CN117025772A - 肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法 - Google Patents
肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117025772A CN117025772A CN202311016224.7A CN202311016224A CN117025772A CN 117025772 A CN117025772 A CN 117025772A CN 202311016224 A CN202311016224 A CN 202311016224A CN 117025772 A CN117025772 A CN 117025772A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- hsa
- seq
- liver cancer
- serum
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims abstract description 91
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 title claims abstract description 90
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 63
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 63
- 239000003550 marker Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 108091055248 Homo sapiens miR-4499 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 108091007780 MiR-122 Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 108091069016 Homo sapiens miR-122 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108091067572 Homo sapiens miR-221 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 108091090625 Homo sapiens miR-2115 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 108091007711 MIR2115 Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 29
- 108091070493 Homo sapiens miR-21 stem-loop Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108091008065 MIR21 Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 19
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 abstract description 69
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 abstract description 69
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 abstract description 21
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 abstract description 19
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 12
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 abstract description 10
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 abstract description 10
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 40
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 40
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 29
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 13
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 238000012549 training Methods 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 5
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 108091068928 Homo sapiens miR-107 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091044881 Homo sapiens miR-1246 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091067995 Homo sapiens miR-192 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091069527 Homo sapiens miR-223 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 101710124239 Poly(A) polymerase Proteins 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 3
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 2
- -1 hsa-miR-199 Proteins 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108091062140 Mir-223 Proteins 0.000 description 1
- 241000795633 Olea <sea slug> Species 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000007321 biological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000010109 chemoembolization Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 201000007450 intrahepatic cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 108091051828 miR-122 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 150000004965 peroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011249 preoperative chemoradiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供的肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法，该肝癌相关血清microRNA标志物肝癌相关血清microRNA标志物由hsa‑miR‑122、hsa‑miR‑21、hsa‑miR‑2115、hsa‑miR‑221、hsa‑miR‑27和hsa‑miR‑4499构成；用Real‑time PCR方法检测各肝癌相关血清microRNA标志物在血清中的相对表达量，检测试剂含有上述肝癌相关血清microRNA标志物的引物。本发明可用于诊断肝细胞癌，尤其是早期肝细胞癌，或者区分至少一个肝细胞癌患者的血清和至少一个健康个体的血清、至少一个慢性乙肝患者的血清或者至少一个肝硬化患者的血清。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及临床医学领域，涉及一种人类肝癌相关的血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法，血清微核糖核酸microRNA包含hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499。
背景技术
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是全球最常见的恶性肿瘤之一，世界卫生组织发布的数据显示，2020年全球癌症新发病例约1929万，死亡病例约996万。恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重要原因之一，给社会带来了沉重的经济负担。肝癌的发生是一个多因素、多阶段的过程，就全球而言，慢性HBV和HCV感染是原发性肝细胞癌（HCC）主要的危险因素，尤其是慢性HBV感染与HCC发病呈现高度的地域一致性，与全球75％的肝癌有关，在发展中国家甚至达到85％。肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，。慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国肝癌的最主要病因。肝癌主要包括：肝细胞癌和肝内胆管细胞癌，前者占到83.9%～92.3%，而约85%的肝细胞癌患者都有HBV感染。我国肝癌5年相对生存率仅为12.1%，但是，如果早期诊断经过有效治疗，可达到相对较好的预后，尤其是5cm以内的小肝癌，5年生存率可达到80%以上。目前，肝癌筛查效果不理想，检出率和早期诊断率相对偏低，开发适用于广泛人群的早期筛查手段，对我国肝癌的有效防治意义重大。
肝癌早期无明显症状，传统早筛方法是针对高危人群进行肝癌血清学诊断标志物甲胎蛋白（AFP）联合肝脏B超检查。甲胎蛋白作为应用最广的血清学标志物，在肝癌诊断和监测中发挥着重要作用，但是其对早期肝癌的检出率并不令人满意。目前国内外研究均证明，甲胎蛋白（AFP）在特异性、敏感性仍然存在不足。临床存在约30%至40%的甲胎蛋白阴性患者。B超检测的灵敏度跟肿瘤的位置相关，而且对检查医生的技能要求较高，这些就造成了肝癌早期筛查、诊断的难度。
MicroRNA（miRNA）是一系列进化保守的长20～25个核苷酸的单链RNA分子，属于内源性非编码RNA。miRNA通过和靶基因mRNA的不完全互补配对，抑制蛋白的翻译表达过程或促使mRNA的降解。miRNA的调控机制复杂而多样化。通过调节靶基因的表达，miRNA可以指导一系列生物学机制，如胚胎生长、细胞生长、凋亡以及细胞分化等。miRNA作为肿瘤标志物具有以下五大优点：①miRNA在正常人外周血中表达稳定且可以稳定存在，无显著的个体差异；②血清或血浆中miRNA在室温下孵育24h及以上、反复冻融、过酸、过碱条件下不易降解；③miRNA表达水平的变化与恶性肿瘤的病理过程密切相关；④血清中miRNA的异常表达可作为肿瘤细胞存在的直接证据，具有很好的生物学标志物价值；⑤miRNA相比于蛋白标志物不仅检测准确率更高，且更易于实现多组分同时检测，优越性明显。miRNA参与人体许多细胞活动，如增生、凋亡及迁移等。而且，miRNA在癌症的增殖、转移中具有重要作用，可将其作为肿瘤发生、发展及预后的生物标志物。
在前期的研究中，我司首次发现，与对照组相比，hsa-miR-2115和hsa-miR-4499在肝癌患者血清表达水平均具有显著的差异，调控肝癌细胞活性，对肝癌早期诊断有一定的指导作用，具有作为HCC早期诊断标志物的潜力。通过联合hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499，可以进一步的提高诊断效果，提升诊断价值，通过多个miRNA生物标志物联合应用可以快速、准确、低成本的早期诊断HCC患者。
参考文献：[1] Xu J , Wu C , Che X ,et al.Circulating microRNAs, miR-21, miR-122, and miR-223, in patients with hepatocellular carcinoma orchronic hepatitis.[J].Molecular Carcinogenesis, 2011(2):50.
