KR20230174031A - 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법 - Google Patents

비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생체 조직으로부터 분리 및 추출된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로부터 엑소좀(Exosome)을 추출하는 엑소좀 분리 챔버(300); 를 포함하고, 엑소좀 분리 챔버(300)는 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 포함된 내용물이 주입되는 주입구(311)와, 엑소좀(Exosome)을 토출시키는 토출구(312)가 구비되는 챔버 하우징(310); 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)에서 엑소좀(Exosome)이 통과될 수 있는 미세 기공이 형성되고, 주입구(311)와 연통되도록 챔버 하우징(310)의 내측에서 고정되는 제1필터(320); 및 제1필터(320)의 외면과 이격된 틈새를 유지하고, 토출구(312)로 연장되는 유로를 구비한 내부 하우징(330); 을 포함하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치를 제공한다.

Description

비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법{EXOSOME SEPARATING DEVICE USING NON-CONTACT TYPE ULTRASONIC AND EXOSOME SEPARATING METHOD USING THE SAME}
본 발명은 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법에 관한 것이다.
줄기세포 분야는 생명공학(BT) 분야에서 세계적으로 관심이 집중되고 있으며, 줄기세포 중에서도 성체줄기세포의 경우에는 배아줄기세포 또는 유도만능세포에 비해 발암성 등이 없어 안전성이 확보되어 있고, 특히 자신의 세포를 자신이 사용할 수 있는 분야가 많이 있다는 점에서 임상 접근성이 용이한 장점이 있다.
여기서 지방조직으로부터 기질 혈관 분획(Stromal vascular fraction, SVF)에는 줄기세포가 포함되어 있으며, 이를 이용한 세포치료분야 및 미용성형분야에의 수요가 급속도로 증가하고 있다.
기질 혈관 분획(SVF)은 지방조직과 함께 인체에 이식될 경우 이식된 부위에서 혈관생성이 활성화 되어 주변 조직의 영양분을 쉽게 공급받아 지방조직의 생착률이 증가되는 효과가 있는 것으로 밝혀져, 현재 미용·성형 목적으로 전 세계적으로 널리 보급되어 시술되고 있다.
다만, 줄기세포 치료제 시장은 급격히 증가하고 있으나 이에 대한 안전성 문제는 여전히 해결되고 있지 못한 상태임. 현재 시판되고 있는 줄기세포 치료제는 면역거부반응 등 부작용의 가능성이 있고, 줄기세포 자체의 생착률이 낮다는 단점이 있다.
엑소좀(Exosome)은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어져 있으며 내부에는 유래된 줄기세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 단백질, mRNA, miRNA, DNA 등이 포함되어 있고 표면에는 특이적인 바이오마커들이 발현되어 있다.
그러므로 엑소좀(Exosome)은 줄기세포의 역할을 대체할 수 있다는 점에서 기존의 줄기세포 기반 치료제의 문제점을 해결할 수 있는 새로운 치료법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서 종래에는 효소가 단백질을 분해하며 조직사이에 있는 줄기세포를 분리하는 효소 처리 방식을 적용하였다. 하지만, 미국 FDA에서는 지방분해 효소 사용으로 인한 세포 사멸 및 생물학적 변형 문제로 사용이 제한되고 있으며, 유럽 등에서도 효소 사용이 제한되고 있는 추세이다.
또한, 종래에는 비효소 수단 중 지방 조직에 직접 초음파를 가하여 기질기획분획을 분리하고, 이어서 엑소좀(Exosome)을 분리하는 방식을 제안하였으나, 이경우에 초음파 노즐이 지방조직에 직접적으로 닿아 오염원에 쉽게 노출이 될 수 있다. 또한 종래에는 단순 원심분리, 단순 필터링 방식도 제안되었으나, 위 방식들은 시간이 오래걸리고 줄기세포 수율이 낮은 문제점이 있었다.
따라서 종래에는 줄기세포에서 엑소좀(Exosome)을 분리할 때, 줄기세포의 효율이 현저이 떨어지기에 엑소좀(Exosome) 역시 효율성이 낮은 문제점이 있다.
