CN109536439A - 一种调控小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法 - Google Patents

一种调控小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法。此方法将miRNA和/或其抑制剂应用于调控小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化中，所述miRNA为miR‑146b‑5p，其序列为5’‑UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU‑3’，所述调控为促进或抑制。本发明利用miR‑146b‑5p或其抑制剂对小鼠骨实质来源MSC成脂分化能力的调控作用，过表达miR‑146b‑5p后，MSC成脂分化能力显著升高；敲减miR‑146b‑5p后，MSC成脂分化能力显著下降，由此提出了调控间充质干细胞成脂分化的新型小分子化合物，可应用于调节脂肪合成、控制间充质干细胞成脂分化。

Description

一种调控小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法
技术领域
本发明属于间充质干细胞培养技术领域，具体涉及一种调控小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于动物组织和器官，例如骨髓、脂肪组织、心脏、肺脏及新生儿组织包括胎盘、羊膜和脐带，在适宜条件下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多种类型细胞。MSC还可以通过分泌细胞外基质和可溶性因子，如细胞因子、趋化因子、生长因子等多种代谢产物，间接调控肿瘤发生与发展。
微小RNA(microRNA，miRNA)是生物体内一类具有调控基因表达作用的非编码小RNA分子，其发夹状前体经Dicer酶切成为21-24nt的成熟的miRNA，通过与靶基因mRNA碱基互补配对的方式，下调基因表达或促进下游mRNA降解。在生物体发育、细胞程序性凋亡坏死、细胞增殖、免疫和神经系统模式形成等生命过程中，miRNA的表达与调控发挥着至关重要的作用，其表达异常可以导致多种疾病发生。因此，深入研究miRNA的功能将有助于我们理解生物发育与疾病的作用机制。同理，也有大量的miRNA参与MSC的增殖、分化、迁移以及免疫调控等生物学功能。
发明内容
本发明人通过研究，发现miR-146b-5p对小鼠骨实质来源MSC成脂分化能力的调控作用。
本发明目的之一在于提供miRNA和/或其抑制剂在调控小鼠骨实质来源的间充质干细胞成脂分化中的应用，所述miRNA为miR-146b-5p，其序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3’，所述调控为促进或抑制。
上述应用中，所述miRNA抑制剂为单链RNA分子，其序列为5’-AGCCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3’。
本发明同时也提供了一种促进小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法，包括以下步骤：
分离提取小鼠骨实质来源的间充质干细胞，然后进行原代培养、传代培养；
将miR-146b-5p导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞，然后培养。
上述方法中，所述将miR-146b-5p导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞的方法为：用脂质体包裹miR-146b-5p mimic，接种于第三代指数期的小鼠骨实质来源间充质干细胞，当细胞融合40-60％时进行转染；所述miR-146b-5p mimic为双链RNA分子，其中有义链为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3’。
上述方法中，所述脂质体为jetPRIME，其包裹miR-146b-5p mimic的方法为：将miR-146b-5p mimic用DEPC水稀释，得到终浓度为20μM的miR-146b-5p mimic水溶液；将水溶液按体积比1:40-50稀释于jetPRIME Buffer中，室温孵育3-8min，得到A液；将Jet Prime按体积比1:40-50稀释于Jet Prime Buffer，室温孵育3-8min，得到B液；混合A、B液，室温下静置20min，形成A/B复合物。
上述方法中，所述转染方法为：将A/B复合物混合，控制miRNA终浓度为50nM，转染培养基为含10％FBS的α-MEM培养基，不含抗生素。
本发明还提供了一种抑制小鼠骨实质来源的间充质干细胞成脂分化的方法，包括以下步骤：
分离提取小鼠骨实质来源的间充质干细胞，然后进行原代培养、传代培养；
将miR-146b-5p抑制剂导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞，然后培养；所述miRNA抑制剂为单链RNA分子，其序列为5’-AGCCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3’
