CN117025772A - 肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法,该肝癌相关血清microRNA标志物肝癌相关血清microRNA标志物由hsa‑miR‑122、hsa‑miR‑21、hsa‑miR‑2115、hsa‑miR‑221、hsa‑miR‑27和hsa‑miR‑4499构成;用Real‑time PCR方法检测各肝癌相关血清microRNA标志物在血清中的相对表达量,检测试剂含有上述肝癌相关血清microRNA标志物的引物。本发明可用于诊断肝细胞癌,尤其是早期肝细胞癌,或者区分至少一个肝细胞癌患者的血清和至少一个健康个体的血清、至少一个慢性乙肝患者的血清或者至少一个肝硬化患者的血清。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及临床医学领域,涉及一种人类肝癌相关的血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法,血清微核糖核酸microRNA包含hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,世界卫生组织发布的数据显示,2020年全球癌症新发病例约1929万,死亡病例约996万。恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重要原因之一,给社会带来了沉重的经济负担。肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程,就全球而言,慢性HBV和HCV感染是原发性肝细胞癌(HCC)主要的危险因素,尤其是慢性HBV感染与HCC发病呈现高度的地域一致性,与全球75%的肝癌有关,在发展中国家甚至达到85%。肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国肝癌的最主要病因。肝癌主要包括:肝细胞癌和肝内胆管细胞癌,前者占到83.9%~92.3%,而约85%的肝细胞癌患者都有HBV感染。我国肝癌5年相对生存率仅为12.1%,但是,如果早期诊断经过有效治疗,可达到相对较好的预后,尤其是5cm以内的小肝癌,5年生存率可达到80%以上。目前,肝癌筛查效果不理想,检出率和早期诊断率相对偏低,开发适用于广泛人群的早期筛查手段,对我国肝癌的有效防治意义重大。
肝癌早期无明显症状,传统早筛方法是针对高危人群进行肝癌血清学诊断标志物甲胎蛋白(AFP)联合肝脏B超检查。甲胎蛋白作为应用最广的血清学标志物,在肝癌诊断和监测中发挥着重要作用,但是其对早期肝癌的检出率并不令人满意。目前国内外研究均证明,甲胎蛋白(AFP)在特异性、敏感性仍然存在不足。临床存在约30%至40%的甲胎蛋白阴性患者。B超检测的灵敏度跟肿瘤的位置相关,而且对检查医生的技能要求较高,这些就造成了肝癌早期筛查、诊断的难度。
MicroRNA(miRNA)是一系列进化保守的长20~25个核苷酸的单链RNA分子,属于内源性非编码RNA。miRNA通过和靶基因mRNA的不完全互补配对,抑制蛋白的翻译表达过程或促使mRNA的降解。miRNA的调控机制复杂而多样化。通过调节靶基因的表达,miRNA可以指导一系列生物学机制,如胚胎生长、细胞生长、凋亡以及细胞分化等。miRNA作为肿瘤标志物具有以下五大优点:①miRNA在正常人外周血中表达稳定且可以稳定存在,无显著的个体差异;②血清或血浆中miRNA在室温下孵育24h及以上、反复冻融、过酸、过碱条件下不易降解;③miRNA表达水平的变化与恶性肿瘤的病理过程密切相关;④血清中miRNA的异常表达可作为肿瘤细胞存在的直接证据,具有很好的生物学标志物价值;⑤miRNA相比于蛋白标志物不仅检测准确率更高,且更易于实现多组分同时检测,优越性明显。miRNA参与人体许多细胞活动,如增生、凋亡及迁移等。而且,miRNA在癌症的增殖、转移中具有重要作用,可将其作为肿瘤发生、发展及预后的生物标志物。
在前期的研究中,我司首次发现,与对照组相比,hsa-miR-2115和hsa-miR-4499在肝癌患者血清表达水平均具有显著的差异,调控肝癌细胞活性,对肝癌早期诊断有一定的指导作用,具有作为HCC早期诊断标志物的潜力。通过联合hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499,可以进一步的提高诊断效果,提升诊断价值,通过多个miRNA生物标志物联合应用可以快速、准确、低成本的早期诊断HCC患者。
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发明内容
本发明的目的是提供一组肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法,可以进一步的提高肝癌诊断效果,提升诊断价值。
本发明采用的技术方案如下:
本发明提供的肝癌相关血清microRNA标志物,其特征在于,肝癌相关血清microRNA标志物由hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499构成;其中hsa-miR-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg(SEQ ID No.1),hsa-miR-21的序列为tagcttatcagactgatgttga(SEQ ID No.1),hsa-miR-2115的序列为catcagaattcatggaggctag(SEQ ID No.3),hsa-miR-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc(SEQ ID No.4),hsa-miR-27的序列为ttcacagtggctaagttccgc(SEQ ID No.5),hsa-miR-4499的序列为gattgctctgcgtgcggaatcgac(SEQ ID No.6)。
