CN110468099B - 一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用 - Google Patents

一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种骨髓间充质干细胞培养基，属于干细胞及细胞体外培养扩增技术领域，所述培养基包括以下浓度的组分：Dulbecco改良MEM培养基体积百分含量52％～53％、MCDB培养基体积百分含量38％～42％、ITS细胞培养添加物1X、亚油酸8～12μg/mL、人血清白蛋白40～60μg/mL、青霉素和链霉素1X、左旋抗坏血酸75～125μM、胎牛血清体积百分含量1％～3％、地塞米松10～15μM、血小板源性生长因子12～18ng/mL和促生长因子8～12ng/mL。采用本发明的培养基培养后，骨髓间充质干细胞bMSC的克隆化培养成功率增加，传代次数增加，细胞纯度较高，细胞的原始性增加。

Description

一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞及细胞体外培养扩增技术领域，尤其涉及一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用。
背景技术
干细胞的临床治疗需要合适的种子细胞。目前研究较多的胚胎干细胞ESC，是最早被分离得到的多能干细胞，体外培养可保持稳定增殖能力，具有向多个胚层方向分化的潜能。但是胚胎干细胞一般是来自于异源性组织的细胞，有免疫排斥的风险。虽然已经有成体细胞核移植获得的ESC，可避免免疫排斥反应，但依然存在在体内有形成畸胎瘤的风险，并且ESC的伦理学争议较多。
自体组织中，骨髓中含有多中干细胞已被多次报道，且有多例临床报道骨髓干细胞移植可帮助治疗其他非造血系统疾病。同时，骨髓干细胞恶性转化仅有体外实验报道，体内实验尚未见恶性转化。骨髓中目前已经分离得到的干细胞包括HSC,bMSC，MAPC，MIAMI等，其中，MSC，MAPC，MIAMI等均具有向多个胚层方向分化的潜能。
但是，bMSC是来源于骨髓的间充质干细胞，其细胞成分复杂，自我更新能力较低，同时，bMSC体外增殖能力一般，其后续应用于临床细胞治疗也受到限制。综上所述：病人自体的骨髓中存在bMSC，且骨髓来源的bMSC体外可向三胚层方向分化，有巨大的临床应用潜能。所以有必要培养一种比较纯化的bMSC，并实现其在体外的长期扩增培养。
常规的骨髓间充质干细胞培养基配方为10％胎牛血清，1％青霉素链霉素双抗，低糖DMEM。用这种培养基培养骨髓间充质干细胞，一般传代到第5代，细胞会出现分化，衰老。因而，目前需要一种能够实现人骨髓间充质干细胞的体外长期扩增培养。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用，该培养基能够实现人骨髓间充质干细胞的体外长期扩增培养。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种骨髓间充质干细胞培养基，包括以下浓度的组分：Dulbecco改良MEM培养基体积百分含量52％～53％、MCDB培养基体积百分含量38％～42％、ITS细胞培养添加物1X、亚油酸8～12μg/mL、人血清白蛋白40～60μg/mL、青霉素和链霉素1X、左旋抗坏血酸75～125μM、胎牛血清体积百分含量1％～3％、地塞米松10～15μM、血小板源性生长因子12～18ng/mL和促生长因子8～12ng/mL。
优选的，所述骨髓间充质干细胞培养基，包括以下浓度的组分：体积百分含量为52.7％的Dulbecco改良MEM低糖培养基、体积百分含量为40％的MCDB培养基、ITS细胞培养添加物1X、亚油酸10μg/mL、人血清白蛋白50μg/mL、青霉素和链霉素1X、左旋抗坏血酸100uM、体积百分含量为2％的胎牛血清、地塞米松10μM、血小板源性生长因子15ng/mL和促生长因子10ng/mL。
本发明还提供了上述方案所述骨髓间充质干细胞培养基在间充质干细胞传代培养中的应用。
优选的，所述骨髓间充质干细胞包括人骨髓间充质干细胞。
优选的，所述应用包括以下步骤：将骨髓间充质干细胞接种于上述方案所述骨髓间充质干细胞培养基中进行培养，培养至骨髓间充质干细胞密度为70％～80％汇合时进行传代。
优选的，用于传代的骨髓间充质干细胞的接种密度为100～500cells/mL。
优选的，用于传代的骨髓间充质干细胞的接种密度为300～500cells/mL。
