CN109731096A

CN109731096A - 一种用于治疗犬细小病毒病的组合物及其制备方法

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Publication number: CN109731096A
Application number: CN201811652967.2A
Authority: CN
Inventors: 李东升; 王丙云; 陈胜锋; 陈志胜; 丁毅力
Original assignee: Guangdong Victoria Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Victoria Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明提供了一种用于治疗犬细小病毒病的组合物，其包括：犬脂肪间充质干细胞、犬脂肪间充质干细胞培养上清液和犬干扰素。本发明的组合物能够有效地治疗犬细小病毒病。

Description

一种用于治疗犬细小病毒病的组合物及其制备方法

技术领域

本发明属于动物医药领域，具体涉及一种用于治疗犬细小病毒病的组合物及其制备方法。

背景技术

细小病毒病是由犬细小病毒感染幼犬所惹起的一种急性传染病。临床上有两种表现型：出血性肠炎型以猛烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少为主要特征；心肌炎型则以忽然死亡为特征。无论哪种表现型，其临床表现均以发病率高、死亡率高和传染性强为特性。现尚未有针对细小病毒的特效药物。

干细胞(stem sell，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)和多向分化潜能的原始未分化细胞，是形成不同组织器官和个体的始祖细胞，能够在一定条件下分化成多种功能细胞，医学界称之为“万用细胞”。

发明内容

本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种使用方便、能够有效治疗犬细小病毒病的组合物。

本发明的另一个目的是提供上述组合物的制备方法。

为此，本发明提供了一种用于治疗犬细小病毒病的组合物，其包括：犬脂肪间充质干细胞、犬脂肪间充质干细胞培养上清液、犬干扰素。

作为一种优选的实施方式，所述的犬脂肪间充质干细胞是传代培养的P2-P8犬脂肪间充质干细胞，更优选为P6代犬脂肪间充质干细胞。

优选地，基于所述犬脂肪间充质干细胞培养上清液与犬干扰素的总体积，每毫升加入 10±5×10⁵个所述犬脂肪间充质干细胞。

优选地，所述犬脂肪间充质干细胞培养上清液与所述犬干扰素的体积比为1：2至5：1。

优选地，所述犬干扰素为30-50万U/mL的市售犬干扰素制剂。

优选地，所述犬脂肪间充质干细胞同时表达以下表面标记：CD29、CD44、CD73、CD90、 CD105。

在另一优选例中，所述犬脂肪间充质干细胞同时不表达以下表面标记：CD34、CD45。

本发明还提供了所述用于治疗犬细小病毒病的组合物的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：制备犬脂肪间充质干细胞；

步骤2：制备犬脂肪间充质干细胞培养上清液；

步骤3：将所述犬脂肪间充质干细胞培养上清液和所述犬干扰素混匀，再加入所述犬脂肪间充质干细胞，制得所述组合物。

作为一种优选的实施方式，所述步骤1包括：用I型胶原酶消化犬脂肪组织，消化后所得消化液过滤，滤液离心，弃上清，即得犬脂肪间充质干细胞。

进一步地，将犬脂肪间充质干细胞于37℃、5％CO₂条件下培养24h后换液，以后每3天换一次液，直至细胞长满进行传代培养。更优选地，用犬脂肪间充质干细胞培养液培养犬脂肪间充质干细胞。该犬脂肪间充质干细胞培养液的成分为含10％v/v胎牛血清、1％wtL-谷氨酰胺的DMEM。

作为一种优选的实施方式，所述步骤2包括：当根据步骤1分离培养的犬脂肪间充质干细胞培养至融合度为至少80％，用PBS清洗后，加入无血清培养基，于37℃、5％CO₂条件下培养72h后，将无血清的细胞上清液收集并以3000g、4℃条件离心30min，去除细胞上清液中的细胞残渣，然后离心、过滤，获得纯净的细胞上清液，即为犬脂肪间充质干细胞培养上清液。

犬脂肪间充质干细胞是存在于脂肪组织中的间充质干细胞，属于具有多向分化潜能的多能干细胞。间充质干细胞起源于中胚层，广泛分布于不同动物的脂肪组织中。间充质干细胞具有来源广泛、取材方便、获得率高、体外增殖能力强、对动物损伤小、机体储备量大、免疫原性低等优点，可作为组织工程的种子细胞。自发现以来，已成为干细胞领域中最常应用的成体干细胞之一。