KR 10-2020-0142214 A(2020.12.22)
본 발명은 상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 엑소좀(Exosome)의 분리 효율을 높일 수 있는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 하기와 같은 실시예를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예는 생체 조직으로부터 분리 및 추출된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로부터 엑소좀(Exosome)을 추출하는 엑소좀 분리 챔버를 포함하고, 엑소좀 분리 챔버는 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 포함된 내용물이 주입되는 주입구와, 엑소좀(Exosome)을 토출시키는 토출구가 구비되는 챔버 하우징과, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)에서 엑소좀(Exosome)이 통과될 수 있는 미세 기공이 형성되고, 주입구와 연통되도록 챔버 하우징의 내측에서 고정되는 제1필터 및 제1필터의 외면과 이격된 틈새를 유지하고, 토출구로 연장되는 유로를 구비한 내부 하우징을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 실시예는 생체 조직으로부터 분리 및 추출된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로부터 엑소좀(Exosome)을 추출하는 엑소좀 분리 챔버를 포함하고, 엑소좀 분리 챔버는 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 포함된 내용물이 주입되는 주입구와, 엑소좀(Exosome)을 토출시키는 토출구가 구비되는 챔버 하우징 및 챔버 하우징의 내측에서 주입구 및 토출구 사이의 공간에서 미세 기공이 형성되어 주입구를 통해 주입된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)에서 엑소좀(Exosome)을 분리하는 제2필터를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 실시예는 생체 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 비접촉 방식으로 1차 분리하는 비접촉식 초음파 부재와, 1차 분리된 생체 조직을 원심분리하여 기절혈관분획을 2차 분리하는 원심 분리 부재 및 2차 분리된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)에서 엑소좀(Exosome)을 추출하는 엑소좀 분리 챔버를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 또 다른 실시예로서 a)생체 조직이 주입된 제1 튜브형 용기에 비접촉식으로 초음파를 가하여 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 1차 분리하는 단계와, b)1차 분리된 제1 튜브형 용기를 원심분리하여 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 2차 분리하는 단계와, c)제1 튜브형 용기 내의 내용물을 추출한 제2튜브형 용기에 세척액을 주입하고, 원심분리하여 제2튜브형 용기의 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 세척하는 단계 및 d)세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 엑소좀(Exosome) 분리장치에 주입하여 엑소좀(Exosome)을 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
그러므로 본 발명은 비접촉식 초음파를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(SVF)을 분리하고, 기질혈관분획에서 제2필터를 통하여 엑소좀(Exosome)을 추출함에 따라 기존에 비하여 많은 양의 세포와 엑소좀(Exosome)을 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치를 도시한 블럭도이다.
도 2는 비접촉식 초음파 부재를 도시한 사시도이다.
도 3은 엑소좀 분리 챔버의 일실시예를 도시한 사시도이다.
도 4는 엑소좀 분리 챔버의 다른 실시예를 도시한 사시도이다.
도 5는 도 4의 제2필터를 도시한 단면도이다.
도 6은 본 발명에 따른 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법을 도시한 순서도이다.
도 7은 S40 및 S50 단계를 도시한 도면이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
이하에서는 본 발명에 따른 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법의 바람직한 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치를 도시한 블럭도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치는 생체 조직이 투입된 제1 튜브형 용기(T1)와, 비접촉식 초음파 부재(100)와, 원심 분리 부재(200)와, 엑소좀 분리 챔버(300)를 포함한다.
제1 튜브형 용기(T1)는 생체 조직(예를 들면, 지방 조직)이 투입되며, 주사기의 체결이 가능한 구조의 커버가 탈착 가능하며 내측에 생체 조직이 수용되는 공간을 형성한다.
비접촉식 초음파 부재(100)는 제1 튜브형 용기(T1)에 직접 접촉되지 않은 방식으로 초음파를 가하여 지방 조직으로부터 콜라겐 및 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리한다.
원심 분리 부재(200)는 초음파에 의해 1차 분리된 제1 튜브형 용기(T1)를 원심 분리하여 제1 튜브형 용기(T1) 내의 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 2차 분리 및 세척한다.
여기서 제1 튜브형 용기(T1) 내의 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)은 제2튜브형 용기(T1)로 추출된 후 원심 분리를 통해 세척된다.
엑소좀 분리 챔버(300)는 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)에서 엑소좀(Exosome)을 분리한다.
이와 같은 각각의 장치 중, 비접촉식 초음파부재는 도 2를 참조하여 설명한다.