本发明的有益效果：本发明提供了一种骨髓间充质干细胞培养基，包括以下浓度的组分：Dulbecco改良MEM培养基体积百分含量52％～53％、MCDB培养基体积百分含量38％～42％、ITS细胞培养添加物1X、亚油酸8～12μg/mL、人血清白蛋白40～60μg/mL、青霉素和链霉素1X、左旋抗坏血酸75～125μM、胎牛血清体积百分含量1％～3％、地塞米松10～15μM、血小板源性生长因子12～18ng/mL和促生长因子8～12ng/mL。采用本发明的骨髓间充质干细胞培养基培养后，人骨髓间充质干细胞bMSC的克隆化培养成功率增加，传代次数增加，细胞纯度较高，细胞的原始性增加。bMSC用常规培养基培养，体外传代至第7代，细胞出现显著的形态变化，从比较均一的梭型形态变为长梭型，核质比下降，遮光性降低，凋亡数目增加。干细胞的多能性指标OCT-4，SOX-2，NANOG的表达减弱甚至消失。骨髓间充质干细胞的标志性分子如CD29，CD44，CD90的阳性率也呈现下降趋势。采用本发明的骨髓间充质干细胞培养基培养，传代至20代时，细胞依然维持典型的短梭型，核质比大，干细胞多能性指标表达水平较高，骨髓间充质干细胞纯度增加。
附图说明：
图1表示实施例1中常规培养基和本发明骨髓间充质干细胞培养基用于人骨髓间充质干细胞培养中的情况；其中图1-A，图1-A1为原代培养；图1-B，图1-C以及图1-B1，图1-C1：克隆化培养后细胞更为纯化，形态均一；图1-A，图1-B，图1-C使用的是实验组中的本发明骨髓间充质干细胞培养基；图1-A1，图1-B1，图1-C1使用的是对照组中的常规培养基；
图2表示实施例3中实验组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中多能性基因的表达情况；
图3表示实施例3中对照组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中多能性基因的表达情况；
图4表示实施例4中流式细胞术检测实施例1中不同培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中凋亡细胞的形成情况；
图5表示实施例5中对实施例1中不同培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞的表达谱高通量测序结果；其中ESC表示胚胎干细胞表达谱高通量测序结果；实验组表示实施例1中实验组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞表达谱高通量测序结果；对照组表示实施例1中对照组培养后第7代人骨髓间充质干细胞表达谱高通量测序结果。
具体实施方式
本发明提供了一种骨髓间充质干细胞培养基，包括以下浓度的组分：Dulbecco改良MEM培养基体积百分含量52％～53％、MCDB培养基体积百分含量38％～42％、ITS细胞培养添加物1X、亚油酸8～12μg/mL、人血清白蛋白40～60μg/mL、青霉素和链霉素1X、左旋抗坏血酸75～125μM、胎牛血清体积百分含量1％～3％、地塞米松10～15μM、血小板源性生长因子12～18ng/mL和促生长因子8～12ng/mL；优选的，所述骨髓间充质干细胞培养基包括以下浓度的组分：体积百分含量为52.7％的Dulbecco改良MEM培养基、体积百分含量为40％的MCDB培养基、ITS细胞培养添加物1X、亚油酸1mg/mL、人血清白蛋白5mg/mL、青霉素和链霉素1X、左旋抗坏血酸0.1mM、体积百分含量为2％的胎牛血清、地塞米松0.5μM、血小板源性生长因子15ng/mL和促生长因子10ng/mL。
本发明所述培养基能够提供低糖培养环境，降低细胞的内代谢比率，从而更好的维持了干细胞的自我更新能力。FBS是细胞培养的必需成分，但FBS又具有诱导干细胞分化的风险，所以本发明中使用了较低浓度的FBS。ITS成分包括IGF，转铁蛋白，亚硒酸钠等，对于干细胞的生长维持均起着重要的维持作用。而PDGF-BB的使用，对骨髓来源的干细胞生长无疑是一种更加优良的微环境条件。再次单独使用IGF对细胞的扩增速度有提高作用。本发明，通过合理设置组分多种添加成分，模拟了人骨髓间充质干细胞的体内环境，从而为骨髓来源的间充质干细胞的分离培养及体外长期扩增构建了良好的基础。
本发明中，所述Dulbecco改良MEM低糖培养基、MCDB培养基、ITS细胞培养添加物、亚油酸、人血清白蛋白、青霉素和链霉素、左旋抗坏血酸、胎牛血清、地塞米松、血小板源性生长因子和促生长因子来源于市售。本发明具体实施过程中，所述Dulbecco改良MEM培养基(DMEM(LG))、胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素(Pen/Strep)购自于Gibco公司，本发明青霉素链霉素混合溶液(100×双抗)中青素的含量优选为10kU/m，链霉素的含量优选为10mg/m；所述青霉素链霉素混合溶液优选的采用0.9％NaCl或PBS配制；所述MCDB培养基(MCDB)、ITS细胞培养添加物(ITS)、亚油酸(LA)、左旋抗坏血酸(LAA)、地塞米松(Dex)和促生长因子(IGF-I)购自于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma)；所述人血清白蛋白(HSA)购自于上海联硕生物科技有限公司(SAGA)；所述血小板源性生长因子(PDGF)购自于美国R&D公司(R&D)。