[2] Zuo D , Chen L , Liu X ,et al.Combination of miR-125b and miR-27aenhances sensitivity and specificity of AFP-based diagnosis of hepatocellularcarcinoma[J].Tumor Biology, 2016, 37(5):6539-6549. DOI:10.1007/s13277-015-4545-1.
[3] Wang C , Hann H W , Ye Z ,et al.Prospective evidence of acirculating microRNA signature as a non-invasive marker of hepatocellularcarcinoma in HBV patients[J].Oncotarget, 2017, 8(10):-. DOI:10.18632/oncotarget.9429.
[4] Shaker O , Alhelf M , Morcos G ,et al.miRNA-101-1 and miRNA-221expressions and their polymorphisms as biomarkers for early diagnosis ofhepatocellular carcinoma[J]. Infection, genetics and evolution: journal ofmolecular epidemiology and evolutionary genetics in infectious diseases,2017, 51:173-181.DOI:10.1016/j.meegid.2017.03.030.
发明内容
本发明的目的是提供一组肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法，可以进一步的提高肝癌诊断效果，提升诊断价值。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的肝癌相关血清microRNA标志物，其特征在于，肝癌相关血清microRNA标志物由hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499构成；其中hsa-miR-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg（SEQ ID No.1），hsa-miR-21的序列为tagcttatcagactgatgttga（SEQ ID No.1），hsa-miR-2115的序列为catcagaattcatggaggctag（SEQ ID No.3），hsa-miR-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc（SEQ ID No.4），hsa-miR-27的序列为ttcacagtggctaagttccgc（SEQ ID No.5），hsa-miR-4499的序列为gattgctctgcgtgcggaatcgac（SEQ ID No.6）。
本发明一种诊断肝癌的新方法，其特征在于，待测血清采样处理后，用Real-timePCR方法测量肝癌相关血清microRNA标志物在血清中的相对表达量；对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行检测的试剂，含有针对上述标志物的引物，具体构成如下：标志物hsa-miR-122（SEQ ID No.1）的上游引物hsa-miR-122-F的序列为gccgagtggagtgtgacaatg（SEQID No.7），标志物hsa-miR-21（SEQ ID No.2）的上游引物hsa-miR-21-F的序列为tcggcaggtagcttatcagac（SEQ ID No.8）；标志物hsa-miR-2115（SEQ ID No.3）的上游引物hsa-miR-2115-F的序列为catcagaattcatggaggct（SEQ ID No.9）；标志物hsa-miR-221（SEQID No.4）的上游引物hsa-miR-221-F的序列为gccgagagctacattgtctgc（SEQ ID No.10）；标志物hsa-miR-27（SEQ ID No.5）的上游引物hsa-miR-27-F的序列为gccgagttcacagtggctaag（SEQ ID No.11）；标志物hsa-miR-4499（SEQ ID No.6）的上游引物hsa-miR-4499-F的序列为gattgctctgcgtgcggaatc（SEQ ID No.12）；上述标志物的通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt （SEQ ID No.13）。
本发明一种诊断肝癌的新方法，其特征在于，对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行测量，测出ΔCt值后输入判别公式：
综合判断值=-1.772+0.097*ΔCt hsa-miR-122 +0.295*ΔCt hsa-miR-21 -1.123*ΔCt hsa-miR-2115 -0.322*ΔCt hsa-miR-221 +0.606*ΔCt hsa-miR-27 +0.057*ΔCt hsa-miR-4499；综合判断值≥0，为阳性，患肝癌的风险较高；综合判断值＜0，为阴性，患肝癌的风险较低。
本发明肝癌相关血清microRNA标志物，选自hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499中的多种。
为了方便检测使用，将肝癌相关血清microRNA标志物测量所用到的试剂和工具制备成试剂盒，其中包含的试剂是能够测定这些血清microRNA标志物在血清中表达量的，含有上述肝癌相关血清microRNA标志物（hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499）的引物。具体实施如下：
