KR101229536B1 - 인간 성체 줄기세포 또는 전구세포를 이용한 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생방법 - Google Patents

Abstract

본원발명은 인간 성체 줄기세포 또는 이를 체외에서 배양한 신경 전구세포로부터 도파민 신경세포를 재생 또는 복원시키는 방법에 관한 것으로, 특히, 인간 성체 줄기세포 및 이를 분화시킨 신경 전구세포를 이용하여 흑질 치밀부에서 도파민 신경세포를 재생하거나 복원하는 방법에 관한 것이다.

본원발명은 신경세포 생성영역으로 알려진 곳이 아닌 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생 및 복원에 관한 것으로, 파킨스 질환과 같은 신경계 질환에서 세포 대체 요법을 위한 효율적인 공급원으로서 기능할 수 있다.

성체 줄기세포, 신경전구세포, 도파민 신경세포, 흑질 치밀부

Description

인간 성체 줄기세포 또는 전구세포를 이용한 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생방법{A method for Regenerating Dopaminergic neurons in Substantia nigra pars compacta using adult stem cells or progenitor cells }

본 발명은 인간 성체 줄기 세포 또는 전구세포를 이용하여 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포를 재생 또는 복원시키는 방법에 관한 것이다.

인체의 여러 기관들 중에서 뇌는 특히 허혈에 취약한 기관으로 뇌로 가는 혈류가 단지 5분이라도 완전히 차단이 되면 취약한 신경세포들의 죽음이 시작된다. 부분적으로, 허혈 손상에 대한 뇌조직의 현저한 취약성은 뇌의 높은 대사율과 뇌 축적량이 제한된 포도당에 전적으로 의지하는 에너지 기질의 제한성에 의한 것이다.

또한, 출생 초기에 중등도의 저산소 상태에 노출되면 신경학적인 손상을 일으키지는 않으나 선택적으로 시냅스의 기능이 파괴된다는 것이 증명되었으며, 또한 발달단계에 저산소에 노출되면 영구적인 시냅스 기능의 변화가 온다고 알려졌다. 이런 손상은 흥분성 아미노산들과 함께 도파민이 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는데, 아직 도파민의 뇌손상 기전은 완전히 밝혀지지는 않았으나 2가지의 가능성을 생각할 수 있다.

첫째, 카테콜라민 신경전달 물질들은 산화촉진제로써의 특성이 있는데 도파민이 자동산화(autoxidation)의 과정을 거치며 발생한 산소자유기가 신경세포에 직접 독성을 나타내는 것이고, 둘째는 저산소-허혈시 도파민이 신경세포 수용체와 결합하여 뇌세포 사멸에 작용하는데, 이는 도파민 수용체 길항체를 투여했을 때 신경세포 보호의 효과가 있다는 것으로 증명되었다. 그러나 신생 흰쥐의 미성숙 뇌에서 monoamine과 그 대사물들의 변화에 관한 연구는 일시적 인 저산소 또는 무산소와 관련하여 이루어졌으며, 허혈을 동반하는 비교적 심한 뇌손상과 관련한 연구는 매우 드물다.

그리고, 인간을 비롯한 동물의 뇌에 있어서 도파민의 결핍은 다양하고 심각한 장애를 일으킨다. 그 중 운동장애가 특히 심각한데 이는 파킨슨씨병 등의 환자에서 잘 밝혀져 있다. 파킨슨씨병은 50대 이후에 주로 발병하며 중뇌의 흑질에서 도파민성 신경세포의 사멸로 인하여 선조체에서 도파민의 결핍을 초래하며 akinesis, bradykinesia, 경직, 떨림, 불안한 자세 등의 운동장애를 일으킨다. 이러한 운동장애는 6-히드록시도파민(OHDA)으로 처리한 실험동물에서도 거의 그대로 나타난다.

도파민 신경세포는 중간 뇌의 배쪽 및 복외측에 존재하며, 자세반사, 운동, 및 보상관련 거동을 조절한다. 이들 신경세포는 전뇌 중의 다수의 구조를 자극하며 저산소증 및 허혈증으로 인한 뇌손상, 파킨슨 질환, 정신분열증, 및 약물 중독 등이 이들의 퇴행 또는 기능이상과 연관되어 있다 (Hynes 등, 1995, Cell 80:95-101). 그 중에서도 파킨슨 질환은 운동을 조절하는 뇌 영역 중의 도파민성 신경세포의 사멸에 의해 유발되는 퇴행성 신경질환이다. 퇴행은 도파민으로 알려진 뇌 신호전달 화학(신경전달물질)의 부족을 일으키고 bradykinesia, akinesis, 불안한 자세, 경직 등 본 질환에서 특이적으로 관찰되는 운동장애를 초래한다.

이러한 신경 퇴행성 장애 및 신경계 질환에서 소실된 신경세포를 대체할 수 있는 치료방법은 유전자 요법 또는 세포 이식이다.

특히, 후자의 방법인 세포이식과 관련하여, 사람 태아의 도파민 신경세포의 이식이 유익한 효과를 나타낸다는 것이 확인된 적이 있다(Freed 등, 2001, N.Engl.J. Med. 344:710-719). 그러나, 태아 흑질 이식 요법이 환자에게서 임상적으로 유효한 효과를 나타내기 위해서는 적어도 5-10 태아에서 얻은 사람 태아 조직을 필요로 한다. 따라서, 퇴행성 신경장애 및 신경계 질환을 치료하기 위해서는 도파민 신경세포과 같은 신경세포의 대체 공급원이 시급하게 요구된다고 할 수 있다.

또한, 사람 배아 줄기세포로부터의 분화된 도파민 신경세포는 집단내 총 세포 비율과 비교하여 낮은 수율로 얻어지는 문제점이 여전히 존재하고 있으며 이식 시 분화하지 않은 세포에 의한 기형종(teratoma)의 형성에 대한 문제가 여전히 미제로 남아있다. 그러므로, 많은 수의 도파민 신경세포를 필요로 하는 세포 대체 요법이 효과적으로 이용되지 못하고 있는 실정이다.

이에 본 발명자는 인간 태반 유래 다능성 성체 줄기세포로부터 100%에 이르는 네스틴 양성의 신경 전구세포를 수득하고, 이를 저산소 허혈성 손상(HI insult)된 쥐의 선조체에 이식한 결과, 흑질 치밀부(Substantia nigra pars compacta, SNc)에서 도파민 신경세포가 재생 및 복원되어 쥐의 운동성이 향상되는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 흑질 치밀부에서 도파민 신경세포를 재생 또는 복원하는세포집단, 상기 세포집단의 생산방법 및 상기 세포집단을 이용한 도파민 신경세포 재생 및 복원방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 흑질 치밀부 내 도파민 신경세포 재생 및 복원용 조성물과 흑질선조 회로 회복용(복구용) 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 영장류 성체 줄기세포 또는 이를 신경 전구세포로 분화시키는 것을 포함하는, 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포 재생 및 복원용 세포집단을 생성하는 방법을 제공한다.

이 때, 상기 성체 줄기세포를 네스틴 양성의 신경 전구세포로 분화시키는 방법으로는 특정 외배엽 분화유도 물질 없이 성체 줄기세포만을 응집시키는 것을 특 징으로 할 수 있다. 상기 분화된 신경 전구세포는 네스틴(nestin), Dcx, Sox1 및 HuD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 한다. 이러한 신경 전구세포의 선조체로의 이식은 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생 및 복원효과를 가져오는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 영장류 성체 줄기세포 또는 이를 분화시킨 신경 전구세포를 함유하는, 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포 재생용 세포집단을 제공하며, 특히, 상기 세포집단은 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포로의 분화 또는 성숙을 유도하여 흑질 치밀부 영역에서 도파민 신경세포가 재생 및 복원된다.