本发明还提供了上述方案所述骨髓间充质干细胞培养基在骨髓间充质干细胞传代培养中的应用；所述骨髓间充质干细胞优选的包括人骨髓间充质干细胞；所述骨髓间充质干细胞优选为纯化的骨髓间充质干细胞；所述纯化的骨髓间充质干细胞来源于市售或者经制备获得，本发明对纯化的骨髓间充质干细胞的制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明所述应用优选的包括以下步骤：将骨髓间充质干细胞接种于上述方案所述骨髓间充质干细胞培养基中进行培养，培养至骨髓间充质干细胞密度为70％～80％汇合时进行传代。
本发明中，所述骨髓间充质干细胞的接种密度优选为300～500cells/mL；所述培养的温度优选为37℃；本发明在传代前，优选的还依次包括去除培养基、对骨髓间充质干细胞进行洗涤、对骨髓间充质干细胞进行消化处理、终止消化和制备单细胞重悬液；所述洗涤采用的试剂优选为PBS；所述消化处理的试剂优选为0.05％Trypsin-EDTA；所述终止消化的试剂优选为胎牛血清；用于传代的骨髓间充质干细胞的接种密度优选为50～500cells/ml，更优选为100～400cells/ml，最优选为200～300cells/ml。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1分析常规培养基和本发明骨髓间充质干细胞培养基用于骨髓间充质干细胞培养中的情况
对照组采用常规培养基，常规培养基的组分为：10％胎牛血清(体积百分比)，1％青霉素链霉素双抗(体积百分比)，低糖DMEM；实验组采用本发明骨髓间充质干细胞培养基，实验组培养基组方详见表1。
表1实验组培养基组方
两种培养基分别进行原代培养和传代培养。
1.原代培养：
临床患者来源的骨髓，对其进行PBS冲洗2次，使用4℃预冷的0.16M Tris-NH4Cl破红处理5min，1000转/分离心5min，去除裂解后红细胞，PBS洗去多余的Tris-NH4Cl，加入少量培养基均匀分散后，剩余单个核细胞置于100ng/ml FN预先处理过的细胞培养皿底部。CO2培养箱(饱和湿度；95％air-5％CO2；37℃)中培养3天后全量换液，PBS冲洗去除悬浮未贴壁细胞，以后每3天半量换液1次，约10天左右达100％汇合后，0.25％Trypsin-EDTA消化成单细胞悬液，1:2进行传代，采用相同的培养基继续培养。
原代培养的骨髓细胞经过1周增殖后，进行克隆化培养获得较为纯化的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell，bMSC)。
使用有限稀释法接种第二代bMSC至96孔板，每孔接种数为1～5个/孔，继续培养并观察接种后细胞生长情况，约1周后约10％培养孔出现细胞增殖克隆，依次扩大培养至24孔板，6孔板，6cm培养皿，10cm培养皿。对克隆化培养后获得的细胞进行常规冻存和后续培养。原代培养后的人骨髓间充质干细胞。
2.传代培养：细胞长至70％～80％汇合时传代，用吸管吸去培养瓶(或培养板)内培养液，PBS充分洗涤后，用0.05％Trypsin-EDTA消化至大部分细胞从底壁脱落后，加入含有胎牛血清的培养液终止消化，用吸管轻轻吹打成单细胞悬液，计数后以300cells/ml的密度接种至另一培养瓶(皿)中继续培养。
3.培养结果参见图1，其中图1-A，图1-A1：原代培养。图1-B,图1-C以及图1-B1，图1-C1：克隆化培养后细胞更为纯化，形态均一。其中图1-A，图1-B，图1-C使用的是实验组中的本发明骨髓间充质干细胞培养基。图1-A1，图1-B1，图1-C1使用的是对照组中的常规培养基。由图1可以看出实验组形态均一，均为短梭型。对照组细胞形态各异。
实施例2流式细胞术检测bMSC特异性标记
分别取实施例1中实验组和对照组对数生长期的bMSC细胞，PBS清洗细胞三次，0.05％Trypsin消化细胞，培养基终止消化并吹打至获得单细胞悬液；取约105～106细胞，分别按抗体说明书加入相应检测量的荧光标记抗体(CD34-FITC，CD45-FITC，CD106-FITC，CD44-FITC，HLA-1-FITC；CD90-FITC，CD29-PE,)和相应的同型对照抗体，混匀，室温避光放置30min。加入2ml PBS，1000g离心5min，弃上清，加入300μl PBS重悬细胞。流式细胞仪检测，以Cell quest软件获取细胞，分析阳性细胞百分比。分析结果参见表2。流式细胞仪检测细胞表面标记物显示：分离得到的骨髓间充质干细胞CD34、CD45阴性，CD44、CD106、CD29、CD90阳性。实验组培养基在体外培养过程中，可长时间维持骨髓间充质干细胞的特性。