一种人类肝癌诊断试剂盒，该试剂盒含有上述肝癌相关血清microRNA标志物的引物，对应microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499的测量试剂分别含有上游引物和下游引物，6对引物具体如下：
标志物hsa-miR-122（SEQ ID No.1）的上游引物hsa-miR-122-F的序列为gccgagtggagtgtgacaatg（SEQ ID No.7），通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13）；
标志物hsa-miR-21（SEQ ID No.2）的上游引物hsa-miR-21-F的序列为tcggcaggtagcttatcagac（SEQ ID No.8），通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13）；
标志物hsa-miR-2115（SEQ ID No.3）的上游引物hsa-miR-2115-F的序列为catcagaattcatggaggct（SEQ ID No.9），通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13）；
标志物hsa-miR-221（SEQ ID No.4）的上游引物hsa-miR-221-F的序列为gccgagagctacattgtctgc（SEQ ID No.10），通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13）；
标志物hsa-miR-27（SEQ ID No.5）的上游引物hsa-miR-27-F的序列为gccgagttcacagtggctaag（SEQ ID No.11），通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13）；
标志物hsa-miR-4499（SEQ ID No.6）的上游引物hsa-miR-4499-F的序列为gattgctctgcgtgcggaatc（SEQ ID No.12），通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt（SEQ ID No.13）。
试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。
本发明人以标准操作程序（SOP）采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人群基础信息和临床资料，并采用了RT-PCR方法、TaqMan miRNA Array、Real-time PCR（TaqMan探针）方法的多种进行检测。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
一、研究对象选择和分组依据
A组：对照组（n=345，150例健康对照，150例慢性乙肝患者，145例肝硬化患者），无其他全身性重大疾病；
B组：肝癌患者（n=233），无其他全身性重大疾病。
二、血液血清分离及前处理
（1）抽取外周血（2ml）放入分离胶采血管中，轻轻地180°上下颠倒混匀，持续5-6次，12小时内，将促凝采血管在3,000g条件下离心10分钟。然后，随后将上清液转移到干净的管中，在-80℃储存；
（2）用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒（miRNeasy Serum/Plasma AdvancedKit），按照厂家（Qiagen）提供的使用说明来抽提总RNA，用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度。
三、Real-time PCR方法测量血清miRNAs表达量
1. 取经前处理的血清，通过RNA逆转录反应得到cDNA样品；按下表所示配制反转录体系 ：
| 成分 | 体积（μL） |
| 10×Poly（A）Polymerase Buffer | 2 |
| E.coli Poly（A）Polymerase（5U/μl） | 0.5 |
| ATP（10mM） | 1 |
| dNTP Mix（10μM） | 1 |
| HiScript Ⅱ Reverse Transcriptase（200U/μl） | 1 |
| RNase inhibitor（40μM） | 1 |
| RT primer universal（5μM） | 1 |
| RNA | 10 |
| RNase-free ddH2O | 2.5 |
| 合计 | 20 |
2. 将PCR管反复颠倒混匀8次后做简短离心，冰上放置3分钟。
3. 将PCR管放入基因扩增仪进行反转录，反应条件如下 ：
42℃，60min；85℃，5min；4℃，forever；
反转录产物保存于4℃冰箱以用于下一步的预扩增。
4. 逆转录之后的cDNA按下表反应体系配制进行预扩增 ：
| 成分 | 体积（μL） |
| 预扩增混合液（2×） | 12.5 |
| 预扩增引物（10×） | 2.5 |
| 反转录产物 | 2.5 |
| RNase-free ddH2O | 7.5 |
| 合计 | 25 |
预扩增的反应条件如下表所示 ：
降至4℃后，将预扩增产物保存于4℃以用于下一步的Real-time PCR反应。
5. 将预扩增产物简短离心后，加入0.1×TE(pH8.0)75μl，颠倒混匀后再做简短离心。预扩增产物可以直接用于下面的Real-time PCR。
预扩增产物进行Real-time PCR按下表所示配制反应体系 ：
| 成分 | 一块芯片所需体积（μL） |
| 通用PCR混合物（2×） | 400 |
| 稀释后的预扩增产物 | 8 |
| RNase-free ddH2O | 392 |
| 合计 | 800 |
6. 检测并比较健康对照组、肝癌患者血清样本中miRNAs表达量的差异。
