KR20230098400A

KR20230098400A - 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하는 방법 및 이에 이용된 비접촉식 초음파 장치

Info

Publication number: KR20230098400A
Application number: KR1020210186942A
Authority: KR
Inventors: 양민아
Original assignee: 양민아
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2023-07-04
Also published as: US20230203425A1

Abstract

본 발명은 전원부; 초음파 발진부; 및 초음파 진동부;를 포함하는 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법 및 이에 이용된 비접촉식 초음파 장치를 제공한다. 구체적으로, 본 발명에서는 비효소적 방식이며, 비접촉식 초음파 장치를 이용함으로써, 오염 또는 세포 파괴가 최소화되면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 추출할 수 있는, 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법 및 이에 이용된 비접촉식 초음파 장치를 제공한다.

Description

비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하는 방법 및 이에 이용된 비접촉식 초음파 장치{METHODE FOR SEPARATING STROMAL VASCULAR FRACTION FROM FAT TISSUE USING THE NON-CONTACT TYPE ULTRASONIC DEVICE, AND NON-CONTACT TYPE ULTRASONIC DEVICE USED THEREIN}

본 발명은 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 비접촉식 초음파 방식이 적용된 것으로서, 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법에 이용되는 비접촉식 초음파 장치에 관한 것이다.

지방 조직 유래의 기질혈관분획(SVF)은 지방 전구 세포(preadipocytes), 내피 세포(EC), 혈관내피전구 세포(EPC), 혈관 평활근 세포(SMC), 혈관 주위 세포(pericytes), 벽세포, 대식세포(macrophages), 섬유 모세포 및　지방　유래 줄기/기질 세포(ASC) 등을 포함하는 이종 세포 혼합물이다.

기질혈관분획은 크론(Crohn's)병, 이식편 숙주 반응(graft-versus-host)병, 다발성 경화증과 염증 성장 질환(inflammatory bowel disease)과 같은 자가 면역 및 알러지 병리학, 급성 심근 경색(myocardial infarction), 하지 허혈, 불치성 만성 창상(chronic wounds), 방사선 장애(radiation injury), 요실금(urinary incontinence) 등의 증상에 대한 임상 시험, 및 여러 예비 질병 치료 모델에서 임상적 효과를 보임이 보고되고 있다. 또한, 기질혈관분획은 자가　지방　이식의 생존을 연장하여, 미용 및 재활 의약품으로의 활용이 기대된다.

현재까지는, 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 추출할 때, 콜라게나아제 등의 효소를 이용하여 세포 분리를 진행하는 방식이 주로 사용되고 있다. 일례로, 대한민국 공개특허 제10-2018-0009435호에서는 세척한 지방 조직에 콜라게나아제, 디스파아제 및 아큐타아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는 조직해리용 효소제제를 처리하여, 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하는 방법에 대해 개시하고 있다.

그러나, 상기 특허에 개시된 바와 같은, 효소적 방식의 경우에는, 시간 및 비용이 많이 들어 경제적이지 못하며, 효소로 인한 오염 또는 효소로 인한 세포 파괴에 대한 문제가 있어, 그 사용이 제한되고 있는 추세이다.

이러한 문제를 해결하기 위해, 최근에는 접촉식 초음파를 이용하거나, 원심 분리를 이용하여, 기질혈관분획을 분리하고자 하는 다양한 시도들이 계속되고 있다. 그러나, 접촉식 초음파의 경우에는, 초음파 노즐과 지방 조직이 직접적으로 맞닿게 되어, 오염 및 세포 파괴가 쉬운 문제가 있다. 또한, 원심 분리의 경우에는, 지방 조직으로부터 분리되는 기질혈관분획의 세포수가 현저히 적어, 효율성이 떨어지는 문제가 있다.

이에 따라, 본 출원인은 효소적 방식, 접촉식 초음파 사용 방식 등의 종래 기술과 달리, 비접촉식 초음파를 실시하여, 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 효과적으로 분리하는 방법 및 이에 적합한 비접촉식 초음파 장치를 개발함으로써, 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2018-0009435호

본 발명의 첫 번째 목적은 비효소적 방식으로, 비접촉식 초음파 장치를 이용함으로써, 세포 오염 또는 파괴가 최소화되면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 추출할 수 있는, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 두 번째 목적은 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하는 과정에서, 높은 효율로 기질혈관분획을 분리함과 동시에 세포 오염 또는 파괴가 최소화되도록 하기 위한, 비접촉식 초음파 장치를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 목적은 상기된 바와 같은 기술적 과제로 한정되지 않으며, 이하의 설명으로부터 또 다른 기술적 과제가 도출될 수 있다.