도 2는 비접촉식 초음파 부재(100)를 도시한 사시도이다.
도 2를 참조하면, 비접촉식 초음파 부재(100)는 초음파를 발진하는 발진부(120)와, 초음파에 의해 진동되는 진동부(130)와, 발진부(120)를 제어 및 전원을 공급하는 컨트롤러(110)를 포함한다.
발진부(120)는 컨트롤러(110)의 제어에 의하여 초음파를 발진한다. 여기서 발진부(120)는 30 ~ 40 kHz의 주파수를 갖는 초음파를 1~10분 발진시킨다.
예를 들면, 실험을 통하여 측정한 결과, 초음파의 주파수가 30 kHz 미만일 경우에는 피부 조직에서 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 저하될 수 있다.
만약, 상기 초음파의 주파수가 40 kHz 초과일 경우에는, 세포의 손상이 발생되어 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 저하될 수 있다.
그러나 33 ~ 37 kHz의 주파수를 갖는 초음파로서 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리할 경우에는 위 주파수 대역의 초음파 보다 효율이 높은 것으로 확인되었다. 이는 후술한다.
또한, 발진부(120)는 일방향으로 연장되는 고정축(121)을 포함하며, 고정축(121)은 진동부(130)에 억지 끼움 또는 나사 결합, 별도의 고정 치구에 의해 고정될 수 있다. 즉, 발진부(120)와 진동부(130)는 분리형 구조로서 상호 착탈이 용이하다.
고정축(121)은 일방향으로 연장되는 막대 또는 봉형상으로서 내측에 혼(Horn)이 설치될 수 있다. 그리소 고정축(121)은 선단이 진동부(130)의 몸체에 억지 끼움식 또는 나사 결합 방식으로 체결될 수 있다.
또는, 고정축(121)은 억지 끼움으로 체결된 이후에 별도의 나사나 고정 볼트에 의해 고정될 수 있다.
따라서 본 발명에서 발진부(120)는 32 ~ 38 kHz의 주파수로 1~10분동안 초음파를 발진시키는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게로 33 ~ 37 kHz의 주파수를 갖는 초음파를 발진한다.
진동부(130)는 발진부(120)에서 출력된 초음파에 의해 진동되어 제1 튜브형 용기(T1)를 진동시킨다. 이를 위해 진동부(130)는 상하로 관통되는 복수의 고정구(131)를 포함한다.
고정구(131)는 제1 튜브형 용기(T1)가 끼움식으로 고정되도록 진동부의 상면에서 상면에서 상하로 관통 형성된다.
또한, 진동부(130)는 몸체의 일면에서 고정축(121)이 체결되는 체결공(도시되지 않음)이 포함된다.
여기서, 초음파에 의해 진동되는 혼(Horn)은 진동부(130)의 몸체 내에 설치되거나, 발진부(120)에서 진동부(130)로 연장 및 체결되는 고정축(121) 내에 설치되어 진동부(130)를 진동시킬 수 있다.
따라서 진동부(130)는 초음파에 의해 발생된 진동을 제1 튜브형 용기(T1)에 가한다.
그러므로 제1 튜브형 용기(T1)는 직접적으로 초음파가 가해지는 것이 아닌, 진동부(130)를 통한 비접촉식으로 초음파가 가해진다.
컨트롤러(110)는 디스플레이 및/또는 복수의 스위치가 구비된 조작 패널을 구비할 수있다. 컨트롤러(110)는 조작 패널을 통해 입력된 명령에 따라 발진부(120)를 구동시킨다.
여기서 제1 튜브형 용기(T1)에 주입된 생체 조직(예를 들면, 지방 조직)은 비접촉식으로 가해지는 초음파에 의해 오일과 콜라겐 및 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로 분리된다.
원심 분리 부재(200)는 비접촉식 초음파 부재(100)에 의해 분리된 지방 조직을 원심분리하여 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 2차 분리한다. 즉, 본 발명은 비접촉식 초음파 부재(100)에 의해 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 1차 분리하고, 원심 분리 부재(200)에서 2차 분리 과정을 진행한다.
여기서 원심 분리 부재(200)는 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기(T1)를 원심 분리하여 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로 분리할 수 있다.
