CN113699115A - Dapk1在调控人骨髓来源msc的成脂分化能力中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于再生医学技术领域，具体涉及DAPK1在调控人骨髓来源MSC的成脂分化能力中的用途。本发明经研究发现，通过转染PRK5‑DAPK1质粒过表达DAPK1后，MSC成脂分化能力显著下降；通过转染DAPK1的siRNA干扰剂敲减DAPK1后，MSC成脂分化能力显著上升，说明可通过新型小分子化合物PRK5‑DAPK1质粒或者DAPK1的siRNA干扰剂调控间充质干细胞的成脂分化，在调节脂肪合成、控制间充质干细胞成脂分化等方面具有广泛的应用前景。本发明调控人骨髓来源间充质干细胞成脂分化的方法，方法操作简便，可快速、方便、高效地进行转染，转染效率较高，且对细胞的损伤小。

Description

DAPK1在调控人骨髓来源MSC的成脂分化能力中的用途
技术领域
本发明属于再生医学技术领域，具体涉及DAPK1在调控人骨髓来源MSC的成脂分化能力中的用途。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一类具有多向分化潜能和免疫调节作用的成体干细胞，广泛存在于人体组织和器官中，例如骨髓、脂肪组织、牙髓及新生儿组织(包括胎盘、羊膜和脐带等)，在适宜条件下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞等多种类型的细胞。MSC还可以通过分泌细胞外基质和可溶性因子(如细胞因子、趋化因子、生长因子等多种代谢产物)来调控机体免疫，从而参与多种自身免疫性疾病的发生和发展，同时还与肿瘤的发生与发展有关。MSC向成脂细胞分化和成骨细胞分化是机体普遍存在的两种重要的生理过程，参与了多种组织代谢与平衡的维持。MSC向成脂分化和成骨分化的平衡失调，会引起多种疾病的发生，如骨质疏松症、肥胖症、动脉粥样硬化等，揭示MSC向成脂和成骨分化平衡的调控机制对上述脂肪和骨分化失衡相关疾病的治疗具有重要的指导意义。
DAPK1(Death associated protein kinase 1，死亡相关蛋白激酶)是一种Ca2+/钙调蛋白调节的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，其蛋白质的氨基酸序列含有一个激酶结构域(Kinase domain,KD)、钙调蛋白结合结构域(CaM-binding motif)，8个锚定蛋白的重复序列以及一个死亡结构域(Death domain)。DAPK1是调控和参与体内多种信号通路的重要分子，介导细胞凋亡、自噬、焦亡等死亡信号，DAPK1在免疫调节、炎症、上皮修复以及调节核内细胞信号转导等方面也有重要作用，其表达异常可以导致多种疾病的发生。目前尚未有关于DAPK1调控MSC的分化的生物学功能报道。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了DAPK1在调控人骨髓来源MSC的成脂分化能力中的用途，即过表达DAPK1后，MSC成脂分化能力显著下降；敲减DAPK1后，MSC成脂分化能力显著上升，为MSC成脂分化能力的调控提供了新的途径。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了DAPK1在调控人骨髓来源MSC的成脂分化中的用途。
本发明还提供了DAPK1在制备调控人骨髓来源MSC成脂分化的产品中的用途。
本发明还提供了一种体外促进人骨髓来源MSC成脂分化的方法，具体为通过敲减DAPK1来促进MSC的成脂分化。
优选地，通过往人骨髓来源MSC中转染siRNA干扰剂敲减DAPK1，所述siRNA干扰剂为单链RNA分子，所述siRNA干扰剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1【5’-CCUUCAAAUCGCCCACUUUTT-3’(S1)】或SEQ ID NO.2【5’-GCAAAUGAUCCCACGUCAATT-3’(S2)】所示。
进一步地，敲减DAPK1的具体方法为：用脂质体包裹siRNA干扰剂后，当细胞密度达到80-90％时，接种于第3-5代的人骨髓来源MSC中进行转染，转染6小时后采用成脂诱导培养基进行培养。