상기 첫 번째 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전원부; 초음파 발진부; 및 초음파 진동부;를 포함하는 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법으로서, 지방 조직을 제1 튜브형 용기의 내부 공간에 주입하는 주입단계; 상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 상기 비접촉식 초음파 장치의 초음파 진동부에 장착하고, 초음파를 조사하여 지방 조직을 분리하는 초음파조사단계; 상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 원심 분리기에 장착하고, 원심 분리하여 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획으로 분리하는 원심분리단계; 상기 기질혈관분획 및 세척 용액을, 제2 튜브형 용기의 내부 공간에 주입하고, 원심 분리하는 세척단계; 및 상기 세척단계에 따라, 세척된 기질혈관분획을 추출하는 추출단계;를 포함하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법을 제공한다.

상기 초음파조사단계에서는 주파수가 30 ~ 40 kHz인 초음파를 조사할 수 있다.

상기 초음파조사단계에서는 초음파를 1 ~ 10 분 동안 조사할 수 있다.

상기 원심분리단계에서는 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 1 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시할 수 있다.

상기 세척단계에서는 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 3 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시할 수 있다.

상기 분리방법은 비효소적 방식일 수 있다.

상기 두 번째 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기에 따라, 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하기 위한 비접촉식 초음파 장치로서, 상기 비접촉식 초음파 장치는 전원부; 상기 전원부로부터 공급된 전기에너지를 이용하여 초음파를 발생시키는 초음파 발진부; 및 상기 초음파 발진부와 접하는 사각 기둥 형태로 형성되되, 상면에는 상기 상면에서 하면 방향으로, 지방 조직이 수용되는 튜브형 용기가 삽입 및 고정되는 복수개의 고정홈이 형성된 초음파 진동부;를 포함하는, 기질혈관분획 분리용 비접촉식 초음파 장치를 제공한다.

상기 고정홈은 적어도 두 개 이상인 것일 수 있다.

본 발명에서는 비효소적 방식이면서 비접촉식 초음파 장치를 이용함에 따라, 세포의 오염과 파괴가 최소화되면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 분리할 수 있는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 세포의 오염과 파괴가 최소화되면서도 지방 조직으로부터 효율적으로 기질혈관분획이 분리되도록 하기 위한, 비접촉식 초음파 장치를 제공한다.

도 1은 본 발명에 따르는 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하는 방법의 순서를 도시한 흐름도이다.
도 2는 상기 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하는 방법 중 일부를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따르는 비접촉식 초음파 장치의 사시도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따르는 비접촉식 초음파 장치의 사시도이다.
도 5는 도 3에 도시된 비접촉식 초음파 장치에서 초음파 발진부 및 초음파 진동부의 평면도이다.
도 6은 도 3에 도시된 비접촉식 초음파 장치에서 초음파 발진부 및 초음파 진동부의 측면도이다.
도 7은 도 3에 도시된 비접촉식 초음파 장치에 튜브형 용기가 장착된 모습을 도시한 도면이다.

아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.

본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.

이하에서 본 발명을 구체적으로 설명하였으나, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법 및 이에 이용된 비접촉식 초음파 장치를 제공한다.

본 발명의 실시예에서는 전원부; 초음파 발진부; 및 초음파 진동부;를 포함하는 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법으로서, 지방 조직을 제1 튜브형 용기의 내부 공간에 주입하는 주입단계; 상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 상기 비접촉식 초음파 장치의 초음파 진동부에 장착하고, 초음파를 조사하여 지방 조직을 분리하는 초음파조사단계; 상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 원심 분리기에 장착하고, 원심 분리하여 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획으로 분리하는 원심분리단계; 상기 기질혈관분획 및 세척 용액을, 제2 튜브형 용기의 내부 공간에 주입하고, 원심 분리하는 세척단계; 및 상기 세척단계에 따라, 세척된 기질혈관분획을 추출하는 추출단계;를 포함하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법을 제공한다.