表2流式细胞术检测实验组和对照组中骨髓间充质干细胞克传代培养后相关干细胞标记物的表达情况
实施例3bMSC的多能性基因表达鉴定(RT-PCR检测)
1.细胞总RNA的抽提：使用TRIzol总RNA抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，分别抽取实施例1实验组和对照组制备的骨髓间充质干细胞细胞扩增第7代时的总RNA，分光光度计测抽提的RNA纯度与量，保存于-70℃。
2.cDNA的合成：采用25μl反应体系：细胞RNA样品2μg，随机引物或Oligo dT-AdaptorPrimer 3μl，Rnase Free ddH2O 10μl。70℃，10min。冰上骤冷，1min。短暂离心。加入10mM dNTP 1.5μl，Rnase Inhibitor 0.5μl(25units),M-MMLV ReverseTranscriptase1μl(200units)，5×RNA PCR Buffer5μl，Rnase Free ddH2O 4μl，轻弹，PCR仪中37℃，100min。反应结束后，混匀，-20℃贮存，备用。
3.PCR反应：采用50μl反应体系，包括cDNA模板0.5μl，10mM dNTP0.5μl，Taq酶0.5μl，上游PCR引物0.5μl，下游PCR引物0.5μl，PCR缓冲液5μl(10×)，以ddH2O补足50μl反应体系。所用引物如表3所示：(由上海英骏生物技术有限公司合成)。
表3PCR反应所用引物
检测结果参见图2和图3，其中图2表示实验组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中多能性基因的表达情况；图3表示对照组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中多能性基因的表达情况。结果表明实验组培养基培养有利于多能性基因Oct4，Sox2，Nanog的表达，而对照组培养基培养到第7代的时候多能性基因的表达下降较明显。
实施例4流式细胞术检测实施例1中不同培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中凋亡细胞的形成情况
取对数生长期的第7代人骨髓间充质干细胞，PBS清洗细胞三次，
0.05％Trypsin/EDTA消化细胞，培养基终止消化并用洗管反复吹打至获得单细胞悬液。4℃预冷的70％乙醇固定10min。PBS洗涤3min×3次。37度，1mg/ml的RNAase处理细胞20min。PBS洗涤3min×3次。40μg/ml的细胞周期检测所用标记物碘化吡啶PI，4"C，避光，染色30min～60min。200ulPBS悬浮细胞，4℃避光存放，流式细胞仪488nm波长光源检测。
流式细胞仪检测PI标记的第7代人骨髓间充质干细胞细胞周期表明，在实验组细胞周期中处于静止期或增殖准备期(G0/G1期)的比例均在80％以上，凋亡细胞的比例为5％以下。
检测结果参见图4，其中上边的图表示流式细胞术检测实施例1中实验组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中凋亡细胞的形成情况，凋亡细胞的百分比为5.43％；下边的图表示实施例1中对照组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞中凋亡细胞的形成情况，凋亡细胞的百分比为14.77％。从上述实验结果可以看出，实验组培养基在体外培养过程中细胞凋亡数目较对照组显著降低。
实施例5对实施例1中不同培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞的表达谱高通量测序结果
为了分析实验组人骨髓间充质干细胞相对于常规培养的MSC细胞的特异性基因表达特征，我们采用GEO数据库中的人MSC细胞Human Genome U133 CHIP 2.0PLUS芯片检测数据(GSM866168，GSM866169，GSM866170)与我们自行检测的人骨髓间充质干细胞的基因表达谱数据进行了对比研究，并且以人胚胎干细胞H1 Human Genome U133 CHIP 2.0PLUS芯片检测数据(GSM661349，GSM661350，GSM661351)作为对照。运用聚类分析法研究发现，我们检测的采用本专利培养基培养的人骨髓间充质干细胞的基因表达谱数据在3次生物学重复中具有良好的一致性，并且与MSC细胞和ESC均具有良好的区分度(图5)，证实我们培养的人骨髓间充质干细胞表达谱显著不同于未经处理的MSC细胞，提示我们的人骨髓间充质干细胞经过实验组培养基培养及单克隆化处理筛选获得了一种新的细胞亚群，显著区别于传统方法建立的MSC细胞。随后我们采用主成分分析法分析实验组人骨髓间充质干细胞、传统方法培养的MSC及ESC细胞全基因组表达谱特征的相关性，结果发现实验组人骨髓间充质干细胞基因表达特征介于MSC及ESC两种细胞之间(图5)。这一结果提示实验组人骨髓间充质干细胞可能具有相对于传统的MSC更好的体外增殖能力，并且在基因特征上相比MSC更倾向于ESC，后者则是具有目前具有最强自我更新和体外增殖能力的干细胞。
