CN105055386A - 伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用。本研究通过大量实验确定了伏立诺他的新性质，这些新性质包括：伏立诺他可抑制STAT-1和STAT-3信号通路，从而抑制初始T细胞向Th1、Th17淋巴细胞分化，进而降低IFN-γ和IL-17表达量；伏立诺他可上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的nTreg细胞数量；伏立诺他可抑制NF-κB？P65的表达，从而抑制TNF-α表达量，进而缓解巨噬细胞的浸润；伏立诺他还可以上调紧密连接蛋白claudin-5的表达量，从而修复血视网膜屏障损伤。基于以上性质，确定了伏立诺他作为免疫调节药物的新用途，并进一步确定了其用于自身免疫性葡萄膜炎治疗药物的用途，实验表明伏立诺他对自身免疫性葡萄膜炎疗效确切，具有全新的治疗通路且无副作用，具备良好的应用前景。

Description

伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用。

背景技术

免疫调节药物泛指能够对免疫系统微观运行状态起到调节作用的一系列药物。由于以免疫系统微观运行状态失衡为效应的疾病类别很多，因此，通过药物干预实现对免疫系统的调节可能作为不同疾病的治疗途径。

葡萄膜(Uvea)是眼球壁的中层，包扩虹膜、睫状体和脉络膜三个富于血管和色素的结构。自身免疫性葡萄膜炎(Autoimmuneuveitis)是一组复杂的威胁视力的疾病，是全球范围内导致视力丧失的主要原因之一。自身免疫性葡萄膜炎可以分为HLA-B27等位基因相关性与非相关性两类。前者男性居多，单眼发病，反复发作，病理所见为非肉芽肿性炎症。后者男女发病率相当，呈现累及双眼的慢性肉芽肿性炎症，且常常伴随血清阴性脊柱关节病(Seronegativespondyloarthritis)、白塞氏病(Behcet'sdisease)、反应性关节炎(Reactivearthritis,RA)以及其他一些自身免疫相关疾病。

现有技术中有研究表明，自身免疫性葡萄膜炎的主要效应T细胞为CD4⁺Th1和Th17细胞，两种T细胞亚群相互独立，前者主要分泌干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)而致病，并以此抑制Th17细胞亚群的分化，而后者则通过IL-17诱导小鼠EAU的产生并阻碍Th1细胞亚群的分化。由Th1或者Th17介导的EAU的临床表现不尽相同，在IRBP诱导的小鼠EAU模型中，Th17细胞占据了更为主导的地位。上述这些自身活化的T细胞将克隆增殖，迁移至视网膜，破坏血-视网膜屏障(Blood-retinalbarrier,BRB)，并募集循环血液中的单核细胞、巨噬细胞以及嗜酸性粒细胞等到达免疫炎症反应部位，这些炎性细胞通过分泌肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、一氧化氮合酶2(Nitricoxidesynthase-2,NOS-2)等炎性因子进一步扩大炎症反应，加强对光感受器层细胞的破坏。

现有技术中，对于自身免疫性葡萄膜炎的主要药物治疗方法是运用糖皮质激素或免疫抑制剂。但是局部或全身长期应用这类药物会导致许多眼部或者全身并发症。此外，由于人类葡萄膜炎本身的异质性，单一的阻断某一种细胞因子并不适用于所有的病例。因此，应当开发一种更有效、副作用更小的药物，防止不可逆的视力损伤并促进视力的恢复。

伏立诺他属于异羟肟酸类HDAC抑制剂，它主要抑制Ⅰ类和Ⅱ类HDAC，参与调节前炎症反应和细胞增殖与分化，以及Ⅳ类HDAC。现有技术中，伏立诺他主要用于非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer)、多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma,MM)、白血病(Leukemia)、淋巴瘤(Lymphoma)以及大脑和中枢神经系统肿瘤的抗肿瘤治疗。它也是首个被美国食品和药品监督管理局批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤(CutaneousTcelllymphoma)的HDAC抑制剂。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供了伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用，从而为实现免疫系统运行状态的调节提供了一种新途径。

本发明解决的另一技术问题是确定了伏立诺他新的药理性质。

本发明解决的再一技术问题是确定了伏立诺他新的医药用途

本发明解决的又一技术问题是实现了对自身免疫性葡萄膜炎的治疗。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用。