检测到的存在差异表达的对照组和肝癌患者血清miRNAs包括hsa-miR-107、hsa-miR-122、hsa-miR-1246、hsa-miR-192、hsa-miR-199、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-223、hsa-miR-26、hsa-miR-27、hsa-miR-4499和hsa-miR-801。
这些miRNAs在肝癌患者中的拷贝数都显著高于对照组。
四、在训练集中使用Real-time PCR方法验证血清miRNAs表达量
1. 设计13条目标miRNAs的引物：运用加PolyA尾PCR方法设计引物。
2. 加入荧光探针进行Real-time PCR反应。检测并对比健康对照组、慢乙肝患者、肝硬化患者和肝癌患者血清样本中miRNAs表达量的差异（68例健康对照、62例慢性乙肝患者、61例肝硬化患者和101例肝癌患者）。
3. 经过Real-time PCR检测，结果一致的有6条miRNAs（简称：6miRNA），具体为：hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499。
因此，最终确认为存在差异表达的健康对照组、肝癌患者血清miRNAs包括hsa-miR-122（SEQ ID No.1）、hsa-miR-21（SEQ ID No.2）、hsa-miR-2115（SEQ ID No.3）、hsa-miR-221（SEQ ID No.4）、hsa-miR-27（SEQ ID No.5）、hsa-miR-4499（SEQ ID No.6）。
将以上存在表达差异显著的miRNAs纳入Logistics回归方程，得到：Logit（p＝HCC）=-1.772+0.097*hsa-miR-122 +0.295*hsa-miR-21 -1.123*hsa-miR-2115 -0.322*hsa-miR-221 +0.606*hsa-miR-27 +0.057*hsa-miR-4499。
五、在验证集中评估上述miRNAs组合的性能
在298例独立血清样本（70例健康对照、65例慢性乙肝患者、63例肝硬化患者和100例肝癌患者）中验证6miRNA组合的性能，以评估6miRNA组合预测肝癌患者的能力。
六、诊断试剂盒制备方法
根据上述一系列实验结果，本发明人还制备了一种能用于人类肝癌microRNA诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含测定受试者血清中可检测的成熟hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27、hsa-miR-4499的引物和工具。诊断试剂盒包括一批血清miRNAs引物，还可以包括Taq酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸等试剂。
附图说明
图1 为本发明用于鉴定至少一个肝细胞癌靶血清，特别是存在早期肝细胞癌（BCLC 0期和A期）的microRNA组合的筛选、训练以及验证阶段的实验设计流程图。
图2 为确定本发明用于诊断肝细胞癌，特别是诊断早期肝细胞癌（BCLC 0期和A期）患者的血液中microRNA组合的主要方法步骤图。对照组包括健康、慢性乙肝和肝硬化受试者。
图3 说明了包含本发明用于确定至少一个肝细胞癌靶血清的优选microRNA组合（hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499）的逻辑回归模型；
图3-A：训练集（n＝292）中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与 AFP（AUC＝0.801）相比，microRNA组合在区分HCC组血清和对照组血清时具有显著高的诊断准确度（AUC＝0.937）；
图3-B：验证集（n＝298）中HCC组与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与 AFP（AUC＝0.747）相比，microRNA组合在区分HCC组血清和对照组血清时具有显著高的诊断准确度（AUC＝0.938）。
图4 说明了包含本发明用于进一步区分肝细胞癌患者血清和健康个体、慢性乙肝患者或肝硬化患者的血清的优选microRNA组合（hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499）的逻辑回归模型；
图4-A：验证集（n＝298）中HCC组与健康组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.793）相比，microRNA组合在区分HCC患者血清和健康个体血清时具有显著高的诊断准确度（AUC＝0.990）；
图4-B： 验证集（n＝298）中HCC组与慢性乙肝组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.734）相比，microRNA组合在区分HCC患者血清和慢性乙肝患者的血清时具有显著高的诊断准确度（AUC＝0.887）；
图4-C： 验证集（n＝298）中HCC组与肝硬化组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.712）相比，microRNA组合在区分HCC患者血清和肝硬化患者的血清时具有显著高的诊断准确度（AUC＝0.826）。
图5 说明了包含本发明用于鉴定不同 BCLC分期的肝细胞癌的至少一个靶血清的优选microRNA组合（hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499）的逻辑回归模型；
图5-A：极早期HCC（BCLC 0）与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.670）相比，microRNA组合在区分极早期HCC患者血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度（AUC＝0.955）；
图5-B：早期HCC（BCLC A）与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.719）相比，microRNA组合在区分早期HCC患者血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度（AUC＝0.982）；