测序结果参见图5。其中ESC表示胚胎干细胞表达谱高通量测序结果；实验组表示实施例1中实验组培养基培养后第7代人骨髓间充质干细胞表达谱高通量测序结果；对照组表示实施例1中对照组培养后第7代人骨髓间充质干细胞表达谱高通量测序结果。由图5可以看出，与对照组的常规培养基相比，经实验组中本发明的骨髓间充质干细胞培养基培养后，bMSC的表达谱更接近胚胎干细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 海门生原干细胞科技有限公司
<120> 一种骨髓间充质干细胞培养基及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
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cgtgaagctg gagaaggaga agctg 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagggccgc agcttacaca tgttc 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaaatggg aggggtgcaa aagagg 26
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgcgtgagt gtggatggga ttggtg 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tttggaagct gctggggaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatgggagga ggggagagga 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccatgttcgt catgggtgtg aacca 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccagtagag gcagggatga tgttc 25
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccgcttctc agagctacag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagactggcg ttttcctctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtgggtggag aggagaacaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttcctccctc aggaacaatg 20

Claims (5)

1.一种骨髓间充质干细胞培养基在骨髓间充质干细胞传代培养中的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞培养基由以下浓度的组分组成：Dulbecco改良MEM低糖培养基体积百分含量52.7％、MCDB培养基体积百分含量40％、ITS细胞培养添加物1X、亚油酸10μg/mL、人血清白蛋白50μg/mL、青霉素和链霉素1X、左旋抗坏血酸100uM、胎牛血清体积百分含量2％、地塞米松0.5μM、血小板源性生长因子15ng/mL和促生长因子10ng/mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨髓间充质干细胞包括人骨髓间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：将骨髓间充质干细胞接种于权利要求1所述骨髓间充质干细胞培养基中进行培养，培养至骨髓间充质干细胞密度为70％～80％汇合时进行传代。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于传代的骨髓间充质干细胞的接种密度为100～500cells/mL。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，用于传代的骨髓间充质干细胞的接种密度为300～500cells/mL。
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