본 실시예의 분리방법에 따르면, 비효소적 방식 및 비접촉식 초음파 장치를 이용함에 따라, 세포의 오염 및 파괴가 최소화면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 분리해낼 수 있다.

이하에서는 도면을 참조하여 분리방법의 각 단계 및 이에 사용되는 비접촉식 초음파 장치에 대해 상세히 설명하도록 하겠다.

구체적으로, 도 1은 본 실시예에 따르는 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하는 방법의 순서를 도시한 흐름도이며, 도 2는 이를 개략적으로 도시한 도면으로서, 도 1 및 2에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 분리방법은 주입단계, 초음파조사단계, 원심분리단계, 세척단계 및 추출단계를 포함할 수 있다.

또한, 도 3은 본 발명에 따르는 일 실시예의 비접촉식 초음파 장치의 사시도이고, 도 4는 본 발명에 따르는 다른 실시예의 비접촉식 초음파 장치의 사시도이다.

또한, 도 5는 도 3에 도시된 비접촉식 초음파 장치의 평면도이며, 도 6은 도 3에 도시된 비접촉식 초음파 장치의 측면도이고, 도 7은 도 3에 도시된 비접촉식 초음파 장치에 제1 튜브형 용기가 장착된 모습을 도시한 도면이다.

(A)주입단계;

본 실시예의 주입단계에서는 지방 조직을 제1 튜브형 용기(T1)의 내부 공간에 주입할 수 있다. 구체적으로, 도 1에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 주입단계에서는 상기 제1 튜브형 용기(T1)의 주입구를 통해, 상기 제1 튜브형 용기(T1)의 내부 공간에 지방 조직을 주입할 수 있다.

(B)초음파조사단계;

본 실시예의 초음파조사단계에서는 상기 주입단계에서 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기(T1)를 비접촉식 초음파 장치(1)에 장착하고, 초음파를 조사하여 지방 조직을 분리할 수 있다.

이때, 상기 비접촉식 초음파 장치(1)는 도 3 내지 6에 도시된 바와 같은 전원부(100); 상기 전원부(100)로부터 공급된 전기에너지를 이용하여 초음파를 발생시키는 초음파 발진부(200); 및 상기 초음파 발진부(200)와 접하는 사각 기둥 형태로 형성되되, 상면에는 상기 상면에서 하면 방향으로, 지방 조직이 수용되는 제1 튜브형 용기(T1)가 삽입 및 고정되는 복수개의 고정홈(310)이 형성된 초음파 진동부(300);를 포함할 수 있다.

특히, 본 실시예의 비접촉식 초음파 장치(1)는 도 3에 도시된 바와 같이, 전원부(100), 초음파 발진부(200) 및 초음파 진동부(300)가 각각 분리된 형태로 형성될 수도 있고, 도 4에 도시된 바와 같이, 전원부(100)의 내부 공간에 초음파 발진부(200) 및 초음파 진동부(300)가 위치되도록 형성될 수도 있다.

도 3에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 전원부(100)는 본 실시예의 비접촉식 초음파 장치(1)에 전기에너지를 공급하는 것으로, 이의 형태 및 구성은 특별히 제한되지 않는다. 이때, 본 실시예의 전원부(100)는 전기에너지 공급 스위치, 초음파의 주파수, 조사 시간 등을 조절할 수 있는 컨트롤 박스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

도 3 내지 6에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 초음파 발진부(200)는 상기 전원부(100)로부터 공급된 전기에너지를 이용하여 초음파를 발생시키는 것으로, 이의 형태 및 구성은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 실시예의 초음파 발진부(200)는 컨버터(Converter) 및 부스터(Booster)가 순차적으로 연결된 형태로 형성될 수 있으며, 하우징으로 둘러싸여 외부로 노출되지 않을 수 있다.

추가적으로, 본 실시예의 초음파 발진부(200)는 혼(Horn)(250)을 포함할 수도 있고, 혼(250)을 포함하지 않을 수도 있다. 만약, 본 실시예의 초음파 발진부(200)가 혼(250)을 포함하지 않을 경우, 상기 초음파 발진부(200)와 접하도록 형성되는 본 실시예의 초음파 진동부(300) 자체가 기존의 혼과 같은 역할을 할 수 있다.