优选的，所述免疫调节药物是抑制STAT-1信号通路的药物；在此基础上进一步优选的，是通过抑制STAT-1信号通路而抑制初始T细胞向Th1淋巴细胞分化的药物；更优的，是通过抑制初始T细胞向Th1淋巴细胞分化而降低Th1细胞数量的药物；最优的，是通过降低Th1细胞数量而降低IFN-γ表达量的药物。

优选的，所述免疫调节药物是抑制STAT-3信号通路的药物；在此基础上进一步优选的，是通过抑制STAT-3信号通路而抑制初始T细胞向Th17淋巴细胞分化的药物；更优的，是通过抑制初始T细胞向Th17淋巴细胞分化而降低Th17细胞数量的药物；最优的，是通过降低Th17细胞数量而降低IL-17表达量的药物。

优选的，所述免疫调节药物是上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的nTreg细胞数量的药物；在此基础上进一步优选的，是通过上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的nTreg细胞数量从而恢复T淋巴细胞各亚群比例平衡。

优选的，所述免疫调节药物是提升CD4⁺CD3⁺CD62L⁺的T细胞数量的药物。

优选的，所述免疫调节药物是抑制NF-κBP65表达的药物；在此基础上优选的，是通过抑制NF-κBP65的表达，从而抑制其对TNF-α转录的促进作用，进而抑制TNF-α表达量的药物；更优的，是通过抑制TNF-α表达量从而缓解巨噬细胞浸润的药物。

优选的，所述免疫调节药物是上调紧密连接蛋白claudin-5表达量的药物；在此基础上进一步优选的，是通过上调紧密连接蛋白claudin-5表达量从而修复血视网膜屏障损伤的药物。

在以上任一项技术方案基础上优选的，所述免疫调节药物是自身免疫疾病治疗药物；更优的，所述自身免疫疾病是自身免疫性葡萄膜炎。

本发明所述的免疫调节药物是指对免疫系统微观运行状态具有调节作用的药物，进一步可以是具有上述药理作用的药物。因此所述药物的适应症可以通过某病症的病理效应是否落入到上述药理作用范围来进行界定。也就是说，当某一疾病的发病过程中其免疫系统的某一病理现象属于上述药物可调节的内容，那么应当认为上述药物适用于该疾病的治疗。

本发明通过大量实验确定了伏立诺他的新性质，这些新性质包括：伏立诺他可抑制STAT-1信号通络，从而抑制初始T细胞向Th1淋巴细胞分化，进而降低Th1细胞数量，进而降低IFN-γ表达量；伏立诺他可抑制STAT-3信号通路，从而抑制初始T细胞向Th17淋巴细胞分化，进而降低Th17细胞数量，进而降低IL-17表达量；伏立诺他可上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的nTreg细胞数量；伏立诺他可提升CD4⁺CD3⁺CD62L⁺的T细胞数量的药物；伏立诺他可抑制NF-κBP65的表达，从而抑制其对TNF-α转录的促进作用，进而抑制TNF-α表达量，进而缓解巨噬细胞的浸润；伏立诺他还可以上调紧密连接蛋白claudin-5的表达量，从而修复血视网膜屏障损伤。

基于以上性质，确定了伏立诺他新的医药用途，具体来说可以用于，以上述任一免疫系统现象为病理效应的疾病的治疗，其治疗机理是通过对上述免疫系统现象的调节来实现的。并进一步确定了其用于自身免疫性葡萄膜炎治疗药物的用途，实验表明伏立诺他对自身免疫性葡萄膜炎疗效确切，具有全新的治疗通路且无副作用，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠眼底图像。

图2是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠临床评分结果。

图3是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠视网膜HE染色图像。

图4是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠组织学评分结果。

图5是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠EB血管灌注造影视网膜铺片。

图6是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠免疫组织化学染色图像。

图7是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠紧密连接蛋白转录水平比较图。

图8是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠辅助T淋巴细胞亚群分布情况图。

图9是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠炎性细胞因子和信号转导蛋白表达水平比较图。

图10是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠视网膜内巨噬细胞分布图。

图11是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠视网膜内表达p65蛋白的巨噬细胞分布图。

图12是本发明实施例中对照组小鼠和伏立诺他治疗组小鼠视网膜内p65蛋白表达水平比较图。

在以上附图中，带有“control”字样的是对照组图像，带有“vorinostat”字样的是伏立诺他治疗组图像。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。