특히, 본 발명은 초음파 조사 후 원심 분리 과정을 실시함에 따라 초음파만 조사한 경우 또는 원심 분리만 실시한 경우 보다, 지방 조직으로부 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 더욱 효과적으로 분리할 수 있다.
이때, 원심 분리는 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수, 구체적으로는 900 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 실시될 수 있다. 특히, 원심 분리가 900 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 실시될 때 비접촉식 초음파 부재(100)를 이용하면서도 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리해낼 수 있다.
만약, 원심 분리의 회전수가 800 rpm 미만일 경우에는, 지방 조직에서 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 저하될 수 있다. 반면, 상기 원심 분리의 회전수가 1,000 rpm 초과일 경우에는, 과도한 회전 및 진동에 의해 세포의 손상이 발생되어, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 저하될 수 있다.
원심 분리는 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 실시되되, 1 ~ 5 분, 구체적으로는 2 ~ 4 분 동안 실시될수 있다.
특히, 원심 분리가 2 ~ 4 분 동안 실시될 때 지방 조직으로부터 높은 효율로 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리 해낼 수 있다.
또한, 본 발명은 원심 분리 부재(200)에 의해 원심 분리된 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF) 중에서 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 별도로 취하여 제2 튜브형 용기(T2)의 내부 공간에 주입하고, 세척을 위하여 상기 제2 튜브형 용기(T2)(T2)의 내부 공간에 세척 용액을 함께 주입한 다음, 원심 분리를 실시함으로써, 세척을 실시할 수 있다.
즉, 원심 분리 부재(200)는 비접촉식 초음파 부재(100)에 의해 1차 분리된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 수용한 제1 튜브형 용기(T1)를 원심분리시켜 2차 분리하고, 제2튜브형 용기로 이동된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 원심 분리하여 세척 공정을 진행한다.
세척 용액은 NS(Nomal saline), HBSS(Hank's Balanced Salt Solution) 및 PBS(phosphate-buffered saline)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 세척 용액은 1 ~ 10 % PBS(phosphate-buffered saline) 용액일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
엑소좀 분리 챔버(300)는 도 4 내지 도 6을 참조하여 설명한다.
도 4는 엑소좀 분리 챔버(300)의 일실시예를 도시한 사시도이다.
도 4를 참조하면, 엑소좀 분리 챔버(300)는 챔버 하우징(310)과, 제1필터(320)과, 내부 하우징(330)을 구비한다.
챔버 하우징(310)은 한쪽에 돌출 형성된 주입구(311)와, 반대쪽에서 돌출된 토출구(312)와, 주입구(311)와 토출구(312) 사이에서 확장된 공간이 형성되는 수용부(313)를 포함할 수 있다.
주입구(311)는, 예를 들면, 원심분리된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 포함된 내용물이 담긴 주사기가 연결된다. 여기서 주사기는 원심분리 및 세척이 완료된 제2 튜브형 용기(T2)에서 추출된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 추출한 뒤에 엑소좀 분리 챔버(300)의 주입구(311)에 체결된다.
수용부(313)는 내측에서 확장된 공간을 형성하여 제1필터(320) 및 내부 하우징(330)을 수용한다.
토출구(312)는 내부 하우징(330)을 통해 안내되는 엑소좀(Exosome)을 수용하기 위한 다른 주사기가 연결된다.
제1필터(320)은 주입구(311)로 연장되고 반대쪽은 폐쇄되되, 외면에서 복수의 미세한 직경을 갖는 통공(예를 들면, 100~200nm의 직경)이 형성되어 엑소좀(Exosome)만을 외측의 내부 하우징(330)으로 배출시킨다. 여기서 제1필터(320)는 미세 통공들이 형성된다. 따라서 엑소좀(Exosome)은 미세 통공 보다 작은 사이즈를 갖고 있기에 토출구(312)를 통해 체결된 주사기의 끌어당기는 압력에 의해 미세 통공 밖으로 이동된다.
내부 하우징(330)은 내측에 제1필터(320)을 수용할 수 있는 공간을 갖고 챔버 하우징(310)의 내측에 수용된다. 여기서 내부 하우징(330)은 내측의 제1필터(320)와 이격된 공간을 형성하되, 챔버 하우징(310)의 토출구(312)에 연결된다. 반대로 내부 하우징(330)은 주입구(311)와 분리된다.
