WO2022270931A1 - 조직 또는 기관으로부터 세포 분리용 조성물 - Google Patents

조직 또는 기관으로부터 세포 분리용 조성물 Download PDF

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WO2022270931A1
WO2022270931A1 PCT/KR2022/008914 KR2022008914W WO2022270931A1 WO 2022270931 A1 WO2022270931 A1 WO 2022270931A1 KR 2022008914 W KR2022008914 W KR 2022008914W WO 2022270931 A1 WO2022270931 A1 WO 2022270931A1
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cells
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organ
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PCT/KR2022/008914
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Inventor
남기택
이부현
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연세대학교 산학협력단
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a composition for isolating cells from a living tissue or organ, particularly the stomach, and a cell isolation method using the same.
  • the epithelial tissue of the stomach corresponds physiologically to a self-renewing tissue.
  • stem cells exist only in the upper part of the gastric gland, but recently, research on chief cells as stem cells existing in the lower part is being conducted. However, it was not possible to clearly distinguish and confirm its function or role.
  • the main cell is a cell that secretes pepsin and gestic lipase and is located at the base.
  • Homeostasis in the stomach depends on the balance of production and maintenance of various cell lineages, such as acid-producing parietal cells, mucus-secreting throat cells, and zymogen-secreting principal cells.
  • mucus-secreting throat cells transdifferentiate into principal cells as they migrate from the parietal cells to the base of the gastric gland.
  • One object of the present invention is to provide a composition for isolating cells from tissues or organs.
  • Another object of the present invention is to provide a method for isolating cells from tissues or organs.
  • the present invention relates to a composition for isolating cells from organs or organ-derived tissues.
  • tissue refers to a cell mass of the same type existing in an organ, and animal tissues may include connective tissue, muscle tissue, nerve tissue, epithelial tissue, etc., but are not limited thereto. .
  • the "organ” is a unit constituting the body of a multicellular organism, and refers to a structure in which various tissues gather to form an integrated structure and perform a specific function.
  • the organ is the stomach, heart, kidney, liver, spleen, pancreas, small intestine, large intestine, lung, brain, thyroid, retina, cornea, eyeball, esophagus, bladder, skin, lymph node, skeletal muscle, bone marrow, bone and teeth, etc. It may be, preferably the stomach, but is not limited thereto, and any organ constituting the human body may be included without limitation.
  • the cell may be at least one selected from the group consisting of chief cells, pit cells, parietal cells, and isthmus cells, and is preferably a chief cell.
  • the “chief cell” includes gastric chief cells, parathyroid chief cells, and type 1 chief cells found in the carotid body. It may be one or more selected from the group consisting of, but preferably may be gastric cells.
  • the "gastric chief cell” is also called a peptic cell or a gastric zymogenic cell, and is a gastric gland cell that secretes pepsinogen and gastric lipase. ), and also applies to cells that secrete chymosin in ruminants.
  • the cell separation composition may include a basic composition.
  • the basic composition is DL-dithiothreitol (DL-Dithiothreitol), monosodium phosphate (NaH 2 PO 4 ), disodium phosphate (Na 2 HPO 4 ), sodium bicarbonate (NaHCO 3 ), sodium chloride ( NaCl) and at least one selected from the group consisting of potassium chloride (KCl).
  • DL-Dithiothreitol DL-dithiothreitol
  • monosodium phosphate NaH 2 PO 4
  • disodium phosphate Na 2 HPO 4
  • sodium bicarbonate NaHCO 3
  • sodium chloride NaCl
  • KCl potassium chloride
  • the basic composition may include DL-dithiothreitol at a concentration of 0.01 to 10 mM, preferably 0.1 to 5 mM, and more preferably 0.1 to 1 mM, but is limited thereto It is not.
  • the monosodium phosphate (NaH 2 PO 4 ) may be included at a concentration of 0.1 to 10 mM, preferably 0.5 to 5 mM, and more preferably 0.1 to 2 mM, but is not limited thereto.
  • the disodium phosphate (Na 2 HPO 4 ) may be included at a concentration of 0.1 to 10 mM, preferably 0.5 to 5 mM, and more preferably 0.1 to 2 mM, but is not limited thereto.
  • the sodium bicarbonate (NaHCO 3 ) may be included at a concentration of 1 to 100 mM, preferably 5 to 50 mM, and more preferably 5 to 20 mM, but is not limited thereto.
  • the sodium chloride (NaCl) may be included at a concentration of 10 to 200 mM, preferably 20 to 100 mM, and more preferably 30 to 70 mM, but is not limited thereto.
  • the potassium chloride (KCl) may be included at a concentration of 1 to 100 mM, preferably 5 to 50 mM, and more preferably 5 to 20 mM, but is not limited thereto.
  • the basic composition may further include glucose, preferably D-(+)-glucose.
  • the glucose may be included at a concentration of 1 to 100 mM, preferably 5 to 50 mM, and more preferably 5 to 20 mM, but is not limited thereto.
  • the basic composition may further include a buffer, wherein the buffer is HEPES (Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid) buffer, TNM (Tris NaCl MgCl 2 ) buffer, PBS (Phosphate Buffered Saline) buffer, Tris-Cl buffer , Saline Sodium Citrate (SSC) buffer, Hepes EDTA Neocuproine (HEN) buffer, Tris EDTA NaCl (TEN) buffer, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • HEPES Hydroethyl piperazine Ethane Sulfonic acid
  • TNM Tris NaCl MgCl 2
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • Tris-Cl buffer Tris-Cl buffer
  • Saline Sodium Citrate (SSC) buffer Hepes EDTA Neocuproine (HEN) buffer
  • HEN Hepes EDTA Neocuproine
  • TEN Tris EDTA NaCl
  • the amount of the buffer is not particularly limited, but may be included at a concentration of, for example, 10 to 200 mM, preferably 20 to 100 mM, and more preferably 30 to 60 mM, but is not limited thereto.
  • the basic composition may further include an antibiotic, wherein the antibiotic may be gentamicin, streptomycin, penicillin G or amphotericin B, It is not limited thereto.
  • the amount of the antibiotic is not particularly limited, but may be included in an amount of, for example, 0.01 to 50 mg/ml, preferably 0.05 to 10 mg/ml, and more preferably 0.05 to 1 mg/ml. It is not limited.
  • the basic composition may include a solvent as a balance, wherein the solvent may be water, phosphate buffer solution (PBS), saline solution, or alcohol, but is not limited thereto. .
  • the solvent may be water, phosphate buffer solution (PBS), saline solution, or alcohol, but is not limited thereto.
  • the cell isolation composition of the present invention is characterized in that it contains proteinase E.