本发明一种诊断肝癌的新方法,其特征在于,待测血清采样处理后,用Real-timePCR方法测量肝癌相关血清microRNA标志物在血清中的相对表达量;对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行检测的试剂,含有针对上述标志物的引物,具体构成如下:标志物hsa-miR-122(SEQ ID No.1)的上游引物hsa-miR-122-F的序列为gccgagtggagtgtgacaatg(SEQID No.7),标志物hsa-miR-21(SEQ ID No.2)的上游引物hsa-miR-21-F的序列为tcggcaggtagcttatcagac(SEQ ID No.8);标志物hsa-miR-2115(SEQ ID No.3)的上游引物hsa-miR-2115-F的序列为catcagaattcatggaggct(SEQ ID No.9);标志物hsa-miR-221(SEQID No.4)的上游引物hsa-miR-221-F的序列为gccgagagctacattgtctgc(SEQ ID No.10);标志物hsa-miR-27(SEQ ID No.5)的上游引物hsa-miR-27-F的序列为gccgagttcacagtggctaag(SEQ ID No.11);标志物hsa-miR-4499(SEQ ID No.6)的上游引物hsa-miR-4499-F的序列为gattgctctgcgtgcggaatc(SEQ ID No.12);上述标志物的通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt (SEQ ID No.13)。
本发明一种诊断肝癌的新方法,其特征在于,对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行测量,测出ΔCt值后输入判别公式:
综合判断值=-1.772+0.097*ΔCt hsa-miR-122 +0.295*ΔCt hsa-miR-21 -1.123*ΔCt hsa-miR-2115 -0.322*ΔCt hsa-miR-221 +0.606*ΔCt hsa-miR-27 +0.057*ΔCt hsa-miR-4499;综合判断值≥0,为阳性,患肝癌的风险较高;综合判断值<0,为阴性,患肝癌的风险较低。
本发明肝癌相关血清microRNA标志物,选自hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499中的多种。
为了方便检测使用,将肝癌相关血清microRNA标志物测量所用到的试剂和工具制备成试剂盒,其中包含的试剂是能够测定这些血清microRNA标志物在血清中表达量的,含有上述肝癌相关血清microRNA标志物(hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499)的引物。具体实施如下:
一种人类肝癌诊断试剂盒,该试剂盒含有上述肝癌相关血清microRNA标志物的引物,对应microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499的测量试剂分别含有上游引物和下游引物,6对引物具体如下:
标志物hsa-miR-122(SEQ ID No.1)的上游引物hsa-miR-122-F的序列为gccgagtggagtgtgacaatg(SEQ ID No.7),通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt(SEQ ID No.13);
标志物hsa-miR-21(SEQ ID No.2)的上游引物hsa-miR-21-F的序列为tcggcaggtagcttatcagac(SEQ ID No.8),通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt(SEQ ID No.13);
标志物hsa-miR-2115(SEQ ID No.3)的上游引物hsa-miR-2115-F的序列为catcagaattcatggaggct(SEQ ID No.9),通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt(SEQ ID No.13);
标志物hsa-miR-221(SEQ ID No.4)的上游引物hsa-miR-221-F的序列为gccgagagctacattgtctgc(SEQ ID No.10),通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt(SEQ ID No.13);
标志物hsa-miR-27(SEQ ID No.5)的上游引物hsa-miR-27-F的序列为gccgagttcacagtggctaag(SEQ ID No.11),通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt(SEQ ID No.13);
标志物hsa-miR-4499(SEQ ID No.6)的上游引物hsa-miR-4499-F的序列为gattgctctgcgtgcggaatc(SEQ ID No.12),通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt(SEQ ID No.13)。