본 발명은 또한 영장류 성체 줄기세포 또는 이를 분화시킨 신경 전구세포를 함유하는 세포집단을 이용하여 흑질 치밀부 영역에서 도파민 신경세포가 재생 및 복원되도록 하는 방법을 제공한다.

따라서 본 발명은 상기 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포 재생용 성체 줄기세포 및/또는 신경 전구세포를 함유하는 세포집단의 "흑질 치밀부 내 도파민 신경세포의 재생 및 복원" 용도를 제공한다.

바람직하게는, 영장류 성체 줄기세포 또는 상기 성체 줄기세포로부터 분화된 네스틴 양성의 신경 전구세포 집단을 함유하는, 흑질 치밀부 내 도파민 신경세포의 재생 및 복원용 조성물과 흑질선조 회로 회복용(복구용) 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 인간 성체 줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경 전구세포 집단을 선조체 등에 이식하면, 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 분화 또는 성숙을 유도하여 상기 영역에서의 도파민 신경세포 재생 및 복원을 가능하게 하기 때문에, 상기 흑질 치밀부 영역에서 파괴된 도파민 신경세포를 직접적으로 대체하여 허혈성 저산소 손상 등과 관련된 신경계 질환에 대하여 보다 효과적인 세포 대체 치료요법(Cellular replacement therapy)으로 활용될 수 있다.

본 발명은 일 관점에서, 영장류 성체 줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경 전구세포를 함유하는, 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포 재생 및 복원용 세포집단 및 상기 세포집단을 생성하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 다른 관점에서 상기 세포집단, 구체적으로는 영장류 성체 줄기세포 또는 분화된 네스틴 양성의 신경 전구세포의 사용에 관한 것으로, 예를 들어, 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포를 재생 또는 복원시키는 조성물의 형태로의 사용; 및 흑질 치밀부 영역에서 재생(복원)된 상기 도파민 신경세포의 선조체 타겟팅(targetting)에 의한 흑질선조 회로 회복용 조성물의 형태로의 사용에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 대해서 보다 상세히 설명한다.

인간 성체 줄기세포의 분리

본 발명에서 사용하는 줄기세포는 성체 줄기세포이다. 바람직하게는 영장류의, 보다 바람직하게는 인간 유래 성체 줄기세포이다.

줄기세포(stem cell)란 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있어 증식(proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아와 성체 줄기 세포로 나눌 수 있는데, 본 발명에서는 생물학적, 윤리적, 그리고 법적인 문제가 많아 임상적용에 제한이 많은 배아 줄기세포가 아닌, 성체 줄기세포를 사용한다.

상기 "성체 줄기세포(adult stem cell)"는 성장한 신체조직으로부터 추출해낸 줄기세포로서, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포다. 성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 인체에 내재된 조직 특이적 전구세포로 분화할 수 있다. 성체 줄기세포는 분화하여 다양한 특성을 가지는 세포가 될 수 있고, 심장, 췌장, 신경 조직, 근육, 연골 등과 같은 광범위하게 위치한 조직 및 기관에 대한 대체 세포를 생성할 수 있는 가능성을 가지는데, 그 중에서도 본 발명은 신경 조직을 이루는 세포로 분화하는 것에 관한 것이다. 더욱 구체적으 로는 인간 성체 줄기세포 또는 이로부터 분화된 신경 전구세포가 도파민 신경세포로 분화하는 것에 관한 것이다.

상기와 같은 성체 줄기세포는 영장류, 바람직하게는 인간의 골수, 지방, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 뇌, 췌장, 간, 눈 및 태아 조직 등 대부분의 조직으로부터 수득할 수 있다. 일 구체예로, 다양한 조직으로의 분화능이 있고, in vitro에서의 조작이 용이하며, 면역조절 능력을 가지고 있는 태반 유래 줄기세포를 사용할 수 있는데, 이 때, 예를 들어 임신 1/3분기의 초기에 해당하는 5~7주의 태반을 이용할 수 있다.

인간의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 각 조직에 적절한, 당업계에 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수득한 특정 조직을, 트립신 용액 및/또는 콜라게나아제 등을 처리하여 단일 세포체로 분리한 후, bFGF, EGF등의 성장인자(growth factor)를 적합한 양으로 첨가한 적합한 배지에서 배양한 다음, FACS 등으로 분리하거나 성장속도에 따라 성체 줄기세포를 분리하는 방법을 사용할 수 있다.

신경 전구세포의 생성

본 발명은 상기 수득한 영장류 성체 줄기세포 또는 상기 성체 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포를 이용한다.

상기 수득한 영장류 성체 줄기세포는 당업계에 알려져 있는 통상적인 방법 등에 의해 신경 전구세포로 분화시킬 수 있다. 상기 분화방법의 구체적인 예로서, 이하와 같은 방법들이 있다.

성체 줄기세포를 신경 전구세포와 같은 외배엽성 세포로 분화시키기 위해 가용성 인자 및 성장 인자와 같은 생화학적 분화 유도물질을 함유하는 배지에서 배양함으로써 수행할 수 있다.

이 때, 상기 "성장 인자"는 세포 증식 및 분화 활성의 1차 결과로 세포 표면 상에서 수용체에 결합하는 단백질을 의미하고, 가용성 인자로는, 예를 들어, 뉴로트로핀, 미토겐, 줄기 세포 인자, 성장 인자, 분화 인자(예를 들면, TGF-β 상과), TGF-β 상과 아고니스트, 향신경성 인자, 산화제, 신경전달물질 및 생존 인자 등이 있다. 많은 가용성 인자는 수많은 상이한 세포 유형에서 세포 분할을 자극하는 반면에, 다른 것은 특정 세포 유형에 특이적이다. 신경세포 유형의 분화를 특이적으로 조장하는 통상의 분화제로는, 프로게스테론, 푸트레신, 라미닌, 인슐린, 아셀렌산나트륨, 트랜스페린, 뉴르투린, 소닉 헤지호그(SHH), 노긴, 폴리스타틴, 상피성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자(예를 들면 FGF-4, FGF-8, 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 성장 및 분화 인자 5(GDF-5), 뉴로트로핀 3(NT-3), 뉴로트로핀 4(NT-4), 뇌 유도 향신경성 인자(BDNF)), 형질전환 성장 인자 α(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타-3(TGF β3), 혈소판 유도 성장 인자(PDGF-AA), 인슐린양 성장 인자(IGF-1), 골형태형성 단백질(BMP-2, BMP-4), 신경아교 세포 유도향신경성 인자(GDNF), 레티노산(RA), 미드카인, 아스코르브산, 디부티릴 cAMP, 도파민 및 gp130과 착화하는 수용체에 대한 리간드(예컨대, LIF, CNTF, SCF, IL-11 및 IL-6) 등이 있다.

그리고, 성체 줄기세포를 분화시켜 신경 전구세포를 수득하는 방법으로는 상기와 같은 종래 분화방법을 사용할 수도 있지만, 외배엽 조직 유도용 생화학적 유도체를 사용하지 않고 응집에 의해 분화시킬 수도 있다.

상기 방법에서는 인간 성체 줄기세포를 응집하여 타원체를 형성시킴으로써 줄기세포들간의 강화된 '세포 상호작용'만으로 네스틴 양성의 신경 전구세포로 분화시키는 방법을 사용한다.

성체 줄기세포를 응집하면 응집된 줄기세포들 사이의 세포 상호작용이 증대되어 다른 외배엽 분화 유도 물질 없이도 외배엽 조직, 특히 신경조직 발생용 전구세포로 분화하게 되는데, 이 때, 성체 줄기세포를, 폴리에틸렌이민이나 폴리-D-라이신을 코팅한 배양접시에서 응집하여 타원체를 형성시킬 수 있다.