具体地，脂质体包裹siRNA干扰剂的方法为：往100uL Opt-MEN中加入lipoMAX2uL，制得A液；往100uL Opt-MEN中加入4uL siRNA，制得B液，将A液和B液混合后常温孵育20min即可。
特别的，siRNA在使用前，先按1OD siRNA加入125uL DEPC水的标准进行震荡溶解，使溶解后的siRNA浓度为20uM。
具体地，转染培养基为含10％FBS的DMEM培养基，不含抗生素。
本发明还提供了一种体外抑制人骨髓来源MSC成脂分化的方法，具体为通过过表达DAPK1来抑制MSC的成脂分化。
优选地，通过往人骨髓来源MSC中转染PRK5-DAPK1质粒来过表达DAPK1，所述PRK5-DAPK1为双链DNA分子，其中目的基因为人源性DAPK1，其基因ID为1416。
进一步地，过表达DAPK1的具体方法为：用脂质体包裹PRK5-DAPK1质粒后，当细胞密度达到80-90％时，接种于第3-5代的人骨髓来源MSC中进行转染，转染6小时后采用成脂诱导培养基进行培养。
具体地，脂质体包裹PRK5-DAPK1质粒的方法为：往100uL Opt-MEN中加入lipo30000.5uL，制得A液；往100uL Opt-MEN中加入1ug质粒PRK5-DAPK1，以及0.5uL p3000，制得B液；将A液和B液混合后常温孵育20min记可。
具体地，转染培养基为含10％FBS的DMEM培养基，不含抗生素。
优选地，所述调控为促进或抑制。
在本发明中，所述成脂诱导培养基的配置方法为：地塞米松以无水酒精为溶剂，配成浓度为1mmol/L的储存溶液；吲哚美辛以甲醇为溶剂，配成浓度为40mmol/L的储存溶液；胰岛素溶于2N盐酸中，配成浓度为5mg/mL的储存溶液；IBMX以DMSO为溶剂，配成浓度为50mmol/L的储存溶液；然后往100mL的高糖培养基中加入100uL地塞米松储存液，200uL胰岛素储存液，1mL IBMX储存夜，500uL吲哚美辛储存液；最后经过滤后制备得到。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明经研究发现，DAPK1与MSC成脂分化能力密切相关，通过转染PRK5-DAPK1质粒过表达DAPK1后，MSC成脂分化能力显著下降；通过转染DAPK1的siRNA干扰剂敲减DAPK1后，MSC成脂分化能力显著上升，说明通过调控DAPK1的表达情况可以有效调控MSC的成脂分化，即可通过新型小分子化合物PRK5-DAPK1质粒或者DAPK1的siRNA干扰剂调控间充质干细胞的成脂分化(促进或抑制)，即利用脂质体承载基因和/或siRNA后转染进人骨髓来源的间充质干细胞中，在调节脂肪合成、控制间充质干细胞成脂分化等方面具有广泛的应用前景。本发明促进/抑制人骨髓来源间充质干细胞成脂分化的方法，方法操作简便，可快速、方便、高效地进行转染，转染效率较高，且对细胞的损伤小。
附图说明
图1为MSC诱导不同天数后DAPK1以及成脂相关蛋白的表达水平(A为DAPK1的qPCR结果；B和C为WB结果的免疫印迹图和定量统计图；**p＜0.01，***p＜0.001)；
图2为DAPK1过表达对MSC成脂分化的影响情况(A和B分别为油红O染色后的镜下拍照结果和萃取后的定量结果；C和D分别为成脂分化后成脂相关蛋白表达水平的免疫印迹和相对定量结果；*p＜0.05，**p＜0.01；比例尺：250um)；
图3为DAPK1敲减对MSC成脂分化的影响情况(A和B分别为油红O染色后的镜下拍照结果和萃取后的定量结果；C和D分别为成脂分化后成脂相关蛋白表达水平的免疫印迹和相对定量结果；**p＜0.01，分别与NC组比较；比例尺：250um)。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。
在下述实施例中，胎牛血清(FBS)购自四季青公司；PBS磷酸盐缓冲液预混粉剂(购自博士德生物工程有限公司)在使用前溶于2000mL去离子水中；地塞米松、胰岛素、油红O染料、IBMX均购自Sigma公司；RNA提取试剂盒购自奕杉生物；qPCR试剂盒购自艾科锐公司；DAPK1过表达质粒(PRK5-DAPK1)，DAPK1的siRNA干扰序列，其阴性对照(PRK5)、引物(其具体序列如表1所示)购自广州艾基股份有限公司；SI或S2敲减使用的脂质体是LipofectamineRNAiMAX(lipoMAX)，购自英潍捷基；过表达使用的脂质体是Lipofectamine 3000Transfection Kit(包含P3000和lipo 3000)，购自英潍捷基，相关的蛋白抗体购自cellsignaling technology。