试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本,系统收集完整的人群基础信息和临床资料,并采用了RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array、Real-time PCR(TaqMan探针)方法的多种进行检测。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分:
一、研究对象选择和分组依据
A组:对照组(n=345,150例健康对照,150例慢性乙肝患者,145例肝硬化患者),无其他全身性重大疾病;
B组:肝癌患者(n=233),无其他全身性重大疾病。
二、血液血清分离及前处理
(1)抽取外周血(2ml)放入分离胶采血管中,轻轻地180°上下颠倒混匀,持续5-6次,12小时内,将促凝采血管在3,000g条件下离心10分钟。然后,随后将上清液转移到干净的管中,在-80℃储存;
(2)用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒(miRNeasy Serum/Plasma AdvancedKit),按照厂家(Qiagen)提供的使用说明来抽提总RNA,用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度。
三、Real-time PCR方法测量血清miRNAs表达量
1. 取经前处理的血清,通过RNA逆转录反应得到cDNA样品;按下表所示配制反转录体系 :
成分 | 体积(μL) |
10×Poly(A)Polymerase Buffer | 2 |
E.coli Poly(A)Polymerase(5U/μl) | 0.5 |
ATP(10mM) | 1 |
dNTP Mix(10μM) | 1 |
HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase(200U/μl) | 1 |
RNase inhibitor(40μM) | 1 |
RT primer universal(5μM) | 1 |
RNA | 10 |
RNase-free ddH2O | 2.5 |
合计 | 20 |
2. 将PCR管反复颠倒混匀8次后做简短离心,冰上放置3分钟。
3. 将PCR管放入基因扩增仪进行反转录,反应条件如下 :
42℃,60min;85℃,5min;4℃,forever;
反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。
4. 逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增 :
成分 | 体积(μL) |
预扩增混合液(2×) | 12.5 |
预扩增引物(10×) | 2.5 |
反转录产物 | 2.5 |
RNase-free ddH2O | 7.5 |
合计 | 25 |
预扩增的反应条件如下表所示 :
降至4℃后,将预扩增产物保存于4℃以用于下一步的Real-time PCR反应。
5. 将预扩增产物简短离心后,加入0.1×TE(pH8.0)75μl,颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-time PCR。
预扩增产物进行Real-time PCR按下表所示配制反应体系 :
成分 | 一块芯片所需体积(μL) |
通用PCR混合物(2×) | 400 |
稀释后的预扩增产物 | 8 |
RNase-free ddH2O | 392 |
合计 | 800 |
6. 检测并比较健康对照组、肝癌患者血清样本中miRNAs表达量的差异。
检测到的存在差异表达的对照组和肝癌患者血清miRNAs包括hsa-miR-107、hsa-miR-122、hsa-miR-1246、hsa-miR-192、hsa-miR-199、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-223、hsa-miR-26、hsa-miR-27、hsa-miR-4499和hsa-miR-801。
这些miRNAs在肝癌患者中的拷贝数都显著高于对照组。
四、在训练集中使用Real-time PCR方法验证血清miRNAs表达量
1. 设计13条目标miRNAs的引物:运用加PolyA尾PCR方法设计引物。
2. 加入荧光探针进行Real-time PCR反应。检测并对比健康对照组、慢乙肝患者、肝硬化患者和肝癌患者血清样本中miRNAs表达量的差异(68例健康对照、62例慢性乙肝患者、61例肝硬化患者和101例肝癌患者)。
3. 经过Real-time PCR检测,结果一致的有6条miRNAs(简称:6miRNA),具体为:hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499。
因此,最终确认为存在差异表达的健康对照组、肝癌患者血清miRNAs包括hsa-miR-122(SEQ ID No.1)、hsa-miR-21(SEQ ID No.2)、hsa-miR-2115(SEQ ID No.3)、hsa-miR-221(SEQ ID No.4)、hsa-miR-27(SEQ ID No.5)、hsa-miR-4499(SEQ ID No.6)。