예를 들어, 태반 유래 성체 줄기세포를 이용하는 경우, 폴리에틸렌이민이나 폴리-D-라이신은 배양접시의 표면에 양전하를 띄게하여 상기 줄기세포가 표면에 부착하는 능력을 강화시키지만, 상기 줄기세포를 고농도로 배양하면 줄기세포는 배양접시 표면에 부착하지 않고 서로 응집하여 타원체를 이룬다. 배양하는 바람직한 줄기세포의 수는 0.2 x 10⁵~ 2.5 x 10⁵ cells/㎠이고, 보다 바람직하게는 1.0 x 10⁵~ 1.5 x 10⁵ cells/㎠이다. 2.5 x 10⁵ cells/㎠보다 더 많은 줄기세포를 배양하는 경우에는 형성된 타원체의 크기가 너무 커서 그 형태가 잘 유지되지 않으며, 0.2 x 10⁵ 보다 적은 수의 줄기세포를 배양하는 경우에는 대부분이 배양 접시 표면에 부착하게 된다.

다능성 성체 줄기세포가 응집하여 형성된 타원체는 그 직경이 50 ~ 400㎛를 형성토록 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 100 ~ 200㎛의 직경을 형성토록 하는 것이 좋다.

상기와 같은 방법으로 형성된 타원체를 통상의 배지에서 배양하면, 외배엽 조직, 특히 신경 발생용 신경 전구세포로 분화하게 된다. 이는 타원체의 세포 대부분이 네스틴을 발현하는 것을 통하여 확인할 수 있다(도 3의 B). 네스틴(nestin)은 신경 줄기세포나 신경전구 세포에 특유한 세포 표지인자(marker)로서, 네스틴이 발현되는 사실은 타원체로 응집한 세포간 상호작용의 강화 자체로 외배엽 분화를 위한 강한 시그널이 됨을 암시한다.

상기 네스틴-발현 세포를 통상의 배양접시에 이식하여 배양하면, 네스틴-발현(nestin+) 세포는 타원체 밖에서 성장하고 장미모양 퍼짐(rosette-like spread)을 형성하고, 본 발명의 방법에 의해서는 세포 모두가, 즉 100%의 세포가 nestin+이 된다(도 4의 C)

이와 같이, 성체 줄기세포의 응집에 의한 분화방법은 성체 줄기세포 100%가 신경 전구세포로 분화하는 우수한 효과를 발휘할 뿐만 아니라, 그 공정 역시 매우 간단하여 분화에 소요되는 시간을 현저히 단축시켜 분화된 세포의 생존성을 증가시켰고, 나아가 분화 유도 약물 또는 유전자 변환의 과정을 없앰으로써 타 물질에 의한 오염의 위험성도 줄어드는 장점이 있다.

본 발명에서는 외배엽 조직 유도용 생화학적 유도체의 사용 또는 줄기세포의 응집에 의해 성체 줄기세포를 적절한 방법으로 분화시켜 수득한 모든 신경 전구세 포를 사용할 수 있지만, 보다 바람직하게는, 외배엽 조직 유도용 생화학적 유도체를 사용하지 않고 응집에 의한 타원체를 형성 및 배양하여 신경 전구세포를 수득하여 사용한다.

한편, 본 발명에서 성체 줄기세포를 분화시켜 수득한 전구세포는 네스틴(nestin), Dcx, Sox1 및 HuD 등의 유전자들 중에서 적어도 하나 이상을 발현하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 태양으로 상기 네스틴(nestin), Dcx, Sox1 및 HuD 유전자를 모두 발현할 수도 있다. 상기 DCX, Sox1 및 HuD 유전자는 발생 초기 신경전구세포에서 발현된다.

흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생 및 복원

본 발명은 인간 성체 줄기세포 혹은 이를 분화시켜 얻은 신경 전구세포를 이용하여, 흑질 치밀부 영역에서의 도파민 신경세포의 재생 및 복원을 도모하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "분화"는 미분화 다능성 줄기 세포 또는 전구 세포가 보다 특수화된 결말을 획득하는 것을 의미하는 것으로, 분화된 세포는 특정 세포 유형 또는 조직의 특성인 표현형을 가진다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "도파민 신경세포"는 티로신 수산화효소(TH)을 발현하는 신경세포를 말한다. 도파민 신경세포은 중간뇌 흑색질에 특이적으로 위치하고, 생체내에서 선조체, 변연계 및 신피질을 자극하여 자세반사, 운동, 및 보상 관련 거동을 조절한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "재생(regeneration)"이란 형성된 기관 또는 개체의 일부가 상실되었을 때 그부분이 보충되는 현상이고, "복원"이란 "재구성(reconstitution)"이라고도 할 수 있는데, 이는 조직의 재구축을 의미하는 것으로 일단 해리된 세포나 조직으로부터 조직이나 기관을 다시 구축하는 것을 말한다.

본 발명은 '흑질 치밀부' 영역에서 손상된 도파민 신경세포를 보충(재생)하거나 다시 구축(복원)하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기에서 수득한 성체 줄기세포 또는 신경 전구세포를, 저산소증 및 허혈증으로 도파민 신경세포를 인위적으로 사멸시킨 동물의 선조체에 이식하였을 때, 상기 선조체에서 도파민 신경세포의 표지인 티로신 수산화효소(TH) 및 성상교세포의 표지 단백질인 GFAP를 함께 발현됨을 확인하였을 뿐만 아니라, 흑질 치밀부 영역에서 도파민 신경세포로의 분화 및 성숙을 유도하여 손상되었던 도파민 신경세포를 재생하고 복원함을 확인하였다.

그러나, 일반적으로, 성체에서 신경발생은 전뇌의 뇌실하대(subventricular zone, SVZ)와 해마의 과립세포하층(subgranular zone, SGZ)의 두 곳에서만 일어난다고 알려져 있다. SVZ에 존재하는 세포들은 비교적 작고 밀집된 형태로 배열되어 있으며, 한 가지 종류의 세포로 구성되어 있는 것이 아니라 조금씩 다른 분화능을 가진 미성숙한 세포들의 모자이크 군집으로 이루어져 있다. SVZ에 존재하는 신경 줄기세포는 신경모세포(neuroblast)로 분화하면서 RMS(rostral migration stream) 을 타고 후각구(olfactory bulb)로 이동, 최종적으로는 중간신경원(interneuron)으로 분화하여 과립 세포층(granule cell layer)에 위치하게 된다. SGZ의 신경줄기세포는 비교적 가까운 거리를 이동하면서 분화하여 마침내 해마 치아이랑(dentate gyrus)의 과립세포층에 존재하는 투사신경세포(projection neuron)으로서 기능하게 된다.

즉, 성체의 신경발생은 상기 두 영역에서만 일어나는 것으로 알려져 있으므로 본 발명의 "흑질 치밀부에서 도파민 신경세포가 재생될 수 있다"는 사실은 큰 의미를 가진다.

흑색질 (substantia nigra)은 교뇌중심회색질의 위쪽 끝부분에서 시상밑핵(subthalamic nucleus)이 나타나는 위치까지 거의 중뇌 전체에 걸쳐 있는 핵으로, 대뇌각기저부(crus cerebri)와 중뇌피개 사이에 위치해 있으며, 상기 흑색질은 피개쪽에 위치한 치밀부(pars compacta)와 대뇌각기저부쪽에 위치한 그물부(pars reticulata)의 두 부분으로 나누어진다. 치밀부에는 멜라닌색소(melanin pigment)가 세포질 내에 있는 큰 신경원들이 밀집되어 있으며, 이 세포들은 신경전달물질로 도파민(dopamine)을 함유하고 있다. 치밀부의 세포들은 큰 다극세포로 핵소체는 크고 뚜렷하며, 니슬소체도 크고 짙게 염색되며 뚜렷하다. 흑질 치밀부의 도파민 함유 신경원은 주로 선조(striatum, 미상핵 caudate nucleus 과 조가비핵 putamen)로 원심섬유(흑색선조섬유 nigrostriatal fiber)를 보낸다. 선조로 투사되는 흑질 치밀부의 도파민원심섬유를 선조관련도파민계(mesostriatal dopaminergic system)라고도 한다.