以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。

除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

1小鼠EAU(实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎，Experimentalautoimmuneuveoretinitis)模型的建立

1.1实验动物的选取及饲养

6-8周龄雌性SPF级C57BL/6J小鼠48只，体重15-20g。全部小鼠饲养于标准化无特定病原体动物(SPF)级动物房，实验动物用标准颗粒饲料喂养，自由饮水摄食，室温为(22±2)℃，相对湿度为40％-60％。适应性饲养2-7d后用于实验。

1.2EAU小鼠模型制作原理

IRBP_1-20多肽通过诱发T淋巴细胞介导的自身免疫反应，损伤小鼠视网膜组织，引起实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎。

1.3EAU小鼠模型的制备

皮下注射乳化的IRBP_1-20于模型组小鼠一侧后足掌垫、双侧尾根及后臀部，共注射抗原300μg，同时腹腔内注射百日咳菌液1μg破坏小鼠的全身免疫耐受，以增强免疫效果，免疫当天记作第0天(day0)。

2实验方法

2.1EAU小鼠的饲养条件

饲养于标准化无特定病原体动物(SPF)级动物房，实验动物用标准颗粒饲料喂养，自由饮水摄食，室温为(22±2)℃，相对湿度为40％-60％。

2.2给药方式和具体途径

自免疫造模前3天(day-3)开始以25mg/kg·day的剂量每日连续对伏立诺他组小鼠进行灌胃给药，直至免疫造模后第21天(day21)。对照组采用同样的方式以空白溶媒PBS灌胃处理。

2.3伏立诺他对小鼠EAU病变临床治疗效果观察

于免疫后第12天(day12)起每日连续观察对照组及伏立诺他组小鼠眼底损伤情况，方法为：复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳后，使用双目间接检眼镜，辅助+90D前置镜暗室检查。

于免疫后第21天(day21)对两组小鼠进行小鼠眼底损伤的临床评分，评分标准见表1。由两位眼科医师共同对所有小鼠双侧眼底损伤情况进行随机双盲打分。

表1C57BL/6J小鼠EAU模型临床评分

2.4小鼠眼底图像采集

于免疫后第21天(day21)对两组小鼠进行眼底图像采集。用复方托吡卡胺滴眼液充分散瞳、盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉，角膜表面涂以医用透明质酸钠凝胶，上覆盖玻片消除角膜曲率的影响。以0度耳镜窥入眼底，计算机成像系统采集眼底图像。

2.5视网膜切片的HE染色及组织病理学评分

2.5.1视网膜切片的HE染色

2.5.1.1取材

免疫后第21天(day21)处死小鼠，完整取出小鼠眼球。

2.5.1.2石蜡切片制备

(1)10％甲醛+5％冰乙酸溶液固定眼球，过夜，生理盐水冲洗眼球；

(2)脱水：眼球依次浸入75％酒精、85％酒精、95％酒精Ⅰ、95％酒精Ⅱ、95％酒精Ⅲ、无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ、无水酒精Ⅲ。

(3)透明：眼球依次浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

(4)浸蜡：将眼球放入预热的包埋盒中(含部分熔化的石蜡)，继续加入熔化的石蜡至组织全部浸没。

(5)冷却：将包埋盒置入4℃冰箱中充分冷却后取出。

(6)将包埋好的蜡块，用石蜡切片机连续切片，厚度为5μm，制成石蜡切片。

2.5.1.3HE染色

(1)石蜡切片脱蜡水化：顺序依次为，二甲苯浸洗2次共5min，100％、95％、90％、80％、70％乙醇浸洗3min×5，自来水洗涤10min；

(2)苏木精染色5min，自来水洗lmin；

(3)1％盐酸酒精分化30s，自来水洗lmin，PBS返蓝30s，自来水洗lmin；

(4)伊红染色2min；自来水洗3min；

(5)梯度酒精脱水，二甲苯透明；

(6)中性树脂胶封片，光镜下观察并拍照。

2.5.2组织病理学评分

分别取对照组和伏立诺他组小鼠眼球的HE染色切片在光学显微镜下观察视网膜及玻璃体腔的组织结构、炎性细胞浸润情况，并进行组织病理学评分，评分标准见表2。由两位眼科病理学医师共同对两组小鼠眼球切片分别进行随机双盲打分。