将以上存在表达差异显著的miRNAs纳入Logistics回归方程,得到:Logit(p=HCC)=-1.772+0.097*hsa-miR-122 +0.295*hsa-miR-21 -1.123*hsa-miR-2115 -0.322*hsa-miR-221 +0.606*hsa-miR-27 +0.057*hsa-miR-4499。
五、在验证集中评估上述miRNAs组合的性能
在298例独立血清样本(70例健康对照、65例慢性乙肝患者、63例肝硬化患者和100例肝癌患者)中验证6miRNA组合的性能,以评估6miRNA组合预测肝癌患者的能力。
六、诊断试剂盒制备方法
根据上述一系列实验结果,本发明人还制备了一种能用于人类肝癌microRNA诊断试剂盒,所述诊断试剂盒包含测定受试者血清中可检测的成熟hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血清miRNAs引物,还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。
附图说明
图1 为本发明用于鉴定至少一个肝细胞癌靶血清,特别是存在早期肝细胞癌(BCLC 0期和A期)的microRNA组合的筛选、训练以及验证阶段的实验设计流程图。
图2 为确定本发明用于诊断肝细胞癌,特别是诊断早期肝细胞癌(BCLC 0期和A期)患者的血液中microRNA组合的主要方法步骤图。对照组包括健康、慢性乙肝和肝硬化受试者。
图3 说明了包含本发明用于确定至少一个肝细胞癌靶血清的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499)的逻辑回归模型;
图3-A:训练集(n=292)中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与 AFP(AUC=0.801)相比,microRNA组合在区分HCC组血清和对照组血清时具有显著高的诊断准确度(AUC=0.937);
图3-B:验证集(n=298)中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与 AFP(AUC=0.747)相比,microRNA组合在区分HCC组血清和对照组血清时具有显著高的诊断准确度(AUC=0.938)。
图4 说明了包含本发明用于进一步区分肝细胞癌患者血清和健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者的血清的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499)的逻辑回归模型;
图4-A:验证集(n=298)中HCC组与健康组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.793)相比,microRNA组合在区分HCC患者血清和健康个体血清时具有显著高的诊断准确度(AUC=0.990);
图4-B: 验证集(n=298)中HCC组与慢性乙肝组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.734)相比,microRNA组合在区分HCC患者血清和慢性乙肝患者的血清时具有显著高的诊断准确度(AUC=0.887);
图4-C: 验证集(n=298)中HCC组与肝硬化组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.712)相比,microRNA组合在区分HCC患者血清和肝硬化患者的血清时具有显著高的诊断准确度(AUC=0.826)。
图5 说明了包含本发明用于鉴定不同 BCLC分期的肝细胞癌的至少一个靶血清的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499)的逻辑回归模型;
图5-A:极早期HCC(BCLC 0)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.670)相比,microRNA组合在区分极早期HCC患者血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度(AUC=0.955);
图5-B:早期HCC(BCLC A)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.719)相比,microRNA组合在区分早期HCC患者血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度(AUC=0.982);
图5-C:中期HCC(BCLC B)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.815)相比,microRNA组合在区分中期HCC患者血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度(AUC=0.912);
图5-D:进展期HCC(BCLC C)与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.830)相比,microRNA组合在区分进展期HCC患者血清和对照血清时具有高得多的诊断准确度(AUC=0.955)。
图6 说明了包含本发明用于鉴定AFP ≤ 20ng/mL及AFP>20ng/mL的肝细胞癌的至少一个靶血清的优选microRNA组合(hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499)的逻辑回归模型;