图5-C：中期HCC（BCLC B）与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.815）相比，microRNA组合在区分中期HCC患者血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度（AUC＝0.912）；
图5-D：进展期HCC（BCLC C）与对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.830）相比，microRNA组合在区分进展期HCC患者血清和对照血清时具有高得多的诊断准确度（AUC＝0.955）。
图6 说明了包含本发明用于鉴定AFP ≤ 20ng/mL及AFP＞20ng/mL的肝细胞癌的至少一个靶血清的优选microRNA组合（hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499）的逻辑回归模型；
图6-A：AFP≤20ng/mL的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.676）相比，microRNA组合在区分AFP≤ 20ng/mL的HCC组血清和对照组血清时具有高得多的诊断准确度（AUC＝0.956）；
图6-B：AFP＞20ng/mL的HCC组和对照组比较时microRNA组合的诊断价值的ROC曲线图。与AFP（AUC＝0.940）相比，microRNA组合在区分AFP＞20ng/mL的HCC组血清和对照组血清时无显著差异（AUC＝0.968）。
图7为表2. microRNA芯片受试者特征；
图8为表3. 训练集和验证集受试者特征；
图9为表6. 训练集中microRNA表达情况及诊断效能。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明做进一步的阐明。
实施例1 研究对象的选择和分组依据
本发明中microRNA生物标志物的筛选阶段、训练阶段以及验证阶段的实验设计如图1所示。用被推荐的血清microRNA组合来鉴别肝细胞癌患者的血清样本的主要方法步骤如图2所示。
在2022年1月到2023年5月间，688个满足合格标准（表1）的血液样本被预先从山东大学齐鲁医院和山东省立医院采集。这些样本从150个健康捐献者（HC健康组），150个慢性乙肝患者（CHB组），145个HBV感染后肝硬化患者（LC肝硬化组），以及233个HBV感染相关HCC患者（HCC组）获得。这些样本被按照时间先后顺序划归为3个阶段（图1）。患者的临床表现被总结在表2和表3中，具体参见附图7、附图8。
表1--选择患者的合格标准
| 纳入标准 |
| 1.年龄≥18岁且≤90岁 |
| 2.具有给与知情同意的能力 |
| 3.在2022年1月到2023年5月间遇到 |
| 健康捐献者（健康组） |
| 1.在医院做过体检 |
| 2.处于一般健康状态，未患恶性肿瘤 |
| 慢性乙肝患者（CHB组） |
| 诊断患有慢性乙肝（即超过6个月呈现HBsAg+、HBeAg+，或呈现HBeAg-但携带可检测到的HBV DNA） |
| HBV感染后肝硬化患者（肝硬化组） |
| 1.患有HBV感染 |
| 2.被两名有经验的病理医生诊断 |
| 3.如果没有可用的组织，诊断必须被两个影响报告（B超、CT或MRI）支持 |
| HBV感染相关HCC患者（HCC组） |
| 1.患有HBV感染 |
| 2.被两名有经验的病理医生诊断 |
| 3.如果没有可用的组织，诊断必须被两个影响报告（B超、CT或MRI）支持 |
| 4.无术前放疗、化疗、肝动脉化学栓赛或消融 |
实施例2 血液血清分离及前处理
抽取外周血（2ml）放入分离胶采血管中，轻轻地180°上下颠倒混匀，持续5-6次，12小时内，将促凝采血管在3,000g条件下离心10分钟。然后，随后将上清液转移到干净的管中，在-80℃储存。
用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒（miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit），按照厂家（Qiagen）提供的使用说明来抽提总RNA，用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度。
实施例3 microRNA芯片分析miRNAs表达差异
经microRNA芯片分析对比HCC组、健康对照组、慢乙肝组合肝硬化组的microRNA表达量的差异。筛选出存在差异表达的HCC患者、健康对照、慢乙肝患者和肝硬化患者血清miRNAs包括hsa-miR-107、hsa-miR-122、hsa-miR-1246、hsa-miR-192、hsa-miR-199、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-223、hsa-miR-26、hsa-miR-27、hsa-miR-4499以及hsa-miR-801（microRNA序列参见表4）。这些miRNAs在肝细胞癌患者中的拷贝数都显著高于健康对照、慢乙肝患者和肝硬化患者。
表4. microRNA序列
| microRNA | 序列（5′→ 3′ ） |
| hsa-miR-107 | agcagcattgtacagggctatca |
| hsa-miR-122 | Tggagtgtgacaatggtgtttg （SEQ ID No.1） |
| hsa-miR-1246 | aatggatttttggagcagg |
| hsa-miR-192 | ctgacctatgaattgacagcc |
| hsa-miR-199 | acagtagtctgcacattggtta |
| hsa-miR-21 | tagcttatcagactgatgttga （SEQ ID No.2） |
| hsa-miR-2115 | catcagaattcatggaggctag （SEQ ID No.3） |