脂肪间充质干细胞通过自分泌和旁分泌作用，促进血液中造血干细胞的的形成和分化，促进血液中白细胞的生成。犬脂肪间充质干细胞具有免疫调节功能，能够刺激IL-2和IFN- α的产生，从而抑制细小病毒，显著提高生活质量。

实验结果表明，与现有的其他治疗药物/治疗手段相比，本发明的组合物能够有效地治疗犬细小病毒病。

附图说明

图1是犬脂肪间充质干细胞形态图。

图2是犬脂肪间充质干细胞成骨分化后茜素红染色鉴定图。

图3是犬脂肪间充质干细胞成脂分化后油红O染色鉴定图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。

如未特别指出，本发明所使用的试剂均为现有试剂，可通过商业渠道获得。出于简要目的，部分技术操作并未具体描述细节，但应理解，这些操作都在本领域技术人员所熟知的范围内，其可以根据本说明书中所记载的内容予以实现。

实施例1-犬脂肪间充质干细胞的制备

(1)犬脂肪间充质干细胞的分离培养

取犬(健康成年犬，无狂犬病病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、犬细小病毒、犬冠状病毒、真菌及细菌感染。)腹部脂肪组织约1cm³，用含5％v/v双抗(含有青霉素(10,000IU)和链霉素(10,000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。)的PBS清洗干净，然后剪碎，转移至离心管中，加入浓度为1mg/mL的I型胶原酶，于37℃培养箱中消化1h，消化后所得消化液用100目细胞筛过滤，滤液离心5min，弃上清，加入犬脂肪间充质干细胞培养液(含10％v/v胎牛血清、1％wt L-谷氨酰胺的DMEM)混匀，制成细胞悬液，接种至细胞培养皿中。

将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后换液，以后每3天换一次液，直至细胞长满进行传代培养。

第6代犬脂肪间充质干细胞的形态如图1所示。

(2)犬脂肪间充质干细胞的成脂成骨分化

成骨分化：将传代后的脂肪间充质干细胞接种于6孔板中，待达到90％融合后，吸去旧培养基，换用脂肪间质干细胞成骨诱导完全培养液(广州赛业科技，HUXMD-90021)，每3 天换液1次，共诱导8-14天，茜素红染色鉴定钙结节的形成。结果如图2所示。

成脂分化：将传代后的脂肪间充质干细胞接种于6孔板中，待达到90％融合后，吸去旧培养基，换用脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基成脂诱导完全培养液(广州赛业科技， HUXMD-90031)，每3天换液1次，共诱导8-14天，油红O染色鉴定脂滴的形成。结果如图3所示。

结果表明，该犬脂肪间充质干细胞具有分化为成骨细胞和脂肪细胞的能力。

(3)犬脂肪间充质干细胞的流式分析

调整2×10⁵个细胞/mL/管，每管加入PE或FITC标记的单抗CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD45及同型对照各10μL，4℃避光处理30min，PBS洗涤后用多聚甲醛固定5min，流式细胞仪检测并分析结果，结果见表1。

表1：犬脂肪间充质干细胞的流式分析结果

表面标记

CD29

CD44

CD73

CD90

CD105

CD34

CD45

结果

96.2％

91％

99.1％

96.2％

99.3％

0.7％

1.1％

由表1结果可见，该犬脂肪间充质干细胞表达以下表面标记：CD29、CD44、CD73、CD90、 CD105，几乎不表达CD34和CD45表面标记。

实施例2-犬脂肪间充质干细胞培养上清液的制备

当根据实施例1分离培养的犬脂肪间充质干细胞培养至融合度为80％左右，用PBS清洗3遍后，加入无血清培养基(基础培养基DMEM，Gibco)，置于37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中培养72h后，将无血清的细胞上清液收集到离心管中，3000g、4℃离心30min，去除细胞上清液中的细胞残渣。离心后通过0.22μm滤膜进行无菌过滤。获得纯净的细胞上清液，即为犬脂肪间充质干细胞培养上清液。

经检测，该犬脂肪间充质干细胞培养上清液的蛋白质浓度为1～8mg/mL。

该犬脂肪间充质干细胞培养上清液中含有多种生物活性因子，包括但不限于干细胞因子 (SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)、白介素(IL)、抗炎因子、转化生长因子、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白和溶菌酶中的任意一种或多种。