实施例1MSC成脂分化过程中DAPK1的表达情况
(1)对收集自中山大学附属第八医院的志愿者骨髓严格按照干细胞分离培养要求进行分离(分离方法参照文献：Peng W,Li Y,Huang L.Effects and safety of allogenicmesenchymal stem cell intravenous infusion in active ankylosing spondylitispatients who failed NSAIDs:a 20-week clinical trial.[J].Cell Transplantation,2014,23(10):1293-303.)，得到人体来源的MSCs，将人体来源的MSCs培养至3-5代备用。
(2)配置成脂诱导培养基：地塞米松以无水酒精为溶剂，配成浓度为1mmol/L的储存溶液；吲哚美辛以甲醇为溶剂，配成浓度为40mmol/L的储存溶液；胰岛素溶于2N盐酸中，配成浓度为5mg/mL的储存溶液；IBMX以DMSO为溶剂，配成浓度为50mmol/L的储存溶液；然后往100mL的高糖培养基中加入100uL地塞米松储存液，200uL胰岛素储存液，1mL IBMX储存夜，500uL吲哚美辛储存液；混匀后用0.22um的滤膜过滤，置于4℃储存备用。
(3)成脂诱导：往上述成脂分化诱导液中加入100IU/mL的青霉素/链霉素，按2mL/孔的量加入到人骨髓来源的间充质干细胞中，每隔两天半换液一次。
(4)收集成脂诱导0，1，3，6，10，14天后的MSCs，采用奕杉生物的RNA提取试剂盒提取总RNA，根据说明书操作的指引，使用艾科瑞生物的Evo M-MLV反转录试剂预混液进行逆转录得到cDNA，并使用艾科瑞生物的预混型qPCR试剂盒进行qPCR检测(以GAPDH为内参)，qPCR所使用的引物见表1。同时，对诱导不同天数的MSCs提取总蛋白(使用北京康为世纪生物科技有限公司的RIPA Lysis Buffer(strong)裂解细胞提取总蛋白)，采用WB法检测DAPK1和成脂相关蛋白(PPARγ，C/EBPα和FABP4)的表达水平(WB检测参照“Li,M.；Xie,Z.；Wang,P.；Li,J.；Liu,W.；Tang,S.A.；Liu,Z.；Wu,X.；Wu,Y.；Shen,H.The long noncodingRNA GAS5 negatively regulates the adipogenic differentiation of MSCs bymodulating the miR-18a/CTGF axis as a ceRNA.Cell Death Dis.2018,9.”)。
(5)检测结果：如图1的检测结果所示，在成脂分化过程中，DAPK1的RNA和蛋白水平逐渐下降，而成脂相关蛋白PPARγ，C/EBPα和FABP4逐渐上升。说明MSC成脂过程中DAPK1的表达下调。
表1 qPCR引物序列
Figure BDA0003210068310000051
实施例2 DAPK1过表达对MSC成脂分化的影响
(1)将人体来源的MSCs细胞经过复苏后，用0.25％胰酶进行消化，然后按0.8×105/孔的量接种于12孔细胞培养板中，用含有10％胎牛血清的DMEM细胞基础培养基(不含抗生素)培养，当细胞密度达到80％-90％时进行转染。转染的方法为：
1)配置过表达体系：往100uL Opt-MEN中加入lipo30000.5 uL，制得A液；往100uLOpt-MEN中加入1ug质粒(对照PRK5或者PRK5-DAPK1，DAPK1对应NCBI库的Gene ID号为1612)以及0.5uL p3000，制得B液；
2)转染及成脂诱导：将A液和B液混合后常温孵育20min，然后加入细胞密度达到80％-90％且含有完全培养基的细胞孔板中。6小时后，弃上清，按2mL/孔的量将培养液全部换为成脂诱导培养基(含100IU/mL的青霉素/链霉素，制备方法见实施例1)，培养于5％、CO2浓度下的37℃细胞恒温培养箱中，每隔两天半换液一次，14天后，进行成脂能力检测。
(2)PRK5空载体过表达组和PRK5-DAPK1过表达组待成脂分化诱导14天后，将细胞固定，分别进行油红O(Oil Red O，ORO)染色活性定量分析和成脂相关蛋白表达水平的检测(蛋白免疫印迹法)，具体操作方法为：
