因的表現量會顯著地降低；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中ACAA2基因的表現量會顯著地提升。

本發明之戈氏副擬桿菌提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中PPAR-γ基因表現量的實驗結果如圖7所示。由圖7中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中PPAR-γ基因的表現量會顯著地降低；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中PPAR-γ基因的表現量會顯著地提升。

本發明之戈氏副擬桿菌提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中CPT1基因表現量的實驗結果如圖8所示。由圖8中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中CPT1基因的表現量差異不大；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中CPT1基因的表現量會顯著地提升。

本發明之戈氏副擬桿菌提升慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中PGC-1α基因表現量的實驗結果如圖9所示。由圖9中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中PGC-1α基因的表現量會顯著地降低；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中PGC-1α基因的表現量會顯著地提升。

本發明之戈氏副擬桿菌降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中COL3A1基因表現量的實驗結果如圖10所示。由圖10中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中COL3A1基因的表現量會顯著地提升；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中COL3A1基因的表現量會顯著地降低。

本發明之戈氏副擬桿菌降低慢性腎臟疾病小鼠之腎臟組織中COL6A1基因表現量的實驗結果如圖11所示。由圖11中可知，相較於餵食標準食物飼料的控制組小鼠，經餵食高脂肪食物飼料誘導為慢性腎臟疾病的比較組小鼠，其腎臟組織中COL6A1基因的表現量會顯著地提升；而若在以餵食高脂肪食物飼料誘導小鼠為慢性腎臟疾病時，同時餵食本發明之戈氏副擬桿菌，相較於比較組小鼠，實驗組小鼠之腎臟組織中COL6A1基因的表現量會顯著地降低。

其中，MCP-1基因及IL-1β基因為促進發炎之重要基因；COL3A1基因及COL6A1基因為導致腎臟纖維化的重要基因；ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因為影響細胞粒線體功能及抗氧化壓力的重要基因。

此些結果顯示，本發明之戈氏副擬桿菌可有效降低與腎臟發炎及/或腎臟纖維化相關之MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現量，以及有效提升與粒線體活性相關之ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量，而能夠有效減緩腎臟發炎及腎臟纖維化的發生，並同時有效提升腎臟細胞的活性，以提高整體腎臟的正常功能。

利用本發明實施例之戈氏副擬桿菌於抑制或治療慢性腎臟病時，可以口服方式給藥。其給藥時可與一般食物一同食用，因此製備包含戈氏副擬桿菌醫藥組成物時，該醫藥組成物可進一步包括蛋白質、單醣、雙醣、寡醣、多醣、碳水化合物、胺基酸、脂質、維他命或其任意組合的成分。

此外，於製備包含本發明實施例之戈氏副擬桿菌之醫藥組成物時，亦可進一步加入所屬技術領域所熟知之載劑或其他輔劑。而其劑型，可為但不限於溶液、明膠膠囊、軟膠囊或錠劑，以便於將本發明之戈氏副擬桿菌傳遞至腸道及/或部分或全部定殖於腸道。同時，本發明實施例之戈氏副擬桿菌或包含其他成分的醫藥組成物，亦可添加於食品、保健食品或膳食補充品中。

藉由上述試驗可知，本發明實施例所提供一種戈氏副擬桿菌用於製備抑制或治療慢性腎臟疾病之醫藥組成物的用途；本發明之戈氏副擬桿菌可有效減緩腎小球硬化的現象、及腎臟組織周圍單核白血球浸潤的現象，以能有效改善個體之慢性腎臟疾病之病理症狀；且本發明之戈氏副擬桿菌亦可有效改善個體之尿蛋白與血清肌酸酐比值上升現象，以及改善個體之血液中尿素氮上升現象，可有效提升個體尿液中尿蛋白回收量、有效提升個體血液中肌酸酐的排泄量、以及可有效提升個體血液中尿素氮的排泄量，而能效提升個體的腎功能，以減緩或抑制慢性腎臟疾病的發生；再者，本發明之戈氏副擬桿菌可有效降低腎臟組織中與腎臟發炎及/或腎臟纖維化相關之MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及COL6A1基因的表現量，以及有效提升與粒線體活性相關之ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及PGC-1α基因的表現量，能有效減緩腎臟發炎及腎臟纖維化的發生，並同時有效提升腎臟細胞的活性，以提高整體腎臟的正常功能，而減緩或抑制慢性腎臟疾病的發生；因此，本發明之戈氏副擬桿菌可應用於慢性腎臟疾病之抑制或治療以及相關醫藥組成物的製備。

【生物材料寄存】

德國微生物菌種保存中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ)；民國107年10月29日；編號DSM 32939。食品工業發展研究所；民國108年2月15日；編號BCRC 910869。

<110> 星聚樊生物科技有限公司

<120> 戈氏副擬桿菌用於治療慢性腎臟疾病之用途

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims

一種戈氏副擬桿菌(Parabacteroides goldsteinii)用於製備治療慢性腎臟疾病之醫藥組成物的用途。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物係包含該戈氏副擬桿菌之代謝產物。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該戈氏副擬桿菌係一活菌。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該戈氏副擬桿菌之有效劑量係每一個體每日至少給予5×10¹⁰CFUs/kg。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該醫藥組成物係提升一個體之腎功能、及/或維持一個體腎臟組織之正常型態。
如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該提升個體之腎功能係提升尿液中尿蛋白回收量、提升血液中肌酸酐的排泄量、及/或提升血液中尿素氮的排泄量。
如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該維持個體腎臟組織之正常型態係改善腎小球硬化現象、及/或改善腎臟組織周圍單核白血球浸潤現象。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物可進一步包含除該戈氏副擬桿菌之外的它種細菌。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該戈氏副擬桿菌之寄存編號為BCRC 910869。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物係降低一腎臟組織中MCP-1基因、IL-1β基因、COL3A1基因、及/或COL6A1基因的表現量。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物係提升一腎臟組織中ACAA2基因、PPAR-γ基因、CPT1基因、及/或PGC-1α基因的表現量。
如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該醫藥組成物係降低腎臟發炎現象、降低腎臟纖維化現象、及/或提升腎臟細胞中粒線體之活性。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物進一步包括一醫藥學上可接受之賦形劑、載劑、輔劑及/或食品添加劑。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物的劑型係係一噴霧氣體、一溶液、一半固態、一固態、一明膠膠囊、一軟膠囊、一錠劑、一口含片、一口香糖及/或一冷凍乾燥粉末製劑。