즉, 엑소좀은 제1필터(320)에서 출력되어 내부 하우징(330)과 제1필터(320) 사이의 간격을 통해 토출구로 토출된다.
또한, 본 발명은 엑소좀 분리 챔버(300)의 다른 실시예를 포함한다. 이는도 5와 도 6을 참조하여 설명한다.
도 5는 엑소좀 분리 챔버(300)의 다른 실시예를 도시한 사시도, 도 6은 도 5의 제2필터(340)를 도시한 단면도이다.
도 5 및 도 6을 참조하면, 본 발명의 다른 실시예는 주입구(311)와 토출구(312)가 형성된 챔버 하우징(310)과, 챔버 하우징(310)의 내측에서 엑소좀(Exosome) 만을 통과시키는 제2필터(340)를 포함한다.
챔버 하우징(310)은 주입구(311)를 통해 원심분리 후 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 수용된 주사기가 연결되고, 토출구(312)를 통해 엑소좀(Exosome)을 수용하는 수용하는 주사기가 연결되며, 내측의 확장된 공간을 형성하는 수용부(313) 내측에 제2필터(340)가 설치된다.
제2필터(340)는 기질혈괄분획 중에서 엑소좀(Exosome)만을 통과시킨다. 이를 위하여 제2필터(340)는 100~200nm의 미세 기공이 형성된 다공성 나노 필터이다. 따라서 제2필터(340)은 미세 기공 보다 더 작은 사이즈를 갖는 엑소좀(Exosome) 만을 통과시키고, 나머지 성분들을 통과시키지 않는다.
그러므로 제2필터(340)는 주입구(311)를 통해 주입된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF) 중 엑소좀(Exosome) 만을 토출구(312)로 토출시킨다.
본 발명은 상기와 같은 구성들을 포함하며, 이하에서는 본 발명에 따른 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법을 설명한다.
도 6은 본 발명에 따른 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법을 도시한 순서도, 도 7은 S40 및 S50 단계를 도시한 순서도이다.
도 7 및 도 8을 참조하면, 본 발명은 생체 조직을 제1 튜브형 용기(T1)에 주입하는 S10 단계와, 비접촉 방식으로 초음파를 가하여 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 1차 분리하는 S20 단계와, 원심 분리로 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 2차 분리하는 S30 단계와, 원심 분리로 세척하는 S40 단계와, 세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 추출하는 S50 단계와, 엑소좀(Exosome)을 분리하는 S60 단계를 포함한다.
S10 단계는 생체 조직(예를 들면, 지방 조직)을 제1 튜브형 용기(T1)에 주입하는 단계이다.
S20 단계는 비접촉 방식으로 제1 튜브형 용기(T1) 내의 지방 조직에서 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 1차 분리하는 단계이다.
여기서 컨트롤러(110)는 발진부(120)를 구동하여 초음파를 출력하도록 제어한다. 이때,제1 튜브형 용기(T1)는 진동부(130)의 고정구(131)에 설치된 상태이다. 따라서 진동부(130)는 발진부(120)에서 발진된 초음파에 의해 진동되어 제1 튜브형 용기(T1)를 진동시킨다.
따라서 지방 조직은 진동부(130)를 통해 전달되는 초음파 진동으로 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)과, 콜라겐 및 오일로 분리된다.
S30 단계는 1차 분리된 지방 조직이 수용된 제1 튜브형 용기(T1)를 원심분리하여 2차 분리하는 단계이다. 여기서 원심 분리 부재(200)는 1차 분리된 제1 튜브형 용기(T1)를 원심분리하여 2차로 분리한다.
S40 단계는 원심분리된 제1 튜브형 용기(T1)에서 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 추출하여 제2튜브형 용기로 이동하고, 제2튜브형 용기에 세척용액을 주입하여 원심분리로 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 세척하는 단계이다. 여기서 세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)은 제2튜브형 용기의 하측에 층을 이루고, 세척액은 상층을 이루게 된다.
S50 단계는 제2튜브형 용기내에서 세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 추출하는 단계이다. 여기서 작업자는 주사기를 이용하여 제2튜브형 용기에서 세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 추출한다.