도 3 내지 6에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 초음파 진동부(300)는 상기 초음파 발진부(200)와 접하는 사각 기둥 형태로 형성된 것으로, 상면에는 상기 상면에서 하면 방향으로, 지방 조직이 수용되는 제1 튜브형 용기(T1)가 삽입 및 고정되는 복수개의 고정홈(310)이 형성될 수 있다. 도 3 내지 4에 도시된 바와 같이, 상기 고정홈(310)은 적어도 두 개 이상, 구체적으로는 적어도 네 개 이상 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이때, 도 3에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 초음파 진동부(300)의 측면에 상기 초음파 발진부(200)가 위치될 수도 있으며, 본 실시예의 초음파 진동부(300)의 하면에 상기 초음파 발진부(200)가 위치될 수도 있다.

도 3 내지 6에 도시된 바와 같이, 본 실시예에서는 지방 조직에 초음파 프로브가 직접 접촉되도록 하지 않고, 제1 튜브형 용기(T1) 내에 지방 조직을 주입하고, 제1 튜브형 용기(T1)를 초음파 진동부(300)에 삽입 및 고정하는, 비접촉 방식으로 초음파를 조사함으로써, 세포의 오염 및 파괴를 최소화할 수 있다.

또한, 본 실시예의 초음파 발진부(200)가 혼을 포함하는 경우에는, 초음파 발진부(200)를 기준축으로 하여, 초음파 발진부(200)의 혼 및 초음파 진동부(300)가 함께 회전될 수 있다. 또한, 본 실시예의 초음파 발진부(200)가 혼을 포함하지 않는 경우에는, 초음파 발진부(200)를 기준축으로 하여, 초음파 진동부(300)가 회전할 수 있다. 특히, 상기된 바와 같이, 초음파 발진부(200)의 혼 및/또는 초음파 진동부(300)가 회전할 경우, 초음파 조사 과정에서 제1 튜브형 용기(T1) 내 수용된 지방 조직이 균일하게 혼합되고, 초음파 처리됨으로써, 기질혈관분획의 분리 효율을 더욱 향상시킬 수 있다.

구체적으로, 본 실시예의 초음파조사단계에서는 상기 주입단계에서 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기(T1)를 상기 초음파 진동부(300)의 고정홈(310)에 삽입 및 고정하고, 상기 전원부(100)에 전원을 공급하여, 상기 초음파 발진부(200)에서 생성된 초음파가, 상기 초음파 진동부(300)에 고정된 제1 튜브형 용기(T1)에 도달되록함으로써, 상기 제1 튜브형 용기(T1) 내에 수용된 지방 조직을 분리할 수 있다.

상기 초음파의 주파수는 30 ~ 40 kHz, 구체적으로는 32 ~ 38 kHz, 더 구체적으로는 33 ~ 37 kHz 일 수 있다. 특히, 본 실시예의 초음파조사단계에서 주파수가 33 ~ 37 kHz인 초음파를 조사할 때, 본 실시예에서는 비효소적 방식으로, 비접촉식 초음파 장치(1)를 이용하면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 분리해낼 수 있다.

만약, 상기 초음파의 주파수가 30 kHz 미만일 경우에는, 지방 조직에서 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다. 반면, 상기 초음파의 주파수가 40 kHz 초과일 경우에는, 세포의 손상이 발생되어, 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다.

상기 초음파의 주파수는 30 ~ 40 kHz이되, 1 ~ 10 분, 구체적으로는 3 ~ 9 분, 더 구체적으로는 5 ~ 8 분 동안 조사될 수 있다. 특히, 본 실시예의 초음파조사단계에서 주파수가 30 ~ 40 kHz인 초음파를 5 ~ 8 분 동안 조사할 때, 본 실시예에서는 비효소적 방식으로, 비접촉식 초음파 장치(1)를 이용하면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 분리해낼 수 있다.

만약, 상기 초음파 조사 시간이 1 분 미만일 경우에는, 지방 조직에서 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다. 반면, 상기 초음파 조사 시간이 10 분 초과일 경우에는, 세포의 손상이 발생되어, 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다.