图6-A:AFP≤20ng/mL的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.676)相比,microRNA组合在区分AFP≤ 20ng/mL的HCC组血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度(AUC=0.956);
图6-B:AFP>20ng/mL的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP(AUC=0.940)相比,microRNA组合在区分AFP>20ng/mL的HCC组血清和对照组血清时无显著差异(AUC=0.968)。
图7为表2. microRNA芯片受试者特征;
图8为表3. 训练集和验证集受试者特征;
图9为表6. 训练集中microRNA表达情况及诊断效能。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的阐明。
实施例1 研究对象的选择和分组依据
本发明中microRNA生物标志物的筛选阶段、训练阶段以及验证阶段的实验设计如图1所示。用被推荐的血清microRNA组合来鉴别肝细胞癌患者的血清样本的主要方法步骤如图2所示。
在2022年1月到2023年5月间,688个满足合格标准(表1)的血液样本被预先从山东大学齐鲁医院和山东省立医院采集。这些样本从150个健康捐献者(HC健康组),150个慢性乙肝患者(CHB组),145个HBV感染后肝硬化患者(LC肝硬化组),以及233个HBV感染相关HCC患者(HCC组)获得。这些样本被按照时间先后顺序划归为3个阶段(图1)。患者的临床表现被总结在表2和表3中,具体参见附图7、附图8。
表1--选择患者的合格标准
纳入标准 |
1.年龄≥18岁且≤90岁 |
2.具有给与知情同意的能力 |
3.在2022年1月到2023年5月间遇到 |
健康捐献者(健康组) |
1.在医院做过体检 |
2.处于一般健康状态,未患恶性肿瘤 |
慢性乙肝患者(CHB组) |
诊断患有慢性乙肝(即超过6个月呈现HBsAg+、HBeAg+,或呈现HBeAg-但携带可检测到的HBV DNA) |
HBV感染后肝硬化患者(肝硬化组) |
1.患有HBV感染 |
2.被两名有经验的病理医生诊断 |
3.如果没有可用的组织,诊断必须被两个影响报告(B超、CT或MRI)支持 |
HBV感染相关HCC患者(HCC组) |
1.患有HBV感染 |
2.被两名有经验的病理医生诊断 |
3.如果没有可用的组织,诊断必须被两个影响报告(B超、CT或MRI)支持 |
4.无术前放疗、化疗、肝动脉化学栓赛或消融 |
实施例2 血液血清分离及前处理
抽取外周血(2ml)放入分离胶采血管中,轻轻地180°上下颠倒混匀,持续5-6次,12小时内,将促凝采血管在3,000g条件下离心10分钟。然后,随后将上清液转移到干净的管中,在-80℃储存。
用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒(miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit),按照厂家(Qiagen)提供的使用说明来抽提总RNA,用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度。
实施例3 microRNA芯片分析miRNAs表达差异
经microRNA芯片分析对比HCC组、健康对照组、慢乙肝组合肝硬化组的microRNA表达量的差异。筛选出存在差异表达的HCC患者、健康对照、慢乙肝患者和肝硬化患者血清miRNAs包括hsa-miR-107、hsa-miR-122、hsa-miR-1246、hsa-miR-192、hsa-miR-199、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-223、hsa-miR-26、hsa-miR-27、hsa-miR-4499以及hsa-miR-801(microRNA序列参见表4)。这些miRNAs在肝细胞癌患者中的拷贝数都显著高于健康对照、慢乙肝患者和肝硬化患者。
表4. microRNA序列
microRNA | 序列(5′→ 3′ ) |
hsa-miR-107 | agcagcattgtacagggctatca |
hsa-miR-122 | Tggagtgtgacaatggtgtttg (SEQ ID No.1) |
hsa-miR-1246 | aatggatttttggagcagg |
hsa-miR-192 | ctgacctatgaattgacagcc |
hsa-miR-199 | acagtagtctgcacattggtta |
hsa-miR-21 | tagcttatcagactgatgttga (SEQ ID No.2) |
hsa-miR-2115 | catcagaattcatggaggctag (SEQ ID No.3) |
hsa-miR-221 | agctacattgtctgctgggtttc (SEQ ID No.4) |
hsa-miR-223 | tgtcagtttgtcaaatacccca |
hsa-miR-26 | ttcaagtaatccaggataggct |
hsa-miR-27 | ttcacagtggctaagttccgc (SEQ ID No.5) |
hsa-miR-4499 | gattgctctgcgtgcggaatcgac (SEQ ID No.6) |
hsa-miR-801 | gattgctgcgtgcggaatcgac |