S60 단계는 세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 엑소좀 분리 챔버(300)에 주입하여 엑소좀(Exosome)을 추출하는 단계이다. 주사기는 챔버 하우징(310)의 주입구(311)에 결합되어 챔버 하우징(310) 내측에 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 주입한다.
엑소좀 분리 챔버(300)는, 일실시예의 경우, 제1필터의 미세 기공을 통해 엑소좀(Exosome)이 내부 하우징(330) 측으로 배출된다. 배출된 엑소좀(Exosome)은 내부 하우징(330)과 제1필터 사이의 이격된 틈새를 통해 챔버 하우징(310)의 토출구(312)로 토출된다. 이때, 토출구(312)는 신규 주사기가 결합되어 토출구(312)로부터 토출된 엑소좀(Exosome)을 저장한다.
또는, 엑소좀 분리 챔버(300)는, 다른 실시예의 경우, 주입구(311)를 통해 주입된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)가 제2필터(340)를 통해 엑소좀(Exosome) 만이 통과되어 챔버 하우징(310)의 토출구(312)로 토출된다.
이와 같이 본 발명은 비접촉식 초음파 및 원심분리 과정을 통해 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF) 공정을 수행함에 따라 비효소적인 방식임에도 불구하고, 효소적인 방식에 비하여 보다 많은 숫자의 줄기세포를 얻을 수 있었다. 따라서 엑소좀 분리 챔버(300)는 기존 보다 많은 줄기세포를 통해 엑소좀(Exosome)을 분리할 수 있다.
이는 아래와 같은 실험을 통해 확인 되었으며, 실험은 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 통한 줄기 세포수를 측정하는 방식으로 진행되었다.
이하 실시예, 비교예, 및 실험예를 통하여 본 발명의 비접촉식 초음파 장치를 이용하여 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하는 방법 및 이에 이용된 비접촉식 초음파 장치에 대해 구체적으로 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[ 실시예 ]
실시예 1 : 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리
(A)지방 조직을 제1 튜브형 용기에 주입하였다.
(B) 상기 지방 조직이 주입된 제1 튜브형 용기를 도 7에 도시된 바와 같이, 비접촉식 초음파 장치의 초음파 진동부(130)의 고정홈에 삽입하여 고정되도록 하였다.
이어서, 상기 비접촉식 초음파 장치의 컨트롤러(110)에 전원을 공급하여, 초음파가 발생되도록 하였으며, 초음파는 33 ~ 37 kHz 주파수로 약 5 분 동안 조사하였다.
(C)초음파가 조사된 후, 제1 튜브형 용기를 원심 분리기에 장착한 뒤, 약 900 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 3 분 동안 원심 분리를 실시하였으며, 이에 따라, 도 2에 도시된 바와 같이, 오일, 콜라겐 및 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로 층이 분리되었다.
(D)상기 제1 튜브형 용기 내에 수용된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)만을 주사기로 추출한 다음, 이를 새로운 제2 튜브형 용기(T2) 내에 주입하였다. 이어서, 상기 제2 튜브형 용기(T2)에 5 % PBS 용액(세척 용액)을 주입하고, 850 ~ 950 rpm 의 회전수로 3 ~ 5 분 동안 원심 분리하여 세척하였다.
(E)도 2에 도시된 바와 같이, 상기 원심 분리에 의해, 분리된 세척 용액 및 세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 주사기로 제2 튜브형 용기(T2)에서 추출해내었다.
[ 비교예 ]
비교예 1
효소적 방식에 따라, 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하였다.
구체적으로, 지방 조직 1 mL 및 콜라게나제 1 mL를 혼합하고 약 37 ℃ 에서 40 분간 반응시킨 뒤, 원심분리(1,500 rpm, 5분)하고, 침전된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 추출하였다. 이를 세척 용액과 혼합하여 세척하고, 원심분리(1,500 rpm, 5분)한 뒤, 세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 추출하였다.
비교예 2
상기 (B) 과정을 생략한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
비교예 3
상기 (C) 과정을 생략한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
비교예 4 내지 7
상기 (B) 단계에서, 표 1과 같은 조건으로 초음파를 조사한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
비교예4 비교예5 비교예6 비교예7
초음파 주파수 20 ~ 25 kHz 45 ~ 50 kHz 33 ~ 37 kHz 33 ~ 37 kHz
조사 시간 5 분 5 분 30 초 15 분
비교예 8 내지 11
상기 (C) 단계에서, 표 2과 같은 조건으로 원심 분리를 실시한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일하게 실시하였다.
비교예8 비교예9 비교예10 비교예11
회전수(rpm) 600 ~ 700 1,100 ~ 1,200 900 ~ 1,000 900 ~ 1,000
시간 3분 3분 30초 10분
[ 실험예 ]
실험예 1 : 기질혈관분획 내 줄기세포 수 평가
실시예 1에 따라, 지방 조직 1ml로부터 분리된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF) 내 포함된 줄기세포의 세포수를 세포 자동 측정기기 NC-200로 측정(Stem cell number/Fat tissue 1 mL)하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
또한, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, 비교예 1 내지 11에 따라, 지방 조직 1ml로부터 분리된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF) 내 포함된 줄기세포의 세포수를 측정하여, 그 결과를 표 3에 나타내었다.
세포수 세포수
실시예1 65,800 비교예6 21,100
비교예1 42,000 비교예7 37,000
비교예2 36,000 비교예8 30,200
비교예3 15,600 비교예9 35,000
비교예4 20,000 비교예10 28,000
비교예5 34,500 비교예11 34,500
표 3을 보면, 본 실시예에 따를 경우, 지방 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF) 내 줄기세포의 분리 효율이 현저히 우수함을 알 수 있으며, 이는 지방 세포로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 높은 효율로 분리됨을 의미한다.
구체적으로, 본 실시예에 따르는 실시예 1은, 효소적 방식인 비교예 1 보다, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 우수함을 알 수 있다.
또한, 실시예 1 및 비교예 2 내지 3을 비교하면, 비접촉식 초음파 처리와 원심 분리를 모두 실시할 때에만, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 향상됨을 알 수있다.
또한, 실시예 1 및 비교예 4 내지 11을 비교하면, 상기 (B)단계에서 주파수가 30 ~ 40 kHz인 초음파를 1 ~ 10 분 동안 조사하고, 상기 (C)단계에서 800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 1 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시할 때, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 현저히 향상됨을 알 수 있다.
실험예 2 : 기질혈관분획 분리 성능 평가
실시예 1 및 비교예 1에 따라, 지방 조직 1g으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리하고, 분리된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 총 세포수를 측정하여, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
또한, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 세포자동계수장비(Logos사 LUNA Stem 또는 Life technologies사 Countess Ⅱ automated cell counter)를 이용하여 생존율을 측정하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
기질혈관분획 세포의 수 생존율
실시예1 7.45 x 105 cells/g 92.0%
비교예1 4.00 x 105 cells/g 75.3%
표 4를 보면, 본 발명에 따라 비접촉 초음파 방식을 이용하는 실시예 1의 경우, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 우수하면서도 생존율 또한 우수함을 알 수 있다.
반면, 본 발명과 달리, 효소적 방식을 사용하는 비교예 1의 경우, 실시예 1 보다, 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 효율이 저하되며, 세포의 생존율 또한 저하됨을 확인할 수 있다.
위와 같은 실험에 따르면, 본 발명은 비효소적 방식 및 비접촉 초음파 방식을 이용하면서도 특정 조건으로 초음파 및 원심 분리를 실시함에 따라, 지방 조직으로부터 효과적으로 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 분리할 수 있다.
또한, 본 발명은 위와 같이 종래에 비하여 보다 많은 숫자의 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 엑소좀 분리 챔버(300)에 주입하여 보다 높은 효율로서 엑소좀(Exosome)을 분리할 수 있다.