(C)원심분리단계;

도 2에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 원심분리단계에서는 상기 초음파조사단계를 거친, 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기(T1)를 원심 분리기에 장착하고, 원심 분리를 실시하여, 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획으로 분리할 수 있다. 특히, 본 실시예서는 비접촉식 초음파 장치(1)를 이용하여 초음파조사단계를 실시한 다음, 원심 분리 장치를 이용하여 원심 분리를 실시함으로써, 초음파만 조사한 경우 또는 원심 분리만 실시한 경우 보다, 지방 조직으로부 기질혈관분획을 더욱 효과적으로 분리할 수 있다.

이때, 상기 원심 분리는 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수, 구체적으로는 900 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 실시될 수 있다. 특히, 상기 원심 분리가 900 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 실시될 때, 본 실시예에서는 비효소적 방식으로, 비접촉식 초음파 장치(1)를 이용하면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 분리해낼 수 있다.

만약, 상기 원심 분리의 회전수가 800 rpm 미만일 경우에는, 지방 조직에서 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다. 반면, 상기 원심 분리의 회전수가 1,000 rpm 초과일 경우에는, 과도한 회전 및 진동에 의해 세포의 손상이 발생되어, 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다.

상기 원심 분리는 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 실시되되, 1 ~ 5 분, 구체적으로는 2 ~ 4 분 동안 실시될수 있다. 특히, 상기 원심 분리가 2 ~ 4 분 동안 실시될 때, 본 실시예에서는 비효소적 방식으로, 비접촉식 초음파 장치(1)를 이용하면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 분리해낼 수 있다.

만약, 상기 원심 분리가 약 1 분 미만으로 실시될 경우에는, 지방 조직에서 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다. 반면, 상기 원심 분리가 5 분 초과로 실시될 경우에는, 과도한 회전 및 진동에 의해 세포의 손상이 발생되어, 기질혈관분획의 분리 효율이 저하될 수 있다.

(D)세척단계;

도 2에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 세척단계에서는 상기 원심분리단계에서 분리된 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획 중에서 기질혈관분획을 별도로 취하여 제2 튜브형 용기(T2)의 내부 공간에 주입하고, 세척을 위하여 상기 제2 튜브형 용기(T2)의 내부 공간에 세척 용액을 함께 주입한 다음, 원심 분리를 실시함으로써, 세척을 실시할 수 있다.

상기 세척 용액은 NS(Nomal saline), HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) 및 PBS(phosphate-buffered saline)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세척 용액은 1 ~ 10 % PBS(phosphate-buffered saline) 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 실시예의 세척단계에서는 기질혈관분획 및 세척 용액을 상기 제2 튜브형 용기(T2)에 주입한 뒤, 원심 분리를 실시하되, 상기 원심 분리는 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수, 구체적으로는 850 ~ 950 rpm 의 회전수로 3 ~ 5 분 동안 실시될 수 있다. 특히, 본 실시예의 세척단계에서 원심 분리가 850 ~ 950 rpm 으로 실시될 때, 본 실시예에서는 비효소적 방식으로, 비접촉식 초음파 장치(1)를 이용하면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획을 분리해낼 수 있다.

(E)추출단계;

도 2에 도시된 바와 같이, 본 실시예의 추출단계에서는 분리된 세척 용액과 세척된 기질혈관분획 중에서 세척된 기질혈관분획을 공지의 도구를 이용하여 추출해낼 수 있다. 구체적으로, 본 실시예의 추출단계에서는 주사기를 이용하여 세척된 기질혈관분획만을 별도로 추출해낼 수 있다.

본 실시예의 분리방법에서는 지방 조직으로부터 기질혈관분획의 분리 내지 추출 효율을 높이기 위한 공지의 전처리 또는 후처리 단계가 추가로 더 실시될 수 있다.

또한, 본 실시예의 비접촉식 초음파 장치(1)는 지방 조직으로부터 기질혈관분획의 분리 내지 추출 효율을 높이기 위한 공지의 수단을 더 포함할 수 있다.

이하 실시예, 비교예, 및 실험예를 통하여 본 발명의 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법 및 이에 이용된 비접촉식 초음파 장치에 대해 구체적으로 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

[ 실시예 ]

실시예 1 : 지방 조직으로부터 기질혈관분획의 분리

(A)지방 조직을 제1 튜브형 용기에 주입하였다.