  • the "proteinase E” is an enzyme known as pancreatic endopeptidase E, the EC number is 3.4.21.70, the CAS number is 68073-27-8, It cleaves the Ala- site and belongs to the peptidases of family S1 derived from pancreatic juice.
  • the cell separation composition of the present invention may further contain at least one selected from the group consisting of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), bovine serum albumin (BSA), and collagenase. .
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • BSA bovine serum albumin
  • collagenase collagenase
  • the proteinase E may be included in a concentration of 0.1 to 10 mg/ml, preferably 1 to 5 mg/ml, and more preferably 2 to 3 mg/ml, based on the basic composition. However, it is not limited thereto.
  • the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) may be included in a concentration of 0.1 to 10 mM, preferably 1 to 5 mM, and more preferably 1 to 3 mM, based on the basic composition, but is not limited thereto.
  • the bovine serum albumin may be included in a concentration of 0.01 to 10 w/v%, preferably 0.1 to 5 w/v%, and more preferably 0.5 to 2 w/v%, based on the basic composition. However, it is not limited thereto.
  • the collagenase may be type 1 collagenase, and is 0.1 to 10 mg/ml, preferably 2 to 8 mg/ml, and more preferably 3 to 5 mg/ml based on the basic composition. It may be included at a concentration of, but is not limited thereto.
  • the cell separation composition of the present invention may further include at least one of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) and bovine serum albumin (BSA).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • BSA bovine serum albumin
  • the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) may be included in a concentration of 0.1 to 10 mM, preferably 1 to 5 mM, and more preferably 1 to 3 mM, based on the basic composition, but is not limited thereto.
  • the bovine serum albumin may be included in a concentration of 0.01 to 10 w/v%, preferably 0.1 to 5 w/v%, and more preferably 0.5 to 2 w/v%, based on the basic composition. However, it is not limited thereto.
  • the cell isolation composition of the present invention may further include at least one of calcium chloride (CaCl 2 ), magnesium chloride (MgCl 2 ), and bovine serum albumin (BSA).
  • CaCl 2 calcium chloride
  • MgCl 2 magnesium chloride
  • BSA bovine serum albumin
  • the calcium chloride (CaCl 2 ) may be included in a concentration of 0.1 to 10 mM, preferably 0.5 to 5 mM, and more preferably 0.1 to 2 mM, based on the basic composition, but is not limited thereto.
  • the magnesium chloride (MgCl 2 ) may be included in a concentration of 0.1 to 10 mM, preferably 0.5 to 5 mM, and more preferably 0.1 to 2 mM, based on the basic composition, but is not limited thereto.
  • the bovine serum albumin may be included in a concentration of 0.01 to 10 w/v%, preferably 0.1 to 5 w/v%, and more preferably 0.5 to 2 w/v%, based on the basic composition. However, it is not limited thereto.
  • a cell separation method comprising the step of isolating cells from a separated organ or organ-derived tissue using the cell isolation composition provided in the present invention.
  • the cell isolation method may include first preparing an organ or tissue isolated from a target object.
  • the subject is not particularly limited as long as it is a vertebrate, and more preferably a livestock such as a mammal, a livestock such as a bird, or a human.
  • a livestock such as a mammal
  • a livestock such as a bird
  • a human as mammalian livestock, cattle, horses, camels, llamas, donkeys, yaks, sheep, pigs, goats, deer, alpacas, dogs, raccoons, weasels, foxes, cats, rabbits, hamsters, guinea pigs, rats, mice, squirrels, and Americas raccoons, etc.
  • livestock of birds parakeets, parrots, chickens, ducks, turkeys, geese, guinea fowls (helmeted guinea fowl), pheasants, ostriches, quails, emu, etc.
  • guinea fowls helmeted guinea fowl
  • pheasants ostriches, quails, emu, etc.
  • mice cows, pigs , rabbit or human.
  • the tissue may include connective tissue, muscle tissue, nerve tissue, and epithelial tissue, but is not limited thereto.
  • the organ is stomach, heart, kidney, liver, spleen, pancreas, small intestine, large intestine, lung, brain, thyroid, retina, cornea, eyeball, esophagus, bladder, skin, lymph node, skeletal muscle, bone marrow, bone And it may be teeth, etc., preferably the stomach, but is not limited thereto, and any organ constituting the human body may be included without limitation.
  • the cell may be at least one selected from the group consisting of chief cells, pit cells, parietal cells, and isthmus cells, and is preferably a chief cell.
  • the principal cells are composed of, for example, gastric chief cells, parathyroid chief cells, and type 1 chief cells found in the carotid body. It may be one or more selected from the group, and preferably may be gastric cells, but is not limited thereto.
  • a step of treating the prepared tissue or organ with the first composition for isolating cells according to the present invention may be included.
  • the method before treating the tissue or organ with the first cell isolation composition; after; Alternatively, the method may further include immersing the tissue or organ in at least one of the second composition for cell isolation and the third composition for cell isolation according to the present invention, both before and after.
  • composition for cell isolation of the present invention chief cells, pit cells, parietal cells or isthmus cells from tissues or organs, particularly stomach tissues or organs, are separated. separation with high efficiency.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for separating chief cells, pit cells, parietal cells, and isthmus cells after each treatment in the gastric organ according to the present invention.
  • Figure 2 shows a photograph of tying the junction of the esophagus and the stomach of the mouse using a sterilized suture in Example 1.
  • Figure 3 shows a photograph of washing by immersing in a PBS solution after extracting the stomach of a mouse in Example 1.
  • Figure 4 shows a photograph after turning the forestomach of the mouse excised with a sterilized cotton swab in Example 1 so that the gastric mucosa is exposed to the outside.
  • Example 5 shows a photograph after tying the fundus of the inverted stomach with a sterilized suture in Example 1 so that the mucous membrane is exposed to the outside.
  • FIG. 6 shows a photograph of injecting a solution for first cell isolation using an insulin syringe into a forestomach region of a mouse in Example 1.
  • Example 7 is a photograph showing a fraction 1 solution obtained by immersing the stomach in the second cell isolation solution in Example 1 and stirring for 30 minutes at a speed of 60 RPM in a 37 ° C incubator.
  • FIG. 8 shows a photograph of obtaining a fraction 2 solution by taking the stomach out of the fraction 1 solution in Example 1, immersing it in a third cell separation solution and stirring for 30 minutes under the same conditions.
  • Figure 9 shows a photograph of the fraction 5 solution in Example 1 passing through a 100 ⁇ m sieve filter.
  • FIG. 10 shows a photograph in which the main cells were precipitated by centrifugation of the Fraction 5 solution passed through the sieve filter in Example 1.
  • H&E hematoxylin & eosin
  • the present invention relates to cell isolation for research on the function and role of chief cells present in conventional gastric glands.
  • the present invention exposes the gastric mucosa to the outside, unlike conventional methods, and specifically separates only the main cells.