이와 같이, 흑질 치밀부는 도파민 신경세포가 밀집되어 있기 때문에, 파킨슨병과 같이, 중간뇌 흑색질중의 도파민 신경세포의 손상을 특징으로 하는 질환과 밀접한 관련을 가지고 있고, 상기 흑질 치밀부의 손상된 도파민 신경세포들을 대체(replacement)할 수 있는 치료방법이 상기 질환 등에 매우 큰 효과가 있을 것이라는 사실을 예측할 수 있다.

본 발명은 상기 세포들을 이용하여 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생 및 복원을 도모하므로, 이와 같은 세포 대체 치료법에 유용하다.

이 때, 흑질 치밀부에서 재생되는 도파민 신경세포는 선조체로부터 이동되어 온, 이식한 줄기세포나 신경 전구세포의 분화가 아닌, 흑질 치밀부에 내재되어 있는 줄기세포 또는 전구체로부터의 도파민 신경세포로 분화 또는 성숙에 의한 것이다. 즉, 흑질 치밀부에서 재생된 도파민 신경세포는, 이식된 선조체로부터 이동되어 온 줄기세포나 신경 전구세포에 의한 것도 아니고, SVZ로부터 이동해온 도파민 신경세포도 아니며, 흑질 치밀부 자체에 존재하는 줄기세포 또는 전구체들로부터 성숙 및/또는 분화한 것이다.

이는 성체 줄기세포 또는 신경 전구세포의 선조체로의 이식에 의해 흑질 치밀부에 내재되어 있는 줄기세포 또는 전구체들이 도파민 신경세포로 성숙 및/또는 분화하도록 자극 혹은 유도되어 결과적으로 도파민 신경세포가 재생됨을 의미한다.

본 발명은 또 다른 관점에서 중추 신경계 기능을 회복하기 위한 성체 줄기세포 또는 신경 전구세포의 용도를 또한 제공한다. 특히, 도파민 신경세포의 손상에 의해 야기되는 신경계 질환에 대한 치료적 용도를 제공한다.

예를 들면, 이들 세포는 치료하고자 하는 질환 또는 상태에 따라서 선조체 등의 부위로 직접 이식함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 또한, 영장류 성체 줄기세포, 바람직하게는 인간 성체 줄기세포 또는 이로부터 유래된 신경 전구세포를 치료학적 유효량으로 함유하는 조성물의 형태로 투여 또는 이식함으로써 치료적으로 사용할 수 있다. 그리고, 본 발명은 도파민 신경세포의 변성 또는 변형을 특징으로 하는 신경변성 장애 또는 신경병의 치료 방법도 포함한다.

본 발명의 상기 치료적 용도는 앞서 설명한 본 발명의 신경 전구세포 또는 분화된 신경세포나 이를 함유하는 조성물의 형태로 병변 부위에 직접 이식함으로써 유리하게 수행될 수 있다. 신경 이식 및 세포 배양의 방법은 당업자에게 널리 알려진 공지의 방법을 사용할 수 있다.

한 가지 구체예에서, 본 발명의 성체 줄기세포 또는 신경 전구세포는 환자의 선조체에 직접 이식될 수 있다. 이식 후, 약 8주 정도가 지나면 흑질 치밀부에서 도파민 신경세포가 거의 완전히 재생(복원)되어 손상된 도파민 신경세포를 대체할 수 있게 되고, 그 결과 흑질선조체 도파민 작용성 시스템의 실험 병변을 가진 동물에게서 운동 기능을 회복시킬 수 있다.

그리고, 상기 복원된 도파민 신경세포가 효과적으로 원래의 신경전달 역할을 수행하기 위해 선조체로의 타겟팅(targeting)이 이루어짐에 따라 저산소증 및 허혈증 등에서와 같이 파괴된 흑질선조 회로를 재확립시킨다.

또 다른 구체예에서, 상기 도파민 신경세포 재생용 성체 줄기세포 또는 신경 전구세포는, PBS 및 항산화제(아스코르브산 등)를 포함하는 조성물의 형태로도 제공될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 일관점에서 인간 성체 줄기세포 또는 상기 성체 줄기세포 유래의 신경 전구세포를 함유하는, 흑질 치밀부 내 도파민 신경세포 생성용 조성물에 관한 것이다. 또한, 재생된 도파민 신경세포의 선조체로의 타겟팅(targeting)에 의해 파괴된 흑질선조 회로를 재확립시키므로, 본 발명의 다른 관점에서 영장류 성체 줄기세포 또는 상기 성체 줄기세포 유래의 신경 전구세포를 함유하는, 흑질선조 회로 회복용(복구용) 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "치료" 또는 "치료하다"는 치료학적 처치 및 예방 또는 방지 수단이다. 그러므로, 치료가 필요한 자들은 이미 신경변성 장애 또는 신경병을 가진 자, 뿐만 아니라 신경변성 장애 또는 신경병을 예방하고자 하는 자들을 포함한다. 본 발명의 방법은, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 영장류 및 가축, 사육,애완용 또는 스포츠 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 치료가 필요한 임의의 포유동물을 치료하는 데 사용할 수 있다. "장애"는 신경 원시세포, 분화된 신경세포 또는 본 발명의 세포의 두 가지 유형으로 치료하여 이익이 되는 임의의 상태이다. 성체 줄기세포 혹은 신경 전구세포를 이식함으로써 재생 및 복원되는 도파민 신경세포로부터 이익을 얻을 수 있는 장애의 예는 부적당한 자세 반사, 이동 및 보상 관련 거동, 예컨대 파킨슨병, 정신분열증, 약물 중독과 관련된 것들이다.

본 명세서에서 사용되는, 세포의 "치료학적 유효량"은 분화된 신경세포, 예컨대 도파민 신경세포, 별아교세포 및 희소돌기아세포의 손실, 손상 또는 변성에 의해 유발되는 환자의 생리학적 효과를 중지 또는 경감시키기에 충분한 양이다.

사용된 세포의 치료학적 유효량은 환자의 필요성, 환자의 연령, 생리학적 상태 및 건강, 소정의 치료 효과, 치료에 표적하고자 하는 조직의 크기 및 면적, 병변의 정도 및 선택된 전달 경로에 의존할 것이다. 예를 들면, 뇌의 더 큰 영역에 영향을 주는 장애의 치료는 보다 작은 표적 영역과 비교하였을 때 치료 효과를 달성하기 위하여 보다 다수의 세포를 요할 수 있다. 또한, 세포는 저 세포 투여량의 다중 소형 이식편으로 소정의 표적 조직내 1 이상의 부위에 투여할 수 있다. 본 발명의 세포는 이식 전에 완전히 분리되어, 예컨대 단일 세포의 현탁액을 형성하거나, 또는 이식 전에 거의 완전히 분리되어, 예컨대 세포의 소형 응집물을 형성할 수 있다. 세포는 이들을 소정의 조직 부위로 이식 또는 이동시키고, 기능적으로 결핍된 영역을 재구성 또는 재생하는 방식으로 투여할 수 있다.

치료학적으로 유효하게 달성하도록 투여할 수 있는 세포의 적당한 범위는 당업자의 통상의 지식 내에서 환자에 맞추어 적절히 사용할 수 있다. 예를 들어 약 1,000 내지 10,000,000 세포, 혹은 그 이상 일수도 있으나, 고용량이 되면 암세포로 변할 가능성을 완전히 배제할 수 없으므로 2,000,000 내지 4,000,000 정도가 바람직할 수 있다.