表2C57BL/6J小鼠EAU模型组织病理学评分

2.6伊文思蓝(EB)血管灌注造影视网膜铺片

于免疫后第21天(day21)将EAU对照组和伏立诺他组分别取4只小鼠，进行EB血管灌注造影视网膜铺片。

(1)麻醉：称重后10％水合氯醛以300mg/kg腹腔注射麻醉；

(2)EB注射：29G针头穿刺入尾静脉内注射2％EB100μl，循环2小时；

(3)固定：处死小鼠，摘取眼球，置于浓度为4％多聚甲醛溶液中固定3小时；

(4)剥离视网膜：在手术显微镜下用角巩膜剪于眼球角巩膜缘后约0.5mm处剪开，除去角膜、虹膜，娩出晶状体和玻璃体。将视网膜以视盘为中心放射状剪开4刀，置于载玻片上，用显微有齿镊小心将巩膜翻转，完整分离出视网膜，平铺于载玻片上；

(5)封片：滴少许封片剂后以盖玻片封片；

(6)照相：立即置于激光扫描共聚焦荧光显微镜下观察、照相。

2.7视网膜免疫组织化学染色

2.7.1取材

免疫后第21天(day21)处死小鼠，完整取出小鼠眼球。

2.7.2石蜡切片制备

(1)10％甲醛+5％冰乙酸溶液固定眼球，过夜，生理盐水冲洗眼球；

(2)梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、冷却(方法同第一部分)。

(3)将包埋好的蜡块，用石蜡切片机连续切片，厚度为5μm，制成石蜡切片。

2.7.3免疫组织化学染色

(1)石蜡切片置于65℃烤箱烘烤2小时，取出后冷却至室温；

(2)二甲苯脱腊(二甲苯Ⅰ10分钟、二甲苯Ⅱ10分钟)，梯度酒精水化(100％乙醇Ⅰ5分钟、100％乙醇Ⅱ5分钟、95％乙醇10分钟、80％乙醇10分钟)，自来水洗1min，蒸馏水洗1min；

(3)切片浸入PH＝6.4柠檬酸盐缓冲液，微波加热，高火加热10min后，低火加热10min，从微波炉取出后冷却至室温，浸入蒸馏水洗5min；

(4)将切片置于3％H₂O₂，水平震荡5min，蒸馏水洗5min

(5)加入5％BSA封闭液，室温孵育1h，甩掉封闭液；

(6)滴加50μl一抗F4/80抗体(1：200稀释)，置于湿盒中4℃孵育过夜，0.1％PBST水平震荡洗3次，5min/次；

(7)滴加50μl生物素标记的二抗(山羊抗大鼠抗体)(1：200稀释)，室温下孵育1h，0.1％PBST水平震荡洗3次，5min/次；

(8)滴加50μl辣根过氧化物酶-生物素偶联的三抗，室温下孵育2h，0.1％PBST水平震荡洗3次，5min/次；

(9)DAB显色：1ml蒸馏水加A、B、C液各一滴，现用现配；将配好的DAB显色液滴加到切片上覆盖全部组织，镜下观察以特异性着色良好背景不出现着色为标准，自来水冲洗终止显色；