RNU6-1 | gtgctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaa ggatgacacgcaaattcgtgaagcgttccatatttt |
实施例4 在292个样本的训练集中对microRNA芯片筛选出的microRNA进行验证
设计引物( miRNA引物序列见表5),分别对68例健康对照、62例慢乙肝患者、61例肝硬化患者和101例肝癌患者的血清进行各miRNAs的定量Real-time PCR检测。
(1)制备cDNA样品:(a)使用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒(miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit,Qiagen),按照厂家提供的使用说明来抽提小RNA,用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度,(b)使用加尾试剂对小RNA进行加尾(E.coli Poly(A)Polymerase,Vazyme),(c)使用逆转录试剂对加尾后的小RNA进行逆转录(HiScript® IIReverse Transcriptase,Vazyme),得到cDNA。
(2)Real-time PCR:使用探针法实时荧光定量PCR(Taq Pro U Multiple ProbeqPCR MIX,Vazyme)检测并比较对照组(健康对照、慢乙肝患者、肝硬化患者)和肝癌患者血清样本中miRNA表达量的变化,各组样本血清miRNA表达水平是以RNU6-1为内参检测得到。
使用Kruskal-Wallis检验对HCC组和对照组进行比较,使用Mann-Whitney未配对检验对HCC组和对照组进行比较。使用逐步逻辑回归模型基于训练集选择microRNA诊断标志物,使用HCC的预测概率作为替代标志物来建立受试者工作特征(ROC)曲线,使用ROC曲线下面积(AUC)作为评价血清AFP和microRNA组合的诊断效能,使用MedCalc(19.8)软件进行ROC和回归分析。从结果分析得到,hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499这6个miRNA在对照组和肝癌患者间有显著差异。
6个候选microRNA在训练集中的表达谱和诊断效能如附图9表6所示,其中6microRNA组合*AUC=0.937(0.940,0.912)
将以上存在表达差异显著的miRNAs纳入Logistics回归方程,得到:*Logit(p=HCC)=-1.772+0.097*hsa-miR-122 +0.295*hsa-miR-21 -1.123*hsa-miR-2115 -0.322*hsa-miR-221 +0.606*hsa-miR-27 +0.057*hsa-miR-4499。
microRNA组合的AUC显著地大于AFP的AUC(0.937vs.0.801,p<0.001,图3-A),参见图3。
表5 miRNA引物序列
引物名称 | 对应miRNA引物序列(5′→ 3′ ) |
hsa-miR-107-F | AACAAGAGCAGCATTGTACAGGG |
hsa-miR-122-F | GCCGAGTGGAGTGTGACAATG(SEQ ID No.7) |
hsa-miR-1246-F | AACACGCAATGGATTTTTGGAGC |
hsa-miR-192-F | TCGGCAGGCTGACCTATGAAT |
hsa-miR-199-F | GCCGAGACAGTAGTCTGCACA |
hsa-miR-21-F | TCGGCAGGTAGCTTATCAGAC(SEQ ID No.8) |
hsa-miR-2115-F | CATCAGAATTCATGGAGGCT(SEQ ID No.9) |
hsa-miR-221-F | GCCGAGAGCTACATTGTCTGC(SEQ ID No.10) |
hsa-miR-223-F | TCGGCAGGTGTCAGTTTGTCA |
hsa-miR-26-F | TCGGCAGGTTCAAGTAATCCA |
hsa-miR-27-F | GCCGAGTTCACAGTGGCTAAG(SEQ ID No.11) |
hsa-miR-4499-F | GATTGCTCTGCGTGCGGAATC(SEQ ID No.12) |
hsa-miR-801-F | GATTGCTCTGCGTGCGGAATC |
RNU6-1-F | AACAAGCGCAAGGATGACACG |
Universal Rp | CAGTGCAGGGTCCGAGGT(SEQ ID No.13) |
Universal RT primer | CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTTVN |
Universal Taqman Probe | FAM-TGCCCAGGTGGCT-MGBNFQ |
实施例5 在298个样本的验证集中验证上述microRNA组合。
本实施例参见图3、图4。
从训练集中估计的参数被用于独立的验证集(298血清样本)上预测被诊断患有HCC的概率。同样地,采用定量RT-PCR检测方法来进行实验。预测概率被用来建立受试者工作特征曲线。
MicroRNA组合与AFP之间的AUC在验证集中的比较表明microRNA组合的诊断准确度显著高于AFP(AUC:0.938vs.0.747,p<0.001,图3-B)。