본 명세서에 개시된 바와 같은 성체 줄기 세포로부터 흑질 치밀부에서 도파민 신경세포를 재생하는 능력은 다양한 신경변성 장애 및 신경병에 대한 이식 치료 에 대하여 임상 관련성이 크다. 예를 들면, 도파민 신경세포는 자세 반사, 이동 및 보상 관련 거동 조절의 비정상을 특징으로 하는 신경변성 장애 및 신경병,예를 들면 저산소 허혈 손상, 파킨슨병, 정신분열증 및 약물 중독, 뿐만 아니라 외상, 또는 파킨슨 유사 상태, 예컨대 운동불능증 및 자세 비정상 등을 초래하는 다른 질환으로 인한 병변을 치료하는 데 사용할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : 인간 성체 줄기세포의 분리

(1) 인간 성체 줄기세포의 분리 및 배양

마리아 불임병원으로부터 임신 1/3분기의 초기에 해당하는 5~7주의 태반을 무균 상태에서 분리한 후, DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)으로 세척하고, 잘게 자른후, 37℃에서 5~20분 동안 트립신 용액(0/25% trypsin/0.5nM EDTA)으로 처리하여 단일 세포체로 분리하였다. 분리된 세포는 100㎛ 나일론 메쉬를 사용하여 회수한 후, DPBS로 세척하였다.

그 후, 원심분리 과정을 거친 후, 10% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 과 4ng/ml 섬유세포성장인자, 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 1% 비필수 아미노산(nonessential amino acids) 및 항생제가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media)배지에 부유하여 37℃ 및 5% CO₂의 가습 배양기(humidified chamber)에서 배양하였다.

5일 후 배지를 교환하면서 비부착 조직 찌꺼기(debris)들을 제거하였다. 세포들이 증식하여 배양 표면(75cm²)에서 밀도가 높아질 때(confluent)를 1계대로(passage 1)하였다. 이러한 공정을 거쳐 총 11개의 각각 독립된 인간 태반 유래 줄기세포주(human placenta stem cells, hPLC)를 확립하였다.

(2) RT-PCR 분석

총 RNA는 트리졸 시약(Trizol reagent, Invitrogen)을 사용하여 추출하였으며, Superscript II (Invitrogen)과 oligo-d(T)₂₀ 프라이머를 이용하여 42℃에서 한 시간, 72℃에서 15분 반응하여 cDNA를 합성하였다. cDNA로부터의 표적 서열은 premix kits (Invitrogen, Bioneer)를 사용하여, 95℃에서 3분동안 최초 변성(denaturation), 95℃에서 30초간 변성, 53~60℃에서 45초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 45초간 증폭(extension)하는 과정을 35회 반복하였다. 증폭된 cDNA는 2% 아가로즈 겔에서 분리하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하여 확인하였다.

그 결과, hPLC가 Oct4, Nanog, Tbn, Klf4, 및 activin (도 3)를 발현하는 것 이 확인되었다. 이는 전능성 배아 줄기세포나 낭배형성 개시 전 미분화된 배아세포에서 일반적으로 발견되는 것과 같다.

(3) FACS 분석

세포의 표면 항원을 분석하기 위하여 세포를, 4 mM EDTA/5% FBS를 첨가한 PBS로 수거하여 헹군 후, 마우스 IgG나 FITC 또는 PE(phycoerythrin)가 결합된 항체를 함유하는 4℃의 2% FBS/PBS 완충액에서 4℃ 및 30분동안 처리하였다. 그 후 세포를 세척하고, FACS Vantage SE (Becton & Dickinson)를 이용하여 분석하였다. FACS 분석 전에 프로피디움 요오드화물(propidium iodide) 5㎍/ml을 첨가하여, 사멸한 세포와 잔해들을 제거하였다. 얻어진 결과는 CellQuest program(Becton & Dickinson)를 사용하여 분석하였다.

유세포 분석결과, CD13, CD9, CD29, CD44, CD90, CD105 및 HLA-ABC에 대해서는 양성을; CD10, CD14, CD24, CD34, CD45, CD50, CD38, 및 HLA-DR에 대해서는 음성을 나타내었다(도 2). 이러한 결과는 제대혈의 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)에서 발현되는 것들과 유사한 것으로, CD13, CD9, CD90 및 CD105의 발현과 CD45, CD10 및 HLA-DR의 결핍은 양 세포의 공통점이었으나, 본 발명의 hPLC에서는 MSCs의 동정 마커인 CD34의 발현은 나타나지 않은 점이 차이점이었다.

(4) 핵형(Karyotype) 분석

75 cm² 배양 표면에서 약 70%의 정도 자란 세포는 0.1㎍/ml의 콜세미드(colcemid) 용액에 2시간 동안 노출 시킨 후, 채취하고 세척한 다음, 37℃에서 75mM KCL의 저장액에 20분간 처리하였다. 배양 후, 저장 용액을 세척하고, 원심분리한 후, 메탄올/아세트산(3:1) 고정액 5ml로 고정하였다.

고정된 세포를 채취하여 고정액 0.5 ml에 재부유시켰다. 부유액 한 방울을 30cm높이에서 얼린 슬라이드(frozen slide)에 떨어뜨렸다. 공기 중에서 건조시킨 슬라이드를 0.025% 트립신에 30초간 노출시킨 후 PBS로 세척하였다. 염색체를 10% 김자 용액(Giemsa solution)으로 염색한 후 Cytovision (Applied Imaging)으로 핵형을 분석하였다.

그 결과, 분리된 hPLC에서 염색체 수 혹은 G-banding 형태의 변화가 없었으며 90~150일 동안 지속적으로 배양하였을 때에도 같은 정도의 항상성을 나타내었다 (도 1).

(5) 수득된 hPLC의 조직화학적 분석

커버 슬립 위에서 배양된 상기 세포주들을 4% 파라포름알데히드 용액으로 15분간 실온에서 고정한 후 PBS로 세척하였다. 고정된 세포는 10% 정상 염소 혈청 (normal goat serum)을 포함하는 0.1% 트리톤 X-100/PBS를 사용하여 세포막의 투과성을 높이고(permeabilized), 비특이적 항원들을 블로킹시킨 다음, 실온에서 1차 항체들을 처리하여 1시간 동안 방치하였다. 세척 후, 다시 실온에서 2차 항체를 처 리하고 1시간 동안 방치하였다. 세포의 핵은 10분동안 Hoeshst 33342(10 ㎍/ml, Sigma)로 표지하여 형광현미경으로 관찰하였다. 사용된 항체는 anti-Nestin( 1:500, Santa Cruz)였다.

그 결과, 미분화된 hPLC의 약 30%정도가 네스틴을 발현하였다(도 4의 A). 이러한 사실은 상기 RT-PCR 분석결과인 Nanog, Oct4, Klf 등의 발현사실과 더불어, 미분화된 hPLC가 외배엽성 조직으로의 분화 가능성을 잠재하고 있다는 점만 시사할 뿐, 아직 구체적으로 특정 조직으로의 분화는 이루어지지는 않았음을 보여준다.

실시예 2 : 신경 전구세포의 형성

실시예 1에서 수득한 hPLC를 신경 전구세포로의 분화를 유도하기 위하여 0.2 x 10⁵ cells/cm² 를 0.01~1% 폴리에틸렌 이민이 코팅된 배양접시 및 폴리-D-라이신(0.1~100 ㎍/ml)이 코팅된 배양접시에 각각 배양하였다. 2일 째, 줄기 세포들이 서로 응집하여 타원체를 이루었다. 상기 줄기 세포 타원체에 대하여 네스틴 항체에 대한 반응을 조사하였다.

그 결과, 도 4에 도시한 바와 같이, 타원체 형성 당시에 네스틴의 발현이 증가하고 있었고(도 4의 B), 또한 타원체를 일반 배양접시에 옮겨 배양한 결과 장미모양 퍼짐(rosette-like spread)을 형성하였고, 세포의 대부분이, 즉 세포의 100%가 네스틴을 발현하였다(도 4의 C). 또한, 한 달 이상 계대배양한 경우에도 상기 네스틴의 발현이 그래도 유지됨을 확인할 수 있었다(도 4의 D). 각 단계에서 네스 틴 유도는 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다(도 5). 그리고 유도된 표현형은 2달 이상 냉동보관 한 경우에도 유지되었다(데이터 도시 않음).