1)ORO染色：去除培养基，用PBS清洗2次后以4％多聚甲醛固定20min，再用PBS清洗3次，按500uL/孔的量加入油红O工作溶液(油红O原液与异丙醇按3：2的体积比混合)，常温染色30min。之后用移液枪去除油红O工作液，加入PBS洗3次，显微镜下拍照。拍照结束后，按500uL/孔的量加入异丙醇常温萃取30min，然后吸取200uL置于96孔板中测520nm波长处的吸光度，记录数值做定量分析。
2)成脂相关蛋白表达水平检测：上述两组在成脂分化14天后，收集细胞裂解后的蛋白样品(使用北京康为世纪生物科技有限公司的RIPA Lysis Buffer(strong)裂解细胞提取总蛋白)，用蛋白免疫印迹方法检测MSCs成脂分化过程中的指标蛋白PPARγ，Perilipin和FABP4的表达水平(WB检测参照“Li,M.；Xie,Z.；Wang,P.；Li,J.；Liu,W.；Tang,S.A.；Liu,Z.；Wu,X.；Wu,Y.；Shen,H.The long noncoding RNA GAS5 negativelyregulates the adipogenic differentiation ofMSCs by modulating the miR-18a/CTGF axis as a ceRNA.Cell Death Dis.2018,9.”)，并进行灰度定量分析。
(3)检测结果：如图2的油红O染色和成脂相关蛋白的WB分析结果所示，过表达DAPK1后，MSCs的成脂分化能力较过表达空载体组下降，说明DAPK1能抑制MSC成脂。
实施例3 DAPK1的siRNA干扰序列对MSC成脂分化的影响
(1)人骨髓来源MSC按照实施例2的方法接种于12孔细胞培养板中，用含有10％胎牛血清的DMEM细胞基础培养基培养，当细胞密度达到80％-90％时进行转染。转染的方法为：
1)通过离心机以1000rpm/min的转速对siRNA(S1：5’-CCUUCAAAUCGCCCACUUUTT-3’或者S2：5’-GCAAAUGAUCCCACGUCAATT-3’)离心1min，然后往每1OD的siRNA中加入125uLDEPC水，震荡溶解，溶解后的siRNA浓度为20uM。
2)配置敲减体系：往100uL Opt-MEN中加入lipoMAX 2uL，制得A液；往100uL Opt-MEN中加入4uL siRNA(对照NC或者S1或者S2)，制得B液；
3)转染及成脂诱导：将A液和B液混合后常温孵育20min，然后加入细胞密度达到80％-90％且含有完全培养基的细胞孔板中。6小时后，弃上清，按2mL/孔的量将培养液全部换为成脂诱导培养基(含100IU/mL的青霉素/链霉素，制备方法见实施例1)，每隔两天半换液一次，14天后，进行成脂能力检测。
(2)空白对照组(C)，无义序列NC对照组，S1敲减组和S2敲减组成脂诱导后，按照实施例2的方法同样进行油红O染色和成脂相关蛋白表达水平检测。
(3)检测结果：如图3的结果所示，通过siRNA序列敲减DAPK1后，MSCs的成脂分化能力较过对照组明显上调。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中山大学附属第八医院(深圳福田)
<120> DAPK1在调控人骨髓来源MSC的成脂分化能力中的用途
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> S1(Artificial Sequence)
<400> 1
ccuucaaauc gcccacuuut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> S2(Artificial Sequence)
<400> 2
gcaaaugauc ccacgucaat t 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> DAPK1-F(Artificial Sequence)
<400> 3