| hsa-miR-221 | agctacattgtctgctgggtttc （SEQ ID No.4） |
| hsa-miR-223 | tgtcagtttgtcaaatacccca |
| hsa-miR-26 | ttcaagtaatccaggataggct |
| hsa-miR-27 | ttcacagtggctaagttccgc （SEQ ID No.5） |
| hsa-miR-4499 | gattgctctgcgtgcggaatcgac （SEQ ID No.6） |
| hsa-miR-801 | gattgctgcgtgcggaatcgac |
| RNU6-1 | gtgctcgcttcggcagcacatatactaaaattggaacgatacagagaagattagcatggcccctgcgcaa ggatgacacgcaaattcgtgaagcgttccatatttt |
实施例4 在292个样本的训练集中对microRNA芯片筛选出的microRNA进行验证
设计引物（ miRNA引物序列见表5），分别对68例健康对照、62例慢乙肝患者、61例肝硬化患者和101例肝癌患者的血清进行各miRNAs的定量Real-time PCR检测。
（1）制备cDNA样品：（a）使用miRNeasy血清/血浆升级版试剂盒（miRNeasy Serum/Plasma Advanced Kit，Qiagen），按照厂家提供的使用说明来抽提小RNA，用Qubit 4.0荧光定量仪来定量检测其浓度，（b）使用加尾试剂对小RNA进行加尾（E.coli Poly(A)Polymerase，Vazyme），（c）使用逆转录试剂对加尾后的小RNA进行逆转录（HiScript® IIReverse Transcriptase，Vazyme），得到cDNA。
（2）Real-time PCR：使用探针法实时荧光定量PCR（Taq Pro U Multiple ProbeqPCR MIX，Vazyme）检测并比较对照组（健康对照、慢乙肝患者、肝硬化患者）和肝癌患者血清样本中miRNA表达量的变化，各组样本血清miRNA表达水平是以RNU6-1为内参检测得到。
使用Kruskal-Wallis检验对HCC组和对照组进行比较，使用Mann-Whitney未配对检验对HCC组和对照组进行比较。使用逐步逻辑回归模型基于训练集选择microRNA诊断标志物，使用HCC的预测概率作为替代标志物来建立受试者工作特征（ROC）曲线，使用ROC曲线下面积（AUC）作为评价血清AFP和microRNA组合的诊断效能，使用MedCalc（19.8）软件进行ROC和回归分析。从结果分析得到，hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27以及hsa-miR-4499这6个miRNA在对照组和肝癌患者间有显著差异。
6个候选microRNA在训练集中的表达谱和诊断效能如附图9表6所示，其中6microRNA组合*AUC=0.937（0.940，0.912）
将以上存在表达差异显著的miRNAs纳入Logistics回归方程，得到：*Logit（p＝HCC）=-1.772+0.097*hsa-miR-122 +0.295*hsa-miR-21 -1.123*hsa-miR-2115 -0.322*hsa-miR-221 +0.606*hsa-miR-27 +0.057*hsa-miR-4499。
microRNA组合的AUC显著地大于AFP的AUC（0.937vs.0.801，p＜0.001，图3-A），参见图3。
表5 miRNA引物序列
| 引物名称 | 对应miRNA引物序列（5′→ 3′ ） |
| hsa-miR-107-F | AACAAGAGCAGCATTGTACAGGG |
| hsa-miR-122-F | GCCGAGTGGAGTGTGACAATG（SEQ ID No.7） |
| hsa-miR-1246-F | AACACGCAATGGATTTTTGGAGC |
| hsa-miR-192-F | TCGGCAGGCTGACCTATGAAT |
| hsa-miR-199-F | GCCGAGACAGTAGTCTGCACA |
| hsa-miR-21-F | TCGGCAGGTAGCTTATCAGAC（SEQ ID No.8） |
| hsa-miR-2115-F | CATCAGAATTCATGGAGGCT（SEQ ID No.9） |
| hsa-miR-221-F | GCCGAGAGCTACATTGTCTGC（SEQ ID No.10） |
| hsa-miR-223-F | TCGGCAGGTGTCAGTTTGTCA |
| hsa-miR-26-F | TCGGCAGGTTCAAGTAATCCA |
| hsa-miR-27-F | GCCGAGTTCACAGTGGCTAAG（SEQ ID No.11） |
| hsa-miR-4499-F | GATTGCTCTGCGTGCGGAATC（SEQ ID No.12） |
| hsa-miR-801-F | GATTGCTCTGCGTGCGGAATC |
| RNU6-1-F | AACAAGCGCAAGGATGACACG |
| Universal Rp | CAGTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID No.13） |
| Universal RT primer | CAGTGCAGGGTCCGAGGTCAGAGCCACCTGGGCAATTTTTTTTTTTTVN |
| Universal Taqman Probe | FAM-TGCCCAGGTGGCT-MGBNFQ |
实施例5 在298个样本的验证集中验证上述microRNA组合。
本实施例参见图3、图4。
从训练集中估计的参数被用于独立的验证集（298血清样本）上预测被诊断患有HCC的概率。同样地，采用定量RT-PCR检测方法来进行实验。预测概率被用来建立受试者工作特征曲线。
MicroRNA组合与AFP之间的AUC在验证集中的比较表明microRNA组合的诊断准确度显著高于AFP（AUC：0.938vs.0.747，p＜0.001，图3-B）。