  • the main cells isolated by the method of specifically isolating only the main cells can differentiate into all lineages, especially parietal cells, which have been difficult to differentiate in the past, thereby providing an important foothold in the development of therapeutic compositions related to gastrointestinal diseases.
  • a basic solution was prepared by adding each component in the composition shown in Table 1 to sterilized tertiary distilled water.
  • a first cell isolation solution was prepared by adding the components shown in Table 2 to the basic solution prepared in Preparation Example 1.
  • the solution thus prepared was used after filtering with a sterile cellulose acetate membrane filter having a pore size of 0.22 ⁇ m before use.
  • working concentration 1st Cell Separation Solution
  • EDTA 2mM/basic solution
  • BSA 1w/v% / basic solution
  • Proteinase E 2.5mg/ml basic solution
  • Collagenase Type 1 4mg/ml basic solution
  • a second cell separation solution was prepared by adding the components shown in Table 3 to the basic solution prepared in Preparation Example 1.
  • the solution thus prepared was used after filtering with a sterile cellulose acetate membrane filter having a pore size of 0.22 ⁇ m before use.
  • a third cell separation solution was prepared by adding the ingredients shown in Table 4 to the basic solution prepared in Preparation Example 1 above.
  • the solution thus prepared was used after filtering with a sterile cellulose acetate membrane filter having a pore size of 0.22 ⁇ m before use.
  • the above main cell culture solution was prepared by adding each component to the basal culture medium according to the composition shown in Table 5 below.
  • the solution thus prepared was used after filtering with a sterile cellulose acetate membrane filter having a pore size of 0.22 ⁇ m before use.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for separating chief cells, pit cells, parietal cells, and isthmus cells after each treatment in the gastric organ according to the present invention.
  • 8-week-old C57BL/6 mice were euthanized using a CO 2 chamber, the abdominal cavity was incised, and the junction of the esophagus and stomach was tied using a sterilized suture (FIG. 2).
  • the stomach was removed, it was immersed in a PBS solution and washed (FIG. 3), and the anterior part (Antrum/Pylorus) except for the fundus part was removed using scissors.
  • the forestomach part was pushed with a sterilized cotton swab and turned inside out so that the gastric mucosa was exposed to the outside (FIG. 4).
  • the incised fundus was tied with a sterile suture (FIG. 5).
  • the stomach was inflated by injecting the first cell isolation solution into the Forestomach region using an insulin syringe (FIG. 6). Thereafter, the stomach was immersed in the second cell separation solution and stirred at 60 RPM for 30 minutes in an incubator at 37 ° C (Fig. 7) (fraction 1 solution), and after 30 minutes, the stomach was taken out of the obtained fraction 1 solution to separate the third cells.
  • Fraction 5 solution was passed through a 100 ⁇ m sieve filter (FIG. 9) and centrifuged at 12000 RPM to precipitate main cells contained in the solution (FIG. 10). The supernatant was removed and only the main precipitated cells were obtained.
  • Hematoxylin & eosin (H&E) staining was performed on the gastric tissue excised from the mouse in Example 1 and the gastric tissue filtered from the Fraction 5 solution, and the results are shown in FIG. 11 .
  • Gif and GPR43 which are major cell-specific proteins, were expressed in all the isolated cells.
  • Example 1 the cells precipitated and recovered from the Fraction 5 solution obtained in Example 1 were the main cells derived from the stomach.
  • Example 1 the 8-week-old C57BL/6 mouse was euthanized using a CO 2 chamber, the abdominal cavity was incised, and the junction of the esophagus and stomach was tied using a sterile suture, and the stomach was removed and then placed in a PBS solution. Washed by immersion. Thereafter, the extracted stomach was finely chopped (chopping), cultured with EDTA, and single cells were isolated through trypsin treatment.
  • Figure 14 shows a schematic diagram of this experiment, after subcutaneously administering 5 mg of Tamoxifen 3 times to a reporter mouse (Mist1creEr; R26-tdTomato) capable of expressing RFP fluorescent protein specifically in the main cell present in the stomach. , The stomach was removed to obtain a fraction 5 solution in the same manner as in Example 1, and cells precipitated and recovered therefrom were observed under a microscope. The results are shown in FIG. 15 .
  • a reporter mouse Mist1creEr; R26-tdTomato
  • RFP fluorescent protein was expressed as a whole in the cells precipitated and recovered from the fraction 5 solution.
  • a fraction 1 solution, a fraction 3 solution, and a fraction 5 solution were obtained in the same manner as in Example 1 for germ free (GF) mice and specific pathogen free (SPF) mice. Thereafter, mRNA was extracted from cells present in each fraction solution, and expression levels of various gastric epithelial cell markers were confirmed by qRT-PCR, and the results are shown in FIG. 16 .
  • Ki67 a proliferative cell marker, in Fraction 5 solution cells derived from SPF mice and in Fraction 5 solution cells derived from GF mice, Ki67 was expressed more strongly in Fraction 5 solution cells derived from GF mice. As confirmed, it was found that the stem cell activity of the GF mouse-derived Fraction 5 solution cells was superior to that of the Fraction 5 solution cells derived from SPF mice.
  • the main cells derived from the Fraction 5 solution obtained from the SPF mouse and the GF mouse in Experimental Example 4 were cultured for 7 days after passing one passage each, and immunostaining of gastric epithelial cells differentiated from these main cells was performed. 17.
  • Example 4 After diluting the main cell pellet isolated in Example 1 in 1 ml of RPMI1640 culture medium, counting the cells, centrifuging again, mixing the cell aggregates with Matrigel (15 ⁇ l / well), dispensing in a 24-well plate, and then at 37 ° C. Incubated for 1 hour. Then, the main cell culture solution of Preparation Example 4 was added and cultured in an incubator at 37° C., 5 vol% gas CO 2 . The culture medium was freshly replaced every 2-3 days, and differentiation into other epithelial cells was observed after 5 days of culture. A photograph of the prepared gastric organoid under a microscope is shown in FIG. 18 .
  • the cell pellet isolated in Comparative Example 1 was diluted in 1 ml of RPMI1640 culture medium, the cells were counted, centrifuged again, the cell aggregates were mixed with Matrigel, and then dispensed into a 24-well plate and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Then, a culture medium (ENRGFW medium) supplemented with EGF, gastrin, FGF10, Noggin, Wnt3a, and R-spondin was added and cultured in a 37°C CO 2 incubator. The culture medium was freshly replaced every 2-3 days. A photo of the prepared gastric organoid under a microscope is shown in FIG. 19 .
  • the present invention is for the development of an effective novel separation method for chief cells, which are difficult to separate and culture in the prior art.
  • research on the function and role of the main cells present in the gastric gland is insignificant, and the need for research through a new isolation method is required.
  • the present invention exposes the gastric mucosa to the outside, unlike conventional methods, and specifically separates only the main cells.
  • the main cell isolated by the method of specifically isolating only the main cell differentiates into all lineages, especially the parietal cell, which was difficult to differentiate in the past, and is a study on the function and role of the main cell, effectively developing a therapeutic composition related to gastrointestinal diseases. expected to be used.

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Abstract

본 발명은 생체 조직 또는 기관, 특히는 위(stomach)로부터 세포를 분리하기 위한 조성물과 이를 이용하여 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다.

Description

조직 또는 기관으로부터 세포 분리용 조성물
본 발명은 생체 조직 또는 기관, 특히는 위(stomach)로부터 세포를 분리하기 위한 조성물 및 이를 이용한 세포 분리 방법에 관한 것이다.
위의 상피 조직은 생리학적으로 자가 재생 조직에 해당한다. 종래에는 위선의 상부에만 줄기세포가 존재하는 것으로 파악되었으나, 최근 하부에 존재하는 줄기세포로서 주 세포(Chief cell)에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 그 기능이나 역할에 대해 뚜렷하게 구분되어 확인할 수 없었다. 위의 루멘을 구성하고 있는 세포 형태 중, 주 세포는 펩신과 게스트릭 리파제를 분비하는 세포로서, 하부(base)에 위치한다.
위에서 항상성은 다양한 세포 계통으로 예를 들면 산 생성 벽 세포, 점액 분비 목 세포 및 지모겐 분비 주 세포의 생성 및 유지의 균형에 의존한다. 정상 위에서 점액 분비 목 세포는 벽 세포로부터 위선의 기저부로 이동하면서 주 세포로 전이 분화(transdifferentiate)한다.
벽 세포의 부재 시 주 세포 또한 소멸하는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 주 세포의 성숙을 조절하는 인자를 벽 세포가 분비할 것으로 예측되었다. 이러한 인자 및 신호 기작들을 밝히려는 많은 시도가 있었지만, 주 세포의 항상성 및 기능의 복잡한 기작을 구성하는 요소에 대한 연구는 아직까지 많이 진행된 바 없다.
따라서, 최근에는 위 벽 세포 및 주 세포 등의 상관 관계를 조사하고 위의 기작 등을 연구하기 위하여, 위 기관으로부터 이들 세포를 높은 효율로 분리할 수 있는 방법 또한 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 일 목적은 조직 또는 기관으로부터 세포를 분리하기 위한 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 조직 또는 기관으로부터 세포를 분리하는 방법을 제공하고자 한다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세 사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
1. 세포 분리용 조성물
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 기관(organ) 또는 기관 유래 조직(tissue)으로부터 세포를 분리하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 “조직(tissue)”은 장기 내에 존재하는 같은 종류의 세포 덩어리를 말하며, 동물 조직으로는 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 및 상피 조직 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 “기관(organ)”은 다세포생물의 몸을 구성하는 단위로, 여러 가지 조직이 모여 통합된 구조를 형성하고, 특정 기능을 하는 구조를 말한다. 본 발명에서 상기 기관은 위, 심장, 신장, 간, 비장, 췌장, 소장, 대장, 폐, 뇌, 갑상선, 망막, 각막, 안구, 식도, 방광, 피부, 림프절, 골격근, 골수, 뼈 및 치아 등일 수 있고, 바람직하게는 위 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 인체를 구성하는 기관이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 주 세포(chief cell), 벽공 세포(pit cell), 벽 세포(parietal cell) 및 협부 세포(isthmus cell)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 주 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 “주 세포(chief cell)”는 위 주 세포(gastric chief cell), 부갑상샘 주 세포(parathyroid chief cell) 및 경동맥체 유래 1형 주 세포(type 1 chief cells found in the carotid body)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 바람직하게는 위 주 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 “위 주 세포(gastric chief cell)”는 소화성 세포(peptic cell) 또는 위 효소원 세포(gastric zymogenic cell)이라고도 불리우며 펩시노겐 및 위장 리파아제(gastric lipase)를 분비하는 위선 세포(gastric gland cell)에 해당하며, 반추 동물에서 키모신(chymosin)을 분비하는 세포에도 해당된다.
본 발명에서 상기 세포 분리용 조성물은 기본 조성물을 포함할 수 있다.
기본 조성물
본 발명에서 상기 기본 조성물은 DL-디티오트레이톨(DL-Dithiothreitol), 모노나트륨 인산염(NaH2PO4), 디나트륨 인산염(Na2HPO4), 탄산수소 나트륨(NaHCO3), 염화 나트륨(NaCl) 및 염화 칼륨(KCl)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 기본 조성물은 DL-디티오트레이톨(DL-Dithiothreitol)을 0.01 내지 10 mM, 바람직하게는 0.1 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 모노나트륨 인산염(NaH2PO4)은 0.1 내지 10 mM, 바람직하게는 0.5 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 디나트륨인산염(Na2HPO4)은 0.1 내지 10 mM, 바람직하게는 0.5 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 탄산수소 나트륨(NaHCO3)은 1 내지 100 mM, 바람직하게는 5 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 5 내지 20 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 염화 나트륨(NaCl)은 10 내지 200 mM, 바람직하게는 20 내지 100 mM, 보다 바람직하게는 30 내지 70 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 염화 칼륨(KCl)은 1 내지 100 mM, 바람직하게는 5 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 5 내지 20 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 기본 조성물은 글루코스, 바람직하게는 D-(+)-글루코스(D-(+)-Glucose)를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 글루코스는 1 내지 100 mM, 바람직하게는 5 내지 50 mM, 보다 바람직하게는 5 내지 20 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 기본 조성물은 버퍼를 더 포함할 수 있고, 여기서 상기 버퍼는 HEPES(Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonic acid) 버퍼, TNM(Tris NaCl MgCl2) 버퍼, PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC(Saline Sodium Citrate) 버퍼, HEN(Hepes EDTA Neocuproine) 버퍼, TEN(Tris EDTA NaCl) 버퍼 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 버퍼의 양은 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 10 내지 200 mM, 바람직하게는 20 내지 100 mM, 보다 바람직하게는 30 내지 60 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 기본 조성물은 항생제를 더 포함할 수 있고, 여기서 상기 항생제는 젠타마이신(gentamicin), 스트렙토마이신(streptomycin), 페니실린 G(penicillin G) 또는 암포테리신 B(amphotericin B) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 항생제의 양은 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면 0.01 내지 50 mg/ml, 바람직하게는 0.05 내지 10 mg/ml, 보다 바람직하게는 0.05 내지 1 mg/ml의 양으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 기본 조성물은 용매를 잔부로 포함할 수 있고, 여기서 상기 용매는 물, 인산염 완충 용액(phosphate buffer solution; PBS), 생리 식염수(saline solution) 또는 알코올 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제1 세포 분리용 조성물
본 발명의 세포 분리용 조성물은 프로테이나제 E(proteinase E)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 상기 “프로테이나제 E(proteinase E)”는 췌장 엔도펩티다제 E(Pancreatic endopeptidase E)로 알려진 효소로, EC 번호가 3.4.21.70이고, CAS 번호는 68073-27-8이며, Ala- 부위를 절단하고, 췌장액 유래 패밀리 S1의 펩티다제에 속한다.
본 발명의 세포 분리용 조성물은 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA) 및 콜라게나제(collagenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 프로테이나제 E(proteinase E)는 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 1 내지 5 mg/ml, 보다 바람직하게는 2 내지 3 mg/ml의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mM, 바람직하게는 1 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 1 내지 3 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 소 혈청 알부민(BSA)은 기본 조성물에 대하여 0.01 내지 10 w/v%, 바람직하게는 0.1 내지 5 w/v%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2 w/v%의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 콜라게나제(collagenase)는 1형 콜라게나제일 수 있고, 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 2 내지 8 mg/ml, 보다 바람직하게는 3 내지 5 mg/ml의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제2 세포 분리용 조성물
본 발명의 세포 분리용 조성물은 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mM, 바람직하게는 1 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 1 내지 3 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 소 혈청 알부민(BSA)은 기본 조성물에 대하여 0.01 내지 10 w/v%, 바람직하게는 0.1 내지 5 w/v%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2 w/v%의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
제3 세포 분리용 조성물
본 발명의 세포 분리용 조성물은 염화 칼슘(CaCl2), 염화 마그네슘(MgCl2) 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA) 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 염화 칼슘(CaCl2)은 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mM, 바람직하게는 0.5 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 염화 마그네슘(MgCl2)은 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mM, 바람직하게는 0.5 내지 5 mM, 보다 바람직하게는 0.1 내지 2 mM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 소 혈청 알부민(BSA)은 기본 조성물에 대하여 0.01 내지 10 w/v%, 바람직하게는 0.1 내지 5 w/v%, 보다 바람직하게는 0.5 내지 2 w/v%의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
2. 세포 분리 방법
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 세포 분리용 조성물을 이용하여 분리된 기관(organ) 또는 기관 유래 조직(tissue)으로부터 세포를 분리하는 단계를 포함하는 세포 분리 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 세포 분리 방법은 우선 목적하는 개체로부터 분리된 기관 또는 조직을 준비하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 개체는 척추 동물이라면, 특히 제한되지 않으며, 포유류인 가축, 조류인 가축 또는 인간이 보다 바람직하다. 포유류의 가축으로서는, 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니피그, 랫트, 마우스, 다람쥐, 아메리카너구리 등을 들 수 있다. 또한, 조류의 가축으로서는, 잉꼬, 앵무새, 닭, 오리, 칠면조, 거위, 뿔닭(helmeted guinea fowl), 꿩, 타조, 메추라기, 에뮤(emu) 등을 들 수 있으나, 바람직하게는 마우스, 소, 돼지, 토끼 또는 인간일 수 있다.
본 발명에서 상기 조직(tissue)은 결합 조직, 근육 조직, 신경 조직 및 상피 조직 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 기관(organ)은 위, 심장, 신장, 간, 비장, 췌장, 소장, 대장, 폐, 뇌, 갑상선, 망막, 각막, 안구, 식도, 방광, 피부, 림프절, 골격근, 골수, 뼈 및 치아 등일 수 있고, 바람직하게는 위 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 인체를 구성하는 기관이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 세포는 주 세포(chief cell), 벽공 세포(pit cell), 벽 세포(parietal cell) 및 협부 세포(isthmus cell)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 주 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 주 세포는 예를 들면, 위 주 세포(gastric chief cell), 부갑상샘 주 세포(parathyroid chief cell) 및 경동맥체 유래 1형 주 세포(type 1 chief cells found in the carotid body)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 위 주 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 준비된 조직 또는 기관에 본 발명에 따르는 제1 세포 분리용 조성물을 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 조직 또는 기관에 상기 제1 세포 분리용 조성물을 처리하기 전; 후; 또는 전과 후 모두에, 상기 조직 또는 기관을 본 발명에 따르는 제2 세포 분리용 조성물 및 제3 세포 분리용 조성물 중 적어도 하나에 침지하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 세포 분리용 조성물을 이용하는 경우 조직 또는 기관, 특히는 위 조직 또는 기관으로부터 주 세포(chief cell), 벽공 세포(pit cell), 벽 세포(parietal cell) 또는 협부 세포(isthmus cell) 등을 높은 효율로 분리할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 위 기관에 각 처리 후 주 세포(chief cell), 벽공 세포(pit cell), 벽 세포(parietal cell) 및 협부 세포(isthmus cell)를 분리하는 방법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 멸균된 봉합사를 이용하여 마우스의 식도와 위의 접합 부위를 묶어준 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1에서 마우스의 위를 적출한 뒤 PBS 용액에 침지하여 세척하는 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 1에서 멸균된 면봉으로 적출된 마우스의 전위(Forestomach)를 밀어 위 점막이 외부로 노출되도록 뒤집어준 뒤의 사진을 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 1에서 점막이 외부로 노출되도록 뒤집어진 위의 위 저 부분(Fundus)을 멸균된 봉합사로 묶어 준 후의 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 1에서 마우스의 전위(Forestomach) 부위에 인슐린 주사기를 이용하여 제1 세포 분리용 용액을 주입하는 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 1에서 위를 제2 세포 분리용 용액에 침지하여 37도씨 인큐베이터에서 60RPM 속도로 30분간 교반 시켜 분획1 용액을 얻은 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 1에서 분획1 용액에서 위를 꺼내어 제3 세포 분리용 용액에 침지하여 동일한 조건으로 30분간 교반 시켜 분획2 용액을 얻은 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 1에서 분획5 용액을 100 μm 거름망 필터를 통과시키는 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 1에서 거름망 필터를 통과시킨 분획5 용액을 원심분리하여 주 세포를 침전시킨 사진을 나타낸 것이다.
도 11은 실험예 1에서 마우스로부터 적출된 위 조직과, 분획5 용액에서 여과된 위 조직에 대하여 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실험예 2에서 분획5 용액로부터 얻어진 세포에 Gif 와 GPR43을 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실험예 3에서 분획5 용액로부터 얻어진 세포와 비교예 1에서 분리된 세포에 대하여 다양한 위 상피 세포 마커의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실험예 3의 실험 모식도를 나타낸 것이다.
도 15는 실험예 3에서 주 세포 특이적으로 RFP 형광 단백질을 발현시킬 수 있는 리포터 마우스(Mist1creEr;R26-tdTomato)의 위로부터 얻어진 분획5 용액에서 침전 및 회수된 세포를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 16은 실험예 4에서 GF(germ free) 마우스와 SPF(specific pathogen free) 마우스의 위로부터 얻어진 분획1 용액, 분획3 용액 및 분획5 용액에 존재하는 세포에 대하여 다양한 위 상피 세포 마커의 발현 수준을 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실험예 6에서 SPF 마우스와 GF 마우스의 위로부터 얻어진 분획5 용액에서 얻어진 주 세포로부터 분화되는 위 상피 세포를 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실시예 2에서 제조된 위 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 19는 비교예 2에서 제조된 위 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 20은 실험예 7에서 분획5 용액로부터 얻어진 세포를 제조예 4의 배양 용액 또는 기존의 일반적 배양 용액에서 배양한 뒤 다양한 위 상피 세포 마커의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 종래의 위샘에 존재하는 주세포(Chief cell)의 기능과 역할에 대한 연구를 위한 세포 분리에 관한 것이다. 본 발명은 위 점막부의 위샘에 존재하는 주세포 분리를 위하여, 종래에 사용되는 방법과 달리 위 점막을 외부로 노출시켜, 주세포만을 특이적으로 분리해 내는 것이다. 주세포만을 특이적으로 분리한 방법으로 분리된 주세포는 모든 계통, 특히 종래에는 분화시키기 어렵던 벽세포(Parietal cell)까지 분화시킴으로써, 위장질환 관련 치료 조성물 개발에 중요 발판을 제공할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
[준비예 1] 기본 용액의 제조
멸균된 3차 증류수에 하기 표 1에 나타낸 조성으로 각 성분을 첨가하여 기본 용액을 제조하였다.
기본용액 성분 구조식 작업 농도
(working concentration)
젠타마이신(Gentamicin) 0.1mg/ml
DL-디티오트레이톨(DL-Dithiothreitol) HSCH2CH(OH)CH(OH)CH2SH 0.5mM
모노나트륨 인산염(Sodium phosphate monobasic) NaH2PO4 1mM
디나트륨 인산염(di-Sodium hydrogen phosphate) Na2HPO4 1mM
탄산수소 나트륨(Sodium bicarbonate) NaHCO3 10mM
염화 나트륨(Sodium chloride) Nacl 50mM
염화 칼륨(Potassium chloride) KCl 10mM
HEPES C8H18N2O4S 50mM
D-(+)-글루코스(D-(+)-Glucose) C6H12O6 10mM
[제조예 1] 제1 세포 분리용 용액의 제조
상기 준비예 1에서 제조된 기본 용액에 하기 표 2에 나타낸 성분을 첨가하여 제1 세포 분리용 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 용액은 사용 전 포어 사이즈가 0. 22 μm인 멸균의 셀룰로오스 아세테이트 막(Cellulose acetate membrane) 필터로 여과한 뒤 사용하였다.
　 성분 작업 농도
(working concentration)
제1 세포 분리용 용액 EDTA 2mM / 기본 용액
BSA 1w/v% / 기본 용액
프로테이나제 E(Proteinase E) 2.5mg /ml 기본 용액
콜라게나제 1형(Collagenase Type1) 4mg /ml 기본 용액
[제조예 2] 제2 세포 분리용 용액
상기 준비예 1에서 제조된 기본 용액에 하기 표 3에 나타낸 성분을 첨가하여 제2 세포 분리용 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 용액은 사용 전 포어 사이즈가 0. 22 μm인 멸균의 셀룰로오스 아세테이트 막(Cellulose acetate membrane) 필터로 여과한 뒤 사용하였다.
　 성분 작업 농도
(working concentration)
제2 세포 분리용 용액 EDTA 2mM / 기본 용액
BSA 1w/v% / 기본 용액
[제조예 3] 제3 세포 분리용 용액
상기 준비예 1에서 제조된 기본 용액에 하기 표 4에 나타낸 성분을 첨가하여 제3 세포 분리용 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 용액은 사용 전 포어 사이즈가 0. 22 μm인 멸균의 셀룰로오스 아세테이트 막(Cellulose acetate membrane) 필터로 여과한 뒤 사용하였다.
　 성분 구조식 작업 농도
(working concentration)
제3 세포 분리용 용액 염화 칼슘
(Calcium chloride)		 Cacl2 1mM / 기본 용액
염화 마그네슘
(Magnesium chloride)		 Mgcl2 1.5mM / 기본 용액
BSA 1% 1w/v% / 기본 용액
[제조예 4] 주 세포 배양용 용액
하기 표 5에 나타낸 조성으로 기본 배양 배지에 각 성분을 첨가하여 위의 주 세포 배양용 용액을 제조하였다. 이렇게 제조된 용액은 사용 전 포어 사이즈가 0. 22 μm인 멸균의 셀룰로오스 아세테이트 막(Cellulose acetate membrane) 필터로 여과한 뒤 사용하였다.
　 인자 작업 농도
주세포
배양 용액		 기본 배양 배지 Glutamax 1v/v% 37.35v/v%
HEPES 1mM
Penicillin-Streptomycin 100U/ml
Advanced DMEM/F-12 (Gibco, # 12634028)
Wnt3a CM 50v/v%
R-spondin CM 10v/v%
mNoggin 100ng/ml
B27 0.02v/v%
N-acetyl Cystein 1.25mM
hFGF10 100ng/ml
bFGF 100ng/ml
mEGF 25ng/ml
HGF 200ng/ml
gastrin 1uM
Y-27632 10mM
BSA 10w/v%
Insulin-Transferrin-Selenium-Sodium Pyruvate 8ug/ml
Hydrocortisone 1ug/ml
[실시예 1] 마우스 위로부터의 주 세포의 분리
도 1은 본 발명에 따라 위 기관에 각 처리 후 주 세포(chief cell), 벽공 세포(pit cell), 벽 세포(parietal cell) 및 협부 세포(isthmus cell)를 분리하는 방법의 모식도를 나타낸 것이다. 구체적인 분리 방법으로는 8주령 C57BL/6 마우스를 CO2챔버를 이용하여 안락사 시킨 뒤 복강을 절개하고, 멸균된 봉합사를 이용하여 식도와 위의 접합 부위를 묶어주었다(도 2). 위를 적출한 뒤 PBS 용액에 침지하여 세척하고(도 3), 위 저 부분(Fundus)을 제외한 전정부(Antrum/Pylorus)를 가위를 이용하여 제거하였다. 멸균된 면봉으로 전위(Forestomach) 부분을 밀어주어 위 점막이 외부로 노출되도록 뒤집어주었다(도 4). 뒤집어진 위를 제2 세포 분리용 용액에 침지하여 세척한 후 절개된 위 저 부분(Fundus)을 멸균된 봉합사로 묶어 주었다(도 5). 전위(Forestomach) 부위에 인슐린 주사기를 이용하여 제1 세포 분리용 용액을 주입하여 위를 부풀렸다(도 6). 이후, 위를 제2 세포 분리용 용액에 침지하여 37도씨 인큐베이터에서 60RPM 속도로 30분간 교반 시킨 후(도 7)(분획1 용액), 30분뒤 얻어진 분획1 용액에서 위를 꺼내어 제3 세포 분리용 용액에 침지하여 동일한 조건으로 30분간 교반 시켰다(분획2 용액). 30분뒤 분획2 용액에서 위를 꺼내어 제3 세포 분리용 용액에 침지하여 60RPM 속도로 30분간 교반 시키고(분획3 용액), 30분뒤 분획3 용액에서 위를 꺼내어 제3 세포 분리용 용액에 침지하고 동일 조건으로 교반시켰다(분획4 용액). 이후 분획4 용액으로부터 위를 꺼내어 제3 세포 분리용 용액에 침지하여 60RPM 속도로 30분간 교반 시키되, 매 5분마다 볼텍스믹서로 30초간 강하게 믹싱하였다(도 8)(분획5 용액). 얻어진 분획5 용액을 100 μm 거름망 필터를 통과시킨 뒤(도 9) 12000RPM으로 원심분리하여 용액에 포함 되어있는 주 세포를 침전시켰다(도 10). 상층액을 제거하고 침전된 주 세포만을 수득하였다.