acgtggatga ttactacgac acc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> DAPK1-R(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcttttctc acggcatttc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> GAPDH-F(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagcgagat ccctccaaaa t 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> GAPDH-R(Artificial Sequence)
<400> 6
ggctgttgtc atacttctca tgg 23

Claims (10)

1.DAPK1在制备调控人骨髓来源MSC成脂分化的产品中的用途。
2.一种体外促进人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，通过敲减DAPK1来促进MSC的成脂分化。
3.根据权利要求2所述的一种体外促进人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，通过往人骨髓来源MSC中转染siRNA干扰剂敲减DAPK1，所述siRNA干扰剂为单链RNA分子，所述siRNA干扰剂的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的一种体外促进人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，敲减DAPK1的具体方法为：用脂质体包裹siRNA干扰剂后，当细胞密度达到80-90％时，接种于第3-5代的人骨髓来源MSC中进行转染，转染6小时后采用成脂诱导培养基进行培养。
5.根据权利要求4所述的一种体外促进人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，脂质体包裹siRNA干扰剂的方法为：往100uL Opt-MEN中加入lipoMAX 2uL，制得A液；往100uL Opt-MEN中加入4uL siRNA，制得B液，将A液和B液混合后常温孵育20min即可。
6.一种体外抑制人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，通过过表达DAPK1来抑制MSC的成脂分化。
7.根据权利要求6所述的一种体外抑制人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，通过往人骨髓来源MSC中转染PRK5-DAPK1质粒来过表达DAPK1，所述PRK5-DAPK1为双链DNA分子，其中目的基因为人源性DAPK1，其基因ID为1416。
8.根据权利要求7所述的一种体外抑制人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，过表达DAPK1的具体方法为：用脂质体包裹PRK5-DAPK1质粒后，当细胞密度达到80-90％时，接种于第3-5代的人骨髓来源MSC中进行转染，转染6小时后采用成脂诱导培养基进行培养。
9.根据权利要求7所述的一种体外抑制人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，脂质体包裹PRK5-DAPK1质粒的方法为：往100uL Opt-MEN中加入lipo30000.5 uL，制得A液；往100uL Opt-MEN中加入1ug质粒PRK5-DAPK1，以及0.5uL p3000，制得B液；将A液和B液混合后常温孵育20min记可。
10.根据权利要求4所述的一种体外促进人骨髓来源MSC成脂分化的方法或根据权利要求8所述的一种体外抑制人骨髓来源MSC成脂分化的方法，其特征在于，所述成脂诱导培养基的配置方法为：地塞米松以无水酒精为溶剂，配成浓度为1mmol/L的储存溶液；吲哚美辛以甲醇为溶剂，配成浓度为40mmol/L的储存溶液；胰岛素溶于2N盐酸中，配成浓度为5mg/mL的储存溶液；IBMX以DMSO为溶剂，配成浓度为50mmol/L的储存溶液；然后往100mL的高糖培养基中加入100uL地塞米松储存液，200uL胰岛素储存液，1mL IBMX储存夜，500uL吲哚美辛储存液；最后经过滤后制备得到。
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