上述方法中，所述miR-146b-5p抑制剂导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞的方法为：用脂质体包裹miR-146b-5p抑制剂，接种于第三代指数期的小鼠骨实质来源间充质干细胞，当细胞融合40-60％时进行转染。
上述方法中，所述脂质体为jetPRIME，其包裹miR-146b-5p抑制剂的方法为：将miR-146b-5p抑制剂用DEPC水稀释，得到终浓度为20μM的miR-146b-5p抑制剂水溶液；将水溶液按体积比1:40-50稀释于jetPRIME Buffer中，室温孵育3-8min，得到A液；将Jet Prime按体积比1:40-50稀释于Jet Prime Buffer，室温孵育3-8min，得到B液；混合A、B液，室温下静置20min，形成A/B复合物。
上述方法中，所述转染方法为：将A/B复合物混合，控制miR-146b-5p抑制剂终浓度为50nM，转染培养基为含10％FBS的α-MEM培养基，不含抗生素。
上述方法中，所述分离提取小鼠骨实质来源间充质干细胞的方法为：取一周龄C57BL/6小鼠的胫骨、股骨，剪碎；置于0.1％的II型胶原酶中消化45min，消化后，取出骨片，置于培养瓶中培养。
上述方法中，所述的原代培养方式为：在温度为37℃、CO2浓度为5％、湿度为饱和湿度的条件下，采用含10％FBS的α-MEM完全培养基(青霉素、链霉素各100U/ml)，培养72h后全量换液；培养过程中每2-3d更换一次新的含10％FBS的α-MEM完全培养基，其中含有青霉素、链霉素各100U/ml。
上述方法中，所述的传代培养方式为：待爬出的细胞在培养瓶底部融合成单层，达80％-90％融合度时，加入胰酶消化后离心，收集的细胞重新接种于含10％FBS的α-MEM完全培养基其中含有青霉素、链霉素各100U/ml；传代比例为1:2-1:3。
本发明的有益效果为：
1、本发明利用miR-146b-5p或其抑制剂对小鼠骨实质来源MSC成脂分化能力的调控作用，过表达miR-146b-5p后，MSC成脂分化能力显著升高；敲减miR-146b-5p后，MSC成脂分化能力显著下降，由此提出了调控间充质干细胞成脂分化的新型小分子化合物，可应用于调节脂肪合成、控制间充质干细胞成脂分化。
2、本发明的提供的促进/抑制小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法，利用脂质体承载小分子化合物miR-146b-5p mimic或抑制剂转染小鼠骨实质来源的间充质干细胞，方法操作简便，可以控制miR-146b-5p稳定表达；优选培养基和转染体系，可快速、方便、高效地进行转染，转染效率较高，但是对细胞损伤尽可能减小。
附图说明
图1为小鼠骨实质来源间充质干细胞的形态结构与细胞表面标记物表型；其中，A为纯化培养第三代(P3)的小鼠骨实质来源间充质干细胞，梭形突起变长，排列有明显方向性，呈旋涡状生长；B为A图放大效果；C为P3代的MSC流式标记结果。
图2为小鼠骨实质来源间充质干细胞分化成脂肪细胞过程中，细胞内miR-146b-5p的表达水平改变情况。
图3为miR-146b-5p类似物或抑制剂对小鼠骨实质来源间充质干细胞的转染效率以及转染后miR-146b-5p的表达改变情况；A-D为转染后的荧光照片，A为转染miR-146b-5pmimic NC，B为转染miR-146b-5p mimic，C为转染miR-146b-5p inhibitor NC，D为转染miR-146b-5p inhibitor；E为转染后miR-146b-5p的表达变化，***为(p<0.001)，**为(p<0.01)，*为(p<0.05)。
图4为miR-146b-5p类似物或抑制剂对小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂肪细胞分化的调控作用；A-F为油红染色结果，A为自分化组，B为转染miR-146b-5p mimic NC，C为转染miR-146b-5p mimic，D为诱导分化组，E为转染miR-146b-5p inhibitor NC，F为转染miR-146b-5p inhibitor(100X)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中所用到的实验方法如无特殊说明均为常规的方法；所用到的原料为：胎牛血清(FBS)为Hyclone公司产品；流式细胞术相关抗鼠单克隆抗体：CD29-PE、Sca-1-FITC、CD105-PE、CD31-PE、CD34-FITC、MHCII-PE、CD45-FITC、CD140a-PE、Isotype Rat-IgG2a-FITC、Isotype Rat-IgG2a-PE，均为eBioscience公司产品；PBS(8.0gNaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl、0.24g KH2PO4溶于1000mL去离子水中，调整pH值至7.4，非特殊指出，本文中所用PBS皆为此配方)；II型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松、胰岛素、油红O染料、IBMX均为Sigma公司产品；MiReasy试剂盒购自美国Qiagen Sciences公司，RT-PCR试剂盒为Takara公司产品；miR-146b-5p类似物或抑制物及其阴性对照、引物购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，其具体序列如表1所示。