MicroRNA组合与AFP区分HCC组和健康组、CHB组以及肝硬化组的效能也进行了对比，如图4所示。该分析证明了MicroRNA组合与AFP皆可区分HCC组和非HCC。然而，MicroRNA组合的AUC显著大于AFP（HCC与健康组：0.990 vs. 0.793，p＜0.001；HCC与CHB：0.887 vs.0.734，p＜0.001；HCC与肝硬化组：0.826 vs. 0.712，p＜0.001；图4-A，4-B和4-C）。
实施例6 MicroRNA组合与AFP在不同BCLC分期的诊断表现
MicroRNA组合与AFP在不同BCLC分期的诊断表现被进一步评价，如图5所示。在诊断早期、中期和晚期HCC（BCLC 0、A、B和C期）方面，MicroRNA组合的诊断表现显著高于AFP(BCLC 0期，AUC 0.955vs.0.670，p＜0.001；BCLC A期，AUC 0.982vs.0.719，p＜0.001；BCLCB期，AUC 0.912vs.0.815，p＜0.001；BCLC C期，AUC 0.955 vs. 0.830，p＜0.001；图5-A，5-B，5-C和5-D)。
实施例7 MicroRNA组合在AFP正常（≤ 20ng/mL）组和高AFP（＞20ng/mL）组中的诊断表现
本实施7参见图6。按照AFP水平评估MicroRNA组合诊断准确度。在AFP正常（≤20ng/mL）组中，MicroRNA组合的AUC显著大于AFP的AUC(0.956 vs. 0.676，p＜0.001，图6-A)。在高AFP（＞20ng/mL）组中，MicroRNA组合的AUC与AFP的AUC差异不大(0.968 vs.0.940，p=0.26，图6-B)。
所获得的结果证实microRNA在肝细胞癌患者血清中的特异性表达。因此，这里规定的microRNA集可作为独特的microRNA生物标志物，通过肝细胞癌血清microRNA表达谱分析，不仅可以早期诊断肝癌的发生，也可区别肝细胞癌和慢性乙肝以及肝硬化。
本发明对于血清microRNA表达生物标志物的鉴别和验证提供了可在血液样本中进行筛选、早期诊断、区别诊断肝细胞癌的独特的分子标志物。
Claims (3)
1.肝癌相关血清microRNA标志物，其特征在于，肝癌相关血清microRNA标志物由hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499构成；其中hsa-miR-122的序列为tggagtgtgacaatggtgtttg（SEQ ID No.1），hsa-miR-21的序列为tagcttatcagactgatgttga（SEQ ID No.2），hsa-miR-2115的序列为catcagaattcatggaggctag（SEQ ID No.3），hsa-miR-221的序列为agctacattgtctgctgggtttc（SEQ ID No.4），hsa-miR-27的序列为ttcacagtggctaagttccgc（SEQ ID No.5），hsa-miR-4499的序列为gattgctctgcgtgcggaatcgac（SEQ ID No.6）。
2.一种诊断肝癌的新方法，其特征在于，待测血清采样处理后，用Real-time PCR方法检测权1中肝癌相关血清microRNA标志物在血清中的相对表达量；对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行检测的试剂，含有针对上述标志物的引物，具体构成如下：标志物hsa-miR-122（SEQ ID No.1）的上游引物hsa-miR-122-F的序列为gccgagtggagtgtgacaatg（SEQID No.7），标志物hsa-miR-21（SEQ ID No.2）的上游引物hsa-miR-21-F的序列为tcggcaggtagcttatcagac（SEQ ID No.8）；标志物hsa-miR-2115（SEQ ID No.3）的上游引物hsa-miR-2115-F的序列为catcagaattcatggaggct（SEQ ID No.9）；标志物hsa-miR-221（SEQID No.4）的上游引物hsa-miR-221-F的序列为gccgagagctacattgtctgc（SEQ ID No.10）；标志物hsa-miR-27（SEQ ID No.5）的上游引物hsa-miR-27-F的序列为gccgagttcacagtggctaag（SEQ ID No.11）；标志物hsa-miR-4499（SEQ ID No.6）的上游引物hsa-miR-4499-F的序列为gattgctctgcgtgcggaatc（SEQ ID No.12）；上述标志物的通用下游引物Universal Rp序列为cagtgcagggtccgaggt （SEQ ID No.13）。
3.根据权利要求2所述的一种诊断肝癌的新方法，其特征在于，对肝癌相关血清microRNA标志物hsa-miR-122、hsa-miR-21、hsa-miR-2115、hsa-miR-221、hsa-miR-27和hsa-miR-4499进行检测，测出ΔCt值后输入判别公式：
综合判断值=-1.772+0.097*ΔCt hsa-miR-122 +0.295*ΔCt hsa-miR-21 -1.123*ΔCt hsa-miR-2115 -0.322*ΔCt hsa-miR-221 +0.606*ΔCt hsa-miR-27 +0.057*ΔCthsa-miR-4499；
综合判断值≥0，为阳性，患肝癌的风险较高；综合判断值＜0，为阴性，患肝癌的风险较低。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311016224.7A CN117025772A (zh) | 2023-08-14 | 2023-08-14 | 肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311016224.7A CN117025772A (zh) | 2023-08-14 | 2023-08-14 | 肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117025772A true CN117025772A (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=88631307