(B) 상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 도 7에 도시된 바와 같이, 비접촉식 초음파 장치의 초음파 진동부의 고정홈에 삽입하여 고정되도록 하였다.

이어서, 상기 비접촉식 초음파 장치의 전원부에 전원을 공급하여, 초음파가 발생되도록 하였으며, 초음파는 33 ~ 37 kHz 주파수로 약 5 분 동안 조사하였다.

(C)초음파가 조사된 후, 제1 튜브형 용기를 원심 분리기에 장착한 뒤, 약 900 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 3 분 동안 원심 분리를 실시하였으며, 이에 따라, 도 2에 도시된 바와 같이, 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획으로 층이 분리되었다.

(D)상기 제1 튜브형 용기 내에 수용된 기질혈관분획만을 주사기로 추출한 다음, 이를 새로운 제2 튜브형 용기 내에 주입하였다. 이어서, 상기 제2 튜브형 용기에 5 % PBS 용액(세척 용액)을 주입하고, 850 ~ 950 rpm 의 회전수로 3 ~ 5 분 동안 원심 분리하여 세척하였다.

(E)도 2에 도시된 바와 같이, 상기 원심 분리에 의해, 분리된 세척 용액 및 세척된 기질혈관분획 중에서, 상기 기질혈관분획을 주사기를 이용하여 제2 튜브형 용기에서 추출해내었다.

[ 비교예 ]

비교예 1

효소적 방식에 따라, 지방 조직으로부터 기질혈관분획을 분리하였다.

구체적으로, 지방 조직 1 mL 및 콜라게나제 1 mL를 혼합하고 약 37 ℃ 에서 40 분간 반응시킨 뒤, 원심분리(1,500 rpm, 5분)하고, 침전된 기질혈관분획을 추출하였다. 이를 세척 용액과 혼합하여 세척하고, 원심분리(1,500 rpm, 5분)한 뒤, 세척된 기질혈관분획을 추출하였다.

비교예 2

상기 (B) 과정을 생략한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

비교예 3

상기 (C) 과정을 생략한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

비교예 4 내지 7

상기 (B) 단계에서, 표 1과 같은 조건으로 초음파를 조사한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

	비교예4	비교예5	비교예6	비교예7
초음파 주파수	20 ~ 25 kHz	45 ~ 50 kHz	33 ~ 37 kHz	33 ~ 37 kHz
조사 시간	5 분	5 분	30 초	15 분

비교예 8 내지 11

상기 (C) 단계에서, 표 2과 같은 조건으로 원심 분리를 실시한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

	비교예8	비교예9	비교예10	비교예11
회전수(rpm)	600 ~ 700	1,100 ~ 1,200	900 ~ 1,000	900 ~ 1,000
시간	3분	3분	30초	10분

[ 실험예 ]

실험예 1 : 기질혈관분획 내 줄기세포 수 평가

실시예 1에 따라, 지방 조직 1ml로부터 분리된 기질혈관분획 내 포함된 줄기세포의 세포수를 세포 자동 측정기기 NC-200로 측정(Stem cell number/Fat tissue 1 mL)하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

또한, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 비교예 1 내지 11에 따라, 지방 조직 1ml로부터 분리된 기질혈관분획 내 포함된 줄기세포의 세포수를 측정하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

	세포수		세포수
실시예1	65,800	비교예6	21,100
비교예1	42,000	비교예7	37,000
비교예2	36,000	비교예8	30,200
비교예3	15,600	비교예9	35,000
비교예4	20,000	비교예10	28,000
비교예5	34,500	비교예11	34,500

표 3을 보면, 본 실시예에 따를 경우, 지방 조직으로부터 기질혈관분획 내 줄기세포의 분리 효율이 현저히 우수함을 알 수 있으며, 이는 지방 세포로부터 기질혈관분획이 높은 효율로 분리됨을 의미한다.

구체적으로, 본 실시예에 따르는 실시예 1은, 효소적 방식인 비교예 1 보다, 기질혈관분획의 분리 효율이 우수함을 알 수 있다.

또한, 실시예 1 및 비교예 2 내지 3을 비교하면, 비접촉식 초음파 처리와 원심 분리를 모두 실시할 때에만, 기질혈관분획의 분리 효율이 향상됨을 알 수있다.