MicroRNA组合与AFP区分HCC组和健康组、CHB组以及肝硬化组的效能也进行了对比,如图4所示。该分析证明了MicroRNA组合与AFP皆可区分HCC组和非HCC。然而,MicroRNA组合的AUC显著大于AFP(HCC与健康组:0.990 vs. 0.793,p<0.001;HCC与CHB:0.887 vs.0.734,p<0.001;HCC与肝硬化组:0.826 vs. 0.712,p<0.001;图4-A,4-B和4-C)。
实施例6 MicroRNA组合与AFP在不同BCLC分期的诊断表现
MicroRNA组合与AFP在不同BCLC分期的诊断表现被进一步评价,如图5所示。在诊断早期、中期和晚期HCC(BCLC 0、A、B和C期)方面,MicroRNA组合的诊断表现显著高于AFP(BCLC 0期,AUC 0.955vs.0.670,p<0.001;BCLC A期,AUC 0.982vs.0.719,p<0.001;BCLCB期,AUC 0.912vs.0.815,p<0.001;BCLC C期,AUC 0.955 vs. 0.830,p<0.001;图5-A,5-B,5-C和5-D)。
实施例7 MicroRNA组合在AFP正常(≤ 20ng/mL)组和高AFP(>20ng/mL)组中的诊断表现
本实施7参见图6。按照AFP水平评估MicroRNA组合诊断准确度。在AFP正常(≤20ng/mL)组中,MicroRNA组合的AUC显著大于AFP的AUC(0.956 vs. 0.676,p<0.001,图6-A)。在高AFP(>20ng/mL)组中,MicroRNA组合的AUC与AFP的AUC差异不大(0.968 vs.0.940,p=0.26,图6-B)。
所获得的结果证实microRNA在肝细胞癌患者血清中的特异性表达。因此,这里规定的microRNA集可作为独特的microRNA生物标志物,通过肝细胞癌血清microRNA表达谱分析,不仅可以早期诊断肝癌的发生,也可区别肝细胞癌和慢性乙肝以及肝硬化。
本发明对于血清microRNA表达生物标志物的鉴别和验证提供了可在血液样本中进行筛选、早期诊断、区别诊断肝细胞癌的独特的分子标志物。
Claims (3)
1.肝癌相关血清microRNA标志物,其特征在于,肝癌相关血清microRNA标志物由hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499构成;其中hsa-miR-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg(SEQ ID No.1),hsa-miR-21的序列为tagcttatcagactgatgttga(SEQ ID No.2),hsa-miR-2115的序列为catcagaattcatggaggctag(SEQ ID No.3),hsa-miR-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc(SEQ ID No.4),hsa-miR-27的序列为ttcacagtggctaagttccgc(SEQ ID No.5),hsa-miR-4499的序列为gattgctctgcgtgcggaatcgac(SEQ ID No.6)。
2.一种诊断肝癌的新方法,其特征在于,待测血清采样处理后,用Real-time PCR方法检测权1中肝癌相关血清microRNA标志物在血清中的相对表达量;对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行检测的试剂,含有针对上述标志物的引物,具体构成如下:标志物hsa-miR-122(SEQ ID No.1)的上游引物hsa-miR-122-F的序列为gccgagtggagtgtgacaatg(SEQID No.7),标志物hsa-miR-21(SEQ ID No.2)的上游引物hsa-miR-21-F的序列为tcggcaggtagcttatcagac(SEQ ID No.8);标志物hsa-miR-2115(SEQ ID No.3)的上游引物hsa-miR-2115-F的序列为catcagaattcatggaggct(SEQ ID No.9);标志物hsa-miR-221(SEQID No.4)的上游引物hsa-miR-221-F的序列为gccgagagctacattgtctgc(SEQ ID No.10);标志物hsa-miR-27(SEQ ID No.5)的上游引物hsa-miR-27-F的序列为gccgagttcacagtggctaag(SEQ ID No.11);标志物hsa-miR-4499(SEQ ID No.6)的上游引物hsa-miR-4499-F的序列为gattgctctgcgtgcggaatc(SEQ ID No.12);上述标志物的通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt (SEQ ID No.13)。
3.根据权利要求2所述的一种诊断肝癌的新方法,其特征在于,对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行检测,测出ΔCt值后输入判别公式:
综合判断值=-1.772+0.097*ΔCt hsa-miR-122 +0.295*ΔCt hsa-miR-21 -1.123*ΔCt hsa-miR-2115 -0.322*ΔCt hsa-miR-221 +0.606*ΔCt hsa-miR-27 +0.057*ΔCthsa-miR-4499;
综合判断值≥0,为阳性,患肝癌的风险较高;综合判断值<0,为阴性,患肝癌的风险较低。
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