[실험예 1]
상기 실시예 1에서 마우스로부터 적출된 위 조직과, 분획5 용액에서 여과된 위 조직에 대하여 헤마톡실린&에오신(H&E) 염색을 수행하여 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보는 바와 같이, 분획5 용액에서 여과된 위 조직에서는 대부분의 위 상피 세포들이 분리 및 제거된 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2]
상기 실시예 1에서 얻어진 분획5 용액에서 침전 및 회수된 세포를 배양하여 마우스 위 조직의 주 세포 특이적으로 발현되는 단백질로 알려진 Gif 와 GPR43을 면역 염색하여 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에서 보는 바와 같이, 분리된 세포 전체에서 주 세포 특이적인 단백질인 Gif 와 GPR43가 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 상기 실시예 1에서 얻어진 분획5 용액에서 침전 및 회수된 세포는 위 유래 주 세포인 것을 알 수 있었다.
[비교예 1]
본 발명에 따른 분리 방법의 위 주 세포 분리 효율이 뛰어남을 증명하기 위하여 이하의 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1과 같이 8주령 C57BL/6 마우스를 CO2챔버를 이용하여 안락사 시킨 뒤 복강을 절개하고, 멸균된 봉합사를 이용하여 식도와 위의 접합 부위를 묶어주어 위를 적출한 뒤 PBS 용액에 침지하여 세척하였다. 이후, 적출된 위를 잘게 다진 후(chopping) EDTA로 배양하고 트립신 처리를 통해 단일 세포를 분리하였다.
[실험예 3]
상기 실시예 1에서 얻어진 분획5 용액에서 침전 및 회수된 세포와 상기 비교예 1에서 분리된 세포로부터 RNA를 추출한 뒤 위 점막을 이루는 각 상피 세포 특이적 마커를 발현하는 지 확인하여 그 결과를 도 13에 나타내었다. 단, 도 13에서 MUC5ac는 선와 세포(foveolar cell)의 마커이고, TFF2는 목 세포(neck cell)의 마커이며, Gif 및 Mist1는 주 세포(chief cell)의 마커이고, H+K+ ATPase는 벽 세포(parietal cell)의 마커이다.
도 13에서 보는 바와 같이, 실시예 1에서 회수된 세포(#2)에서는 주 세포의 마커(Gif 및 Mist1)만 발현되는 것을 확인할 수 있었으나, 비교예 1에서 분리된 세포(#1)에서는 위 점막을 이루는 상피 세포인 선와 세포(MUC5ac), 목 세포(TFF2), 주 세포(Gif 및 Mist1) 및 벽 세포(H+K+ ATPase)의 마커가 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 본 발명에 따른 분리 방법을 이용하는 경우 위 주 세포만을 높은 효율로 분리할 수 있음을 알 수 있었다.
[실험예 4]
도 14는 본 실험의 모식도를 나타낸 것으로, 위에 존재하는 주 세포 특이적으로 RFP 형광 단백질을 발현시킬 수 있는 리포터 마우스(Mist1creEr;R26-tdTomato)에 대하여 타목시펜(Tamoxifen) 5mg을 3회 피하 투여한 뒤, 위를 적출하여 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 분획5 용액을 얻고, 이로부터 침전 및 회수된 세포를 현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에서 보는 바와 같이, 분획5 용액에서 침전 및 회수된 세포들에서 전체적으로 RFP 형광 단백질이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 분획5 용액에서 침전 및 회수된 세포는 위 유래 주 세포인 것을 알 수 있었다.
[실험예 5]
GF(germ free) 마우스와 SPF(specific pathogen free) 마우스에 대하여 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 분획1 용액, 분획3 용액 및 분획5 용액을 얻었다. 이후 각 분획 용액에 존재하는 세포에서 mRNA를 추출한 뒤, qRT-PCR로 다양한 위 상피 세포 마커의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에서 보는 바와 같이, 분획1 용액 및 분획3 용액 유래의 세포들에서는 주 세포 마커와 함께 그 외에 위 상피 세포의 마커가 발현되는 것을 확인할 수 있었으나, 분획5 용액 유래의 세포에서는 주 세포 마커가 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, SPF 마우스 유래의 분획5 용액 세포와, GF 마우스 유래의 분획5 용액 세포에서의 증식 세포 마커인 Ki67의 발현 수준을 확인한 결과, GF 마우스 유래의 분획5 용액 세포에서 Ki67가 더 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었는 바, GF 마우스 유래의 분획5 용액 세포의 줄기세포능이 SPF 마우스 유래의 분획5 용액 세포 보다 뛰어난 것을 알 수 있었다.
[실험예 6]
상기 실험예 4에서 SPF 마우스와 GF 마우스로부터 얻어진 분획5 용액 유래의 주 세포를 각각 1번의 계대(passage)를 넘기고 7일간 배양한 뒤 이러한 주 세포로부터 분화되는 위 상피 세포를 면역 염색하여 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에서 보는 바와 같이, SPF 마우스 유래의 주 세포 보다 GF 마우스 유래의 주 세포로부터 분화되는 위 상피 세포의 수가 더 많은 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 GF 마우스 유래의 주 세포가 SPF 마우스 유래의 주 세포에 비하여 줄기세포능이 더 뛰어난 것을 알 수 있었다.