实施例3-用于治疗犬细小病毒病的组合物的制备

本发明的用于治疗犬细小病毒病的组合物包括根据实施例1制备的犬脂肪间充质干细胞、根据实施例2制备的犬脂肪间充质干细胞培养上清液和犬干扰素。将犬脂肪间充质干细胞培养上清液和犬干扰素按量混合均匀后，再将犬脂肪间充质干细胞加入，即可制得本发明的用于治疗犬细小病毒病的组合物。

该组合物中，犬脂肪间充质干细胞培养上清液、犬干扰素的体积比为1：2至5：1。

该组合物中，按照犬脂肪间充质干细胞培养上清液与犬干扰素的体积之和，每毫升加入 10±5×10⁵个犬脂肪间充质干细胞。

本发明的犬脂肪间充质干细胞优选是传代培养的P2-P8代犬脂肪间充质干细胞。最优选为P6代犬脂肪间充质干细胞。

优选地，犬干扰素为30-50万U/mL的市售犬干扰素制剂。

以下是本发明的用于治疗犬细小病毒病的组合物的几个配方实例：

实施例4–本发明的组合物用于治疗犬细小病毒病的效果观察

使用根据本发明实施例3制备的3种组合物分别对7只感染细小病毒的犬(体重为10至 50kg)进行治疗，采用静脉注射，每3天注射一次，按每kg犬体重注射1mL药物活性成分(即由犬脂肪间充质干细胞、犬脂肪间充质干细胞培养上清液和犬干扰素组成的组合物)的剂量进行给药(每次给药用注射用水补齐至100ml)，3次一个疗程。对其中6只感染细小病毒的犬进行组合物治疗；另外1只犬作为对照组，仅注射生理盐水。

在使用本发明的组合物治疗之前，用胶体金试纸条检测感染细小病毒的犬，结果为细小病毒抗原阳性，患犬的症状表现为：精神沉郁、鼻镜干燥、嗜睡、呕吐、个别患犬体温升高 40℃以上。

经过一个疗程的治疗后，6只进行组合物治疗的患犬精神有所好转，白细胞数量上升，第 3天恢复至正常，结合常规治疗(常规抗病毒治疗(细小病毒单克隆抗体)的静脉滴注，配合体内酸碱度平衡调理。)，迅速治愈细小病毒病，疗程短，效果好，且无任何不良反应。作为对照组的患犬3天后死亡。

使用本发明的组合物治疗犬细小病毒病前后的血象变化(平均值)如表2所示。

表2：使用本发明的组合物治疗犬细小病毒病前后的血象变化(平均值)

Claims

1.一种用于治疗犬细小病毒病的组合物，其包括：治疗有效量的犬脂肪间充质干细胞、犬脂肪间充质干细胞培养上清液和犬干扰素。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述犬脂肪间充质干细胞是传代培养的P2-P8犬脂肪间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，基于所述犬脂肪间充质干细胞培养上清液与犬干扰素的总体积，每毫升加入10±5×10⁵个所述犬脂肪间充质干细胞。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述犬脂肪间充质干细胞培养上清液与所述犬干扰素的体积比为1：2至5：1。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述犬干扰素为30-50万国际单位/mL的市售犬干扰素制剂。

6.权利要求1至5任一项所述组合物的制备方法，其包括以下步骤：

步骤1：制备所述犬脂肪间充质干细胞；

步骤2：制备所述犬脂肪间充质干细胞培养上清液；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括：用I型胶原酶消化犬脂肪组织，消化后所得消化液过滤，滤液离心，弃上清，即得所述犬脂肪间充质干细胞。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：将所述犬脂肪间充质干细胞于37℃、5％CO₂条件下培养24h后换液，以后每3天换一次液，直至细胞长满进行传代培养。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，用所述犬脂肪间充质干细胞培养液培养犬脂肪间充质干细胞，所述犬脂肪间充质干细胞培养液的成分为含10％v/v胎牛血清、1％wtL-谷氨酰胺的DMEM。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤2包括：当根据步骤1分离培养的犬脂肪间充质干细胞培养至融合度为至少80％，用PBS清洗后，加入无血清培养基，于37℃、5％CO₂条件下培养72h后，将无血清的细胞上清液收集并离心，去除细胞上清液中的细胞残渣，然后离心、过滤，获得纯净的细胞上清液，即为犬脂肪间充质干细胞培养上清液。