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311016224.7A Pending CN117025772A (zh) | 2023-08-14 | 2023-08-14 | 肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117025772A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102776185A (zh) * | 2011-05-06 | 2012-11-14 | 复旦大学附属中山医院 | 由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物及一种诊断肝癌的新方法 |
| KR20180029936A (ko) * | 2016-09-13 | 2018-03-21 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 신규한 간암 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 |
| KR20210019232A (ko) * | 2019-08-12 | 2021-02-22 | 아주대학교산학협력단 | 조기 간암 진단을 위한 엑소좀 유래 microRNA 바이오마커 및 그 용도 |
-
2023
- 2023-08-14 CN CN202311016224.7A patent/CN117025772A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102776185A (zh) * | 2011-05-06 | 2012-11-14 | 复旦大学附属中山医院 | 由血浆microRNA组合成的肝癌诊断标志物及一种诊断肝癌的新方法 |
| KR20180029936A (ko) * | 2016-09-13 | 2018-03-21 | 사회복지법인 삼성생명공익재단 | 신규한 간암 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 |
| KR20210019232A (ko) * | 2019-08-12 | 2021-02-22 | 아주대학교산학협력단 | 조기 간암 진단을 위한 엑소좀 유래 microRNA 바이오마커 및 그 용도 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6966508B2 (ja) | 尿バイオマーカーコホート、遺伝子発現特性、およびその使用の方法 | |
| KR101987358B1 (ko) | 신규한 간암 진단용 바이오 마커 및 이의 용도 | |
| CN108949992B (zh) | 一种与食管鳞癌及其分级相关的生物标志物 | |
| CN107674916B (zh) | 一种环状rna在结直肠癌生物标志物中的应用 | |
| CN109825586A (zh) | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 | |
| CN109161593B (zh) | 环状RNA和microRNA在结直肠癌筛查诊断的应用 | |
| CN111662982A (zh) | 用于脑胶质瘤早期诊断和/或复发监测的生物标志物及其应用 | |
| CN107630093B (zh) | 用于诊断肝癌的试剂、试剂盒、检测方法及用途 | |
| CN108866187B (zh) | 一种与肺癌辅助诊断相关的长链非编码rna标志物及其应用 | |
| CN106555004B (zh) | 缺血性脑卒中的lncRNA标志物 | |
| CN114150063A (zh) | 膀胱癌诊断用尿液miRNA标志物、诊断试剂及试剂盒 | |
| CN110229899A (zh) | 用于结直肠癌早期诊断或预后预测的血浆标记物组合 | |
| CN106755343A (zh) | 胰腺癌预后诊断分子标记物 | |
| CN105671179B (zh) | 血清microRNA在肝癌诊断中的应用及诊断试剂盒 | |
| KR20220052461A (ko) | 난소암 진단 또는 감별진단을 위한 마이크로rna-1246 및 이의 용도 | |
| CN111518908A (zh) | 尿液前列腺癌标志物组合及其在制备精准诊断试剂中的用途 | |
| CN104450702B (zh) | 一种血清miRNA生物标志物组合物与应用 | |
| CN117025772A (zh) | 肝癌相关血清microRNA标志物及一种诊断肝癌的新方法 | |
| CN114410795A (zh) | 基于miRNA特征标记的肝癌早期检测 | |
| CN110295232B (zh) | 用于结直肠癌的microRNA生物标记物 | |
| CN113774123B (zh) | 预测HIV感染者免疫应答水平的microRNA分子标志物组合及其用途 | |
| CN112111570A (zh) | 一种与缺血性卒中辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用 | |
| CN110218795B (zh) | miR-766-3p和miR-766-5p在制备高级别胶质瘤和颅内淋巴瘤诊断和鉴别诊断制剂中的应用 | |
| CN114836538B (zh) | 生物标志物在hbv相关肝癌诊断及预后中的应用 | |
| CN117385038A (zh) | 肺癌诊断相关标志物、检测试剂及肺癌诊断方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |