JP2007531504A - 新規真菌タンパク質および同タンパク質をコードする核酸 - Google Patents

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Abstract

新規ポリペプチドをコードする菌類の核酸配列が本願明細書に開示される。これらの核酸配列がコードするポリペプチドならびに前記ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体の誘導体、変異体、突然変異体または断片もまた開示される。本発明のEXOX核酸およびタンパク質と呼ぶ新規ロイシンアミノペプチダーゼ(LAP)ならびに他のアミノ-およびカルボキシルペプチダーゼポリペプチドは、種々の医療、研究および商業的応用に有用である。

Description

本発明は、新規ポリペプチド、ならびにそれらをコードする核酸に関するものであり、これらのポリペプチドは独特の触媒特性を有する。より詳細には、本発明は、本明細書において総称してEXOXと称することとする、新規ロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）および他のアミノ-およびカルボキシ-ペプチダーゼポリペプチドをコードする核酸、ならびにベクター、宿主細胞、抗体、およびこれらの核酸およびポリペプチドを製造する組換え法に関する。これらの遺伝子は、2つの異なる真菌、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）およびアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）において同定された。
細菌、酵母および糸状菌、ならびに植物、無脊椎動物および脊椎動物の特殊化した細胞は、アミノ酸、ジペプチドおよびトリペプチドの取り込みに有用な膜タンパク質を発現する。Lubkowitzら、Microbiology 143:387-396(1997); Hauserら、Mol. Membr. Biol 18(1): 105-112(2001); Staceyら、Trends Plant Sci. 7(6):257-263(2002); Rubio-AliagaおよびDaniel, Trends Pharmacol. Sci. 23(9):434-440(2002)。もっと大きなオリゴペプチド（4-5アミノ酸残基）も受容するトランスポーターが酵母、糸状菌および植物では知られている。タンパク質のアミノ酸への消化は、食品醗酵工業で使用される微生物において研究されている。ラクトバチルス（Lactobacillus）属の細菌（O’Cuinnら、Biochem. Soc. Trans. 27(4):730-734(1999)）およびアスペルギルス（Aspergillus）属の真菌（Doumasら、Appl. Environ. Microbiol. 64:4809-4815(1998)）は、エンドプロテアーゼおよびエキソプロテアーゼを分泌し、これらはタンパク質消化に際して非常に効率的に共同して作用する。
感染時に真菌の成長に影響を及ぼす可能性もあるアミノペプチダーゼ活性は、ある種の真菌の菌糸体および培養上清において検出されている（De BersaquesおよびDockx, Arch. Belg. Dermatol. Syphiligr. 29:135-140(1973); DanewおよびFriedrich, Mykosen 23:502-511(1980)）が、しかしながら、アミノペプチダーゼもカルボキシペプチダーゼも、現在までのところ、皮膚糸状菌から単離されておらず、特性も明らかにされていない。
発明の概要
本発明は、一つには、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35から選択される成熟型アミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチドの発見に基づくものである。本発明はまた、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド、ならびに前記配列を有するポリペプチドと少なくとも90%同一である、単離されたポリペプチドを提供するが、こうしたポリペプチドは状況に応じてアミノペプチダーゼ活性もしくはカルボキシペプチダーゼ活性を有する。たとえば、ポリペプチドはruLAP2のようなロイシンアミノペプチダーゼとすることができる。
また、1つもしくは複数の保存的アミノ酸置換を有する単離されたポリペプチドも提供される。こうしたポリペプチドは、アミノペプチダーゼ活性を有する可能性がある。
本発明はまた、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35からなる一群から選択される配列の、自然発生的な対立遺伝子変異体であるポリペプチドも包含する。これらの対立遺伝子変異体は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35からなる一群から選択される核酸配列と、ヌクレオチドが1つもしくは複数の異なっている核酸配列の、翻訳産物であるアミノ酸配列を包含する。選択された配列において何らかのアミノ酸が変化した変異型ポリペプチドは、保存的置換を与えるように変化している。
本発明はまた、たとえば組換えタンパク質からタグを除去するといった、ペプチドから特定のアミノ酸を除去する方法を含むものであって、アミノ酸を除去する活性ポリペプチドは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性のある断片である。
本発明のいずれのポリペプチドも天然に存在しうる。さらに、これらのポリペプチドはいずれも、担体を包含する組成物に入れることができ、組成物は1つもしくは複数の容器を含めたキットに入れることができる。
本発明のポリペプチドを含有する皮膚糸状菌も与えられる。たとえば、適当な皮膚糸状菌には、有毛表皮糸状菌（Epidermophyton floccosum）、オーズアン小胞子菌（Microsporum audouinii）、鉄さび色白癬菌（Microsporum ferrugineum）、渦状白癬菌（Trichophyton concentricum）、Trichophyton kanei、Trichophyton megninii、毛瘡白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、Trichophyton raubitschekii、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、シェンライン白癬菌（Trichophyton schoenleinii）、スーダン白癬菌（Trichophyton soudanense）、断髪性白癬菌（Trichophyton tonsurans）、黄色白癬菌（Trichophyton violaceum）、Trichophyton yaoundei、イヌ小胞子菌（Microsporum canis）、Microsporum equinum、Microsporum nanum、Microsporum persicolor、Trichophyton equinum、Trichophyton simii、疣状白癬菌（Trichophyton verrucosum）、石膏状小胞子菌（Microsporum gypseum）、Trichophyton ajelloi、およびTrichophyton terrestreが挙げられる。
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含有する微生物培養上清を提供する。
本発明はまた、ヒト疾患に付随する症状を治療するための薬物製造における治療薬の使用に関わるものであって、この場合その治療薬は本発明のポリペプチドを含み、疾患は前記ポリペプチドと関連する病状から選択される。
また本発明は、ポリペプチド基質を分解する方法に関する。この方法は、ポリペプチド基質を、単離されている1つもしくは複数のポリペプチドと接触させることを包含する。たとえば、ポリペプチド基質は全長タンパク質とすることができる。さらに、1つもしくは複数の単離されたポリペプチドを用いて、ポリペプチド基質を順次消化することができる。ポリペプチド基質は、変性カゼイン、グリアジン、グルテン、ウシ血清アルブミン、もしくはそれらの断片から選択することができる。たとえば、単離されたポリペプチドはアミノペプチダーゼとすることができるが、これはruLAP2のようなロイシンアミノペプチダーゼであってもよい。
本発明はさらに、真菌感染治療用の、可能性のある治療薬を同定する方法に関するが、この真菌感染は本発明のポリペプチドの異常発現または異常な生理的相互作用に関係している。この方法は、本発明のポリペプチドを発現し、そのポリペプチドに起因する特性もしくは機能を有する細胞を提供すること、その細胞を、候補物質を含んでなる組成物と接触させること、ならびにその物質がポリペプチドに起因する特性もしくは機能を変化させるかどうかを判定することを包含する。細胞を、当該物質なしで組成物と接触させる場合に、当該物質の存在下で変化が認められないならば、その物質は治療薬の見込みがあると認定される。たとえば、ポリペプチドに起因する特性もしくは機能は、アミノペプチダーゼ活性またはカルボキシペプチダーゼ活性とすることができる。
本発明はさらに、病的状態を軽減するために十分な量のポリペプチドを哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において病的状態を治療する方法に関する。典型的には、ポリペプチドは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35、またはそれらの生物学的に活性な断片からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと、少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する。治療すべき病的状態には、真菌感染、セリアック病、消化管吸収不良、スプルー、アレルギー反応および酵素欠損が含まれる。たとえば、アレルギー反応はグルテンに対する反応であることがある。
加えて、本発明は、哺乳動物に、病的状態を軽減するのに十分な量のプロテアーゼ阻害剤を投与することにより哺乳動物の病的状態を治療する方法に関する。プロテアーゼ阻害剤は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35、またはそれらの生物学的に活性な断片から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも90%同一のアミノ酸配列を包含する。たとえば、病的状態とは真菌感染であってもよい。
本発明はさらに、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35から選択されるアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、そうしたポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することによって、製造することができる。ある実施形態において、細胞は、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、および34からなる一群から選択される核酸配列を有する、単離された核酸分子を含有するベクターを包含する。状況に応じて、細胞は真菌細胞、細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス保有もしくは無し）、植物細胞、および哺乳動物細胞とすることができる。
本発明はまた、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、および34から選択される核酸配列を有する、単離された核酸分子を提供する。たとえば、このような核酸分子は天然に存在する可能性がある。
本発明はまた、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、および34から選択される核酸配列と、一つのヌクレオチドだけ異なる核酸分子、ならびに配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコードする、単離された核酸分子に関する。さらに、この核酸分子は、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、および34からなる一群から選択されるヌクレオチド配列、またはそうしたヌクレオチド配列の相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列とすることができる。ある実施形態において、核酸分子はベクターに含まれていてもよく、ベクターはさらに、前記核酸分子と機能しうるように結合したプロモーターを包含する。ベクターを包含する細胞も提供される。
本発明はまた、本発明のポリペプチドを製造する方法を提供する。その方法は、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することを包含し、細胞は、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、および34から選択される核酸配列を含有する、単離された核酸分子を有するベクターを包含する。ある実施形態において、細胞は真菌細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞もしくは哺乳動物細胞から選択される。
本発明はまた、ポリペプチドを含有する皮膚糸状菌を、タンパク質の製造に十分な条件下で培養すること、ならびに皮膚糸状菌培養物からタンパク質を単離することによってタンパク質を製造する方法に関する。たとえば、タンパク質は分泌タンパク質とすることができる。さらに、タンパク質はアミノペプチダーゼ、またはカルボキシペプチダーゼであってもよい。具体的には、アミノペプチダーゼは、ruLAP2のようなロイシンペプチダーゼとすることができる。加えて、皮膚糸状菌は、有毛表皮糸状菌（Epidermophyton floccosum）、オーズアン小胞子菌（Microsporum audouinii）、鉄さび色白癬菌（Microsporum ferrugineum）、渦状白癬菌（Trichophyton concentricum）、Trichophyton kanei、Trichophyton megninii、毛瘡白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、Trichophyton raubitschekii、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、シェンライン白癬菌（Trichophyton schoenleinii）、スーダン白癬菌（Trichophyton soudanense）、断髪性白癬菌（Trichophyton tonsurans）、黄色白癬菌（Trichophyton violaceum）、Trichophyton yaoundei、イヌ小胞子菌（Microsporum canis）、Microsporum equinum、Microsporum nanum、Microsporum persicolor、Trichophyton equinum、Trichophyton simii、疣状白癬菌（Trichophyton verrucosum）、石膏状小胞子菌（Microsporum gypseum）、Trichophyton ajelloi、およびTrichophyton terrestreから選択することができる。
製造されたタンパク質をポリペプチド基質に適用することができる。場合によっては、製造されたタンパク質はポリペプチドを分解する可能性があり、または全長ポリペプチド基質を順次消化することができる。状況に応じて、ポリペプチド基質の長さは2から200アミノ酸までとすることができる。
ある場合には、製造されたタンパク質は、ポリペプチド基質に1つもしくは複数のアミノ酸を付加する。その他に、製造されたタンパク質が1つもしくは複数のアミノ酸をポリペプチド基質から除去して、改変されたポリペプチド基質を生成し、製造されたタンパク質がその後、改変されたポリペプチド基質に1つもしくは複数のアミノ酸を付加し、それによってポリペプチド基質とは異なるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド産物を形成する場合もある。
本発明はまた、真菌症に罹患している患者の真菌症を治療する方法も提供する。この方法は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33および35から選択されるEXOXタンパク質の活性を有する阻害剤を有効な量投与することを含んでなる。たとえば、EXOXタンパク質は配列番号2を包含することができる。
本発明はさらに、ポリペプチド基質を分解する方法を提供する。こうした方法は、1つもしくは複数の単離された本発明のポリペプチドとポリペプチド基質を接触させることを包含する。状況に応じて、ポリペプチド基質は全長タンパク質とし、1つもしくは複数の単離されたポリペプチドは、ポリペプチド基質を順次消化するポリペプチドとすることができる。ポリペプチド基質は、変性カゼイン、グリアジン、グルテン、ウシ血清アルブミン、もしくはそれらの断片から選択することができる。さらに、ある場合には、単離されたポリペプチドはアミノペプチダーゼである。アミノペプチダーゼはruLAP2のようなロイシンアミノペプチダーゼとすることができる。
加えて、前記方法は状況に応じてポリペプチド基質を1つもしくは複数のプロテアーゼと接触させることを包含する。ある場合には、プロテアーゼは、トリプシン、プロナーゼ、キモトリプシンおよびプロテイナーゼKから選択される。
本発明はさらに、タンパク質のアミノ末端からアミノ酸を除去する方法を提供する。この方法は、タンパク質を、1つもしくは複数の単離された本発明のポリペプチドと接触させることを包含する。ある場合には、タンパク質のアミノ末端はHisタグを包含する。また、タンパク質のアミノ末端がXaa-Proタグを包含する場合もある。状況に応じて、Xaaは、少なくとも2つの近接する求核性の基を包含するアミノ酸であり、その例としてはセリン、トレオニンもしくはシステインが挙げられる。
本発明はさらに、リバースタンパク質分解活性を有する可能性のある、単離された本発明のポリペプチドを提供する。
本発明はさらに、1つもしくは複数のアミノ酸をポリペプチド基質に付加する方法を提供する。この方法は、ポリペプチド基質を1つもしくは複数の本発明の単離ポリペプチドと接触させることを包含する。
特に明示しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似の、または同等の方法および材料を本発明の実施において使用することができるが、適当な方法および材料は下記に記載される。本明細書で言及された刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はいずれも、そのすべてを参考として本発明に含めるものとする。抵触する場合には、本明細書が定義を含めて支配する。加えて、材料、方法、および実施例は一例にすぎず、限定することを意図するものではない。
発明の詳細な説明
本明細書で使用されるプロテアーゼという用語は、ペプチダーゼ、タンパク質分解酵素およびペプチド加水分解酵素と同義である。プロテアーゼは、タンパク質のペプチド結合（CO-NH）の切断を触媒する酵素をすべて包含するものであって、こうしたタンパク質をペプチドもしくは遊離アミノ酸にまで消化する。エキソペプチダーゼは、アミノ（N）もしくはカルボキシ（C）末端の、ポリペプチド鎖末端近くで作用する。遊離N末端に作用するエキソペプチダーゼは単一のアミノ酸残基を遊離し、アミノペプチダーゼと呼ばれる。多種多様な特異性の高いプロテアーゼが、多数のさまざまな生物学的および生理学的プロセスに関与する。したがって、こうしたプロテアーゼは、新薬申請、ならびにコントロールされたペプチドおよび／またはタンパク質分解のために最適な標的となる。
皮膚糸状菌はヒトおよび動物の病原真菌であり、皮膚感染を引き起こす。Vanbreuseghemら、GUIDE PRATIQUE DE MYCOLOGIE MEDICALE ET VETERINAIRE. (1978); Kwong-ChongおよびBennet, MEDICAL MYCOLOGY (1992); WeitzmanおよびSummerbell, Clin. Microbiol. Rev. 8: 240-259 (1995)。皮膚糸状菌の例としては、T. ajelloi、エンドファイト（A. uncinatum）、K. ajelloi、T. asteroides、毛瘡白癬菌（T. mentagrophytes）、渦状白癬菌（T. concentricum）、T.cruris、有毛表皮糸状菌（E. floccosum）、T. dankalienese、G.dankaliensis、T. equinum、T. equinum var. autotrophicum、T. equinum var. equinum、T. erinacei、T.fischeri、T flavescens、T. floccosum、有毛表皮糸状菌（E. floccosum）、T. gloriae、T. gourvilii、T. granulare、T. granulosum、T. gypseum、T.inguinale、T. interdigitale、T. intertriginis、T. kanei、T. krajdenii、T. longfusum、T. megninii、A. quinckanum、A. benhamiae、A. vanbreuseghemii、T. pedis、T. proliferans、T.quickaneum、T. radiolatum、T. mentrophytes var. erinacei、T. mentagrophytes var. interdigitale、T. mentagrophytes var. mentagrophytes、T. mentagrophytes var. nodulare、T. mentagrophytes var. quinnckeanum、T. niveum、T. nodulare、T. persicolor、M. persicolor、T. phaseolforme、T. proliferans、T. purpureum、T. quinckeanum、T. radiolatum、T. raubitschekii、紅色白癬菌（T. rubrum）、S. ruber、シェンライン白癬菌（T. schoenleinii）、T. simii、A. simii、スーダン白癬菌（T. soudanense）、T. sulphureum、断髪性白癬菌（T. tonsurans）、A. insingulare、A. lenticularum、A. quadrifidum、断髪性白癬菌（T. tonsurans）、T. sulphureum、T. terrestre、T. tonsurans var. sulphureum、T. tonsurans var tonsurans subvar. perforans、T. vanbreuseghemii、T. verrucosum、黄色白癬菌（T. violaceum）、T. yaoundei、有毛表皮糸状菌（E. floccosum）、オーズアン小胞子菌（M. audouinii）、鉄さび色白癬菌（M. ferrugineum）、T. kanei、T. megninii、毛瘡白癬菌（T. mentragrophytes）、T. raubitschekii、シェンライン白癬菌（T. schoenleinii）、スーダン白癬菌（T. soudanese）、黄色白癬菌（T. violaceum）、イヌ小胞子菌（M. canis）、M.equinum、M. nanum、M. persicolor、疣状白癬菌（T. verrucosum）、および石膏状小胞子菌（M. gypseum）が挙げられるが、それらに限定されない。ヨーロッパの病院および医院で分離された病原性菌種のうちで、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、毛瘡白癬菌（T. mentragrophytes）、およびイヌ小胞子菌（Microsporum canis）がもっともよく見られた。Monodら、Dermatology, 205: 201-203(2002)。実際、皮膚糸状菌は、もっぱら角質層、爪もしくは毛髪において増殖可能であり、角質化した細胞表層の成分を消化することができる。現在までに、調べられたすべての皮膚糸状菌はin vitroでタンパク質分解活性を生じ、多くの研究者が個別の種からの1つもしくは2つの分泌型エンドプロテアーゼの分離および性質検討を報告している。総説で概観するために、Monodら、Int. J. Med. Microbiol. 292: 405-419(2002)を参照されたい。詳細には、イヌ小胞子菌（M. canis）は、MEROPSタンパク質分解酵素データベース（http://merops.sanger.ac.uk/）で分類されるように、S8（ズブチリシン）およびM36（ファンガリシン(fungalysin)）ファミリーという、エンドプロテアーゼをコードする2つの遺伝子ファミリーを保有することが明らかになった。Broutaら、Infect. Immun. 70: 5676-5683 (2002); Descampsら、J Invest. Dermatol. 70: 830-835 (2002)。分離されたそれぞれのイヌ小胞子菌遺伝子ファミリーを構成する1つの遺伝子は、培養上清由来の2つのすでに性質の明らかなエンドプロテアーゼのうちの一方をコードしていた。Mignonら、Med. Mycol. 36: 395-404 (1998); Broutaら、Med. Mycol. 39: 269-275 (2001)。2つの酵素は、ケラチン分解性であって、ネコの感染の際に生成されることが示された。Mignonら、Med. Mycol. 36: 395-404 (1998); Broutaら、Med. Mycol. 39: 269-275 (2001)。こうしたタンパク質分解活性によって、皮膚糸状菌はもっぱら角質層、爪もしくは毛髪において増殖することができ、角質化した細胞表層の消化された成分、すなわち単一アミノ酸もしくは短いペプチドをin vivo増殖のための栄養物として利用することができる。
皮膚糸状菌である紅色白癬菌（T. rubrum）由来の２つの新規ロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）、ruLAP1およびruLAP2を本明細書に記載する。紅色白癬菌（T. rubrum）は、トリコフィトン（Trichophyton）属の一種であって、トリコフィトン属には、たとえば、T.ajelloi、星状白癬菌（T. asteroides）、毛瘡白癬菌（T. mentagrophytes）、渦状白癬菌（T. concentricum）、T. cruris、T. dankalienese、T. equinum、T. equinum var. autotrophicum、T. equinum var. equinum、T. erinacei、T. fischeri、T. flavescens、T. floccosum、, T. gloriae、T. gourvilii、T. granulare、T. granulosum、T gypseum、T. inguinale、趾間白癬菌（T. interdigitale）、T. intertriginis、T. kanei、T. krajdenii、T. longfusum、T. megninii、T. pedis、T. proliferans、T. quickaneum、T. radiolatum、T. mentrophytes var. erinacei、T. mentagrophytes var. interdigitale、T. mentagrophytes var. mentagrophytes、T. mentagrophytes var. nodulare、T. mentagrophytes var. quinnckeanum、T.niveum、T. nodulare、T. persicolor、T. phaseolforme、T. proliferans、T. purpureum、T. quinckeanum、T. radiolatum、T. raubitschekii、シェンライン白癬菌(T. shoenleinii)、T. simii、スーダン白癬菌（T. soudanense）、T. sulphureum、T. tonsrans、T. sulphureum、T. terrestre、T. tonsurans
var. sulphureum、T. tonsurans var. tonsurans subvar. perforans、T. vanbreuseghemii、疣状白癬菌(T. verrucosum)、黄色白癬菌(T. violaceum)、T. yaoundei、T. kanei、T. raubischekii、スーダン白癬菌(T. soudanese)が含まれる。2つのLAPの性質を、日和見真菌であるアスペルギルス・フミガーツス（Aspergillus fumigatus）のオルソログ（相同分子種）遺伝子によってコードされる分泌型酵素、fuLAP1およびfuLAP2、ならびに市販のブタ腎臓由来ミクロソームLAP（pkLAP）（MEROPS>M1ファミリー）の性質と比較した。これらの酵素はすべてロイシンアミノペプチダーゼ活性を示す。また、A. フミガーツスのアミノペプチダーゼfuLAP1およびfuLAP2は、米国特許第6,127,161号および第5,994,113号において報告されたコウジカビ（A. oryzae）のオルソログと約70%のアミノ酸同一性を示し、これらの特許は参考として本明細書に含めるものとする。さらに、ruLAP2は独特のものであると思われるが、その理由は、(i)ruLAP1およびruLAP2が、A. フミガーツスのオルソログfuLAP1およびfuLAP2と、ならびに米国特許第6,127,161号および第5,994,113号において報告されたコウジカビ（A. oryzae）のオルソログと、約50%のアミノ酸同一性を示す；（ii）ruLAPおよびP. pastoris発現系起源のトリプシン様エンドプロテアーゼの混合物は、変性カゼインのような全長ポリペプチド鎖を順次、消化する；（iii）ruLAP2およびruDPPIV（紅色白癬菌のもう一つのエキソプロテアーゼ）の混合物は、プロテアーゼ作用に抵抗性であることが知られているグリアジンの断片を分解するが、それによってruLAP2は単独で、またはruDPPIVと併用して、セリアック病の治療、もしくは吸収不良といった消化管のいかなる疾患の治療にも使用できると思われる；（iv）他のプロテアーゼと組み合わせたruLAP（混合物）は、食品工業、たとえば苦味の基質の分解、theves分解、肉の処理、石鹸工業、プリオンの分解、ウイルスの分解、および毒性もしくは汚染タンパク質の分解において役立つ；（v）ならびに、ruLAP2および／または真菌によって分泌される他のプロテアーゼは、皮膚糸状菌が爪の角化基部で増殖するために必要であるので、ruLAP2および／または真菌によって分泌される他のプロテアーゼの阻害剤が真菌症の新規治療法となりうるためである。
本発明は真菌の新規核酸およびタンパク質を提供するが、これはロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するものである。LAPは、血液凝固、制御された細胞死、組織分化、腫瘍の浸潤を包含するがそれらに限定されない、さまざまな機能において、ならびにこうした酵素が新規医薬品のための有用な標的および強力な手段となる、多くの病原微生物およびウイルスの感染サイクルにおいて、役割を果たしている。生理学上の機能を有することに加えて、アミノペプチダーゼはまた、主に洗剤および食品産業において商業的用途がある。真菌のような微生物は、広範な生化学的多様性を有し遺伝子操作を受けやすいため、この酵素のすぐれた供給源である。微生物はタンパク質を分解し、分解産物を増殖のための栄養物として利用する。したがって、本明細書で同定された新規LAPは、食品工業におけるタンパク質の加水分解、副産物の分解（たとえば、羽毛）；プリオンの分解；プロテオミクスのためのタンパク質の分解；アミノ酸分析のためのポリペプチド加水分解；創傷清浄化（たとえば、死んだ組織を攻撃する）；人工装具の洗浄および／または調製；衣類の柔軟仕上げ剤；石鹸；浄化槽、または、除去もしくは消毒すべきタンパク質を含むなんらかの容器（たとえば、貯蔵樽、瓶など）の洗浄または消毒；ならびに外科手術器具の洗浄を包含するがそれに限定されない、多数の工業的応用において有用である。
本発明は新規酵素および酵素混合物、すなわち、角質化した細胞表層のような不溶性タンパク質構造を消化して短いペプチドおよび遊離アミノ酸とする2つ以上の酵素の混合物を提供する。実際、S8およびM36ファミリーのエンドプロテアーゼに加えて、紅色白癬菌は、それぞれ異なる基質活性を有する２つのLAPを分泌する。ruLAP1およびruLAP2は、それぞれ、LAPの同じファミリーに属する（MEROPS>M28）。２つのLAPの性質を、日和見真菌A. fumigatusのオルソログ遺伝子によってコードされる分泌酵素、fuLAP1およびfuLAP2、ならびに市販のブタ腎臓由来ミクロソームLAP（pkLAP）（MEROPS>M1ファミリー）の性質と比較した。上記酵素はいずれも、ロイシンアミノペプチダーゼ活性を示す。さらに、ruLAP2は、独自の一次構造を有しており、ruDPPIVの存在下で、他のプロテアーゼに対して抵抗性であることが知られているグリアジンの断片のようなペプチド鎖を順次消化することができるという点でユニークである。部分精製されたruLAP2はまた、P. pastoris発現系を起源とするトリプシン様エンドプロテアーゼの存在下で、変性カゼインのような全長ポリペプチド鎖を順次消化することができる。
本発明は、一つには、新規ポリペプチドをコードする新規核酸配列の単離に基づくものである。新規核酸配列およびそれらがコードするポリペプチドはそれぞれruLAP1、ruLAP2、fuLAP1およびfuLAP2と称される。これらの核酸、ならびにそのコードするポリペプチドを、本明細書では総称的に”EXOX”と称する。
本発明の新規EXOX核酸は、その配列が表1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、7A、7B、8A、8B、9A、9B、10A、10B、11A、11Bおよび12Aにおいて与えられる核酸、またはそれらの断片、誘導体、類似体もしくは相同体を包含する。本発明の新規EXOXタンパク質は、その配列が1C、2C、3C、4C、5C、6C、7C、8C、9C、10C、11Cおよび12Bにおいて与えられるタンパク質断片を包含する。個々のEXOX核酸およびタンパク質を下記に説明する。
また、真菌感染、ならびに／または真菌、酵母細胞および／もしくは細菌による日和見感染の治療もしくは予防にプロテアーゼ阻害剤を使用する方法も本発明の範囲に含まれる。
リバース遺伝子技術の手法を用いて、紅色白癬菌により分泌される２つのアミノペプチダーゼの性質は、A. fumigatus由来のオルソログおよびブタ腎臓由来のミクロソームアミノペプチダーゼpkLAPとの比較により明らかになった。本明細書で同定された４つの真菌酵素（ruLAP1、ruLAP2、fuLAP1およびfuLAP2）ならびにpkLAPは、ともに基質としてLeu-AMCを優先し、ロイシンアミノペプチダーゼとして機能することを共有する。加えて、アミノペプチダーゼpkLAPは、きわめて高い効率でAla-AMCにも作用するため、アラニンアミノペプチダーゼとも呼ばれる（MEROPS>M1.001）。
EXOXタンパク質をコードする本発明のEXOX核酸は、その配列が本明細書で与えられる核酸またはその断片を包含する。本発明はまた、その塩基いずれかが本明細書に示した対応する塩基から変化している可能性があるが、一方それでも、EXOX様活性および生理機能を維持しているタンパク質をコードする、変異型（ミュータントもしくはバリアント）核酸、またはそうした核酸の断片を包含する。本発明はさらに、その配列が本明細書に記載の配列と相補的である核酸を包含し、記載された核酸のいずれかと相補的な核酸断片を含める。加えて本発明は、その構造に化学修飾を含む、核酸もしくは核酸断片、またはそれらに対する相補体を包含する。このような修飾には、非限定的な一例として、修飾された塩基、および糖リン酸骨格が修飾もしくは誘導体化された核酸がある。このような修飾は、少なくともある程度は、修飾された核酸の化学的な安定性を高めるために行われ、被験者の治療適用において、たとえばアンチセンス結合核酸として使用することができる。
本発明のEXOXタンパク質は、本明細書で配列が与えられるEXOタンパク質を包含する。本発明はまた、残基のいずれかが本明細書に示された対応する配列から変化しているが、依然としてEXO様活性および生理機能を維持したタンパク質をコードする、変異型（ミュータントもしくはバリアント）タンパク質、またはその機能性断片を包含する。本発明はさらに、免疫特異的に本発明のタンパク質のいずれかと結合する、抗体および抗体フラグメント、たとえばFabもしくは(Fab)2を包含する。
EXOX核酸およびタンパク質は、真菌感染の治療のような、有力な治療への応用に有用である。EXOX核酸、タンパク質および阻害剤は他の機能も有しており、その機能には下記が挙げられるがそれに限定されない：（i）タンパク質生産の改善のためのバイオテクノロジー試薬、たとえばタグの除去、まれなアミノ酸の生産；（ii）特定の疾患適用、たとえばセリアック病（グルテン不耐性）のための薬剤開発；（iii）皮膚病変のための薬剤開発、たとえば抗真菌剤、疣贅治療、創傷治癒；（iv）美容術、たとえば、ピーリングツールによる、脱毛、皮膚剥離術および皮膚平滑化；（ｖ）食品工業、たとえば、栄養補助食品、甘味料、前消化により低アレルゲン食品を生成すること；（vi）殺菌剤、たとえば、プリオンもしくはウイルスのようなタンパク質ベースの汚染物質の除去（コートタンパク質の消化による）、手術用具の清浄化、または人工装具もしくは医療用具のような外科用品の準備；（vii）たとえば、羽毛、骨、毛および毛皮などの特定の廃棄物を衛生的にする、もしくは再生利用すること、；（viii）洗浄剤、たとえば、シャンプーもしくは液体洗剤。
EXOの阻害剤、特にruLAP2の阻害剤は、真菌症を治療する真菌性抗真菌剤としても使用することができる。LAPそれ自体を、吸収不良もしくはセリアック病（小麦グルテンによって引き起こされる）といった消化管疾患の治療に使用することもできる。グルテンは、穀物中に存在するグルテリンおよびグリアジン（プロラミン）からなるタンパク質混合物のための特有の用語である。結合剤および増量剤として働くような固有の物理化学的特性のため、グルテンは食品中の添加物として広く用いられている。グルテンの検出は、グルテン不耐性腸疾患、セリアック病、スプルーおよび関連アレルギー反応を含めた、グルテン不耐性に関連する、またはグルテン不耐性に起因する疾患を有する個体のための、食品の品質管理および選択において重要であり、このような場合、小麦、ライ麦、大麦、および場合によってはオート麦に含まれるグルテンのない食事が必要である。
エキソプロテアーゼ核酸およびポリペプチド
ここに示す紅色白癬菌アミノペプチダーゼ活性、ならびにイヌ小胞子菌により分泌されるズブチリシンおよびメタロプロテアーゼに関するこれまでの研究は、皮膚糸状菌が、単独の炭素源および窒素源としてタンパク質を含有する培地中で、アスペルギルス種のプロテアーゼに類似した一連のプロテアーゼを分泌することを示す。さらに、A. fumigatusおよびコウジカビ（A. oryzae）の両者に由来するDPPIVおよびDPPVに類似性の高いジペプチジルアミノペプチダーゼをコードする２つの遺伝子、ruDPPIVおよびruDPPVについてはruDPPV：EMBL AF082514（Beauvaisら、J. Biol. Chem. 272:6238-6244 (1997); Beauvaisら、Infec. Immun. 65:3042-3047 (1997); Doumasら、Appl. Environ. Microbiol. 64: 4809-4815 (1998); Doumasら、J. Food Mycol. 2: 271-279 (1999)）が、紅色白癬菌のゲノムライブラリおよびcDNAライブラリから単離された。これらのプロテアーゼをコードする紅色白癬菌遺伝子のイントロン-エキソン構造は、A. fumigatusおよびコウジカビ（A. oryzae）から単離された相同遺伝子と類似している。アスペルギルス属種のテレオモルフおよび皮膚糸状菌種のテレオモルフは密接な関係があり、これらは閉鎖子嚢果においてprototunicate子嚢を生成する子嚢菌類（Ascomycetes）の同一分類群に属するので（Eurotiomycetes綱）、上記の結果は驚くには当たらない。ズブチリシンおよびファンガリシン(fungalysin)をコードする遺伝子と対照的に、ruLAP1およびruLAP2は、紅色白癬菌ゲノム中の大きな遺伝子ファミリー群に属さない。
ruLAP1は、fuLAP1および／またはLAP1と約50%のアミノ酸同一性を示す（表19Aおよび20を参照されたい）。これらの３つの酵素は、構造的には、アエロモナス属（Aeromonas）およびビブリオ属（Vibrio）ロイシンアミノペプチダーゼ（MEROPS>M28.002）と同じサブファミリーM28Eに属す。それに加えて、ruLAP2は、fuLAP2および／またはLAP2と約50%のアミノ酸同一性を示す（表19Bおよび21を参照されたい）。これらの３つの酵素は、構造的には、出芽酵母（S. cerevisiae）の液胞プロテアーゼY（MEROPS>M28.001）および放線菌（Streptomyces griseus）の分泌型アミノペプチダーゼ（MEROPS>M28.00X）と同じサブファミリーM28Aに属す。さらに、M28AおよびM28Eサブファミリーを構成する酵素は、低い類似性を共有する。しかしながら、これらのアミノペプチダーゼにおける２つのZn2+結合部位のアミノ酸は保存されており、本明細書で性質が明らかとなった真菌LAPにおいて同定された（表20および21を参照されたい）。S. griseus およびAeromonas proteolyticaの分泌型アミノペプチダーゼにおいて、２つのアミノ酸残基HisおよびAspが第１のZn2+イオンと結合し、さらに２つの残基His およびGluが第２のZn2+イオンと結合するが、他方、もう一つのAsp残基が２つのZn2+イオンを架橋する。Greenblattら、J. Mol. Biol. 265: 620-636 (1997); Hasselgrenら、J. Biol. Inorg. Chem. 6: 120-127 (2001). S. griseusの分泌型アミノペプチダーゼにおいてZn2+を異なる二価イオンによって置換することは、Ca2+の悪影響を受け、効果にはばらつきがある。Ben-Meirら、Eur. J. Biochem 212: 107-112 (1993); Linら、J. Biol. Inorg. Chem. 2: 744-749 (1997); Hasselgrenら、J. Biol. Inorg. Chem. 6: 120-127 (2001).本発明のアミノペプチダーゼは、異なるイオンに感受性があることが明らかになった。S. griseusのアミノペプチダーゼと同様に、ruLAP2およびfuLAP2はCo2+によって非常に活性化される。
ruLAP2およびfuLAP2は、配列同一性の割合が高いにもかかわらずかなり異なるタンパク質分解活性を有する。詳細には、ruLAP2はAsp-およびGlu-7-アミノ-4-メチルクマリン（AMC）を効率よく加水分解することができ、さらにruLAPは、第１にruDPPIVの存在下で、胃および膵臓のプロテアーゼによる消化に抵抗性であることが知られているグリアジンペプチドを消化することができる、または第２に、P.pastoris発現系を起源とするトリプシン様エンドプロテアーゼを含有する部分精製抽出物の形で、変性カゼインのような全長ポリペプチド鎖を消化することができるとこれまでに認められた唯一のLAPである。長いポリペプチドを分解するLAPの能力は、アミノアシル-AMC残基を切断する能力を根拠とするだけでは予測し得ない。イヌ小胞子菌（M. canis）により分泌されるエンドプロテアーゼで、糸状菌酵素の特殊な性質が観察された。31.5kDaのイヌ小胞子菌ズブチリシンおよび43.5kDaのイヌ小胞子菌メタロプロテアーゼはいずれも、A. フミガーツスおよびコウジカビ由来の相同的な分泌酵素とは対照的にケラチンアズールを分解することができる。皮膚糸状菌は土壌中の自然生息環境が起源であるので、特殊なプロテアーゼを用いて角質化した組織を分解する感染の戦略を発達させてきた。ruLAP2のユニークな特性は、角質層および爪に寄生する高度に特殊化した生物を反映するものと考えられる。
本明細書に記載のLAPに加えて、一連の新規プロテアーゼも、病原真菌である紅色白癬菌から単離され、それらを以下に示す。LAPと同様に、これらのプロテアーゼはいずれも特徴からエキソプロテアーゼとされる。こうしたプロテアーゼには、カルボキシペプチダーゼ2種、プロリルアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼP、プロリダーゼ。およびジペプチジルペプチダーゼIVが含まれる。加えて、２つの新規プロテアーゼ：イヌ小胞子菌（Microsporum canis）由来ロイシンアミノペプチダーゼ（caLAP1）、および毛瘡白癬菌（Tricophyton mentagrophytes）ロイシンアミノペプチダーゼ、meLAP1の特徴も明らかになった。
ruLAP2
ruLAP2はT. rubrumロイシンアミノペプチダーゼである。1757ヌクレオチドのruLAP2核酸(配列番号１)を表1Aに示す。
Figure 2007531504
開示された1488ヌクレオチドのruLAP2オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATG開始コドンで始まる（表１Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたruLAP2核酸(配列番号２)は、495アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号３)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表１Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたruLAP2は、表１Ｄ、表１Ｅ、表１Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。
以下のプログラムオプションを用いた。
tblastn タンパク質「配列１」を、６リーディングフレーム全てに翻訳されたヌクレオチド「配列２」と比較する。
blastx ヌクレオチド「配列１」をタンパク質「配列２」と比較する。
blastp タンパク質-タンパク質の比較用。
本明細書における全てのBLASTアラインメントにおいて、「E値」または「期待」値とは、検索したデータベース内で、アラインされた配列がBLASTに問い合わせた配列との類似性を、偶然のみによって達成し得た確率の数値的表示である。期待値（E)は、特定の大きさのデータベースを検索した場合に単に偶然見つけてしまうと「期待」できるヒット数を表すパラメーターである。期待値（E)は、２つの配列の間のマッチに割り当てられたスコア（S)に伴って指数関数的に減少する。本質的に、E値は、配列間のマッチに存在するランダムなバックグラウンドノイズを表す。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
ruLAP1
ruLAP1はT. rubrumロイシンアミノペプチダーゼである。1256ヌクレオチドのruLAP1核酸(配列番号４)を表2Aに示す。
Figure 2007531504
開示された1122ヌクレオチドのruLAP1オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATGコドンで始まる（表２Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたruLAP1核酸(配列番号５)は、377アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号６)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表２Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたruLAP1は、表２Ｄ、表２Ｅ、表２Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
fuLAP2
fuLAP2はA. fumigatusロイシンアミノペプチダーゼである。1557ヌクレオチドのfuLAP2核酸(配列番号７)を表３Ａに示す。
Figure 2007531504
開示された1497ヌクレオチドのfuLAP2オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATGコドンで始まる（表３Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたfuLAP2核酸(配列番号８)は、498アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号９)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表３Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたfuLAP2は、表３Ｄ、表３Ｅ、表３Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
fuLAP1
fuLAP1はA. fumigatusロイシンアミノペプチダーゼである。1298ヌクレオチドのfuLAP1核酸(配列番号１０)を表４Ａに示す。
Figure 2007531504
開示された1167ヌクレオチドのfuLAP1オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATGコドンで始まる（表４Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたfuLAP1核酸(配列番号１１)は、388アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号１２)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表４Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたfuLAP1は、表４Ｄ、表４Ｅ、表４Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
ruCBPS1
ruCBPS1はT. rubrumカルボキシペプチダーゼである。2106ヌクレオチドのruCBPS1核酸のゲノムDNA配列(配列番号１３)を表５Ａに示す。
Figure 2007531504
1989のruCBPS1核酸(配列番号１４)を表５Ｂに示す。開示されたruCBPS1オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATG開始コドンで始まる（表５Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたruCBPS1核酸(配列番号１４)は、662アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号１５)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表５Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたruCBPS1は、表５Ｄ、表５Ｅ、表５Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
ruCBPS1'
ruCBPS1はT. rubrumカルボキシペプチダーゼである。2030ヌクレオチドのruCBPS1'核酸のゲノムDNA配列(配列番号１６)を表６Ａに示す。
Figure 2007531504
1959のruCBPS1'核酸(配列番号１７)を表６Ｂに示す。開示されたruCBPS1'オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATG開始コドンで始まる（表６Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたruCBPS1'核酸(配列番号１７)は、652アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号１８)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表６Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたruCBPS1'は、表６Ｄ、表６Ｅ、表６Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
ruPAP
ruPAPはT. rubrumプロリルアミノペプチダーゼである。1795ヌクレオチドのruPAP核酸のゲノムDNA配列(配列番号１９)を表７Ａに示す。
Figure 2007531504
1326のruPAP核酸(配列番号２０)を表７Ｂに示す。開示されたruPAPオープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATG開始コドンで始まる（表７Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたruPAP核酸(配列番号２０)は、441アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号２１)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表７Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたruPAPは、表７Ｄ、表７Ｅ、表７Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
ruAMPP
ruAMPPはT. rubrumアミノペプチダーゼPである。2418ヌクレオチドのruAMPP核酸のゲノムDNA配列(配列番号２２)を表８Ａに示す。
Figure 2007531504
1878のruAMPP核酸(配列番号２３)を表８Ｂに示す。開示されたruAMPPオープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATG開始コドンで始まる（表８Ｂで下線を引いてある）。
Figure 2007531504
開示されたruAMPP核酸(配列番号２３)は、625アミノ酸残基を有するタンパク質(配列番号２４)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表８Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたruAMPPは、表８Ｄ、表８Ｅ、表８Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
ruPLD
ruPLDはT. rubrumプロリダーゼである。2344ヌクレオチドのruPLD核酸のゲノムDNA配列(配列番号２５)を表９Ａに示す。
Figure 2007531504
1401のruPLD核酸(配列番号２６)を表９Ｂに示す。開示された部分ruPLDオープンリーディングフレーム(ORF)配列が得られたが、これは位置1におけるATG開始コドンの不在から判断した。
Figure 2007531504
開示された部分ruPLD核酸(配列番号２６)は、466アミノ酸残基を有する部分配列のタンパク質(配列番号２７)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表９Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示された部分ruPLDは、表９Ｄ、表９Ｅ、表９Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
caLAP2
caLAP2はMicrosporum canisロイシンアミノペプチダーゼである。1730ヌクレオチドのcaLAP2核酸(配列番号２８)を表１０Ａに示す。
Figure 2007531504
開示された1488ヌクレオチドのcaLAP2オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATG開始コドンで始まる(表１０Ｂで下線を引いてある)。
Figure 2007531504
開示されたcaLAP2核酸(配列番号２９)は、495アミノ酸残基を有する配列のタンパク質(配列番号３０)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表１０Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたcaLAP2は、表１０Ｄ、表１０Ｅ、表１０Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
meLAP2
meLAP2はTrichophyton mentagrophytesロイシンアミノペプチダーゼである。1775ヌクレオチドのmeLAP2核酸(配列番号３１)を表１１Ａに示す。
Figure 2007531504
開示された1488ヌクレオチドのmeLAP2オープンリーディングフレーム(ORF)は、位置1のATG開始コドンで始まる(表１１Ｂで下線を引いてある)。
Figure 2007531504
開示されたmeLAP2核酸(配列番号３２)は、495アミノ酸残基を有する配列のタンパク質(配列番号３３)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表１１Ｃに提示される。
Figure 2007531504
開示されたmeLAP2は、表１１Ｄ、表１１Ｅ、表１１Ｆに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
ruDPPIV
ruDPPIVはT. rubrumジペプチジルペプチダーゼIVである。2326ヌクレオチドのruDPPIV核酸(配列番号３４)を表１２Ａに示す。開示されたruDPPIVオープンリーディングフレーム(「ORF」)は、位置1のATG開始コドン(表１２Ａで下線を引いてある)で始まる。
Figure 2007531504
開示されたruDPPIV核酸(配列番号３４)は、775アミノ酸残基を有する配列のタンパク質(配列番号３５)をコードし、それは1文字アミノ酸コードを用いて表１２Ｂに提示される。
Figure 2007531504
開示されたruDPPIVは、表１２Ｃ、表１２Ｄ、および表１２Ｅに記載されるBLASTデータに示されたアミノ酸配列と相同性を有する。このデータはPAIRWISE BLASTプログラムで解析した。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
Figure 2007531504
本発明のある態様は、EXOXポリペプチド、またはその生物学的に活性のある一部をコードする、単離された核酸分子に関する。また、EXOXをコードする核酸（たとえば、EXOX mRNA）を同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な核酸断片、ならびにEXOX核酸分子を増幅および／または変異させるためにPCRプライマーとして使用するための断片も本発明に含まれる。本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、DNA分子（たとえば、cDNAもしくはゲノムDNA）、RNA分子（たとえば、mRNA）、ヌクレオチド類似体を用いて作製されたDNAもしくはRNAの類似体、ならびにそれらの誘導体、断片および相同体を包含するものとする。核酸分子は一本鎖もしくは二本鎖とすることができる。
EXOX核酸は成熟EXOXポリペプチドをコードすることができる。本明細書で使用される場合、本発明に記載のポリペプチドもしくはタンパク質の「成熟」型は、天然に存在するポリペプチドもしくは前駆体型もしくはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体もしくはプロタンパク質には、限定的でない一例として、対応する遺伝子によってコードされる全長遺伝子産物がある。あるいはまた、本明細書に記載のORFによってコードされるポリペプチド、前駆体もしくはプロタンパク質と定義することもできる。生成産物である「成熟」型は、やはり限定的でない一例として、１つもしくは複数の自然発生的なプロセシングステップの結果として生じ、そうしたプロセシングステップはその遺伝子産物が生じる細胞内もしくは宿主細胞内で起こりうる。ポリペプチドもしくはタンパク質の「成熟」型をもたらす、このようなプロセシングステップの例には、ORFの開始コドンによってコードされるN末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドもしくはリーダー配列のタンパク質分解性切断がある。したがって、残基1からNまでを有する前駆体ポリペプチドもしくはタンパク質から生じる成熟型は、残基1がN末端メチオニンである場合、N末端メチオニンの除去後に残存する残基2からNまでを有することとなる。あるいはまた、残基1からNまでを有する前駆体ポリペプチドもしくはタンパク質から生じる成熟型は、残基1から残基MまでのN末端シグナルペプチドが切断される場合には、残基M+1から残基Nまでの残りの残基を有することになる。さらに、本明細書で使用される場合、ポリペプチドもしくはタンパク質の「成熟」型は、タンパク質分解性事象ではなく翻訳後修飾ステップから生じることもある。このような追加のプロセスには、限定的でない例示として、グリコシル化（N-、O-およびW-型）、ミリストイル化、リン酸化、硫酸化、N末端環化、またはC末端アミド化がある。一般に、成熟ポリペプチドもしくはタンパク質は、上記プロセスのうちただ１つ、またはそれらの任意の組み合わせが機能することの結果として生じる可能性がある。
本明細書で使用される「プローブ」という用語は、具体的な用途に応じて、好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド（nt）、100nt、または、たとえば約6,000ntもの大きさの間で、長さをさまざまに変えることのできる核酸配列を指す。プローブは、同一の、類似した、もしくは相補的な、核酸配列の検出に使用される。一般にもっと長いプローブが天然起源もしくは組換え起源から得られ、それらは特異性は高いが、もっと短いオリゴマープローブよりもはるかにハイブリダイズが遅い。プローブは一本鎖もしくは二本鎖で、PCR、膜によるハイブリダイゼーション技術、またはELISA類似技術において特異性を有するようにデザインすることができる。
本明細書で使用される「単離された」核酸分子という用語は、核酸の天然起源中に存在する他の核酸分子から分離された分子である。好ましくは、「単離された」核酸分子は、その核酸の起源である生物のゲノムDNAにおいて本来その核酸に隣接する配列（たとえば、その核酸の5’および3’末端にある配列）を含まない。たとえば、さまざまな実施形態において、単離されたEXOX核酸分子は、その核酸の起源である細胞／組織／種のゲノムDNAにおいて本来その核酸分子に隣接する、約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kbまたは0.1kb未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、cDNA分子のような「単離された」核酸分子は、実質的に、組換え技術によって製造される場合には他の細胞物質もしくは培地を含まず、化学合成される場合には化学的な前駆体もしくは他の化学物質を含まないものとする。それは、詳細には、核酸もしくはタンパク質が約50%以上、より好ましくは約85%以上、そしてもっとも好ましくは約99%以上の純度を示すことを意味する。
本明細書で使用される「組換え」という用語は、細胞に関して使用される場合には、細胞が異種核酸を複製し、または異種核酸によってコードされるペプチドもしくはタンパク質を発現することを示す。組換え細胞は、天然（非組換え）型の細胞内には見られない遺伝子を含有することができる。組換え細胞はまた、遺伝子が人工的な手段によって改変され、細胞内に再導入されているような、天然型の細胞内に見られる遺伝子を含有することもある。この用語は、細胞から核酸を除去することなく改変された、細胞に内在する核酸を含有する細胞も包含する；このような改変には、遺伝子置換、部位特異的変異、および関連技術により得られる改変が含まれる。当業者には当然のことであるが、こうした細胞を単細胞もしくは多細胞トランスジェニック生物、たとえばEXOXを産生する遺伝子組換え真菌に使用することができる。
本発明の核酸分子、たとえば、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34のヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこの前述のヌクレオチド配列の相補体は、標準的な分子生物学の技法、および本明細書において与えられる配列情報を用いて単離することができる。配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34の核酸配列の全体もしくは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、EXOX分子を（たとえば、Sambrookら、（編）、MOLECULAR CLONING : A LABORATORY MANUAL 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989；およびAusubelら、(編)、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993に記載のように）標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング技術によって単離することができる。
標準的なPCR増幅法にしたがって、鋳型としてのcDNA、mRNA、あるいはゲノムDNA、および適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、本発明の核酸を増幅することができる。そうして増幅された核酸を適当なベクターにクローニングし、DNA配列分析によって特徴づけることができる。さらに、EXOXヌクレオチド配列に相当するオリゴヌクレオチドを、標準的な合成法によって、たとえば自動DNA合成装置を用いて、調製することができる。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、一続きの連結されたヌクレオチド残基を指し、このヌクレオチドはPCR反応において使用するのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列は、ゲノムもしくはcDNA配列に基づくものであり、またはゲノムもしくはcDNA配列からデザインされるものであって、しかも特定の細胞もしくは組織において、同一の、類似した、または相補的な、DNAもしくはRNAの存在を増幅、確認もしくは明示するために使用される。オリゴヌクレオチドは、約10nt、50ntもしくは100ntの長さを有する核酸配列の一部を含んでなるが、好ましくは約15ntから30ntの長さである。本発明のある実施形態において、長さが100nt未満の核酸分子を含んでなるオリゴヌクレオチドは、さらに、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34、またはその相補体の、少なくとも6個の連続したヌクレオチドを含んでなる。オリゴヌクレオチドは化学的に合成されてもよく、プローブとして使用することもできる。
もう一つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34に示されるヌクレオチド配列の相補体、またはこのヌクレオチド配列の一部（たとえば、プローブもしくはプライマーとして使用することができる断片、またはEXOXポリペプチドの生物学的に活性のある部分をコードする断片）である、核酸分子を含んでなる。配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34に示されるヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、ほとんど、またはまったく、ミスマッチなしに配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34に示されるヌクレオチド配列と水素結合し、それによって安定した二本鎖を形成することができる、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34に示されるヌクレオチド配列に十分に相補的な核酸配列である。
本明細書で使用される場合、「相補的な」という用語は、核酸分子のヌクレオチドユニット間のワトソン-クリック型もしくはHoogsteen塩基対を指す。「結合」という用語は、２つのポリペプチドもしくは化合物、または関連するポリペプチドもしくは化合物、またはそれらの組み合わせの間の、物理的または化学的相互作用を意味する。結合は、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス、疎水性相互作用などを包含する。物理的相互作用は、直接的もしくは間接的のいずれかとすることができる。間接的相互作用は別のポリペプチドもしくは化合物の効果を介する、またはそれに起因すると考えられる。直接的な結合は、別のポリペプチドもしくは化合物の効果を介して、もしくはそれに起因して生じるのではなく、それどころか他に実質的な化学的中間体のない相互作用を表す。
本明細書で与えられる断片は、少なくとも6個の（連続した）核酸配列、または少なくとも4個の（連続した）アミノ酸配列と定義され、これは、核酸の場合には特異的ハイブリダイゼーションを、アミノ酸の場合にはエピトープの特異的認識を、それぞれ可能にするのに十分な長さであるが、こうした断片は全長配列ではなくせいぜい一部分である。断片は選択された核酸もしくはアミノ酸配列の任意の連続部分から導くことができる。誘導体は、天然化合物から、直接生成された、または修飾もしくは部分置換によって生成された核酸配列もしくはアミノ酸配列である。類似体は、天然化合物に類似するが同一でない構造を有し、ある特定の成分もしくは側鎖について天然化合物と異なる、核酸配列またはアミノ酸配列である。類似体は、合成によって、もしくは異なる進化上の起源から得られ、野生型と比較して類似した、もしくは相反する代謝活性を有しうる。相同体もしくはオルソログ（相同分子種）は、異なる種に由来する特定の遺伝子の核酸配列もしくはアミノ酸配列である。
誘導体および類似体は、下記のように修飾された核酸もしくはアミノ酸を含有するならば、全長でも全長以外でもよい。本発明の核酸もしくはタンパク質の誘導体または類似体には、同一サイズの核酸もしくはアミノ酸配列にわたって、または当業界で知られているコンピューター相同性プログラムによってアラインメントを行った整列配列と比較したとき、さまざまな実施形態において、少なくとも約70%、80%、もしくは95%の相同性（好ましい相同性は80-95%）により本発明の核酸もしくはタンパク質と実質的に相同である領域を含んでなる分子、またはそれをコードする核酸がストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、もしくは低いストリンジェント条件下で、前述のタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズする能力を有する分子を包含するが、それらに限定されない。たとえば、Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1993および下記を参照されたい。
「相同的な核酸配列」もしくは「相同的なアミノ酸配列」、またはそれらの変形表現は、上記のようにヌクレオチドレベルもしくはアミノ酸レベルで相同性によって特徴づけられる配列を指す。相同なヌクレオチド配列は、EXOXポリペプチドのアイソフォームをコードする配列をコードする。たとえば、RNAの選択的スプライシングの結果として、同一の生物においてアイソフォームを発現することができる。あるいはまた、アイソフォームを異なる遺伝子がコードしていてもよい。本発明において、相同的なヌクレオチド配列は、真菌以外の種のEXOXポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含することができる。相同的なヌクレオチド配列には、本明細書に示すヌクレオチド配列の自然発生的な対立遺伝子変異も含まれるがそれに限定されない。相同な核酸配列は、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34、ならびにEXOXの生物学的活性を有するポリペプチドにおいて保存的アミノ酸置換（下記参照）をコードする核酸配列を包含する。EXOXタンパク質のさまざまな生物学的活性を下記に説明する。
EXOXポリペプチドは、EXOX核酸のオープンリーディングフレーム（”ORP”）によってコードされる。ORPを含んでなる一続きの核酸は終止コドンで中断される。全長タンパク質のコード配列に相当するORPは、ATG「開始」コドンで始まり、3つの「終止」コドン、すなわちTAA、TAGまたはTGAのうち1つで終わる。本発明の目的の上で、ORPは、コード配列の任意の一部とすることができ、開始コドン、終止コドン、もしくはその両者を含んでも含まなくてもよい。ORPが真正な細胞タンパク質をコードする妥当な候補と認められるために、最小サイズの必要条件が、たとえば50アミノ酸以上からなるタンパク質をコードする一続きのDNAとされることが多い。
真菌EXOX遺伝子のクローニングから決定されたヌクレオチド配列は、他の種におけるEXOX相同体、ならびに他の真菌由来のEXOX相同体の同定および／またはクローニングに使用するためにデザインされたプローブおよびプライマーの作製を可能にする。このプローブ／プライマーは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含んでなる。オリゴヌクレオチドは、典型的には、ストリンジェントな条件下で、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34の少なくとも約12、25、50、100、150、200、250、300、350もしくは400個の連続したセンス鎖ヌクレオチド配列；または配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列；もしくは配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34の自然発生変異体のセンスまたはアンチセンス鎖ヌクレオチド配列とハイブリダイズする、ヌクレオチド配列の領域を含んでなる。
「EXOXポリペプチドの生物学的に活性な部分を有するポリペプチド」は、用量依存性の有無にかかわらず、特定の生物学的アッセイで測定された、成熟型を含めた本発明のポリペプチドの活性に類似するが必ずしも同一ではない活性を示すポリペプチドを指す。「EXOXの生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、EXOXの生物学的活性を有し（EXOXタンパク質の生物学的活性については下記に説明する）、EXOXタンパク質のコードされた部分を（たとえば、in vitro組換え発現によって）発現し、EXOXのコードされた部分の活性が評価されるポリペプチドをコードする、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34の一部を単離することによって調製することができる。
EXOX核酸およびポリペプチドバリアント
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重のため、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34に示すヌクレオチド配列とは異なるが、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34に示すヌクレオチド配列によりコードされるのと同一のEXOXタンパク質をコードする核酸分子を包含する。別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を有する。配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34に示す真菌EXOXヌクレオチド配列に加えて、当業者には当然のことながら、EXOXポリペプチドのアミノ酸配列の変化につながるDNA配列多型が、さまざまな種の集団において存在しうる。EXOX遺伝子におけるこのような遺伝子多型は、自然の対立遺伝子変異により集団内部で、個々の真菌種の間に存在する可能性がある。本明細書で使用される「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、EXOXタンパク質、好ましくは真菌EXOXタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ORF）を含んでなる核酸分子を表す。こうした自然の対立遺伝子変異は、通常、EXOX遺伝子のヌクレオチド配列に1-5%の変動をもたらす可能性がある。任意の、およびすべてのヌクレオチド変異、およびその結果生じるEXOXポリペプチドにおけるアミノ酸多型は、自然の対立遺伝子変異の結果であり、EXOXポリペプチドの機能的な活性を変更しないものであって、本発明の範囲に含めるものとする。
さらに、他の種に由来するEXOXタンパク質をコードし、したがって、真菌配列である配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子を、本発明の範囲に含めるものとする。自然の対立遺伝子バリアントに対応する核酸分子、および本発明のEXOX cDNAの相同体は、本発明に記載の真菌EXOX核酸に対する相同性に基づき、真菌cDNA、もしくはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標準的なハイブリダイゼーション技術によって単離することができる。
したがって、もう一つの実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも6ヌクレオチドの長さであって、ストリンジェントな条件下で、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子とハイブリダイズする。
別の実施形態において、核酸は、少なくとも10、25、50、100、250、500、750、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチドの長さである。さらに別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、コード領域とハイブリダイズする。本明細書で使用される「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という表現は、少なくとも互いに60%相同なヌクレオチド配列が、通常、依然として互いにハイブリダイズする、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図するものである。
相同体もしくは他の関連配列（たとえば、オルソログ、パラログ）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびクローニングの分野においてよく知られた方法を使用して、特定の真菌配列の全体もしくは一部をプローブとして用いた、ストリンジェンシーの低い、中程度の、もしくは高い、ハイブリダイゼーションによって得ることができる。
本明細書で使用される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、プローブ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチドが、その標的配列とはハイブリダイズするが他の配列とはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列次第であるが、異なる環境では異なるものとなる。長い配列は、短い配列よりも高い温度で、特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、定められたイオン強度およびpHで、特定の配列に対する融解温度（Tm）より約5℃低くなるよう選択される。Tmは、（定められたイオン強度、pHおよび核酸濃度のもとで）標的配列に相補的なプローブの50%が標的配列と、平衡状態でハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Tmでは、プローブの50%が平衡状態で占有されている。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約1.0 Mナトリウムイオンより低く、典型的にはpH7.0から8.3で、約0.01から1.0 Mナトリウムイオン（もしくは他の塩）であり、温度は短いプローブ、プライマーもしくはオリゴヌクレオチド（たとえば、10ntから50nt）に対しては少なくとも約30℃、もっと長いプローブ、プローブおよびオリゴヌクレオチドに対しては最低約60℃であるような条件といえる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化する薬剤を添加することによって達成されることもある。
ストリンジェントな条件は当業者に知られており、Ausubelら、(編)、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。少なくとも相互に約65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%または99%相同な配列が一般に、相互にハイブリダイズした状態を維持するような条件が好ましい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に関する非限定的な例は、65℃にて、6X SSC、50mM Tris-HCl (pH 7.5)、1mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA、および500mg/ml変性サケ精子DNAを含んでなる高塩濃度バッファー中でのハイブリダイゼーションと、それに続く1回または複数回の0.2X SSC、0.01% BSAによる50℃での洗浄である。ストリンジェントな条件下で、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34の配列とハイブリダイズする、本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に相当する。本明細書で使用される「天然に存在する」核酸分子は、自然状態で存在する（たとえば、天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するRNAもしくはDNAを指す。
第二の実施形態において、ストリンジェンシーが中程度の条件下で、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34、またはそれらの断片、類似体もしくは誘導体のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子とハイブリダイズすることができる核酸配列が与えられる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の限定的でない一例としては、55℃にて、6X SSC、5X Denhardt溶液、0.5% SDSおよび100mg/ml変性サケ精子DNA中でのハイブリダイゼーションと、それに続く1回または複数回の1X SSC、0.1% SDSによる37℃での洗浄が挙げられる。使用することができる中程度のストリンジェンシーを有する他の条件は、当技術分野でよく知られている。たとえば、Ausubelら、(編)、1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY、およびKriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NYを参照されたい。
第三の実施形態において、ストリンジェンシーの低い条件下で、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34、またはそれらの断片、類似体もしくは誘導体のヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子とハイブリダイズすることができる核酸配列が与えられる。ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件の限定的でない一例としては、40℃にて、35%ホルムアミド、5X SSC、50mM Tris-HCl (pH 7.5)、5mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100mg/ml変性サケ精子DNA、10% (w/v)硫酸デキストラン中でのハイブリダイゼーションと、それに続く1回または複数回の2X SSC、25mM Tris-HCl(pH7.4)、5mM EDTAおよび0.1% SDSによる50℃での洗浄がある。使用することができるストリンジェンシーの低い他の条件は、当技術分野でよく知られている（たとえば、異種間ハイブリダイゼーションに用いられる）。たとえば、Ausubelら、(編)、1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY、およびKriegler, 1990; GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY；Shilo & Weinberg, Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792(1981)を参照されたい。
保存的変異
集団において存在する可能性のあるEXOX配列の自然発生的な対立遺伝子バリアントに加えて、当業者には当然のことであるが、変異によって配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34のヌクレオチド配列内に変化を導入することができ、それによって、コードされるEXOXタンパク質のアミノ酸配列内に、前記EXOXタンパク質の機能上の能力を変えることなく、変化をもたらすことができる。たとえば、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35の配列において、「非必須」アミノ酸残基のアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、EXOXタンパク質の生物学的活性を変化させることなく同タンパク質の野生型配列から変更することができる残基であるが、これに対して「必須の」アミノ酸残基は、そうした生物学的活性に必要とされる。
「生物学的活性」もしくは「機能的活性」という用語は、自然の、もしくは正常な、EXOタンパク質の機能、たとえば、他のタンパク質を分解する能力を指す。本発明のEXOXタンパク質の間で保存されるアミノ酸残基は、特に変化しにくいと予想される。保存的置換を行うことができるアミノ酸は、当技術分野でよく知られている。当業者には当然のことであるが、核酸におけるそれぞれのコドン（AUGを除く、これは通常メチオニンに対する唯一のコドンである）を改変して、標準的な技法によって機能的に同一の分子を生じることができる。その上、コードされた配列において単一のアミノ酸もしくはアミノ酸の小部分（典型的には5%未満、より典型的には1%未満）を変更、付加もしくは欠失する、個別の置換、欠失もしくは付加は、その変化が結果としてアミノ酸を化学的に類似したアミノ酸で置換することとなる場合、「保存的変異」である。
本発明のもう一つの態様は、活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含むEXOXタンパク質をコードする核酸分子に関する。こうしたEXOXタンパク質は、アミノ酸配列が配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35とは異なるが、生物学的活性を保持する。ある実施形態において、単離された核酸分子は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、このタンパク質は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35のアミノ酸配列と少なくとも約45%相同なアミノ酸配列を含んでなる。好ましくは、核酸分子によってコードされるタンパク質は、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35と、少なくとも約60%相同であり；さらに好ましくは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35と、少なくとも約70%相同であり；いっそう好ましくは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35と、少なくとも約80%相同であり；さらにいっそう好ましくは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35と、少なくとも約90%相同であり；また、もっとも好ましくは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35と、少なくとも約95%相同である。
配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35のタンパク質と相同なEXOXタンパク質をコードする、単離された核酸分子は、1つもしくは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34のヌクレオチド配列中に導入することによって、作製することができるが、その結果1つもしくは複数のアミノ酸置換、付加もしくは欠失が、コードされるタンパク質中に導入される。
部位特異的変異誘発、PCRを介した変異誘発、およびDNAシャフリングといった標準的な技術によって、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、もしくは35に変異を導入することができる。好ましくは、1つもしくは複数の予想される非必須アミノ酸残基で保存的アミノ酸置換を行う。単一塩基の置換は、ヒトDNAに最もよく見られる変化の一つである。このような塩基の変化は、DNAのコード領域もしくは非コード領域において発生しうる。もしコード領域で生じる場合には、保存的もしくは非保存的置換である可能性がある。「保存的アミノ酸置換」は、同様の特性を有する新たなアミノ酸であり、アミノ酸が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されることである。非保存的置換は新たなアミノ酸を指示するが、それは異なる性質を有する。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の分類群は、当技術分野において定義されている。こうした分類群には、塩基性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（たとえば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）がある。したがって、保存的置換のために、EXOXタンパク質の予想される非必須アミノ酸残基を同じ側鎖群に属する別のアミノ酸で置換する。あるいはまた、別の実施形態において、たとえば、飽和変異誘発によって、EXOXコード配列の全体もしくは一部にランダムに変異を導入することができ、結果として得られた変異体をEXOXの生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32もしくは34の変異誘発後、コードされたタンパク質を、当技術分野で知られている任意の組換え技術によって発現させ、そのタンパク質の活性を測定することができる。
アミノ酸群の関連性は、側鎖の相互作用に基づいて決定することもできる。置換されるアミノ酸は、完全に保存された「強い」残基、または完全に保存された「弱い」残基とすることができる。保存されたアミノ酸残基の「強い」グループは、次の群：STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYWのうちのいずれかとすることができ、この場合アミノ酸の一文字コードは、相互に置換することができるアミノ酸でグループ化されている。同様に、保存された残基の「弱い」グループは、次のCSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、HFYのいずれかとすることができるが、この場合各グループの文字はアミノ酸の一文字コードを表す。
ある実施形態において、変異型EXOXタンパク質の（i）他のEXOXタンパク質、他の細胞表面タンパク質、もしくはその生物学的に活性な部分とタンパク質：タンパク質相互作用を生じる能力、（ii）変異型EXOXタンパク質とEXOXリガンドとの複合体の形成；または（iii）変異型EXOXタンパク質が細胞内標的タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分と結合する能力を、アッセイすることができる（たとえば、アビジンタンパク質）。
さらに別の実施形態において、変異型EXOXタンパク質の、特定の生物学的機能を制御する能力をアッセイすることができる（たとえばタンパク質分解活性）。
EXOXポリペプチド
本発明におけるポリペプチドとしては、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３および３５に提供される配列を有するEXOXポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられる。本発明にはまた、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３および３５に示される残基に対応する残基が変更されていながらも、なおかつ自身のEXOX活性および生理学的機能を維持し続けるタンパク質をコードする突然変異体または変異型タンパク質、あるいはその機能的な断片も含まれる。
一般に、EXOX様機能を保つEXOX変異体としては、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸で置換されている任意の変異体が挙げられ、さらに親タンパク質の２つの残基の間に追加の１または複数の残基が挿入される可能性が含まれ、また、親配列から１または複数の残基が欠失される可能性も含まれる。あらゆるアミノ酸の置換、挿入または欠失は本発明により包含される。好ましい状況に置いて、置換は上記に定義した保存的置換である。
本発明のある態様は、分離されたEXOXタンパク質、および生物学的に活性なその部分、あるいはそれらの誘導体、断片、類似体または相同体に関する。生物学的に活性な部分とは、正常な機能、例えばアミノペプチダーゼ活性に必要なEXOXタンパク質の領域のことを言う。抗EXOX抗体を誘導するための免疫原としての使用に適したポリペプチド断片もまた提供される。ある実施形態において、天然型EXOXタンパク質は、細胞、組織源または培養上清から、適当なタンパク質精製技術を用いた適当な精製スキームにより、分離することができる。別の実施形態において、EXOXタンパク質は組換えDNA技術により生産される。組換え発現の代わりに、標準的タンパク質合成技術を用いてEXOXタンパク質またはポリペプチドを化学合成することもできる。
「分離された」または「精製された」ポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的に活性な部分とは、EXOXタンパク質を誘導した細胞または組織源からの他の汚染タンパク質または細胞性物質を実質的に含まないか、または化学合成した場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないものである。「細胞性物質を実質的に含まない」という用語には、タンパク質が分離または組換え的に産生された細胞の細胞性成分から分離されているEXOXタンパク質の調製物が含まれる。ある実施形態において、「細胞性物質を実質的に含まない」という用語には、約30％(乾燥重量で)未満の非EXOXタンパク質(本明細書において「汚染タンパク質」とも言う)、より好ましくは約20％未満の非EXOXタンパク質、さらにより好ましくは約10％未満の非EXOXタンパク質、および最も好ましくは約5％未満の非EXOXタンパク質しか有さないEXOXタンパク質の調製物が含まれる。EXOXタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え的に産生された場合、それもまた好ましくは培地の成分を実質的に含まないものである。例えば培地成分は、EXOXタンパク質調製物の約20％未満、より好ましくは約10％未満、および最も好ましくは約5％未満に相当するものであってよい。
「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語には、EXOXタンパク質が、タンパク質の合成にかかわる化学的前駆体または他の化学物質から分離されているEXOXタンパク質の調製物が含まれる。ある実施形態において、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語には、約30％(乾燥重量で)未満の化学的前駆体または非EXOX化学物質、より好ましくは約20％未満の化学的前駆体または非EXOX化学物質、さらにより好ましくは約10％未満の化学的前駆体または非EXOX化学物質、および最も好ましくは約5％未満の化学的前駆体または非EXOX化学物質を有するEXOXタンパク質の調製物が含まれる。さらに、「化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」には、酸化副産物(を含まないこと)が挙げられる。当業者ならばどのように酸化を防止したらよいか、例えば化学物質を無酸素環境の状態にしておくことなどを熟知している。
EXOXタンパク質の生物学的に活性な部分としては、EXOXタンパク質のアミノ酸配列(例えば、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３または３５に示されるアミノ酸配列)から誘導された、またはそれらと十分に相同であるアミノ酸配列を含み(これには完全長EXOXタンパク質よりも少ないアミノ酸を含むものも含まれる)、かつEXOXタンパク質の少なくとも1種の活性を示すプチドが挙げられる。典型的には、生物学的に活性な部分は、EXOXタンパク質の少なくとも１種の活性を伴うドメインまたはモチーフを含む。EXOXタンパク質の生物学的に活性な部分は、長さが例えば10、25、50、100またはそれ以上のアミノ酸残基のポリペプチドであってもよい。
さらに、タンパク質の他の領域が欠失されている、他の生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製することができ、天然型EXOXタンパク質の１種以上の機能的活性について評価することができる。
ある実施形態において、EXOXタンパク質は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３または３５に示されるアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、EXOXタンパク質は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３または３５と実質的に相同であり、かつ配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３または３５のタンパク質の機能的活性を保持し続け、しかしながら下記に詳述するような天然の対立遺伝子の変異または突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる。従って、別の実施形態においては、EXOXタンパク質は、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３または３５のアミノ酸配列に少なくとも約90％相同なアミノ酸配列を含むタンパク質であり、かつ配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３または３５のEXOXタンパク質の機能的活性を保持する。本明細書において用いる、「生物学的活性」または「機能的活性」とは、EXOXタンパク質の天然のまたは正常な機能、例えば他のタンパク質を分解する能力のことを言う。
２以上の配列の間の相同性の決定
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の類似性または相同性のパーセントを決定するためには、配列を最適な比較目的のためにアラインさせる(例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸または核酸配列にギャップを導入してもよい)。次に、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、これらの分子はその位置において相同である(すなわち本明細書において用いるアミノ酸または核酸「相同性」はアミノ酸または核酸「同一性」と同等である)。
核酸配列の相同性は、２つの配列の間の同一性の度合いとして決定することができる。相同性は、例えばGCGプログラムパッケージ中に提供されるGAPソフトウェアなど、当技術分野で公知のコンピュータプログラムを用いて決定してもよい。Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 1970を参照のこと。核酸配列比較のために5.0のGAP創作ペナルティーと0.3のGAP延長ペナルティーという設定でGCG GAPソフトウェアを使用した場合、上記の類似核酸配列のコード領域は、配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２および３４に示すDNA配列のCDS(コード)部分と、好ましくは少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、または99％程度の同一性を示す。
「配列同一性」という用語は、比較される特定の領域において、残基対残基ベースでの２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が同一である度合いのことを言う。「配列同一性の百分率」という用語は、比較される領域において２つの最適にアラインされた配列を比較して、両方の配列に存在する同一の核酸塩基（例えば核酸についてはA、T、C、G、UまたはI）が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を生じ、マッチした位置の数を比較する領域の全ての位置の数(例えばウィンドウの大きさ)で割り、その結果に100を掛けて配列同一性の百分率を得ることにより計算する。本明細書において用いる「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴であって、ポリヌクレオチドが比較する領域について参照する配列と比較して少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも85％の配列同一性、しばしば90〜95％の配列同一性、より一般的には少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
キメラタンパク質および融合タンパク質
本発明はまた、EXOXキメラタンパク質または融合タンパク質を提供する。本明細書において用いる「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非EXOXポリペプチドと機能しうるように結合したEXOXポリペプチドを含む。「EXOXポリペプチド」は、EXOXタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチド(配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３または３５)のことを言い、これに対して「非EXOXポリペプチド」は、EXOXタンパク質と実質的に相同ではないタンパク質、例えばEXOXタンパク質とは異なるタンパク質であって、かつ同じまたは異なる生物から誘導されるタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを言う。EXOX融合タンパク質内において、EXOXポリペプチドはEXOXタンパク質の全てまたは一部に対応してもよい。ある実施形態において、EXOX融合タンパク質は、EXOXタンパク質の少なくとも1つの生物学的に活性な部分を含んでなる。別の実施形態において、EXOX融合タンパク質は、EXOXタンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含んでなる。さらなる実施形態において、EXOX融合タンパク質はEXOXタンパク質の少なくとも３つの生物学的に活性な部分を含んでなる。融合タンパク質内において、「機能しうるように結合した」という用語はEXOXポリペプチドと非EXOXポリペプチドとが互いにインフレーム(in frame)で融合されていることを表すことを意図する。非EXOXポリペプチドは、EXOXタンパク質のN末端および／またはC末端に融合することができる。
ある実施形態において、融合タンパク質はGST-EXOX融合タンパク質であって、ここでEXOX配列はGST(グルタチオンS-トランスフェラーゼ)のC末端に融合されている。このような融合タンパク質は組換えEXOXポリペプチドの精製を容易にすることができる。
別の実施形態において、融合タンパク質は、そのN末端において異種のシグナル配列を含有するEXOXタンパク質である。特定の宿主細胞において(例えば哺乳動物宿主細胞)、EXOXの発現および／または分泌は、異種のシグナル配列の使用により増強することができる。
さらなる実施形態において、融合タンパク質はEXOX-免疫グロブリン融合タンパク質であって、EXOX配列が免疫グロブリンタンパク質ファミリーのメンバーから誘導された配列に融合されたものである。本発明のEXOX免疫グロブリン融合タンパク質は、医薬組成物に組み入れることができ、そして被験者に投与して細胞の表面におけるEXOXタンパク質とEXOXリガンドとの間の相互作用を阻害し、そのことによりin vivoのEXOX仲介シグナル伝達を抑制することができる。EXOX免疫グロブリン融合タンパク質は、EXOXと同族のリガンドのバイオアベイラビリティに影響を及ぼすために使用することができる。EXOXリガンド／EXOX相互作用の阻害は、増殖性疾患および分化的疾患の治療ならびに細胞生存の改変(例えば促進または阻害)の両方に治療学的に有用でありうる。さらに、本発明のEXOX免疫グロブリン融合タンパク質は、免疫原として被験者中において抗EXOX抗体を産生させ、EXOXリガンドを精製し、またEXOXとEXOXリガンドとの相互作用を阻害する分子を特定するスクリーニングアッセイに使用することができる。
本発明のEXOXキメラタンパク質または融合タンパク質は、標準的組換えDNA技術により産生することができる。例えば、種々のポリペプチド配列をコードするDNA断片は、慣用技術(例えば連結のために平滑末端または突出末端を用いること、適切な末端を提供するための制限酵素消化、粘着末端を適切に埋めること、望ましくない連結を回避するためのアルカリフォスファターゼ処理、および酵素連結を用いることなど)に従ってインフレームで連結される。別の実施形態において、融合遺伝子は自動化されたDNA合成装置などを含む慣用の技術によって合成することができる。あるいはまた、遺伝子断片のPCR増幅を、２つの連続した遺伝子断片の間の相補的な突出部を生じるアンカープライマーを用いて行うことができるが、これらの断片は、続けてアニーリングし再度増幅してキメラ遺伝子配列を生成させることができる(例えばAusubel ら(eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1992)を参照されたい)。さらに、融合部分(例えばGSTポリペプチド)を既にコードしている発現ベクターが多く市販されている。EXOXをコードする核酸を、融合部分がEXOXタンパク質にインフレームで連結されるように、発現ベクターにクローニングすることができる。
EXOXアゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、EXOXアゴニスト(例えば擬似体)またはEXOXアンタゴニストとして機能するEXOXタンパク質の変異体に関する。EXOXタンパク質の変異体は、突然変異誘発(EXOXタンパク質の個々の点突原変異誘発または短縮)により製造することができる。EXOXタンパク質のアゴニストは、天然に生ずる形態のEXOXタンパク質の生物学的活性と実質的に同じもの、またはそのサブセットを保持できる。EXOXタンパク質のアンタゴニストは、天然に生ずる形態のEXOXタンパク質の１以上の活性を阻害することができ、例えば、細胞性シグナルカスケードの下流または上流のメンバー(EXOXタンパク質が含まれる)に競合的に結合することができる。このことから、機能を限定した変異体を用いた治療により、特定の生物学的効果を引き出すことができる。ある実施形態において、天然に生ずる形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する変異体で被験者を治療することは、天然に生ずる形態のEXOXタンパク質での治療と比較して、被験者における副作用が少ない。
EXOXアゴニスト(例えば擬似体)またはEXOXアンタゴニストとして機能するEXOXタンパク質の変異体は、EXOXタンパク質の変異体(例えば短縮変異体)の組み合わせライブラリーをスクリーニングすることにより、EXOXタンパク質作用活性または拮抗活性について同定することができる。ある実施形態において、EXOX変異体の変化を与えたライブラリーは、核酸レベルでの組み合わせ突然変異誘発により作製され、変化を与えた遺伝子ライブラリーによりコードされる。EXOX変異体の変化を与えたライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的に連結させることにより製造できる。このようにして可能性のあるEXOX配列の縮重セットを個別のポリペプチドとして、あるいはまたEXOX配列をその中に含む大きな融合タンパク質のセット(例えばファージディスプレイ)として発現可能である。縮重したオリゴヌクレオチド配列から可能セルのあるEXOX変異体のライブラリーを作製するために使用することができる色々の方法がある。縮重した遺伝子配列の化学合成は自動化DNA合成装置で行うことができ、次に合成した遺伝子を適当な発現ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットを使用することは、１つの混合物中に、可能性のあるEXOX配列の所望のセットをコードする全ての配列を供給することを可能にする。縮重したオリゴヌクレオチドの合成法は、当技術分野では広く知られている。例えばNarang, Tetrahedron 39:3 (1983); Itakuraら, Annu. Rev. Biochem. 53:323 (1984); Itakuraら, Science 198:1056 (1984); Ikeら, Nucl. Acids Res. 11:477 (1983)を参照のこと。
ポリペプチドライブラリー
さらに、EXOXタンパク質をコードする配列の断片のライブラリーは、スクリーニングとその後のEXOXタンパク質の変異体の選択のための、EXOX断片の変化を与えた集団を作製するために用いることができる。ある実施形態においては、コード配列断片のライブラリーを次のようにして作製することができる：EXOXをコードする配列の二本鎖PCR断片を、一分子あたり１箇所しかニックが生じないような条件下でヌクレアーゼで処理し、二本鎖DNAを変性させ、種々のニックされた産物からのセンス／アンチセンスペアを含みうるような二本鎖DNAが形成されるようDNAを復元させ、S1ヌクレアーゼで処理することにより再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、結果として得られる断片のライブラリーを発現ベクターに連結する。この方法により、EXOXタンパク質の種々の大きさのN末端および内部の断片をコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
点突然変異または短縮により作製された組み合わせライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングすること、およびcDNAライブラリーを選択された性質を有する遺伝子産物についてスクリーニングすることについては、当技術分野では種々の手法が知られている。そのような手法は、EXOXタンパク質の組み合わせ突然変異誘発により作製された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適合させることができる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、高スループット解析を容易にできる、最も広く用いられる手法としては、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、結果として得られるベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、所望の活性の検出が、検出された産物の遺伝子をコードするベクターの単離を容易にする条件下で組み合わせ遺伝子を発現させること、が挙げられる。再帰的集合突然変異誘発（Recursive ensemble mutagenesis, REM）というライブラリー中の機能的な変異体の頻度を高めるする新しい手法を、EXOX変異体を同定するスクリーニングアッセイと組み合わせて用いても良い。例えばArkin & Yourvan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811 - 7815 (1992); Delgraveら, Protein Engineering 6:327 - 331 (1993)を参照のこと。
ライブラリーはDNAシャフリングによっても作製することができる。DNAシャフリングは、機能が関連している、異なる種または遺伝子からの関連遺伝子を用い、それらを断片化し、組換えを通してそれらを再び組み立てる。次に組み換えた遺伝子が使用可能なまたは興味ある可能性のある産物を含むか判別することができる。有用であることが見出されたあらゆる遺伝子は、再び断片化され再び組み立てられて新しい組み換え遺伝子が形成される。異なる種および遺伝子の種々の断片をアニールさせ伸長させることにより、ライブラリー中では多様性が生み出される。このプロセスは興味あるタンパク質が見つかるまで実施してもよい。DNAシャフリングを用いて組み換え遺伝子を生み出すのに重要な因子としては、アニーリングが起こる温度、遺伝子の類似性およびDNA断片の大きさが挙げられる。
Stemmerら, Nature 370:389-391 (1994); Stemmer, Proc. Natl. Acad. USA 91:10747-10751 (1994);米国特許第5,603,793号;米国特許第5,830,721号; および米国特許第5,811,238号を参照により本明細書に組み入れるが、これらは、次のことについて記載している：例えば突然変異誘発、シャフリングおよび選択を繰り返すサイクルによるin vitroタンパク質シャフリング方法、ならびに提示されたペプチドおよび抗体のライブラリーの種々の作製方法、ならびにDNA断片化に続く種々のDNA再組み立て手法、ならびにこれらのin vitroおよびin vivoでの突然変異誘発への応用。さらに、当技術分野ではDNAシャフリング手法の種々の応用もまた周知である。上述の刊行物に加え、再帰的なシャフリング手法により新しい代謝経路の進化およびバイオプロセシングの増強を提供する米国特許第5,837,458号、ならびに抗体ファージライブラリーについての抗体シャフリングを開示するCrameriら, Nature Medicine 2(1):100-103 (1996)を参照されたい。WO95/22625, WO97/20078, WO96/33207, WO97/33957, WO98/27230, WO97/35966, WO98/31837, WO98/13487, WO98/13485およびWO989/42832も参照のこと。
発現ベクター
本発明の別の態様は、ベクター、好ましくはEXOXタンパク質またはその誘導体、断片、類似体または相同体をコードする核酸を含有する発現ベクターに関する。本明細書において用いる「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子のことを言う。ベクターの１つの種類は「プラスミド」であり、これはさらなるDNA断片を連結することができる環状二本鎖DNAループのことを言う。別の種のベクターはウイルスベクターであり、この場合追加のDNA断片をウイルスゲノム内に連結することができる。特定のベクターは、それらを導入した宿主細胞内において自律的複製能力を有する(例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入により宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、そのことにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらに機能しうるように結合されている遺伝子の発現を指令することができる。このようなベクターを本願明細書において「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組み換えDNA技術に用いられる発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドが最も良く用いられる形態のベクターであることから、「プラスミド」と「ベクター」は相互に交換可能なように用いられる。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクター、例えばウイルスベクター(例えば複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)などを包含することを意図する。
機能性タンパク質の産生は、そのタンパク質を産生する生物の細胞性機構部分と深く関連している。Escherichia coli(大腸菌)は一般的に多くのタンパク質の発現のための「工場」として選択されてきた。なぜならば、E. coliのゲノムは完全にマッピングされており、この生物が取り扱いが容易で、迅速に増殖し、増殖には安価で調製しやすい培地しか要求せず、タンパク質の回収を容易にするようにタンパク質を培地中に分泌する。しかしながら、E. coliは原核生物であり、真核生物には存在する小胞体およびゴルジ装置(これらは産生されているタンパク質を修飾する酵素を含有する)などの細胞内の細胞小器官を欠く。多くの真核生物タンパク質はE. coli中で産生可能であるが、グリコシル化または翻訳後修飾が起こらないことから、これらは機能しない、未完成の形態で産生されうる。
従って、研究者達は最近、タンパク質産生のために、真核生物の酵母、哺乳動物および植物発現系に方向を変えた。例えば、メタノール資化性酵母Pichia pastorisは、ここ数年間でタンパク質の異種発現のための強力な宿主となり、高いスループット技術を伴ってヒトタンパク質発現用の代替となる真核生物宿主として認められている。
別の例として、植物は大規模なタンパク質の異種発現用の発現宿主として利用されており、慣用の発現系に対して費用対効果、拡張性および安全性といった潜在的利点を提供する。現在、種々の植物異種発現系があり、その例としては一過性発現、植物細胞懸濁物培養、組み換え植物ウイルスおよびクロロプラスト形質転換系などが挙げられる。植物中で発現するタンパク質は哺乳動物タンパク質とはいくらか異なるが(例えばグリコシル化)、こうした違いがヒト患者において不利な反応を生じる証拠は今のところない。例えばJulianら, Nat. Rev. Gen. 4:794-805 (2003)を参照されたい。
別の適当な異種発現系は、昆虫細胞を、多くの場合バキュロウイルス発現ベクターと組み合わせて用いる。培養する昆虫細胞、例えばSF9細胞、中で発現させるタンパク質に利用可能なバキュロウイルスベクターとしては、pAcシリーズ(Smithら, Mol. Cell. Biol. 3: 2156 - 2165 (1983))およびpVLシリーズpVL series (Lucklow & Summers, Virology 170: 31 - 39 (1989))が挙げられる。
本発明の宿主細胞もまた、非ヒトトランスジェニック動物であって、そのゲノムに外来性配列を導入されたものを作製するために使用することができる。トランスジェニック動物は、動物の１以上の細胞が導入遺伝子を有する非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどの齧歯類である。遺伝子組換え動物の他の例としては、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。胚操作またはマイクロインジェクション法によってトランスジェニック動物、特にマウスのような動物を作る方法は、当技術分野において今や慣用的なものとなり、例えば米国特許第4736866号、第4870009号、第4873191号およびHogan, 1986: Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.などに記載されている。他のトランスジェニック動物の発生のためには、類似の手法が用いられる。
Pichia pastoris発現系
真核生物酵母の例の１つはメタノール資化性のPichia pastorisである。P. pastorisは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離されクローニングされて以来、外来タンパク質産生用の優れた宿主として開発されてきた。P. pastorisの形質転換は、1985に初めて報告された。P. pastorisの異種タンパク質発現系はPillips Petroleumにより開発された。例えば米国特許第4855231号、第4857467号、4879231号、および4929555号を参照されたい。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れる。この系は現在、Invitrogvenにより市販されている。他の真核生物発現系と比べて、P. pastorisは多くの利点を提供する、なぜならば、P. pastorisは細菌に関連した内毒素問題がなく、動物細胞培養で産生されるタンパク質におけるウイルス汚染問題もないからである。さらに、P. pastorisはグルコースの不在下でメタノールを炭素源として利用することができる。P. pastoris発現系は、メタノール誘導性アルコールオキシダーゼ（AOX1)プロモーターを使用するが、これはメタノールの代謝の第一段階を触媒する酵素であるアルコールオキシダーゼの発現をコードする遺伝子を制御するものである。このプロモーターは特徴付けられており、一連のP. pastoris発現ベクターに組み込まれている。P. pastoris中で産生されるタンパク質は一般的には正しくおりたたまれ培地中に分泌されることから、遺伝子改変P. pastorisの発酵は、E. coli発現系と比べて優れた代替手段を提供する。さらにP. pastorisは、発現させたタンパク質を自発的にグリコシル化する能力を有し、これもまたE. coliと比較した場合の利点である。この発現系を用いていくつかのタンパク質が発現されてきたが、そうしたものとしては例えば破傷風毒素フラグメント、百日咳菌パータクチン、ヒト血清アルブミンおよびリゾチームが挙げられる。
EXOXタンパク質を用いたタグ除去
細菌中で発現される組換えタンパク質の迅速なそして効率的な精製を可能にするために、いくつかのシステムが開発されてきた。これらのシステムのほとんどは、タンパク質を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST)ドメイン、カルモジュリン結合ペプチド（CBP)またはHisタグとの融合タンパク質として発現することを基にする。例えば、ポリペプチドをインフレームでグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST)と発現させることは、非変性条件で、グルタチオンアガロースを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより細菌粗抽出物からの融合タンパク質の精製を可能にする。
さらにこのベクター発現系は一般に、細菌融合タンパク質のタンパク質分解を容易にするための特異的プロテアーゼ切断サイトを組み入れるが、そのサイトは用いるベクターに依存したトロンビン、エンテロキナーゼまたは第Xa因子などの切断サイトである。トロンビンは、認識配列Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser (配列番号:44)を含有する標的タンパク質を特異的に切断する。エンテロキナーゼ切断サイトは、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓(配列番号:45)である。エンテロキナーゼ同様、第Xa因子は認識する配列Ile-Glu-Gly-Arg↓(配列番号:46)のC末端側を切断し、このことから適切に設計された構築物から全てのベクターによりコードされる配列を除去するために使用できる。今やこれらの酵素は全て、汚染プロテアーゼによって起こる二次的切断を回避するために高純度で市販されている。これらの酵素は、キット(多くの場合、酵素捕獲用の全てのツールが含まれる)中に提供されるか、または切断反応媒体からの酵素の除去を容易にするためにビオチン化されて提供される。さらに最近、Qiagen社はまた、タンパク質からN末端のHisタグを効率的に除去するTAGZymeシステムを開発したが、これはN末端から、↓Lys-Xaa-、↓Arg-Xaa-、↓Xaa-Xaa-Pro-Xaa-、↓Xaa-Pro-Xaa-Xaa-または↓Gln-Xaa-のいずれかである「停止点」アミノ酸モチーフまで連続してジペプチドを切断するエキソペプチダーゼを伴うものである。
精製後に組換えタンパク質から必ずしも短いHisアフィニティータグを除去する必要はないものの(His残基の数にかかわらず)、タグの除去が望ましいいくつかの用途、例えばX線結晶学またはNMRによる構造解析などがある。同じことは用いた発現系に関連する、トロンビン切断サイトのGly-Ser残留残基または他に存在しうるN末端の補足的アミノ酸残基についても言える。
アフィニティー精製に対するより新しいアプローチは、カルボニル基と２つの近接したの求核性の基を有する分子との間の縮合反応を利用することを含む。２つの近接した求核性の基を有するアミノ酸の例としては、例えばセリン、トレオニンおよびシステインが挙げられる。タンパク質またはペプチドを精製することは、例えばN末端システイン、トレオニンまたはセリン残基と適当な樹脂との間に形成される可逆的な共有結合を形成させることを伴う。Villainら, Chem. & Biol. 8:673-679 (2001)を参照されたい。残基のペア、例えばThr-Pro, Cys-ProまたはSer-Proを、化学合成によって得られたタンパク質(ペプチド)または組換えタンパク質のN末端に付加することは、２段階精製を可能にする：(1)共有的捕捉による精製;および(2)ジペプチドタグの除去。この方法は、ジペプチドフラグ配列のない、成熟した形態の組換えタンパク質の効率的な回収を可能にする。
EXOXタンパク質のリバースタンパク質分解活性
本発明の別の態様は、１以上のEXOXタンパク質のリバースタンパク質分解活性を用いることにより、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはアクセス可能な第二級アミンを有する任意の組成物に、１以上のアミノ酸を付加することに関する。本明細書において用いる「リバースタンパク質分解活性」という用語は、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、またはアクセス可能な第二級アミンを有する任意の組成物への、１以上のアミノ酸の付加を触媒する酵素活性のことを言う。当業者ならば、適当な熱力学的条件下では、タンパク質分解酵素がリバースタンパク質分解活性を有しうると理解するであろう。
リバースタンパク質分解活性を有するタンパク質分解酵素の例はトリプシンであるが、これは陽性に荷電したリジンおよびアルギニン側鎖に基づく基質特異性を有する膵臓セリンプロテアーゼである。トリプシンは、ブタインシュリンからのヒトインシュリンの製造に広く用いられているが、ブタインシュリンはヒト形態と類似しているものの、B鎖の最後のアミノ酸残基がトレオニンではなくアラニンである。トリプシンの存在下で、ブタインシュリンをトレオニンエステルと反応させると、末端アラニンを除去してトレオニンエステルを付加することによりヒトインシュリントレオニンエステルが得られる。その後ヒトインシュリントレオニンエステルをトリフルオロ酢酸で処理するとエステルは加水分解されヒトインシュリンが得られる。
いくつかの実施形態においては、EXOXタンパク質をリバースタンパク質分解的反応を触媒するために用いる。いくつかの事例において、ポリペプチドに１以上のアミノ酸を付加することを可能にする条件下で、EXOXタンパク質をポリペプチドと１以上のアミノ酸とともにインキュベートする。
本発明のEXOXタンパク質をリバースタンパク質分解的酵素として使用することには、複数の用途がある。例えば、EXOXタンパク質のリバースタンパク質分解活性は、ポリペプチド鎖の合成に使用することができる。EXOXタンパク質はまた、アミノ酸、ポリペプチドまたはアクセス可能な第二級アミンを有する任意の組成物に、１以上のアミノ酸を付加させるためのカップリング物質として使用することができる。
医薬組成物
本発明のEXOX核酸分子、EXOXタンパク質、および抗EXOX抗体(本明細書において「活性化合物」とも言う)ならびにその誘導体、フラグメント、類似体、および相同体は、投与に適した医薬組成物に組み入れてもよい。このような組成物は典型的には前記核酸分子、タンパク質または抗体と製薬上許容可能な担体とを含む。本明細書において用いる「製薬上許容可能な担体」とは、薬剤の投与に適合可能な任意のそして全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。適当な担体はRemington’s Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されているが、これは当技術分野の標準的な参考テキストであり、参照により本明細書に組み入れる。このような担体または希釈剤の好適な例としては、限定するものではないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および5％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームならびに不揮発性油などの非水性ビヒクルもまた使用可能である。このような媒体および薬剤を製薬上活性な物質として使用することは当技術分野において周知である。あらゆる慣用の媒体または薬剤が活性化合物と適合不可能な範囲を除いて、本発明の組成物におけるそれらの使用は熟考される。補助的な活性化合物もまた、本発明の組成物に組み入れてもよい。
カプセル化技術もまた多くの産業において広く利用されている。例としては、薬剤の制御された放出のための医薬、食品および飲料中の色素、食品中の抗酸化剤、および農業における昆虫フェロモンの制御された放出などが挙げられる。カプセル、マイクロカプセルおよびミクロスフェアは、粒子マトリックス内にまたは粒子表面に付着された活性成分を含有する、小さな球状粒子である。例えば、生分解性アルギネート微粒子内のカプセル化が示されている。バイオカプセル化技術は、細胞、酵素、および生物学的に活性な物質をカプセル化することを意図する。
本発明の医薬組成物は、それについて意図される投与経路と適合するように配合される。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口(例えば吸入)、経皮(例えば局所)、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用に用いる溶液または懸濁液は、次の成分を含んでもよい：注入のための水のような無菌の希釈剤、生理食塩水溶液、揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど張性を調節するための物質。pHは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチックで作られたアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入されてもよい。
注入の使用に適した医薬組成物としては、無菌水溶液(水溶性の場合)または無菌分散液、ならびに、無菌性の注入可能な溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末が挙げられる。静脈投与については、適当な担体としては生理食塩水、静菌性の水、Cremophore EL(商標)(BASF、Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。いずれの場合についても、組成物は無菌である必要があり、易注入性が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は製造および貯蔵の条件下で安定である必要があり、微生物、例えば細菌、菌類またはウイルスによる汚染から保存される必要がある。担体は溶媒または分散媒体であって、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合液を含むものであってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を用いること、分散液の場合については必要とされる粒径を維持すること、および界面活性剤を使用することなどにより維持することができる。微生物の活動の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、などで達成することができる。多くの場合については、組成物中に等張剤を含むことが好ましく、等張剤としては、例えば、糖、ソルビトール、マンニトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムが挙げられる。注入可能な組成物の持続的な吸収は、組成物に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどを追加することによりもたらすことができる。
無菌性の注入可能な溶液は、必要により活性化合物(例えばEXOXタンパク質または抗EXOX抗体)を必要量で適当な溶媒中で、上記に列挙した成分１つとまたはそれらの組み合わせと共に組み入れ、次いで濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、基礎となる分散媒体および上記に列挙した他の成分のうちの必要なものを含有する無菌ビヒクル内へ、活性化合物を組み入れることにより調製される。無菌性の注入可能な溶液を調製するための無菌粉末については、調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であるが、これは前もって無菌濾過した溶液からの任意の追加の所望の成分をプラスして活性成分の粉末が得られるものである。
T. rubrumまたはEXOXを産生するトランスジェニック菌類の細胞培養物からのクルード調製物、あるいはT. rubrumまたはEXOXを産生するトランスジェニック菌類から精製されたEXOXは、プロテアーゼが分泌されることから、経口投与することが可能である。経口用組成物は一般に不活性な希釈剤または食用の担体を含む。これらはゼラチンカプセルに封入するかまたは錠剤へと圧縮することができる。経口の治療的投与のためには、活性化合物を、賦形剤とともに組み入れることができ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用することができる。経口用組成物はまた、マウスウォッシュとして使用する流体担体を用いて調製することができるが、この場合流体担体中の化合物は経口適用され、漱がれ吐き出されるかまたは飲み込まれる。製薬上適合可能な結合剤および／またはアジュバント物質を、組成物の一部として含ませることができる。錠剤、ピル、カプセル剤、トローチ剤などは任意で以下の成分または類似の性質を有する化合物を含有してもよい：微結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル(Primogel)またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロート(Sterotes)などの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；あるいはペパーミント、メチルサリチル酸、またはオレンジ香味料などの香味料物質。
吸入による投与については、化合物は、加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で送達されるが、この加圧容器またはディスペンサーは例えば二酸化炭素などのような適当な高圧ガス、またはネブライザーを収容するものである。
全身投与もまた、経粘膜または経皮的方法によりなされてもよい。経粘膜または経皮投与については、浸透すべきバリアーに対して適当な浸透剤を配合物に使用する。このような浸透剤は当技術分野で広く知られており、例としては例えば、経粘膜投与については、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって行うことができる。経皮投与については、活性成分は、当技術分野で広く知られている通り軟膏、外用軟膏、ゲルまたはクリームへと配合される。
化合物はまた、坐剤（例えばココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用の坐剤用基剤とともに）または直腸送達のための滞留浣腸の形態で調製することができる。
ある実施形態において、活性化合物は、身体からの迅速な排出に対して化合物を保護する担体とともに調製されるが、その例としては、埋め込み剤およびマイクロカプセル化された送達システムなどを含む制御放出配合物が挙げられる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性で生物適合性ポリマーを使用することができる。このような配合物の調製方法は、当業者にとって明らかとなるであろう。これらの物質はまた、例えばAlza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc.から市販されているものを入手することができる。リポソーム懸濁物(例えばウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を伴う、感染細胞を標的とするリポソームが挙げられる)もまた製薬上許容可能な担体として使用することができる。こうしたものは、例えば米国特許第4522811号に記載されているように、当業者に知られた方法により調製することができる。
経口用または非経口用組成物を、投与しやすいように、そして用量を均一にするために、用量単位剤形として配合することは特に有利である。本明細書において用いる用量単位剤形とは、治療すべき被験者用のための単位用量として適した物理的に別個の単位であり；各単位は必要とされる製薬上の担体と共同して所望の治療的効果を発生させるように計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を含有する。本発明の用量単位剤形の詳細は、活性化合物特有の性質および達成すべき特定の治療的効果、ならびに個体の治療のために前記のような活性化合物を配合する分野固有の制限によって決定され、そしてそれに直接依存する。
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入することができ、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、被験体に、例えば静脈内注入、局所投与(例えば米国特許第5328470号を参照されたい)または定位注入(例えばChen,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054 - 3057 (1994)を参照のこと)により送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含んでもよく、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた低速放出マトリクスを含んでもよい。あるいはまた、完全な遺伝子送達ベクターを組換え細胞から原型を保って産生することができる場合、例えばレトロウイルスベクターについては、医薬調製物は前記遺伝子送達システムを産生する１以上の細胞を含んでもよい。
医薬組成物は、容器、パックまたはディスペンサーに、投与用の説明書とともに含まれてもよい。
実施例１：材料及び方法
菌株およびプラスミド
臨床単離株であるTrichophyton rubrum CHUV 862-00を本研究に用いた。バクテリオファージλEMBL3(Promega, Wallisellen, Switzerland)の増殖のためには、Escherichia coli LE392を使用した。全てのプラスミドサブクローニング実験は、E. coli DH5αで、プラスミドpMTL2Iを用いて行った(Chambersら, Gene 68:139-149 (1988))。組換えペプチダーゼを発現させるためには、Pichia pastoris GS1 15および発現ベクターpKJ113(Borg-von Zepelinら, Mol. Microbiol. 28:543-554 (1998)))を使用した。当技術分野では多量の組換えタンパク質を発現させるためにP. pastorisを利用できることが知られている。
T. rubrum増殖培地
T. rubrumはサブロー寒天および液体培地(Bio〜Rad, Munchen, Germany)上で増殖させたか、またはタンパク質分解活性の産生を促進するために、唯一の窒素源および炭素源として0.2％大豆タンパク質((Supro 1711, Protein Technologies International, St.Louis, MO))を含有する液体培地で増殖させた。この培地には塩を全く添加しなかった。当業者ならば、培地に塩を添加した増殖培地もまた利用可能であることを認識するであろう。800mlの組織培養フラスコ中で、100mlの液体培地に新鮮な増殖中の菌糸体のプラグを接種した。培地を振とうせずに30℃で10日間インキュベートした。
ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリー
T. rubrumゲノムDNAライブラリーを、新鮮な増殖中の菌糸体から単離されたDNAを用いて作製した。（Yeltonら, Proc. NatI. Acad. Sci. USA. 81:1470-1474 (1984)）。このDNAをSau3Aで部分消化し、低融点アガロース(Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland)から12〜20kbのDNA断片を、アガラーゼ（Roche Diagnostics）を用いて分離した。これらのDNA断片を、適当なクローニング系システムを用いてバクテリオファージλEMBL3に挿入した(Promega)。
T. rubrum cDNAライブラリーは、マイクロ量mRNAシステムと500μgの全RNAを用いて、pSPORT6プラスミド(Invitrogen Life Technologies; Rockville, Maryland, USA)中に作製した。このRNAは、大豆タンパク質液体培地(10×100ml)中で10日間経った培地から調製した。菌糸体は、乳棒と乳鉢を用いて液体窒素下で微粉へと粉砕され、植物および菌類用のRNeasy 全RNA精製キット(Qiagen, Basel, Switzerland)を用いて全RNAを分離した。
Aspergillus fumigatus cDNAライブラリーは、唯一の窒素源および炭素源として0.2％コラーゲンを含有する液体培地で30℃で40時間培養されたCHUVI 92-88株を用いて以前に構築された(Monodら, 1991)。記載された手順(Applegate およびMonod)に従って全RNAを抽出し、mRNAは、標準的プロトコル(Sambrookら, 1989)に従ってオリゴ(dT)セルロース(Sigma, Buchs, Switzerland)を用いて精製した。このmRNAを用いて、λファージgt11（Promega）および製造業者のプロトコルを使用してライブラリーを作製した。表１３はアミノペプチダーゼをコードするT. rubrumおよびA. fumigatus遺伝子を示す。
Figure 2007531504
LAP遺伝子クローニング
ゲノムライブラリーの組換えプラーク(104)を、GeneScreenナイロンメンブレン(NEN Life science products, Boston, MA)上に固定した。フィルターを低ストリンジェンシー条件を使用して32P標識プローブでハイブリダイズさせた。Monodら, Mol. Microbiol. 13:357-368 (1994)。全ての陽性プラークを精製し、関連していたバクテリオファージDNAを、Grossbergerに記載された通りに単離した。Grossberger, Nucleic Acid Res. 15:6737 (1987)。EMBL3バクテリオファージ由来のハイブリダイズする断片を、標準的方法に従ってpMTL2Iへとサブクローニングした。ヌクレオチド配列決定は、Microsynth（Balgach, Switzerland)により行った。
標準的PCRによるcDNAの単離
T. rubrumおよびA. fumigatus cDNAは、それぞれのcDNAライブラリーの106クローンから調製したDNAを用いたPCRによって得た。PCRは、種々のペプチダーゼ遺伝子(表１３)のDNA配列から誘導された相同なプライマーを用いて標準的条件で行った。200ngのDNA、濃度にして42mMの各々のセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを10μl、および8μlのデオキシヌクレオチド混合物(各dNTPを10mM含有する)を、100μlのPCRバッファー(10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl および 1.5 mM MgCl2)に溶解させた。各反応系にAmpliTAQ DNAポリメラーゼ(Perkin Elmer, Zurich, Switzerland)を2.5単位ずつ加えた。反応混合物を94℃で5分間(mm)インキュベートし、94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、および72℃で0.5分間のサイクル25回に供し、最後に72℃で10分間インキュベートした。
組換えLAPの産生
発現プラスミドは、E. coli - P. pastorisシャトルベクターであるpKJ113のマルチクローニングサイトに、cDNA産物をクローニングすることにより構築した。PCR産物はPCR精製キット(Roche Diagnostics)を用いて精製し、プライマーの5’末端にあらかじめ設計されたサイト(表１４)についての制限酵素で消化した。P. pastoris GS1 15(Invitrogen)を、EcoR1またはSma1で線形化したプラスミドDNA 10pgでエレクトロポレーションにより形質転換した。ヒスチジン欠損培地(1Mソルビトール、1％(w/v)デキストロース、アミノ酸不含の1.34％(w/v)酵母窒素ベース(YNB)、4×10-5％(w/v)ビオチン、5×10-3％アミノ酸(例えばLグルタミン酸、Lメチオニン、Lリジン、Lロイシン、Lイソロイシンそれぞれについて5×10-3％(w/v))、2％(w/v)アガロース)上で選択された形質転換体を、最小メタノールプレート(アミノ酸不含1.34％(w/v)YNB、4×10-5％(w/v)ビオチン、0.5％(v/v)メタノール、2％(w/v)アガロース)上でAOX1サイトでの構築物の挿入についてスクリーニングした。炭素源としてメタノールのみを含有する培地上で生育できない形質転換体は、AOX1コード領域を転位するAOX1遺伝子座における組込事象によって正しい酵母ゲノム位置に構築物を含有すると推測した。これらの形質転換体をグリセロールをベースとした酵母培地(1％(w/v)酵母エキス、2％(w/v)ペプトン、アミノ酸不含1.34％(w/v)YNB、1％(v/v)グリセロール、および4×1％(w/v)ビオチンを含有するpH 6.0の0.1Mリン酸カリウムバッファー)10mlで30℃で、飽和付近(600nmでOD20)まで増殖させた。細胞を回収し、グリセロールのかわりに0.5％(v/v)メタノールを有する同じ培地2mlに再懸濁し、２日間インキュベートした。２日間インキュベートした後、上清を回収し、SDS-PAGEゲル上でタンパク質産生について試験した。400ml細胞培養上清から、組換えペプチダーゼ酵素が大量に産生された。
表１４は、P. pastorisにおける種々のLAPの発現のために用いた物質について記載する。
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組換えLAPの精製
P. pastorisの培養上清400mlから分泌されたタンパク質を、Amicom cellおよびUltracel Amicon YM30メンブレン(30kDaカットオフ)(Millipore, Volketswil, Switzerland)を用いた限外濾過により濃縮した。この濃縮物を50mM Tris-HCl、pH 7.5で洗浄し、同じバッファーで平衡化したMono-Qセファロース(Amersham Pharmacia, Dubendorf, Switzerland)カラムにアプライした。カラムを50m MTris-HCl、pH 7.5で洗浄後、流速1ml/分で、0〜0.5M NaClの線形濃度勾配で溶出を行った。Mono-Qセファロースカラムから溶出した種々の画分を、ロイシン-7-アミノ-4-メチルクマリン(Leu-AMC)を基質として用いて酵素活性についてスクリーニングし、LAPを含有する画分をプールした。Ultracel Amicon YM30メンブレンでのAmicon 限外濾過セルで濃縮し、20mM Tris-HCl、pH 6.0で洗浄後、LAP抽出物をサイズ排除Superose 6 FPLC(Amersham Pharmacia)カラムにのせ、20mM Tris-HCl、pH 6.0を溶出液として0.2ml/分の流速で溶出を行った。溶出した活性画分をプールした。LAP酵素は、さらなる機能的キャラクタリゼーションを行う前に、30kDaのカットオフ(Millipore)を有するCentricon濃縮器で最終容量0.4〜1.0mlまで4℃で濃縮した。
別の精製スキームでは、精製の各工程を4℃で行った。P. pastorisの培養上清400mlから分泌されたタンパク質を、Amicon cellおよびUltracel Amicon YM30メンブレン(30kDaカットオフ)(Millipore, Volketswil, Switzerland)を用いた限外濾過により濃縮した。この濃縮物を20mMの酢酸ナトリウム100ml、pH 6.0で洗浄し、同じバッファーで平衡化したMono-Qセファロース(Amersham Pharmacia, Dubendorf, Switzerland)カラムにアプライした。カラムを20mM Tris-HCl、pH 6.0バッファーで洗浄後、流速1ml/分で、0〜0.2M NaClの線形濃度勾配で酵素溶出を142分にわたって行った。Mono-Qセファロースカラムから溶出した種々の画分は、ロイシン-7-アミノ-4-メチルクマリン(Leu-AMC)を基質として用いて酵素活性についてスクリーニングし(下記を参照されたい)、LAPを含有する画分をプールした。LAP抽出物を、Ultracel Amicon YM30メンブレンでのAmicon 限外濾過セルで濃縮し、PBSで洗浄した後、20mM 酢酸ナトリウムpH 6.0バッファーを用いてサイズ排除Superdex 200 FPLCカラム(Amersham Pharmacia)にのせ、0.2ml/分の流速で溶出を行った。溶出した活性画分をプールした。このLAP酵素を、30kDaのカットオフ(Millipore)を有するCentricon濃縮器で最終容量0.4〜1.0mlまで4℃で濃縮した後、さらなる機能的キャラクタリゼーションに供した。
ruLAP2活性を有する画分は、MonoQカラムからは30〜40分(約50mM NaCl)で溶出し、superdex 200については65〜70分、すなわち3ピーク目に溶出する。しかしながら、LAP2活性の大部分は保持されず、１M NaClのフロースルーで溶出した。このことから、この画分を20mM酢酸ナトリウムで脱塩した後、このサンプルを同じMonoQカラムに、0.5ml/分で142分にわたる0〜1M NaClという、よりゆるい勾配でアプライした。最初の活性のピークは70〜140mM NaClに対応する7〜15分で溶出し、第２のピークは150〜250mM NaCl(より活性含量が多い)で溶出する。70〜140 mM NaClの画分は、Superdexでは78〜80分で溶出し、従って上記で得られたピーク３とプールした。150〜250mM NaClでの画分からは、Superdexではそれぞれ44〜49分(ピーク１)および50〜63分(ピーク２)で溶出する２つの活性画分が得られた。
タンパク質抽出物解析
タンパク質抽出物は、12％ポリアクリルアミドゲルの分離ゲルをSDS-PAGEで解析した。ゲルはCoomassie brilliant blue R-250(Bio-Rad)で染色した。N-グリコシダーゼF消化は以前に記載された通りに行った。Doumas ら, Appl. Environ. Microbiol. 64:4809-4815 (1998)。
ウェスタンブロット
メンブレンを最初にレッド-ポンソーで染色し、主要タンパク質バンドを針でマークした。免疫ブロットは、ウサギ抗血清と、２次標識化抗体としてのアルカリフォスファターゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgG(Bio Rad)またはペルオキシダーゼコンジュゲート化ヤギ抗ウサギIgG（Amersham Pharmacia)とを用いて行った。ruLAP1、ruLAP2、Aspergillus oryzae分泌アルカリプロテアーゼ(ALP)およびファンガリシン(fungalysin)ファミリーのA. oryzae分泌中性プロテアーゼ(NPI)(Doumas ら, J. Food Mycol. 2:271-279 (1999))に対するウサギ抗血清は、精製した組換え酵素を用いて、Eurogentec（Liege, Belgium)により作製された。
アミノペプチダーゼ活性アッセイ
アミノペプチダーゼ活性は、種々のペプチドの蛍光性アミノアシル-4-メチルクマリル-7-アミド誘導体を用いて測定し、アミノペプチダーゼP活性の特異的測定については内部で反応停止させる蛍光基質Lys(Abz)-Pro-Pro-pNAを用いて測定した。Stockelら, Adv. Exp. Med. Biol. 421:31-35 (1997)。全ての基質はBachem (Bubendorf, Switzerland)からのものであった。基質ストック溶液は、製造業者の指示に従って0.1Mで調製し、-20℃で保存した。反応混合物には、それぞれのLAPについて最適のpH(7〜8)に調節された50mM Tris-HClバッファー25μl中で酵素調製物(各酵素の基質に対する切断活性によって、1アッセイ当たり56〜2662 ng)および濃度5mMの基質を含有した。37℃で60分のインキュベーション後、5μlの氷酢酸を添加することにより反応を停止させ、反応混合物を水3.5mlで希釈した。放出された7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC)は、370nmの励起波長と460nmの発光波長で、分光蛍光光度計(Perkin Elmer LS-5 fluorometer, Zurich, Switzerland)を用いて測定した。合成AMCを用いて作成した標準曲線を利用して、放出されたAMCを評価した。放出されたジプロリル-p-ニトロアニリドは、310nmの励起波長および410nmの発光波長で測定した。LA活性は、放出されたAMCまたはpNAのナノモル／分／μgタンパク質で表した。
表１５には、種々のLAPの、様々なアミノアシル-AMCに対する加水分解活性を、標準として用いたLeu-AMCに対する比較(％)として示す。
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LAPに対する種々の化学試薬の影響
阻害剤および金属カチオンを、酵素とともに37℃で15分間プレインキュベートした。次に、最終濃度5mMのLeu-AMCを添加した。さらに60分間のインキュベーション後、酵素活性を上記のように測定した。精製LAPに対して試験した阻害剤および阻害剤濃度は以下の通りである:500μM アマスタチン(amastatin)(Bachem)、40μMベンズアミジン(Sigma)、500μMベスタチン(Bestatin)(Bachem)、5mM/1mM EDTA(Sigma)、100μM E-64(L-trans-エポキシスクシニル-leu-4-グアニジノブチルアミド)(Bachem)、100μMロイペプチン(Sigma)、5mM/1mMオルト-フェナントロリン(Sigma)、500μM p-クロロマーキュリーベンゾエート(Sigma)、100μMペプスタチンA(Sigma)、40μM PMSF(Sigma)、20μM TLCK(Roche Diagnostics)、および20μM TPCK(Roche Diagnostics)。CaCl2、MgCl2、MnCl2、CoCl2、ZnCl2、NiCl2、CuCl2は0.5mM〜1mMの濃度で試験した。
表１６には、LAPに対する基質としてLeu-AMCを用いて、種々のプロテアーゼ阻害剤の存在下での種々のEXOXの加水分解活性を列挙する。活性は、阻害剤無しでのコントロール酵素反応の活性のパーセンテージとして示す。
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表１７には、LAPの基質としてLeu-AMCを用いて、種々のカチオンの存在下での種々のEXOXの加水分解活性を列挙する。活性は、カチオン無しでのコントロール酵素反応の活性のパーセンテージとして示す。
Figure 2007531504
EXOXの活性の最適pH
酵素活性のための至適pHは、エリスとモリソンのバッファー系を用いて測定した。Ellis & Morrison, Methods Enzymol. 87:405-426 (1982)。このバッファーは、調べたpH範囲全体にわたりバッファーのイオン強度が一定でありながら、異なるpKa値を有する３つの成分を含有した。バッファーのpHを、1M HClまたは1M NaOHで半pH単位ずつの区切りで6〜11に調整した。Leu-AMC基質に対する活性のためのアッセイ条件は、示したpH値においてTris/HClバッファーをエリスとモリソンのバッファー(組成物)で置き換えた以外は上記と同じであった。
表１８は、天然のおよび組換えのT. rubrumおよびA. fumigatus分泌アミノペプチダーゼの性質について列挙する。
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EXOXの活性の温度最適性
最適温度条件は、各LAPをLeu-AMC(5mM)と共に20、30、40、50、60、70、および80℃で10分、30分および60分インキュベート後、最適pHにおける酵素活性を測定することにより決定した。
タンパク質分解アッセイ
タンパク質分解活性は、レゾルフィン標識化カゼインをリン酸バッファー(20mM; pH7.4)中で用いることにより測定した。反応混合物は、合計用量0.5ml中に0.02％基質を含有した。37℃でインキュベート後、未消化の基質をトリクロロ酢酸添加(最終濃度4％)で沈殿させ、遠心分離により上清から分離した。500μl Trisバッファー(500mM; pH9.4)を加えることによりアルカリ化した後、上清の574nmにおける吸収を測定した。実用的な目的から、1単位のタンパク質分解活性は、1分当たり0.001の吸収を生じる活性と定義した。
実施例２: T. rubrumから分泌されたタンパク質分解活性
T. rubrumは、0.2％大豆タンパク質を唯一の炭素源および窒素源として含有する培地で30℃で増殖させた。14日間の増殖後、レゾルフィン標識化カゼインを基質として用いて実質的なタンパク質分解活性(400 U ml-1)を検出し、付随して培地の清浄化が認められた。このタンパク質分解活性は、PMSFおよびオルトーフェナントロリンによりそれぞれ15％および85％阻害され、このことはT. rubrumによりセリンプロテアーゼおよびメタロプロテアーゼが分泌されたことを証明した。培養上清のウェスタンブロット解析は、Microsporum canis同様、T. rubrumが、Aspergillus oryzaeによって分泌される中性メタロプロテアーゼNPIおよびアルカリプロテアーゼALPと同様に、ズブチリシンファミリー(MEROPS>S8)のエンドプロテアーゼおよびファンガリシンファミリー(MEROPS>M36)のエンドプロテアーゼを分泌したことを明らかにした(図１参照)。さらに、Leu-AMCおよびLeu-pNAなどの基質に対する強い活性が、T. rubrum培養上清で検出された。
実施例３: T. rubrumにより分泌されたアミノペプチダーゼ活性
Microsporum canisのエンドプロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、A. oryzaeおよびA. fumigatusにより分泌されたスブチリシンおよびファンガリシンをコードする相同遺伝子と50〜70％の類似性を示した。さらに、M. canis遺伝子とAspergillus遺伝子は、共直線性イントロン-エキソン構造を示した。このことから、T. rubrumゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブを設計するために、アミノペプチダーゼをコードするA. oryzaeおよびSacharomyces cerevisiae遺伝子について利用可能なDNA配列を用いた。日和見病原菌A. fumigatusによって分泌されるものと比較した、T. rubrumにより分泌されるアミノペプチダーゼのキャラクタリゼーションは、組換えタンパク質を用いて行った。
実施例４: T. rubrumおよびA. fumigatusアミノペプチダーゼをコードする遺伝子のクローニング
表１９Ａおよび１９Ｂは、種々のLAPの二つ一組の比較を列挙する。
Figure 2007531504
Figure 2007531504
類似性の％(上右手の隅)および同一性の％(下左手の隅)は、the Genetics Computer Group, University of Wisconsin, MadisonのGAPパッケージに組み込まれたGapプログラムにより取得した。
図１４は、M28Eサブファミリーのアミノペプチダーゼの推定されるアミノ酸配列のアラインメントである。推定上のシグナル配列プロセシングサイトは下線を引いた。ruLAP1中の推定上のKRプロセシングサイトを中空ではない三角で示した。Streptomyces griseusのアミノペプチダーゼ中の2つのZn++結合部位および他のLAPで保存されているアミノ酸を、開いた矢印で示す。このアラインメントは、ウィスコンシン大学のGCGパッケージに組み込まれているPileupアルゴリズムを用いて行い、Boxshade 3.2でリフォーマットした。AbispLAP1は、Agaricus bisporusのLAPを表す。
図１５は、M28Aサブファミリーのアミノペプチダーゼの推定アミノ酸配列のアラインメントである。推定上のシグナル配列プロセシングサイトは下線を引いた。S. griseusアミノペプチダーゼにおける第１のZn++イオンに結合し、菌類LAPで保存されている２つのアミノ酸残基HisおよびAspを、中空の三角で示す。第２のZn++イオンに結合する２つのさらなる残基HisおよびGluを中空ではないダイヤモンドで示し、２つのZn++イオンを架橋するAsp残基を開いた矢印で示す。＊は、ruLAP2にしか見られないメチオニン残基を示す。このアラインメントは、ウィスコンシン大学のGCGパッケージに組み込まれているPileupアルゴリズムを用いて行い、Boxshade 3.2でリフォーマットした。
アミノ酸配列GPGINDDGSG (配列番号３６)およびDM(Q/M)ASPN(配列番号３７)は、A. oryzae分泌52kDaアミノペプチダーゼ(米国特許第6127161号)およびS. cerevisiaeアミノペプチダーゼにみられた。Nishizawaら, J. Biol. Chem. 269:13651-13655 (1994)。これらのデータから、２つのコンセンサスオリゴヌクレオチド(GGXATXAAYGAYGAYGGXTCXGG (配列番号３８)およびTTXGGXGAXGCXATCATRTC (配列番号３９)を、それぞれセンスおよびアンチセンスとして使用して、T. rubrumからDNAを増幅した。220bpのPCR産物を取得し配列決定した。推定上のアミノ酸配列は、A. oryzaeおよびS. cerevisiaeアミノペプチダーゼのアミノ酸配列と高い類似性を示した。この220bpのPCR断片を、λファージEMBL3 T. rubrumゲノムDNAライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして使用し、推定上のアミノペプチダーゼ(ruLAP2)をコードするヌクレオチド配列を見出した。類似の分泌アミノペプチダーゼ(fuLAP2)をコードするヌクレオチド配列が、A. fumigatusゲノム配列に見られた(ウェブサイトアドレスwww.TIGR.comにて)。
A. oryzae 31kDaアミノペプチダーゼをコードする遺伝子(米国特許第5994113号)のヌクレオチド配列を含有する1200bp断片を、GCATTCCTGUGATGCCCGGGCCG (センス)(配列番号４０)およびTTACTTAGCAAGCTCAGTGACGAAGCCGAC(アンチセンス)(配列番号４１)のオリゴヌクレオチドを用いた、A. oryzaeゲノムDNAのPCRから得た。この断片を、T. rubrumゲノムDNAライブラリーに対する第２のスクリーニングのためのプローブとして使用した。A. oryzae 30kDaアミノペプチダーゼおよびA. fumigatusゲノム配列(ウェブサイトアドレスwww.TIGR.comにて)由来の別の推定上の分泌されるアミノペプチダーゼをコードするヌクレオチド配列と類似するヌクレオチド配列(EMBL)が、T. rubrumゲノムライブラリーのλファージEMBL3 DNAから発見された。これらのT. rubrumおよびA. fumigatus推定アミノペプチダーゼを、それぞれruLAP1およびfuLAP1と命名した。
同定したruLAP1、ruLAP2、fuLAP1およびfuLAP2のヌクレオチド配列は、それぞれ17〜20アミノ酸のシグナル配列を含有する。T. rubrumおよびA. fumigatus遺伝子のイントロン-エキソン構造は、単離したゲノムDNAに基づく5'センスおよび3'アンチセンスプライマー(表１４参照)ならびに標的としてのT. rubrumおよびA. fumigatus cDNAライブラリーの108個のクローンのプールからの全DNAを用いたPCR産物を配列決定することにより決定した。ruLAP2における３つのイントロンのうちの最初のものは、fuLAP2特有のイントロンと類似の位置に存在した(表１３参照)。遺伝子ruLAP1およびfuLAP1は、２つのイントロンと３つのエキソンという類似の共直線性の構造を有する。
実施例５:組換えT. rubrumおよびA. fumigatusアミノペプチダーゼの産生
RT-PCRにより得られたT. rubrum およびA. fumigatus cDNAを、pKJ113(Borg-von Zepelin ら,1998)にクローニングし、P. pastorisで発現させた。産生させるペプチダーゼによって、Leu-AMCに対する活性酵素約10〜80μg/mlが得られた(表１８参照)。野生型P. pastorisは、同一の培養条件下では、培地にロイシンアミノペプチダーゼ活性を全く分泌しなかった。P. pastorisの形質転換体により分泌された組換えruLAP2、fuLAP1およびfuLAP2のSDS-PAGE解析は、不鮮明なバンドを示した(図２)。N-グリコシダーゼFでの処理後、移動度がより速い主要バンドのみがゲル上に現れ、このことはruLAP1と対比して、これらの３種のLAPが糖タンパク質であることを証明した(図２)。それぞれの脱グリコシル化組換えLAPの見かけ上の分子量は、プロテアーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列から推定上されるポリペプチド鎖の計算上の分子量に近かった。各組換え酵素の推定される一次構造(アミノ酸配列)を、表１８に示す。
実施例６: T. rubrum 培養上清におけるruLAP1およびruLAP2の検出
抗ruLAP1抗血清を用いて、組換えruLAP1の電気泳動の移動度よりも高い移動度を有するLAP1産物の蓄積を、T. rubrum培養上清において検出した(図３参照)。
抗ruLAP2抗血清を用いた、T. rubrumの培養上清のウェスタンブロット解析は、T. rubrumが、P. pastorisからの組換え酵素の電気泳動移動度と同じ移動度を有するグリコシル化されたLAP2を分泌することを明らかにした(図３)。
実施例７:組換えLAPの性質
アミノペプチダーゼruLAP1、ruLAP2、fuLAP1、fuLAP2およびミクロソーム由来ブタ腎臓アミノペプチダーゼ(pKLAP)は、それぞれ効率的にLeu-AMCを加水分解した。この基質は、活性の最適温度およびpHを測定するため、そしてさらに(i)様々な既知のペプチダーゼ阻害剤(表１６参照)および(ii)種々の二価イオン(表１７参照)の影響を測定することにより酵素を特徴付けするために使用した。それぞれのLAPは、20℃でLeu-AMCを切断することができ、40〜50℃の最適温度を有した。至適pHは7.0〜8.5であった(表１８参照)。80℃での10分間の前処理は、酵素を完全にそして不可逆的に不活性化した。
試験したアミノペプチダーゼは、500μMの濃度でアマスタチンによって強く、または完全に阻害された(表１６参照)。ruLAP1、fuLAP1およびpkLAPは、ベスタチンによっても阻害されたが、この阻害剤はruLAP2およびfuLAP2の両方に対して部分的な阻害効果しか示さなかった。試験したキレート剤のうちで、オルト-フェナントロリンは、1および5mMの濃度で５種の酵素を完全に阻害した。fuLAP1、fuLAP2、およびruLAP1は、他のLAPよりもEDTAに敏感だった。E64とp-クロロマーキュリーベンゾエート(システインプロテアーゼ阻害剤)はruLAP2の活性を鈍化し、この酵素のアミノ酸配列の活性についての重要なチオール残基の存在を示唆した。ロイペプチン(セリン／システインプロテアーゼ阻害剤)、PMSF(セリンプロテアーゼ阻害剤)、ベンズアミジン、TLCK、およびTPCKについては、試験したいずれのLAPに対しても明確な阻害効果が見られなかった。驚くべきことに、fuLAP1およびruLAP1は、0.1mMペプスタチン(アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤)に対していくらかの感受性を示した。
二価イオンに対する全体的な感受性を示すfuLAP1の例外はあるものの、1mMまでの濃度でのCo++イオンは、LAPの活性を200％〜900％増加させた。4種の菌類LAPは、二価のカチオンに対して様々な感受性を示した。例えば、fuLAP2はMn++およびCa++によって活性化されたものの、fuLAP1は同じイオンに阻害された。ミクロソーム由来のpkLAPはZn、NiおよびCu++により高度に活性化され、M28ファミリーの4種の菌類LAPとは異なる。
種々のアミノアシル-AMCに対する酵素の加水分解活性を、基準として用いたLeu-AMCと比較した(表１５参照)。試験するアミノペプチダーゼにつづき、種々のアミノアシル残基に対する様々な優先性を検出した。例えば、アミノペプチダーゼpkLAPは、Ala-AMCおよびArg-AMCに対する非常に高い効率性において、4種の菌類LAPとは異なる。ruLAP1は、明らかにLeu-AMCに対して最も選択的であった。しかしながら、ruLAP2、fuLAP1およびfuLAP2については、いくらかの異なる優先的切断活性が観察された。例えばruLAP2はより効率的にSer-およびPro-AMCを切断し、これに対してfuLAP1はArg-、Val-およびPhe-AMCを認識した。ruLAP2のみが効率的にAsp-およびGlu-AMCを切断した。これらの酵素はいずれも、Lys(Abz)-Pro-Pro-pNAを切断することができなかったことから、アミノペプチダーゼP活性を示さなかった。
実施例８:グリアジンペプチドの消化における、ruDPPIVと一緒になったruLAP2の応用
セリアック病(CD)は、小腸を傷つけ、食品からの栄養吸収を妨げる消化管の疾患である。セリアック病を有する人は、グルテンとよばれる、コムギ、ライムギおよびオオムギに存在するタンパク質を寛容できない。セリアック病を有する人が、グルテンを含有する食品を食べた場合、その人たちの免疫系は小腸を傷つけることにより応答する。この疾患は世界の殆どの人口集団において〜1:200の罹患率を有し、セリアック病の唯一の治療法は、一生涯、厳密にグルテン不含ダイエットを維持することである。殆どの人については、このダイエットを守ることは症状を停止させ、存在する腸の損傷を治癒させ、さらなる損傷を予防する。
コムギグルテンの主要毒性成分はグリアジンと呼ばれるPro-およびGln-リッチなタンパク質のファミリーであり、これらは胃腸管での分解に耐性であり、いくつかのT細胞刺激性エピトープを含有する。これらの研究に異なるin vitro系が使用されたことから、HLA-DQ2陽性の腸由来および末梢性T細胞の免疫学的活性を効果的に誘導するエピトープについてはいくらかの論争がある(Vaderら,Gastroenterology 122:1729-1737 (2002))。CDの器官培養モデルにおける毒性を誘導するグリアジンペプチドの容量は、T細胞を刺激する容量に対応せず、その逆もまた同様である。McAdam および Sollid, Gut 47: 743-745 (2000)。さらに、多くのグルテンエピトープのHLA-DQ2およびHLA-DQ8への結合は、全てではないものの、小腸酵素である組織トランスグルタミナーゼ(それらのエピトープがT細胞を刺激する能力を増強する)の作用により、特定のグルタミン残基がグルタミン酸へと脱アミド化されることにより増強される。Molbergら,Nat. Med. 4:713-717 (1998)。しかしながら、脱アミド化は、T細胞活性化に絶対的に必要なことではない。Arentz-Hansen ら,Gastroenterology 123:803-809 (2002)。
「グルテン不含ダイエット」の代替となることを最終目標として、CDを治療または予防する他の戦略はここ数年にわたって提案されてきたが、そうしたものとしては、HLA-DQ2に結合するペプチドを遮断する化合物によるT細胞活性化の阻害、グルテン脱アミド化を防ぐ組織トランスグルタミナーゼの阻害剤(Sollid, Nat. Rev. Immunol. 2:647-655 (2002))および経口によるペプチダーゼ補充が挙げられる。この後者のアプローチは、プロリン含有ペプチドに対する広範な寛容を有する細菌プロリルエンドペプチダーゼの関与による、免疫刺激性ペプチドの完全な消化を助けると考えられている。Shanら,Science 297:2275-2279 (2002);Hauschら, Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 283:G996-G1003 (2002)。消化酵素分解に耐性であるグリアジンの相対的に大きなフラグメントが確認された。さらにこのペプチドは、グルテンで刺激されたCD患者の腸の生検由来の、種々のHLA-DQ2制限T細胞クローンの刺激因子である可能性があることが示されたが、このクローンはそれぞれ33量体の異なるエピトープを認識するものである。Pro-Xaa-Proモチーフに対する優先性を有するプロリルエンドペプチダーゼは、33量体のグリアジンペプチドを切断することができ、刷子縁(ブラッシュボーダー)アミノペプチダーゼの相乗作用は、ペプチドのT細胞刺激性ポテンシャルを急速に減少させる。
オオムギおよびライムギにはこの33量体の安定な相同体が存在するものの、胃腸分解に耐性であると記載されたこれらのグルテンペプチドモチーフを、本発明において種々のLAPのためのモデル基質として、単独でまたはruDPPIVと組み合わせて用いた:α／βグリアジンAIV(P04724)の82〜95断片に対応するPQPQLPYPQPQLPY(配列番号４２)(14量体)またはグリアジンMM1(P 18573)の57〜89断片に対応するLQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(配列番号４３)(33量体)。
この33量体のN末端をアセチル化した形態のもの(Ac-33量体)もまた、夾雑物酵素によるエンド型タンパク質分解的切断を除外するための、エキソペプチダーゼを用いた消化実験の対照として合成した。
評価した酵素としては、次のものが挙げられる:ruLAP1(Trichophyton rubrumのアミノペプチダーゼI)、ruLAP2(Trichophyton rubrumのアミノペプチダーゼII)、LAP2(Aspergillus oryzaeのアミノペプチダーゼII)、fuLAP2(Aspergillus fumigatusのアミノペプチダーゼII)、MicpKLAP(ブタ腎臓からのミクロソーム由来ロイシンアミノペプチダーゼ、Sigma)、CytpKLAP(ブタ腎臓からの細胞質ゾルロイシンアミノペプチダーゼ、Sigma)およびruDPPIV。
ペプチドの合成
固相合成は、Applied Biosystemsからのカスタム改変型430Aペプチド合成機で行ったが、これには標準-O-CH2-フェニルアセトアミドメチル樹脂上に逐次的Boc化学鎖伸長のためのin situ中性化／2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1、1、1、3、3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（HBTU)活性化プロトコールを用いた。Schnolzerら,Int. J. Peptide Protein Res. 40:180-193 (1992)。
合成の最後で、ペプチドを脱保護し、5％p-クレゾールをスカベンジャーとして0℃で1時間、無水HFで処理することにより樹脂から切断した。切断後、ペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリル中に溶解させて凍結乾燥した。ペプチドは、Waters社からのC18カラムでRP-HPLCにより精製したが、これにはバッファーA(H2O／0.1％トリフルオロ酢酸)中でのバッファーB(90％アセトニトリル／10％H20／0.1％トリフルオロ酢酸)の線形濃度勾配と214nmでのUV検出を用いることにより行った。サンプルは、Platform II 機器(Micromass, Manchester, England)を用いてエレクトロスプレー質量分析により解析した。
分解反応の条件:
インキュベーションは、1mg/mLの基質濃度と1:20のE/S比での、1mM CoCl2を補充した50mM Tris-HCl、pH7.2中で37℃で行った。反応はCH3COOHを用いた酸性化により停止させ、媒体をC8カラムで0.1％TFA中での2％/分CH3CN勾配を用い、RP-HPLCにより解析した。全てのピークを、ESI-MSで特徴付けした。
14量体の消化
図６に示す通り、4時間以内では、14量体はruLAP2によって消化されない。対照と比較しても、HPLCプロファイルには変化はなかった。それどころか、消化は結果的にN末端プロリンの切断にしか起こらない。これに対してruDPPIVは単独ではペプチドを加水分解することができないものの、ruDPPIVの補充はアミノ酸およびジペプチドへの完全な分解を生じる（図７）。
33量体の消化
ruLAP2単独での33量体の消化は、4時間以内でペプチドの部分的分解(50％未満)を生じる(データ不提示)。このペプチドはruDPPIVの基質ではない(図８)。しかしながら、この両方の酵素を混合した場合、この33量体はアミノ酸およびジペプチドに完全に消化され(図９)、そのうちのいくつかはESI-MSによって確認できる(Y、L、F、P、PY、およびPF)。
ruDPPIVをruLAP2またはfuLAP2と混合した場合には、同じHPLCパターンが得られる。しかしながら、ruLAP1と混合した場合、分子量の大きい化合物がいくらか依然として存在するが、それは初期の基質の10％未満にしか相当しない。
他方、ミクロソーム由来ブタ腎臓アミノペプチダーゼとのインキュベーションは、N末端LeuおよびC末端Pheの部分的欠失(カプボキシペプチダーゼ性の汚染因子が原因で)のみを生じ、DPPIVの添加はこのプロファイルを変化させない。細胞質ゾル由来のブタ腎臓アミノペプチダーゼは、33量体に対して全く不活性である。
LAPもしくはDPPIV単独で、または一緒に混合した場合の消化実験におけるAc-グリアジン33量体の安定性は、これらのエキソペプチダーゼによるグリアジン33量体の完全な分解のために遊離のアミノ基が必要であることを確認するものである。