또한, 분화된 신경 전구세포에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 실시한 결과 전분화능과 연관이 있는 유전자의 발현이 없어짐과, 동시에 신경 전구세포의 특징이 되는 Sox1, Dcx, 및 HuD mRNA의 발현이 현저히 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 6).

이러한 결과들은 강화된 세포 상호작용이 hPLC에서 외배엽 분화의 강력하고 효율적인 유도자(inducer)라는 점을 시사한다.

실시예 3 : 회색질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생

(1)신생아 쥐의 뇌에서의 HI-유도 도파민 결핍

5일령 어린 쥐에서 양 측의 경동맥을 전기적으로 마비시켰을 경우, 허혈증 (ischemic) 및 저산소증 (hypoxic insult)으로 인하여 여러 증세의 뇌손상이 나타났으나, 복측 피개영역(ventral tegmental area, VTA) 및 SNc에서 저산소 손상(hypoxic insult)으로 tyrosine hydroxylase-positive (TH+) 세포의 단계적으로 사멸이 그 중 두드러진 손상으로 나타났다(도 7의 A). SNc에서 도파민 신경세포의 퇴행은 흑질선조 회로를 파괴하고, 이어서 선조체에서의 TH-면역반응성의 소실을 가져왔다(도 7의 B).

(2) 선조체로의 이식

저산소 허혈성 손상 2주 후에, 쥐에 Equithesin를 투여하여 마취시키고 이식을 위하여 stereotaxic frame (David Kopf Instruments)에 마운팅하였다. 두개골을 열어 4 ㎕의 0.5% 글루코스/PBS 중의 2 x 10⁵ hPLC를 좌우 선조체(bilateral striata)에 천공점(bregma)을 기준으로 다음과 같이 4부위에 이식하였다.

AP +0.5 mm, ML +1.2 mm, DV -4.5 mm;

AP +0.5 mm, ML -1.2 mm, and DV -4.5 mm;

AP +0.5 mm, ML +1.2 mm, and DV -3.3 mm;

AP +0.5 mm, ML -1.2 mm, and DV -3.3 mm relative to bregma⁵⁰

(여기서 AP는 anterior-posterior의 약자로 뇌의 bregma를 기준으로 앞쪽으로 +0.5 mm 지점을 뜻하며, ML은 medial-laterla 의 약자로 좌우를 뜻하며 +1.2 mm는 우측으로 1.2 mm 지점을 뜻하며, DV은 dorso-ventral의 약자로 등쪽-배쪽을 의미하며, -4.5 mm는 뇌의 표면에서 아래쪽으로 4.5 mm 지점을 의미한다.)

각 부위에 세포 현탁액을 분마다 1㎕씩 주입하고 5분동안 흡수토록 한 후, 천천히 바늘을 빼냈다. 생존 기간에 걸쳐 매일 Cyclosporin A (10 mg/kg, Novartis)을 복강내 투여하였다.

(3) 행동 테스트(Behavioral test)

이식 후 2주가 지난 후 hPLC로부터 분화된 전구세포를 이식받은 쥐에 대하여 로타로드 테스트(Rotarod test)를 실시하였다. 대조군으로는 glucose/PBS를 이식하 여 사용하였다.

가속시킨 로타로드(Ugo Basile)로 쥐의 운동협응 능력을 측정할 수 있다. 우선, 10분 세션으로 세 번 이상 5rpm의 낮은 속도에서 회전하는 막대에 머무르게 훈련시킨 다음, 600초 이상 5rpm에서 40 rpm까지 가속시킨 막대 위에서 동물들이 견딜 수 있는 시간(fall latency)을 측정하였다

그 결과, 이식받은 동물은 대조군에 비하여, 운동활성에 있어서 현저한 개선효과를 보임이 확인되었다 (도 8). 또한, 성체줄기세포 또는 이로부터 유래한 신경전구세포(hP+)를 이식한 동물군에서 동물들이 회전하는 막대에 머무를 수 있는 시간은 점점 증가하여 이식 8주 경에는 정상적인 동물과 거의 유사한 정도의 운동능을 보였다.

동물들에게 Equithesin를 과량 투여하여 마취시키고, 헤파린용액 (1 U/ml PBS)을 심장을 통하여 관류하여 혈액을 제거한 후, PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드로 관류하여 조직을 고정시켰다. 고정된 동물에서 뇌를 수거하고, 조직은 바닥에 가라앉을 때까지 2일 동안 4℃의 30% 수크로오즈에 평형화(Equilibration)시켰다. 일단 평형화되면 상기 조직들을 OCT 화합물(Sakura Finetech)로 마운팅하여 10~40 ㎛ 두께로 냉동 절편(-20℃)한 다음 조직학적 분석을 수행하였다. 실시예1의 (5)방법을 이용하되, 항체로는 anti-TH(1:500, Santa Cruz); anti-BrdU(1:200, Roche); anti-HN(1:500, Chemicon); anti-NeuN(1:500, Santa Cruz); 및 anti-GFAP(1:500, Sigma)를 사용하였다.

그 결과, 이식 후 8주째, hP+를 이식한 동물의 선조체에 인간 핵(human nuclei)을 가지는 세포들의 존재를 확인하였다. 이식된 신경 전구세포들의 일부는 성숙 신경세포으로 분화였는고(도 9의 A), 일부는 TH 단백질을 발현하는 도파민 세포였다(도 9의 C). 그리고, GFAP-발현 성상세포의 존재도 일부 함께 확인되었다. 이는 hP+가 숙주 뇌에서 다른 세포형으로 분화할 수 있음을 시사한다(도 9의 B).

상기와 같은 결과는 이식된 신경 전구세포의 최종 분화 및/또는 성숙이 숙주의 미세환경에 의해 이루어지고 선조체에서의 도파민 신경세포로의 생성에 의해 숙주 뇌질환을 부분적으로 경감시킬 수 있음을 보여준다.

(4) 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포 재생 및 복원

이식된 hP+가 TH+세포로 분화되는 것이 관찰되었지만, 선조체내의 TH+ 세포수는 이식후 8주까지 운동활성의 점진적 개선에 따라 비례적으로 증가하지는 않았다. 이러한 불일치에 따라, 본 발명자들은 정상활성의 회복이 SNc에서의 도파민 신경세포 재생에 기인한 것인지 여부를 시험하였다.

플루오로골드(Fluorochrome LLC) 를 0.9% saline 으로 희석하여 2% 워킹 솔루션을 만들었다. 이하 각 6개의 실험설계에 따라 상기 희석용액 (0.2 μl)은 뇌 정위기 (stereotaxic frame)를 이용하여 천공점 (bregma)으로 부터 다음과 같은 좌표에 주입하였다

AP +1.1 mm, ML +2.0 mm, DV -3.5 mm;

AP +1.1 mm, ML +2.0 mm, DV -2.5 mm;

AP +0.0 mm, ML +2.0 mm, DV -3.75 mm;

AP +0.0 mm, ML +2.0 mm, DV -2.75 mm;

AP -0.8 mm, ML +2.75 mm, DV -3.75 mm; 및

AP -0.8 mm, ML +2.75 mm, DV -2.5 mm relative to bregma ⁵⁰.

이 방법에 의해 선조체 내의 모든 TH+ 세포들이 성공적으로 표지되었다(도 10).

그 결과, 놀랍게도 이식 2주 후에 SNc 및 VTA 2 양쪽 모두에서 많은 TH+ 세포의 증가가 명백히 확인되었다(도 11의 A). 그 후에도 TH+ 세포수는 양쪽 모두에서 현저하게 증가하였고, 4주째에 VTA의 전체 형태가 정상에 근접하였고(도 11의 B), SNc에서의 도파민 신경세포의 재생은 이식 후 8주에 거의 완성되었다(도 11의 C).

흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포의 재생을 보다 자세히 관찰하기 위하여 bromodeoxyuridine (BrdU, Sigma)을 이용하였다. BrdU (Sigma) 을 0.9% saline에 희석하고, 쥐가 사망할 때까지 매일 50 mg/kg씩 복강내 투여하였다. BrdU는 Thymine의 유사체로서 이를 다량 투입한 경우 DNA의 복제 시 세포의 DNA에 침투할 수 있다. 그러므로 이는 주사하는 동안 세포분열 중에 있는 즉, 새로 생겨난 세포만 특이적으로 표지할 수 있는 가장 효율적인 방법이다. BrdU가 주사된 동물의 뇌 절편(30 mm 두께)을 실온에서 1시간 동안 2 N HCl 에서 처리한 후, 0.1 M borate buffer (pH 8.5) 로 10분동안 2회 중화시킨 다음 PBS로 세척하였다. 조직들의 세포막 투과성을 확보하기 위하여 PBS 에서 0.3% Triton X-100 및 3% BSA를 포함하는 PBS에서 1시간 동안 처리한 다음, 4℃에서 밤새 BrdU에 대한 항체에 노출시켰다. 그 후, 세척 및 2차 항체를 처리하였다

BrdU의 투여 결과, SNc 내에서 또는 가까이에서 많은 신경 세포들이 새롭게 생성됨을 보여주었고, 이들이 TH+ 세포질에 의해 둘러싸여 있음을 확인하였다(도 12의 A). 3차원 공초점 현미경으로 양 방향에서 BrdU/TH 이중 양성 세포를 관찰한 결과, 상기 양 시그널은 새로 생성된 TH+ 신경세포을 나타내는 단일 세포 내에 국부적으로 모여있음이 확인되었다. 공초점 현미경으로 0.5-mm 간격에서 z-axis를 통해 세포의 연속적 단면을 관찰한 결과, 단일 세포내에서 상기 BrdU 및 TH 단백질이 같은 세포내에 있음이 확인되었다(도 12의 B). 즉, SNc영역에서의 도파민 신경세포의 재생을 명확히 확인할 수 있었다.

한편, SNc 및 VTA 2 양쪽 모두에서 많은 TH+ 세포의 증가가 명백히 확인되었고, SVZ에서 생성된 도파민 신경세포가 SVZ로부터 전 이주 흐름(rostral migratory stream, RMS)을 경유하여 긴 거리를 이동할 수 있기 때문에, 이러한 SVZ로부터의 도파민 신경세포 이동으로 SNc 영역에서의 재생이 이루어졌는지 여부를 확인하고자 하였다.

이를 위해, SVZ 단면을 Dcx에 대한 항체로 면역염색하여, SNc에서의 도파민 신경세포 재생에 기여할 수 있는 미성숙 신경세포의 이동을 확인하였다.

대조군 이식군(도14의 a) 및 hP+ 이식군(도 14의 b)의 SVZ와의 비교에서, Dcx+ 세포의 양에서는 눈에 띄는 차이를 보이지 않았는 바, 종래 신경세포 생성지역인 SVZ로부터 SNc 영역으로 새로운 도파민 신경세포가 이동해왔을 가능성 없는 것으로 확인되었다.

따라서, 선조체로의 hP+ 이식에 의해 상기 SNc 영역에 내재하는 성체 줄기세포 또는 전구체들이 도파민 신경세포로의 성숙 및/또는 분화가 유도되어, SNc 자체 내에서 손상된 도파민 신경세포가 재생 및 복원되었음을 알 수 있다.

추가의 확인을 위하여, 정상 SNc에서의 네스틴 양성세포의 존재(도 15 a), 손상 후 대조군이 이식된 SNc (도 15 b), 손상 후 hP+가 이식된 SNc (도 15 c)을 조사하였다.

면역조직화학적 분석결과, 정상 동물의 SNc에 네스틴 양성의 전구세포가 존재하였는 바, 일단 SNc 영역내에 SNc의 재생에 관여한 신경 전구세포가 내재되어 있음을 확인였다. 그리고 저산소 허혈성 손상(HI insult) 후 SNc내의 네스틴 단백질의 발현이 현저히 증가하는 사실을 통해, 상기 손상이 SNc에 내재되어 있는 전구체를 활성화시킴을 확인하였다. 즉, 저산소 허혈성 손상에 의해 SNc 자체에서 내재되어 있는 전구체가 활성화되어신경 세포의 재생을 도모하려는 경향이 있음을 알 수 있다.

더구나, human nuclei (HN) 항체로 실시한 조직학적 연구에서, 이러한 SNc내의 네스틴 양성 세포들이 이식된 부위(선조체)로부터 SNc영역으로 이동해온 hP+세 포라는 점을 나타내는 근거가 없고, 나아가, 실시간 RT-PCR 결과에 의해 저산소 허혈성 손상된 SNc에서 네스틴 mRNA 약 3.5 배의 유도가 일어남이 확인되는바(도시 않음), 이러한 사실을 통해 SNc에서 재생되는 도파민 신경세포는 선조체로부터 이동되어 온 줄기세포나 신경 전구세포의 분화가 아닌, SNc에 내재되어 있는 줄기세포 또는 전구체로부터의 도파민 신경세포로 분화 또는 성숙에 의한 것임을 알 수 있다.

즉, SNc에서 재생된 도파민 신경세포는, 선조체로부터 이동되어 온 줄기세포나 신경 전구세포에 의한 것도 아니고, SVZ로부터 이동해온 도파민 신경세포도 아니며, SNc 자체에 존재하는 줄기세포 또는 전구체들로부터 성숙 및/또는 분화하였음을 알 수 있다.

다만, 선조체에 성체 줄기세포 또는 신경 전구세포를 이식하면 이들이 분화하여 직접 SNc로 이동해 가는 것은 아니지만, 상기 이식에 의해 SNc에 내재되어 있는 줄기세포 또는 전구체들이 도파민 신경세포로 성숙 및/또는 분화하도록 자극 혹은 유도하여 결과적으로 SNc에서 도파민 신경세포가 재생되는 것이다.

선조체로의 성체 줄기세포 또는 신경 전구세포의 이식이 상기 SNc에 존재하는 줄기세포 또는 전구체들로부터 성숙 및/또는 분화를 유도하는 기능을 할 수는 있다.

(5) 흑질선조 회로의 회복

이식 후 4주째 선조체에서 TH+섬유가 발생하였고, 8주째에는 그 정도가 정상적인 동물과 차이가 없었다. 이러한 선조체 내의 풍부한 TH+섬유의 출현과 운동활성의 점진적 개선에 따라, SNc에서 재생성된 도파민 신경세포가 원래의 역할대로 상응하는 선조체에 신경을 통하게 한다는 예측을 하고, 실제로 흑질 선조 회로의 회복이 이루어졌는지 여부를 관찰하였다.

이를 위하여, 쥐를 죽이기 3일 전 선조체에 역행성 추적 물질 플루오로골드(retrograde tracer fluorogold)를 주입하고(도 13의 A), TH 단백질의 존재를 확인하기 위하여 뇌 단면을 면역염색하였다.

그 결과, 예측대로 많은 세포들이 TH 및 플루오로골드의 이중 염색으로 핑크색으로 나타났다 (도 13의 B, C, D). 이는 선조체에서 그 말단으로부터 TH+ 세포가 플루오로골드를 흡수하였음을 가리키고 있다.

추가로, 이중 양성(fluorogold+/TH+) 세포들 역시 새로 생성된 세포인지 여부를 알아보기 위하여, BrdU 및 fluorogold를 주입한 동물의 뇌 단면을 조사한 결과, fluorogold+/TH+ 세포의 일부는 명확히 BrdU 양성을 나타냈다(도 13의 D).