实施例1小鼠骨实质来源间充质干细胞的分离提取与鉴定。
骨片贴壁法培养小鼠骨片来源的MSC。取一周龄C57BL/6小鼠，断颈处死，放入75％乙醇中浸泡5min，将消毒后的小鼠放入超净工作台。无菌平皿中解剖开皮毛层，充分暴露大腿，眼科镊取胫骨、股骨放入青瓶，剪碎。用眼科镊将其置于0.1％的II型胶原酶中消化45min，消化后，取出骨片，置于25cm2培养瓶中培养，采用含10％FBS的α-MEM完全培养基(青霉素、链霉素各10万U)，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养72h，全量换液，之后每隔2-3天更换一次培养液，待爬出的细胞达80-90％融合度时，加入0.25％的胰蛋白酶进行消化传代。细胞传至第三代对数生长期时备用。
检测细胞表面抗原表达，所用抗体为抗CD29-PE、Sca-1-FITC、CD105-PE、CD31-PE、CD34-FITC、MHCII-PE、CD45-FITC、CD140a-PE、isotype Rat-IgG2a-FITC、isotype Rat-IgG2a-PE，用流式细胞仪进行检测。结果如图1所示，其中，A为纯化培养第三代(P3)的小鼠骨实质来源间充质干细胞，梭形突起变长，排列有明显方向性，呈旋涡状生长；B为A图放大效果；C为P3代的MSC流式标记结果：高表达间质细胞表面标志CD29和CD105，高表达干性标志物Sca-1，不表达内皮标志物CD31、不表达造血细胞表面标志CD34、CD45和主要组织相容性复合体MHCII和CD140a，具备符合MSC的形态和表型特征。
实施例2miRNA及其抑制剂的制备与转染
1、将1.00OD260的miR-146b-5p mimic和miR-146b-5p mimic negative control(阴性对照)用125μl DEPC水稀释，1.00OD260的miR-146b-5p inhibitor和miR-146b-5pnegative control用250μl DEPC水稀释，使其终浓度为20uM。其中miR-146b-5p mimic、miR-146b-5p mimic阴性对照、miR-146b-5p inhibitor、miR-146b-5p inhibitor阴性对照的序列如表1所示，上述序列购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。
表1 RNA序列
2、转染
转染前1d将P3代MSC分别以1×105/孔、2×104/孔种于六孔板和24孔板中，分别加入2ml、500μl 10％FBS的α-MEM/孔(不含抗生素)，细胞密度达到50％左右进行转染。将5μlRNA稀释于250μl Jet Prime Buffer中，室温孵育5min，得到A液。将5μl Jet Prime稀释于250μl Jet Prime Buffer，室温孵育5min，得到B液。轻轻混合A、B液，室温下静置20min，形成A/B复合物。
将脂质体复合物加入六孔板中，转染体系为500μl(即500μlA/B复合物)，miRNA终浓度为50nM。4-6h后，弃上清，加入2ml 10％FBS的α-MEM完全培养基/孔。24孔板中，转染体系为125μl(即125μlA/B复合物)，miRNA终浓度为50nM。
microRNA提取及检测
收集诱导不同天数或不同处理的小鼠骨实质来源的间充质干细胞，使用MiReasy试剂盒提取microRNA，利用总RNA1ug、RNA free water、RT特异性引物URP(如表2所示)、5×RTase M-MLV Buffer 4μl、DTT 1μl、dNTP 1μl、RTase M-MLV 2μl、RNase inhibitor 1μl制备逆转录混合反应液20μl，在PCR扩增仪上进行逆转录反应(70℃，10min；42℃，1h；70℃，10min)，反应结束后，逆转录产物cDNA置于冰上或储存于-20℃保存。配制实时定量PCR反应体系：2×Μltra Master Mix 10μl、10umol/L的PCR特异引物F 0.5μl、10umol/L的PCR特异引物URP 0.5μl、cDNA1μl、RNase Free Water 8μl，置于MicroTM Optical 8-Tube Strip、盖上MicroTM Optical 8-Cap Strip，短暂离心混合，置于冰上或者4℃冰箱中。设置PCR程序后，将其放入Real-Time PCR仪，进行PCR反应，反应条件为：95℃，10min；40个PCR循环收集荧光(95℃，15s；60℃，1min)；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。SnoRNA202作为内参，数据采用2-△△CT法进行分析。
在成脂诱导分化过程中，收集诱导不同天数的小鼠骨实质来源的间充质干细胞进行microRNA提取及检测，如图2所示，结果表明，诱导后MSC内miR-146b-5p的表达水平逐渐升高，且随着脂肪诱导时间的增加，MSC表达miR-146b-5p的水平逐渐上调(p<0.01)，至诱导的第7天后趋于平稳。