그러므로 본 발명은 비접촉식 초음파 및 원심분리 공정을 결합하여 종래에 비하여 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)의 분리 및 추출 효율이 높고, 간단한 구조를 갖는 엑소좀 분리 챔버(300)가 결합 됨에 따라 엑소좀(Exosome) 추출 까지의 시간이 단축되고, 기존에 비하여 보다 높은 효율로서 엑소좀(Exosome)을 추출할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
100 : 비접촉식 초음파 부재
110 : 컨트롤러
120 : 발진부
121 : 고정축
130 : 진동부
131 : 고정구
200 : 원심 분리 부재
300 : 엑소좀 분리 챔버
310 : 챔버 하우징
311 : 주입구
312 : 토출구
313 : 수용부
320 : 제1필터
330 : 내부 하우징
340 : 제2필터

Claims (11)

  1. 생체 조직으로부터 분리 및 추출된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로부터 엑소좀(Exosome)을 추출하는 엑소좀 분리 챔버(300); 를 포함하고,
    엑소좀 분리 챔버(300)는
    기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 포함된 내용물이 주입되는 주입구(311)와, 엑소좀(Exosome)을 토출시키는 토출구(312)가 구비되는 챔버 하우징(310);
    기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)에서 엑소좀(Exosome)이 통과될 수 있는 미세 기공이 형성되고, 주입구(311)와 연통되도록 챔버 하우징(310)의 내측에서 고정되는 제1필터(320); 및
    제1필터(320)의 외면과 이격된 틈새를 유지하고, 토출구(312)로 연장되는 유로를 구비한 내부 하우징(330); 을 포함하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치.
  2. 생체 조직으로부터 분리 및 추출된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)으로부터 엑소좀(Exosome)을 추출하는 엑소좀 분리 챔버(300); 를 포함하고,
    엑소좀 분리 챔버(300)는
    기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)이 포함된 내용물이 주입되는 주입구(311)와, 엑소좀(Exosome)을 토출시키는 토출구(312)가 구비되는 챔버 하우징(310); 및
    챔버 하우징(310)의 내측에서 주입구(311) 및 토출구(312) 사이의 공간에서 미세 기공이 형성되어 주입구(311)를 통해 주입된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF) 중 엑소좀(Exosome)을 분리하는 제2필터(340); 를 포함하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치.
  3. 청구항 1에서 있어서, 미세 기공은
    100~200nm의 직경을 갖는 것; 을 특징으로 하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치.
  4. 생체 조직으로부터 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 비접촉 방식으로 1차 분리하는 비접촉식 초음파 부재(100);
    1차 분리된 생체 조직을 원심분리하여 기절혈관분획을 2차 분리하는 원심 분리 부재(200); 및
    2차 분리된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)에서 엑소좀(Exosome)을 추출하는 청구항 1 또는 청구항 2의 엑소좀 분리 챔버(300); 를 포함하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치.
  5. 청구항 4에 있어서, 비접촉식 초음파 부재(100)는
    컨트롤러(110);
    컨트롤러(110)의 제어에 의해 초음파를 발생시키는 발진부(120); 및
    상면에서 관통되어 생체 조직이 주입된 튜브형 용기가 고정되는 복수의 고정구(131)를 구비하고, 발진부(120)에서 발진된 초음파를 튜브형 용기에 출력하는 진동부(130); 를 포함하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 장치.
  6. a)생체 조직이 주입된 제1 튜브형 용기(T1)에 비접촉식으로 초음파를 가하여 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 1차 분리하는 단계;
    b)1차 분리된 제1 튜브형 용기(T1)를 원심분리하여 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 2차 분리하는 단계;
    c)제1 튜브형 용기(T1)내의 내용물을 추출한 제2튜브형 용기에 세척액을 주입하고, 원심분리하여 제2튜브형 용기의 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 세척하는 단계; 및
    d)세척된 기질혈관분획(Stromal vascular fraction, SVF)을 청구항1 또는 청구항 2의 엑소좀(Exosome) 분리장치에 주입하여 엑소좀(Exosome)을 추출하는 단계; 를 포함하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, a)단계는
    컨트롤러(110)의 제어에 의해 발진부(120)에서 발진된 초음파가 제1 튜브형 용기(T1)가 고정된 진동부(130)를 통해 제1 튜브형 용기로 가해지는 것; 을 특징으로 하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, a)단계는
    주파수가 30 ~ 40 kHz인 초음파를 조사하는 것을 특징으로 하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법.
  9. 청구항 6에 있어서, a) 단계는
    초음파를 1 ~ 10 분 동안 조사하는 것; 을 특징으로 하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법.
  10. 청구항 6에 있어서, b)단계는
    800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 1 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시하는 것; 을 특징으로 하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법.
  11. 청구항 6에 있어서, c) 단계는
    800 ~ 1,000 rpm 의 회전수로 3 ~ 5 분 동안 원심 분리를 실시하는 것; 을 특징으로 하는 비접촉식 초음파를 이용한 엑소좀 분리 방법.
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