이 결과는 fluorogold+/TH+/BrdU+의 세포가 흑질 치밀부에서 재생된 도파민 신경세포로서, 이들이 상응하는 선조체에 신경을 전달하는 역할을 수행하고 있음을 보여주고, 나아가 흑질 선조 회로가 회복되었음을 보여준다.

도 1은 hPLC의 증식 세포수 및 김자 염색에 의한 핵형 분석 결과이다.

도 2는 hPLC의 표면 발현 양상을 보여주는 유세포 분석(FACS analysis) 결과이다.

도 3은 hPLC의 RT-PCR 분석 결과이다.

도 4는 hPLC의 신경 전구세포로의 분화에 따른 현미경 사진으로서, 미분화된 hPLC(A), hPLC 응집에 의해 타원체 형성 후(B), 타원체 배양 후 (C) 및 세포가 배양접시에 꽉 찰 때까지 증식(D)한 경우를 나타낸다.

도 5는 분화 단계에 따른 웨스턴 블럿 분석 결과이다[Nv:미분화 hPLC; Sph:타원체 형성; +P1:계대1; +P3:계대3]

도 6은 분화 단계에 따른 신경 전구세포의 표지인자들에 대한 RT-PCR 분석 결과이다[Nv:미분화 hPLC; Sph:타원체 형성; +P1:계대1; +P3:계대3].

도 7은 저산소 허혈성 손상에 따른 VTA 및 SNc에서의 도파민 신경세포의 손상(A) 및 흑질 선조 회로의 파괴(B)를 나타낸 현미경 사진이다.

도 8은은 선조체에 본 발명의 신경 전구세포를 이식한 후 쥐의 운동 협응 능력에 대한 로타로드 테스트 결과이다[검은색 막대:대조군(n=14); 회색막대:hP+ 이식군(n=22); 하얀막대:정상쥐군(n=16)].

도 9는 특정 항체(녹색) 및 HN 항체(빨간색)를 이용한, 신경 전구세포가 이식된 후 선조체에서 일어나는 분화와 관련된 사진으로, 성숙한 신경세포로의 분화를 나타내는 NeuN-양성세포(A), GFAP+/HN+ 이중 양성 세포(B) 및 도파민 신경세포 로의 분화를 나타내는 TH 양성세포(C)에 관한 것이다.

도 10은 선조체에서의 TH-면역반응성 섬유 구조의 발생을 나타내는 사진이다[A:이식 후 2주의 실험군; B:이식 후 8주의 실험군; C:대조군].

도 11은 이식 후 시간의 경과에 따라 SN 및 VTA에서의 도파민 신경세포의 재생을 보여주는 사진이다[A:이식 후 2주; B:이식 후 4주; C:이식 후 8주].

도 12는 SNc에서의 도파민 신경세포 재생을 TH (빨간색) 및 BrdU(녹색) 항체를 이용하여 확인한 사진이다.

도 13은 재생된 도파민 신경세포에 의해 흑질 선조 회로의 회복을 보여주는 사진으로, A는 FG(Fluorogold)로 표지한 경우, B는 FG 및 TH로 표지한 경우, C는 SNc의 모든 TH+세포와 VTA의 TH+세포 중 반을 FG로 표지한 경우, D는 FG(흰색), TH(빨간색) 및 BrdU(녹색)으로 표지한 경우를 나타낸다.

도 14는 SVZ 단면을 Dcx에 대한 항체로 면역염색한 현미경 사진이다[a:대조군, b:실험군]

도 15는 정상 SNc(도 15 a), 손상 후 대조군이 이식된 SNc (도 15 b), 손상 후 hP+가 이식된 SNc (도 15 c)에서 네스틴 양성세포의 존재를 확인한 사진이다.

Claims (12)

1. 폴리에틸렌이민 또는 폴리-D-라이신이 코팅된 배양 접시에서 태반 유래 줄기세포를 배양하였을 때 줄기세포가 배양접시 표면에 부착하지 않고 서로 응집하여 형성된 타원체 형상의 응집세포들을 배양하여 수득되고 네스틴(nestin), Dcx, Sox1 및 HuD 유전자로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는, 태반 유래 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포를 함유하는, 흑질 치밀부에서의 도파민 신경세포 재생용 세포집단,

   여기서 상기 세포집단은 흑질 치밀부로 직접 이동하지 않고, 흑질 치밀부에 존재하는 줄기세포를 도파민 신경세포로 분화하도록 자극하는 것을 특징으로 하는 세포집단.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 타원체는 100 내지 200㎛의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 세포집단.
4. 폴리에틸렌이민 또는 폴리-D-라이신이 코팅된 배양 접시에서 태반 유래 줄기세포를 배양하였을 때 줄기세포가 배양접시 표면에 부착하지 않고 서로 응집하여 형성된 타원체 형상의 응집세포들을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 흑질 치밀부 내 도파민 신경세포 재생용 세포집단을 생성하는 방법,

   여기서 상기 세포집단은 흑질 치밀부로 직접 이동하지 않고, 흑질 치밀부에 존재하는 줄기세포를 도파민 신경세포로 분화하도록 자극하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 삭제
6. 제4항에 있어서, 상기 태반 유래 줄기세포의 응집은 외배엽 분화유도용 생화학물질로서 프로게스테론, 푸트레신, 라미닌, 인슐린, 아셀렌산나트륨, 트랜스페린, 뉴르투린, 소닉 헤지호그(SHH), 노긴, 폴리스타틴, 상피성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자, 형질전환 성장 인자 α(TGF-α), 형질전환 성장 인자 베타-3(TGF β3), 혈소판 유도 성장 인자(PDGF-AA), 인슐린양 성장 인자(IGF-1), 골형태형성 단백질(BMP-2, BMP-4), 신경아교 세포 유도향신경성 인자(GDNF), 레티노산(RA), 미드카인, 아스코르브산, 디부티릴 cAMP, 또는 도파민 및 gp130과 착화하는 수용체에 대한 리간드를 함유하고 있지 않은 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 폴리에틸렌이민 또는 폴리-D-라이신이 코팅된 배양 접시에서 태반 유래 줄기세포를 배양하였을 때 줄기세포가 배양접시 표면에 부착하지 않고 서로 응집하여 형성된 타원체 형상의 응집세포들 또는 상기 타원체 형상의 응집 세포들을 배양하여 수득된 태반 유래 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포를 함유하는, 흑질 치밀부 내 도파민 신경세포 재생용 조성물,

   여기서 상기 타원체 형상의 응집 세포들 또는 상기 태반 유래 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포는 흑질 치밀부로 직접 이동하지 않고, 흑질 치밀부에 존재하는 줄기세포를 도파민 신경세포로 분화하도록 자극하는 것을 특징으로 하는 흑질 치밀부 내 도파민 신경세포 재생용 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 신경 전구세포는 네스틴(nestin), Dcx, Sox1 및 HuD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 폴리에틸렌이민 또는 폴리-D-라이신이 코팅된 배양 접시에서 태반 유래 줄기세포를 배양하였을 때 줄기세포가 배양접시 표면에 부착하지 않고 서로 응집하여 형성된 타원체 형상의 응집세포들 또는 상기 타원체 형상의 응집 세포들을 배양하여 수득된 태반 유래 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포를 함유하는, 흑질선조 회로 회복용(복구용) 조성물,

   여기서 상기 타원체 형상의 응집 세포들 또는 상기 태반 유래 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포는 흑질 치밀부로 직접 이동하지 않고, 흑질 치밀부에 존재하는 줄기세포를 도파민 신경세포로 분화하도록 자극하는 것을 특징으로 하는 흑질선조 회로 회복용(복구용) 조성물.
10. 제9항에 있어서, 상기 신경 전구세포는 네스틴(nestin), Dcx, Sox1 및 HuD로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
11. 삭제
12. 삭제

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