miR-146b-5p类似物或抑制剂对小鼠骨实质来源间充质干细胞进行转染效率检测方法为：RNA带有CY3荧光标记，可于荧光显微镜下进行观察。为进一步检测转染microRNA后，细胞内mRNA水平是否产生变化，进行q-PCR检测。结果如图3所示：miR-146b-5p类似物或抑制剂对小鼠骨实质来源间充质干细胞的转染效率以及转染后miR-146b-5p的表达改变情况；A-D为转染后的荧光照片，A为转染miR-146b-5p mimic NC，B为转染miR-146b-5pmimic，C为转染miR-146b-5p inhibitor NC，D为转染miR-146b-5p inhibitor。脂质体介导带有CY3荧光标记的miR-146b-5p mimic和miR-146b-5p inhibitor及对照组RNA转染于P3代的MSC，并于转染后4-6h在荧光显微镜下检测其转染效率，各组均可见红色荧光标记的MSC，证实外源RNA进入MSC内。E为转染后miR-146b-5p的表达变化，转染miR-146b-5p mimic后，MSC内的miR-146b-5p的表达水平显著上调(p<0.001)，并显著高于对照组。同时，转染miR-146b-5p inhibitor的MSC内miR-146b-5p的表达水平亦显著下调(p<0.01)。上述结果提示设计的miR146b-5p mimic与miR146b-5p inhibitor对MSC转染有效，且能够有效改变内源miR146b-5p的表达水平。
实施例4诱导成脂分化
转染后将细胞分为两组，即自分化组和诱导分化组，自分化组包括阴性对照组、转染miR-146b-5p mimic NC组、转染miR-146b-5p mimic组，诱导分化组包括加诱导剂组、转染miR-146b-5p inhibitor NC组、转染miR-146b-5p inhibitor组。自分化组采用α-MEM完全培养液，2-3d后全量换液。诱导分化组改用脂肪诱导分化培养液(内含10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、1umol/L地塞米松、10ug/ml胰岛素、0.5mmol/L IBMX的α-MEM)，2-3d后全量换液。培养至14d后，去除培养液，并加入PBS清洗2次，每孔加入2ml 4％中性甲醛溶液固定30min，用PBS清洗2次，24孔板中每孔加入500μl油红O染料工作液，用PBS清洗2次。在倒置显微镜下观察，并同时拍照。其中，jet Prime购自法国Polyplus transfection公司。
qPCR检测成脂分化因子C/EBPα和PPARγ的相对表达量，逆转录时需将RT特异性引物URP更换为Oligo dT和Random。其中RT-PCR引物序列如表2所示。检测microRNA miR-146b-5p时，以snoRNA202作为对照。检测成脂分化因子C/EBPα和PPARγ，以GAPDH为对照。
表2 RT-PCR引物序列
Western blot检测PPARγ在蛋白水平的变化。收集各组成脂诱导分化细胞，PBS洗2遍，细胞裂解液4℃裂解细胞30min，12000rpm4℃离心10min，BCA蛋白浓度测定试剂检测蛋白含量。取30ug蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，经10％SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上，含5％脱脂奶粉室温封闭1h。4℃过夜孵育一抗，用TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育1h，再用TBST洗膜3次，ECL化学发光显影。
结果如图4所示，转染有miR146b-5p mimic的MSC不经成脂诱导即可大量分化为脂肪细胞(图4C)，与自分化组(图4A)和miR146b-5p mimic NC对照组(图4B)相比，过表达miR146b-5p mimic可显著提高MSC自分化所形成的脂滴数目和脂肪细胞比例，提示miR146b-5p可促进MSC向脂肪细胞分化；与此同时，在诱导MSC向脂肪细胞分化的过程中转染miR146b-5p inhibitor，以降低miR146b-5p的表达水平，发现转染miR-146b-5pinhibitor(图4F)后脂滴数明显少于诱导分化组(图4D)和miR-146b-5p inhibitor NC对照组(图4E)，提示敲减miR-146b-5p的表达可显著抑制MSC向脂肪细胞分化过程。
G为mRNA水平上C/EBPα和PPARγ表达变化。q-PCR检测结果表明，与自分化组和miR-146b-5p mimic NC组相比，转染miR-146b-5p mimic的MSC内高表达成脂分化因子C/EBPα和PPARγ，两者的表达量均显著上调(p<0.01)。同时，与诱导分化组和miR-146b-5pinhibitor NC组相比，转染有miR-146b-5p inhibitor的MSC内成脂分化因子C/EBPα和PPARγ表达显著下调(p<0.05)。
F为蛋白水平上PPARγ的表达变化。Western blot检测发现未诱导组内，过表达miR-146b-5p mimic后，分化的MSC内PPARγ蛋白水平显著高于自分化组和转染对照组；而转染miR-146b-5p inhibitor抑制miR146b-5p表达的诱导分化组内，其PPARγ的蛋白水平亦显著低于诱导对照组和转染对照组，证实miR-146b-5p对MSC向脂肪细胞分化具有促进作用，其缺失将直接导致MSC向脂肪细胞分化受阻。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