[실시예 2] 위 오가노이드의 제작
상기 실시예 1에서 분리된 주 세포 펠렛을 RPMI1640 배양액 1 ㎖에 희석하여 세포 계수 후, 다시 원심 분리하여 세포 결집체를 마트리젤과 혼합하고(15 ㎕/well), 24웰 플레이트에 분주 후 37 ℃에서 1시간 배양하였다. 이후 상기 제조예 4의 주 세포 배양 용액을 첨가하고 37℃, 가스 5 부피% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양액은 2-3일 간격으로 신선하게 교체하며, 배양 5일 후 다른 상피 세포로의 분화 여부를 관찰하였다. 이렇게 제작된 위 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진을 도 18에 나타내었다.
도 18에서 보는 바와 같이, 버딩(budding) 형상의 위 오가노이드가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
[비교예 2]
상기 비교예 1에서 분리된 세포 펠렛을 RPMI1640 배양액 1㎖에 희석하여 세포 계수 후, 다시 원심 분리하여 세포 결집체를 마트리젤과 혼합하고, 24웰 플레이트에 분주 후 37℃에서 1시간 배양하였다. 이후 EGF, 가스트린, FGF10, Noggin, Wnt3a, 및 R-spondin 보충된 배양 배지(ENRGFW 배지)를 첨가하여 37℃ CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양액은 2-3일 간격으로 신선하게 교체하였다. 이렇게 제작된 위 오가노이드를 현미경으로 관찰한 사진을 도 19에 나타내었다.
도 19에서 보는 바와 같이, 원형의 위 오가노이드가 형성된 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 7]
상기 실시예 1에서 얻어진 분획5 용액에서 침전 및 회수된 세포를 제조예 4의 주 세포 배양 용액 또는 기존의 일반적인 배양 용액으로 EGF, 가스트린, FGF10, Noggin, Wnt3a, 및 R-spondin 보충된 배양 배지(ENRGFW 배지)에서 37℃, 가스 5 부피% CO2 인큐베이터에서 5일간 배양한 후 실험예 3과 같이 RNA를 추출한 뒤 위 점막을 이루는 각 상피 세포 특이적 마커를 발현하는 지 확인하여 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에서 보는 바와 같이, 제조예 4의 주 세포 배양 용액을 이용하여 배양한 경우(#2) 위 점막을 이루는 상피 세포인 선와 세포(MUC5ac), 목 세포(TFF2), 주 세포(Gif 및 Mist1) 및 벽 세포(H+K+ ATPase)의 마커가 모두 발현되는 것을 확인할 수 있었으나, 기존의 일반적인 배양 용액에서 배양한 경우(#1) 벽 세포로의 세포 분화가 일어나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 본 발명에 따른 배양 용액을 사용한 경우 위 주 세포로부터 위 점막을 이루는 상피 세포인 선와 세포, 목 세포, 주 세포 및 벽 세포로 효과적인 분화를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 종래의 분리 배양이 어려운 주세포(Chief cell)의 효과적인 신규 분리방법의 개발을 위한 것이다. 현재 위샘에 존재하는 주세포의 기능과 역할에 대한 연구가 미미하여, 새로운 분리 방법을 통한 연구의 필요성이 요구되고 있다. 본 발명은 위 점막부의 위샘에 존재하는 주세포 분리를 위하여, 종래에 사용되는 방법과 달리 위 점막을 외부로 노출시켜, 주세포만을 특이적으로 분리해 내는 것이다. 주세포만을 특이적으로 분리한 방법으로 분리된 주세포는 모든 계통, 특히 종래에는 분화시키기 어렵던 벽세포(Parietal cell)까지 분화시킴으로써, 주세포의 기능과 역할에 대한 연구로, 위장질환 관련 치료 조성물 개발에 효과적으로 이용될 것으로 기대된다.

Claims (15)

  1. 프로테이나제 E(proteinase E)를 포함하는, 기관(organ) 또는 기관 유래 조직(tissue)으로부터 세포를 분리하기 위한 세포 분리용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기관은 위(stomach)인, 세포 분리용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 주 세포(chief cell), 벽공 세포(pit cell), 벽 세포(parietal cell) 및 협부 세포(isthmus cell)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 세포 분리용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 DL-디티오트레이톨(DL-Dithiothreitol), 모노나트륨 인산염(NaH2PO4), 디나트륨 인산염(Na2HPO4), 탄산수소 나트륨(NaHCO3), 염화 나트륨(NaCl) 및 염화 칼륨(KCl)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 기본 조성물을 더 포함하는, 세포 분리용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프로테이나제 E(proteinase E)는 상기 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mg/ml의 농도로 포함되는, 세포 분리용 조성물.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 기본 조성물은 DL-디티오트레이톨(DL-Dithiothreitol) 0.01 내지 10 mM, 모노나트륨 인산염(NaH2PO4) 0.1 내지 10 mM, 디나트륨인산염(Na2HPO4) 0.1 내지 10 mM, 탄산수소 나트륨(NaHCO3)은 1 내지 100 mM, 염화 나트륨(NaCl) 10 내지 200 mM 및 염화 칼륨(KCl) 1 내지 100 mM을 포함하는, 세포 분리용 조성물.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 기본 조성물은 D-(+)-글루코스(D-(+)-Glucose), 버퍼 및 항생제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 세포 분리용 조성물.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 세포 분리용 조성물은 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA), 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA) 및 콜라게나제(collagenase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는, 세포 분리용 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)은 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mM의 농도로 포함되는, 세포 분리용 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 소 혈청 알부민(BSA)은 기본 조성물에 대하여 0.01 내지 10 w/v%의 농도로 포함되는, 세포 분리용 조성물.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 콜라게나제(collagenase)는 기본 조성물에 대하여 0.1 내지 10 mg/ml의 농도로 포함되는, 세포 분리용 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 세포 분리용 조성물을 이용하여 분리된 기관(organ) 또는 기관 유래 조직(tissue)으로부터 세포를 분리하는 단계를 포함하는 세포 분리 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 기관 또는 조직은 인간, 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니피그, 랫트, 마우스, 다람쥐, 아메리카너구리, 잉꼬, 앵무새, 닭, 오리, 칠면조, 거위, 뿔닭(helmeted guinea fowl), 꿩, 타조, 메추라기 또는 에뮤(emu)로부터 분리된 것인, 세포 분리 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 기관은 위(stomach)인, 세포 분리 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 세포는 주 세포(chief cell), 벽공 세포(pit cell), 벽 세포(parietal cell) 및 협부 세포(isthmus cell)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 세포 분리 방법.
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