他の酵素との消化
20時間にわたるプロナーゼとの消化(E/S=1/25)は部分的(40％未満)でしかなく、ruLAP2の添加(両方の酵素について1:50のE/S比(w:w))は加水分解を向上させない。他方、同じ条件でのDPPIVの添加は、アミノペプチダーゼとジペプチジルペプチダーゼの相補的作用により、ペプチドの完全な分解という結果となる。キモトリプシン単独、またはruLAPもしくはDPPIVを添加したものは、ペプチドを分解することができない。
実施例９:別のタンパク質またはN末端タグと融合された発現組換えタンパク質の処理におけるruLAP2の使用
LAP2を、proNPYのN末端からのGly-Serの切断について、および同じペプチドのN末端からの付加的Alaの切断について、評価した。より大きな組換えタンパク質のプロセシングにおいて、単独でまたは別のエキソペプチダーゼと一緒に、LAP2の応用性を拡大するために、N末端配列Met-Thr-Pro-を有するG-CSF組換えタンパク質(Cys17→Ser、Lys16、23、34、40→Arg)を、ruLAP2およびruDPPIVと連続的にインキュベートしたところ、175残基のタンパク質からMetおよびThr-Proジペプチドが逐次的に除去された。
ruLAP2を用いたGly-Ser-proNPYの消化
ペプチドは1mg/mlで、1:20および1:100(w:w)のE/S比でのruLAP2を有する50mM Tris-HCl、1mM CoCl2バッファー中で37℃で一晩インキュベートした。消化された物質はRP-HPLCで分離し、ESI-MSで特徴付けした。図１０に示す通り、ruLAP2とのインキュベーションは144.1 amuの理論的低下(144.2であると確認された)を伴う２つのN末端残基Gly-Serの切断が生じる。同じ結果は1:100 E/S比で得られた。消化は、酵素がXaa-Pro-モチーフまで到達した場合(proNPYの場合についてはこれはTyr-Proである)に、停止する。
ruLAP2を用いたAla-proNPYの消化
インキュベーション条件は、Gly-Ser-proNPYの場合と同じであった。図１１Ｂは、N末端アラニンがほとんど完全にproNPYから除去されたこと(71 amuの分子量低下)を示す。
G-CSFのN末端からのMetおよびThr-Proの逐次的切断
これらの実験で用いるTG47として知られているG-CSFの変異体類似体は、メチオニル-[C17S、K16、23、34、40R]G-CSFであり、これは折りたたまれたタンパク質について18894.90の理論的質量を有する。
ruLAP2を用いた消化
G-CSFのストック溶液(0.1％サルコシルを含有するPBS中1.9mg/ml)を、1mM CoCl2を添加したpH7.2の50mM Tris-HClで4倍希釈し、ruLAP2と共に(E/S=1/20および1:100、w:w)37℃で15時間インキュベートした。この溶液を、30％(v:v)アセトニトリルで希釈し、酢酸で酸性化し、MSキャラクタリゼーションのためにRP-HPLCでタンパク質を分離した。図１２Ａおよび１２Ｂに示す通り、一晩のインキュベーションは、131.2 amuの理論的質量減少であるN末端メチオニンの完全な切断が起こる。1:100のE/S比(w:w)では、一晩のインキュベーションの後でも切断されていない微量の物質が依然として存在する。
この実験は、37℃で15時間にわたり1:25のE/S比(w:w)で消化を行ることにより、準分取RP-HPLCカラム上で、短縮された物質を分離するために2mgのスケールで繰り返した。分離された物質(0.8mg)は、ESI-MSで特徴付けした(図１２Ｂ、desMet-G-CSF、計算上の分子量は18763 amu;測定された分子量は18762.5)。
DPPIVを用いたdesMet-G-CSFの消化
凍結乾燥させた物質を、0.1％サルコシルを含有するpH7.5の50mM Tris-HClに1mg/mlの濃度で懸濁し、1/20のE/S比(w:w)でDPPIVと共に一晩37℃でインキュベートした。タンパク質は、上記と同じようにRP-HPLCで分離し、ESI-MSで特徴付けした(図１３Ａおよび１３Ｂ)。DPPIV消化(図１３Ｂ)は、N末端ジペプチドThr-Proの切断を生じる(計算上の分子量18564.8 amu;測定された分子量18563)。微量の未消化の物質はなおも、反応媒体中に存在する。
このことから、LAP2およびDPPIVを逐次的に適用することは、組換えタンパク質からのN末端配列の効率的な除去を生じる。ruLAP2を用いた消化は、酵素が「停止点」アミノ酸モチーフ、例えばXaa-Pro-Xaaなど、またはLAP2「停止点」として特に導入してもよいXaa-Proモチーフに到達した場合に停止し、組換えタンパク質はその後DPPIVで切断される。
しかしながら、N末端残基の最初の切断は配列に高度に依存する。なぜならばLAPおよびDPPIVを用いてインキュベートしても、Met(His)6タグはMet(His)6-proNPYから除去されなかったからである。
他の実施形態
本明細書において特定の実施形態を詳細に開示したが、これは例証のみを目的とした例として行ったことであり、以下の特許請求の範囲を制限することを意図したものではない。特に、本発明者らは、特許請求の範囲に定義される発明の範囲と精神から離れることなく、本発明に種々の置換、変更および改変が可能であることを意図している。核酸出発物質、興味あるクローン、またはライブラリーのタイプの選択は、本明細書に開示する実施態様の知識を有する当業者にとって、日常的な事であると考えられる。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとみなされる。
図１は、抗-コウジカビ（A. orizae）Alp（パネルA、左）およびMep抗血清（パネルC、右）を用いて検出された、紅色白癬菌（T. rubrum）上清標品のウェスタンブロットの写真である。パネルBは、クーマシーブルーで染色した10% SDS-PAGEゲルを示す。レーン1において、紅色白癬菌の培養上清0.25mlのタンパク質をTCAによって沈澱させてから、SDS-PAGEゲルにロードした。0.2gの精製組換えコウジカビALPおよびMEPをそれぞれレーン2およびレーン3にロードした。タンパク質標準物質の分子量を左側余白に示す。 図２は、P. pastorisにおいて生成された組換えruLAP2(1,2)、fuLAP2(3,4)、ruLAP1(5,6)およびfuLAP1(7,8)のタンパク質プロフィールを示すSDS-PAGEゲルの写真である。精製組換えLAPをそれぞれ1gずつ、10% SDS-PAGEにロードした。レーン2、4、6および8はN-グリコシダーゼF処理によって脱グリコシル化されたタンパク質を示す。ゲルはクーマシーブリリアントブルーR-250で染色した。 図３は、抗ruLAP2（レーン1-4）および抗ruLAP1（レーン5-8）抗血清を用いて検出された、紅色白癬菌培養上清、および対照として使用された組換えLAPのウェスタンブロットの写真である。レーン1、2、5および6において、紅色白癬菌培養上清0.25mlのタンパク質をTCAによって沈澱させた後、SDS-PAGEゲルにロードした。0.1gの精製組換えruLAP2（レーン3、4）およびruLAP1（レーン7、8）を対照としてロードした。N-グリコシダーゼFは、タンパク質の脱グリコシル化のために使用した。タンパク質標準物質の分子量を左側余白に示す。 図４は、紅色白癬菌AMPP（アミノペプチダーゼP）のさまざまなpH値での酵素活性のグラフである。AMPPはpH6から11までの広範なpH値にわたって活性を有するようである。 図５は、紅色白癬菌AMPPのさまざまな温度での酵素活性のグラフである。この酵素が活性を示すのは25から60℃までの範囲にわたる温度であって、至適温度は50℃である。 図６は、E/S比（W:W）1/50で、37℃にて4時間にわたる、ruLAP2によるグリアジン14量体の消化を示すグラフである。 図７は、DPPIVのみによる、ならびにDPPIV/ruLAP2混合物による、グリアジン14量体の消化を示すグラフである。 図８は、E/S比（W:W）1/50で、37℃にて4時間にわたる、ruDPPIVによるグリアジン33量体の消化を示すグラフである。 図９は、DPPIV/ruLAP2混合物による、グリアジン33量体の消化を示すグラフである。 図１０Ａおよび１０Ｂは、ruLAP2による消化の前（Ａ）および後（Ｂ）の、Gly-Ser-proNPYのマススペクトルである。 図１１Ａおよび１１Ｂは、ruLAP2による消化の前（Ａ）および後（Ｂ）の、Ala-proNPYのマススペクトルである。 図１２Ａおよび１２Ｂは、ruLAP2による消化の前（Ａ）および後（Ｂ）の、TG47のマススペクトルである。 図１３Ａおよび１３Ｂは、DPPIVによる消化の前（Ａ）および後（Ｂ）の、desMet-G-CSFのマススペクトルである。 図１４は、M28Eサブファミリーのアミノペプチダーゼの、推定アミノ酸配列のアラインメントである。 図１５は、M28Aサブファミリーのアミノペプチダーゼの、推定アミノ酸配列のアラインメントである。

Claims (66)

  1. 配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列の成熟型を含んでなる、単離されたポリペプチド。
  2. 配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
  3. 配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列に少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
  4. 前記の単離されたポリペプチドが、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列の、自然発生的な対立遺伝子バリアントである、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
  5. 前記の単離されたポリペプチドが、アミノペプチダーゼもしくはカルボキシペプチダーゼ活性を有する、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
  6. 前記ポリペプチドがロイシンアミノペプチダーゼである、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 前記ポリペプチドがruLAP2である、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記ポリペプチドが、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列中に1つもしくは複数の保存的置換を包含するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
  9. 前記ポリペプチドが、アミノペプチダーゼ活性を有する、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. 前記ポリペプチドが天然に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
  11. 請求項１に記載のポリペプチド、および担体を含んでなる、組成物。
  12. 請求項１１に記載の組成物を１つもしくは複数の容器内に含んでなる、キット。
  13. 請求項１に記載のポリペプチドを含んでなる、皮膚糸状菌。
  14. 皮膚糸状菌が、有毛表皮糸状菌（Epidermophyton floccosum）、オーズアン小胞子菌（Microsporum audouinii）、鉄さび色白癬菌（Microsporum ferrugineum）、渦状白癬菌（Trichophyton concentricum）、Trichophyton kanei、Trichophyton megninii、毛瘡白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、Trichophyton raubitschekii、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、シェンライン白癬菌（Trichophyton schoenleinii）、スーダン白癬菌（Trichophyton soudanense）、断髪性白癬菌（Trichophyton tonsurans）、黄色白癬菌（Trichophyton violaceum）、Trichophyton yaoundei、イヌ小胞子菌（Microsporum canis）、Microsporum equinum、Microsporum nanum、Microsporum persicolor、Trichophyton equinum、Trichophyton simii、疣状白癬菌（Trichophyton verrucosum）、石膏状小胞子菌（Microsporum gypseum）、Trichophyton ajelloi、およびTrichophyton terrestreからなる一群から選択される、請求項１３に記載の皮膚糸状菌。
  15. 請求項１に記載のポリペプチドを含んでなる、微生物培養上清。
  16. 請求項１に記載のポリペプチドに関わる病理から選択される疾患である、ヒト疾患に付随する症状を治療するための医薬品の製造に、治療薬を使用することであって、その治療薬が請求項１のポリペプチドを含んでなる、前記治療薬の使用。
  17. 真菌感染症治療用の、可能性のある治療薬を同定する方法であって、この真菌感染は、請求項１に記載のポリペプチドの異常な発現、もしくは異常な生理的相互作用に関係しており、その方法は
    (a) 請求項１に記載のポリペプチドを発現し、そのポリペプチドに起因する特性もしくは機能を有する細胞を提供すること；
    (b) その細胞を、候補物質を含んでなる組成物と接触させること；および
    (c) その物質が、ポリペプチドに起因する特性もしくは機能を変化させるかどうかを判定すること；
    を含んでなるが、それによって、物質の存在下で認められた変化が、その物質を含まない組成物と細胞を接触させたときに認められないならば、その物質は治療薬の可能性があると同定される、前記方法。
  18. 前記特性もしくは機能がアミノペプチダーゼもしくはカルボキシペプチダーゼ活性である、請求項１７に記載の方法。
  19. 哺乳動物において病的状態を治療する方法であって、その方法が、病的状態を軽減するのに十分な量のポリペプチドを哺乳動物に投与することを含んでなり、そのポリペプチドは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35、もしくはそれらの生物学的に活性な断片からなる一群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドと、少なくとも90%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、前記方法。
  20. 病的状態が、真菌感染症、セリアック病、消化管吸収不良、スプルー、アレルギー反応および酵素欠損症からなる一群から選択される、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記アレルギー反応がグルテンに対する反応である、請求項２０に記載の方法。
  22. 哺乳動物において病的状態を治療する方法であって、その方法が、病的状態を軽減するのに十分な量のプロテアーゼインヒビターを哺乳動物に投与することを含んでなり、そのプロテアーゼインヒビターは、配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35、もしくはそれらの生物学的に活性な断片からなる一群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、少なくとも90%同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドである、前記方法。
  23. 病的状態が真菌感染症である、請求項２２に記載の方法。
  24. 配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32および34からなる一群から選択される核酸配列を含んでなる、単離された核酸分子。
  25. 前記核酸分子が天然に存在する、請求項２４に記載の核酸分子。
  26. 前記核酸分子が、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32および34からなる一群から選択される核酸配列とはヌクレオチド１つだけ異なっている、核酸分子。
  27. 配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35からなる一群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの成熟型をコードする、単離された核酸配列。
  28. 配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32および34、または前記ヌクレオチド配列の相補体からなる一群から選択されるヌクレオチド配列に対して、ストリンジェントな条件下で、前記核酸分子がハイブリダイズする、請求項２４に記載の核酸分子。
  29. 請求項２４に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
  30. 前記核酸分子と機能しうるように結合したプロモーターをさらに含んでなる、請求項２９に記載のベクター。
  31. 請求項２９に記載のベクターを含んでなる細胞。
  32. 請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法であって、その方法は、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することを含んでなるが、ここで前記細胞は、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32および34からなる一群から選択される核酸配列を含んでなる単離された核酸分子を含んでなる、ベクターを包含する、前記方法。
  33. 前記細胞が、真菌細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞からなる一群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  34. 請求項２に記載のポリペプチドを製造する方法であって、その方法は、ポリペプチドの発現をもたらす条件下で細胞を培養することを含んでなるが、ここで前記細胞は、配列番号2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32および34からなる一群から選択される核酸配列を含んでなる単離された核酸分子を含んでなる、ベクターを包含する、前記方法。
  35. 前記細胞が、真菌細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞からなる一群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. (a) 請求項１３に記載の皮膚糸状菌をタンパク質の製造に十分な条件下で培養すること；および
    (b) 皮膚糸状菌培養物からタンパク質を単離すること；
    を含んでなる、タンパク質を製造する方法。
  37. 前記タンパク質が分泌タンパク質である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記タンパク質がアミノペプチダーゼもしくはカルボキシペプチダーゼである、請求項３６に記載の方法。
  39. 前記アミノペプチダーゼがロイシンアミノペプチダーゼである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ロイシンアミノペプチダーゼがruLAP2である、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記皮膚糸状菌が、有毛表皮糸状菌（Epidermophyton floccosum）、オーズアン小胞子菌（Microsporum audouinii）、鉄さび色白癬菌（Microsporum ferrugineum）、渦状白癬菌（Trichophyton concentricum）、Trichophyton kanei、Trichophyton megninii、毛瘡白癬菌（Trichophyton mentagrophytes）、Trichophyton raubitschekii、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、シェンライン白癬菌（Trichophyton schoenleinii）、スーダン白癬菌（Trichophyton soudanense）、断髪性白癬菌（Trichophyton tonsurans）、黄色白癬菌（Trichophyton violaceum）、Trichophyton yaoundei、イヌ小胞子菌（Microsporum canis）、Microsporum equinum、Microsporum nanum、Microsporum persicolor、Trichophyton equinum、Trichophyton simii、疣状白癬菌（Trichophyton verrucosum）、石膏状小胞子菌（Microsporum gypseum）、Trichophyton ajelloi、およびTrichophyton terrestreからなる一群から選択される、請求項３６に記載の方法。
  42. 製造されたタンパク質をポリペプチド基質に適用することをさらに含んでなる、請求項３６に記載の方法。
  43. 製造されたタンパク質がポリペプチド基質を分解する、請求項４２に記載の方法。
  44. ポリペプチド基質の長さが2から200アミノ酸である、請求項４２に記載の方法。
  45. 製造されたタンパク質が全長ポリペプチド基質を順次消化する、請求項４２に記載の方法。
  46. 真菌症にかかった患者の真菌症を治療する方法であって、その方法は配列番号3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、および35からなる一群から選択されるEXOXタンパク質の活性を有する、有効量の阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
  47. 前記EXOXタンパク質が配列番号２を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
  48. ポリペプチド基質を、請求項１に記載の１つもしくは複数の単離されたポリペプチドと接触させることを含んでなる方法である、ポリペプチド基質を分解する方法。
  49. 前記ポリペプチド基質が全長タンパク質である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記の１つもしくは複数の単離されたポリペプチドが、ポリペプチド基質を順次消化する、請求項４８に記載の方法。
  51. 前記ポリペプチド基質が、変性カゼイン、グリアジン、グルテン、ウシ血清アルブミンもしくはそれらの断片からなる一群から選択される、請求項４８に記載の方法。
  52. 前記の単離されたポリペプチドがアミノペプチダーゼである、請求項４８に記載の方法。
  53. 前記アミノペプチダーゼがロイシンアミノペプチダーゼである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ロイシンアミノペプチダーゼがruLAP2である、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記ポリペプチド基質を１つもしくは複数のプロテアーゼと接触させることをさらに含んでなる、請求項４８に記載の方法。
  56. 前記の１つもしくは複数のプロテアーゼが、トリプシン、プロナーゼ、キモトリプシンおよびプロテイナーゼKからなる一群から選択される、請求項５５に記載の方法。
  57. タンパク質を、請求項３に記載の１つもしくは複数の単離されたポリペプチドと接触させることを含んでなる、タンパク質のアミノ末端からアミノ酸を除去する方法。
  58. タンパク質の前記アミノ末端がHisタグを含んでなる、請求項５７に記載の方法。
  59. タンパク質の前記アミノ末端がXaa-Proタグを含んでなる、請求項５７に記載の方法。
  60. Xaaが、少なくとも２つの近接する求核性の基を含んでなるアミノ酸である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記アミノ酸がセリン、トレオニンまたはシステインである、請求項６０に記載の方法。
  62. 単離されたポリペプチドが、リバースタンパク質分解活性を有する、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
  63. 製造されたタンパク質が、ポリペプチド基質に１つもしくは複数のアミノ酸を付加する、請求項４２に記載の方法。
  64. 製造されたタンパク質が、ポリペプチド基質から１つもしくは複数のアミノ酸を除去して、修飾されたポリペプチド基質を形成させ、さらに製造されたタンパク質は次にこの修飾されたポリペプチド基質に１つもしくは複数のアミノ酸を付加し、それによって元のポリペプチド基質とは異なるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド産物を生成する、請求項４２に記載の方法。
  65. ポリペプチド基質に１つもしくは複数のアミノ酸を付加する方法であって、ポリペプチド基質を、請求項３に記載の１つもしくは複数の単離されたポリペプチドと接触させることを含んでなる、前記方法。
  66. １つもしくは複数のアミノ酸のその後の付加を可能にするのに十分な条件下で、一時、ポリペプチド基質を１つもしくは複数の単離されたポリペプチドとともにインキュベートするステップをさらに含んでなる、請求項４８に記載の方法。
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