北京原能细胞医学研究院有限公司
<120> 一种调控小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法
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ugagaacuga auuccauagg cu 22
<210> 2
<211> 22
<212> RNA
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<223> miR-146b-5p mimic sense
<400> 2
ugagaacuga auuccauagg cu 22
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mir-146b-5p抑制剂
<400> 3
agccuaugga auucaguucu ca 22

Claims (10)

1.miRNA和/或其抑制剂在调控小鼠骨实质来源的间充质干细胞成脂分化中的应用，所述miRNA为miR-146b-5p，其序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3’，所述调控为促进或抑制。
2.根据权利要求1所述的应用，所述miRNA抑制剂为单链RNA分子，其序列为5’-AGCCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3’。
3.一种促进小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离提取小鼠骨实质来源的间充质干细胞，然后进行原代培养、传代培养；
将miR-146b-5p导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞，然后培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述将miR-146b-5p导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞的方法为：用脂质体包裹miR-146b-5p mimic，接种于第三代指数期的小鼠骨实质来源间充质干细胞，当细胞融合40-60％时进行转染；所述miR-146b-5pmimic为双链RNA分子，其中有义链为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3’。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述脂质体为jetPRIME，其包裹miR-146b-5p mimic的方法为：将miR-146b-5p mimic用DEPC水稀释，得到终浓度为20μM的miR-146b-5p mimic水溶液；将水溶液按体积比1:40-50稀释于jetPRIME Buffer中，室温孵育3-8min，得到A液；将Jet Prime按体积比1:40-50稀释于Jet Prime Buffer，室温孵育3-8min，得到B液；混合A、B液，室温下静置20min，形成A/B复合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转染方法为：将A/B复合物混合，控制miRNA终浓度为50nM，转染培养基为含10％FBS的α-MEM培养基，不含抗生素。
7.一种抑制小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
分离提取小鼠骨实质来源的间充质干细胞，然后进行原代培养、传代培养；
将miR-146b-5p抑制剂导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞，然后培养；所述miRNA抑制剂为单链RNA分子，其序列为5’-AGCCUAUGGAAUUCAGUUCUCA-3’。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述miR-146b-5p抑制剂导入传代培养后的小鼠骨实质来源间充质干细胞的方法为：用脂质体包裹miR-146b-5p抑制剂，接种于第三代指数期的小鼠骨实质来源间充质干细胞，当细胞融合40-60％时进行转染。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述脂质体为jetPRIME，其包裹miR-146b-5p抑制剂的方法为：将miR-146b-5p抑制剂用DEPC水稀释，得到终浓度为20μM的miR-146b-5p抑制剂水溶液；将水溶液按体积比1:40-50稀释于jetPRIME Buffer中，室温孵育3-8min，得到A液；将Jet Prime按体积比1:40-50稀释于Jet Prime Buffer，室温孵育3-8min，得到B液；混合A、B液，室温下静置20min，形成A/B复合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述转染方法为：将A/B复合物混合，控制miR-146b-5p抑制剂终浓度为50nM，转染培养基为含10％FBS的α-MEM培养基，不含抗生素。
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