또한, 실시예 1 및 비교예 4 내지 11을 비교하면, 상기 (B)단계에서 주파수가 30 ~ 40 kHz인 초음파를 1 ~ 10 분 동안 조사하고, 상기 (C)단계에서 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 1 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시할 때, 기질혈관분획의 분리 효율이 현저히 향상됨을 알 수 있다.

실험예 2 : 기질혈관분획 분리 성능 평가

실시예 1 및 비교예 1에 따라, 지방 조직 1g으로부터 기질혈관분획을 분리하고, 분리된 기질혈관분획의 총 세포수를 측정하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

또한, 기질혈관분획의 세포자동계수장비(Logos사 LUNA Stem 또는 Life technologies사 Countess Ⅱ automated cell counter)를 이용하여 생존율을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

	기질혈관분획 세포의 수	생존율
실시예1	7.45 x 10⁵cells/g	92.0%
비교예1	4.00 x 10⁵cells/g	75.3%

표 4를 보면, 본 발명에 따라 비접촉식 초음파 방식을 이용하는 실시예 1의 경우, 기질혈관분획의 분리 효율이 우수하면서도 생존율 또한 우수함을 알 수 있다.

반면, 본 발명과 달리, 효소적 방식을 사용하는 비교예 1의 경우, 실시예 1 보다, 기질혈관분획의 분리 효율이 저하되며, 세포의 생존율 또한 저하됨을 확인할 수 있다.

즉, 본 발명에 따르면, 비효소적 방식 및 비접촉식 초음파 방식을 이용하면서도 특정 조건으로 초음파 및 원심 분리를 실시함에 따라, 지방 조직으로부터 효과적으로 기질혈관분획을 분리할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

A : 주입단계
B : 초음파조사단계
C : 원심분리단계
D : 세척단계
E : 추출단계
T1 : 제1 튜브형 용기
T2 : 제2 튜브형 용기
1 : 비접촉식 초음파 장치
100 : 전원부
200 : 초음파 발진부
250 : 혼
300 : 초음파 진동부
310 : 고정홈

Claims

전원부; 초음파 발진부; 및 초음파 진동부;를 포함하는 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법으로서,
지방 조직을 제1 튜브형 용기의 내부 공간에 주입하는 주입단계;
상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 상기 비접촉식 초음파 장치의 초음파 진동부에 장착하고, 초음파를 조사하여 지방 조직을 분리하는 초음파조사단계;
상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 원심 분리기에 장착하고, 원심 분리하여 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획으로 분리하는 원심분리단계;
상기 기질혈관분획 및 세척 용액을, 제2 튜브형 용기의 내부 공간에 주입하고, 원심 분리하는 세척단계; 및
상기 세척단계에 따라, 세척된 기질혈관분획을 추출하는 추출단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법.
제 1 항에 있어서,
상기 초음파조사단계에서는
주파수가 30 ~ 40 kHz인 초음파를 조사하는 것을 특징으로 하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법.
제 1 항에 있어서,
상기 초음파조사단계에서는
초음파를 1 ~ 10 분 동안 조사하는 것을 특징으로 하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법.
제 1 항에 있어서,
상기 원심분리단계에서는
800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 1 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시하는 것을 특징으로 하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법.
제 1 항에 있어서,
상기 세척단계에서는
800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 3 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시하는 것을 특징으로 하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법.
제 1 항에 있어서,
상기 분리방법은
비효소적 방식인 것을 특징으로 하는, 비접촉식 초음파 장치를 이용한 기질혈관분획의 분리방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라, 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하기 위한 비접촉식 초음파 장치로서,
상기 비접촉식 초음파 장치는
전원부;
상기 전원부로부터 공급된 전기에너지를 이용하여 초음파를 발생시키는 초음파 발진부; 및
상기 초음파 발진부와 접하는 사각 기둥 형태로 형성되되, 상면에는 상기 상면에서 하면 방향으로, 지방 조직이 수용되는 튜브형 용기가 삽입 및 고정되는 복수개의 고정홈이 형성된 초음파 진동부;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 기질혈관분획 분리용 비접촉식 초음파 장치.
제 7 항에 있어서,
상기 고정홈은
적어도 두 개 이상인 것을 특징으로 하는, 기질혈관분획 분리용 비접촉식 초음파 장치.