(10)苏木精复染1min，0.5％盐酸酒精分化，视复染深浅而定，氨水返蓝；

(11)梯度酒精脱水(80％乙醇1分钟、95％乙醇5分钟、100％乙醇Ⅰ5分钟、100％乙醇Ⅱ10分钟)，二甲苯透明(二甲苯Ⅰ10分钟、二甲苯Ⅱ10分钟)；

(12)中性树胶封片，光镜下观察并拍照。光学显微镜下F4/80阳性细胞表现为胞浆染色为深棕色。

2.8视网膜免疫荧光染色

2.8.1取材及冰冻切片制备

(1)免疫后第21天(day21)处死小鼠，完整取出小鼠眼球；

(2)立即将小鼠眼球于液氮中冷冻10-15秒，以OCT包埋；

(3)立即将OCT包埋的小鼠眼球冷冻于-80℃超低温冰箱，15分钟后取出。

(4)将冷冻包埋好的组织用冰冻切片机连续切片，厚度为5μm，制成冰冻切片，切片暂时冷冻于-20℃备用。

2.8.2免疫荧光染色

(1)冰冻切片室温复温30分钟；

(2)冰丙酮固定8min，4℃PBS洗3次×5分钟

(3)3％BSA室温封闭30分钟

(4)滴加一抗F4/80抗体(用一抗稀释液1:200稀释)和P65抗体(用一抗稀释液1:200稀释)双染4℃过夜，4℃PBS洗3次×5分钟；

(5)滴加AlexaFluor488驴抗小鼠荧光二抗和AlexaFluor594驴抗兔荧光二抗(1:200稀释)室温避光孵育1小时，4℃PBS洗3次×5分钟；

(6)DAPI染核1分钟，4℃PBS洗3次×5分钟。

(7)Vectashieldmedium封片。荧光共聚焦显微镜下观察、拍照。

2.9小鼠脾细胞流式细胞术

于免疫后第21天(day21)检测伏立诺他组小鼠和对照组脾脏Th17细胞、Th1细胞占单个核细胞比例，Treg细胞、Th0细胞分别占CD4⁺T淋巴细胞的比例，每组各取5只小鼠。

2.9.1小鼠脾脏单细胞悬液的制备

(1)小鼠以10％水合氯醛腹腔注射麻醉后，浸入75％的酒精中10分钟，小鼠取右侧卧位，逐层剖开腹腔，充分暴露脾脏，无菌条件下取出脾脏放入含有1％BSA的无菌培养皿中,小心去除筋膜与脂肪组织,并用剪刀将脾脏分割成小碎块(1-2mm)；

(2)无菌50ml离心管上放置一无菌的40μm无菌尼龙网，将分割完成的脾脏组织置入其上，无菌滴管滴入1％BSA；

(3)用5ml的注射器内栓轻轻研磨脾脏，同时加入适量1％BSA冲洗，至研磨充分，共约10ml脾脏单细胞悬液；

(4)将离心管置于离心机中，调整离心条件：25℃，1200rpm，离心5min，轻轻弃去上清；

(5)加入5-6ml红细胞裂解液并缓慢摇动使细胞重悬；

(6)室内静置4-5min，待红细胞裂解完成，加入10ml无菌PBS终止细胞裂解；

(7)加入10ml1％BSA后离心，25℃，1200rpm，离心l0min，弃上清，加入l0ml1％BSA，轻晃离心管，重悬细胞；

(8)静置2-3min后，25℃，1200rpm，离心l0min，弃上清，加入700μl1％BSA，重悬细胞；

(9)取10μl单细胞悬液，行细胞计数；

(10)根据细胞计数结果调整细胞密度为5×10⁶/ml。

2.9.2小鼠脾脏Th1和Th17细胞的流式检测

2.9.2.1刺激Th1和Th17细胞因子分泌

(1)取无菌24孔板，每孔加100μl上述脾脏单细胞悬液，900μl配好的培养基，0.5μl1mg/mlPMA(终浓度为500ng/ml)，0.5μl1mg/ml离子霉素(终浓度为500ng/ml)，1μlBFA(1μg/ml)，轻轻混匀，37℃无菌温箱培养4h。

(2)取出24孔板，轻轻混匀孔内液体，吸出至相应流式管中。

(3)将装有细胞悬液的流式管置于离心机中离心：25℃，2000rpm，3min，弃上清。

(4)加2mlPBS重悬细胞，25℃离心2000rpm，3min，弃上清。

2.9.2.2Th1和Th17细胞胞外染色

(1)流式管标号，加入小鼠FITC-CD4抗体，轻轻敲打混匀，室温避光孵育15min；

(2)加入1mlPBS混匀，2000rpm，25℃，离心5min，弃上清；

(3)再次加入1mlPBS重悬，2000rpm，25℃，离心5min，弃上清。

2.9.2.3胞内染色

(1)各流式管中加入500μl破膜剂，室温避光破膜20min；

(2)25℃，350g，离心5min，弃上清；

(3)各流式管中加入1ml破膜buffer(1×)，重悬细胞，25℃，350g，离心5min，弃上清；

(4)用于Th1细胞染色的流式管中加入1μl小鼠PE-IL-17抗体，用于Th17细胞染色的流式管中加入1μl小鼠PE-IFN-γ抗体，轻轻敲打混匀，室温避光孵育20min；

(5)加入1mlPBS溶液，重悬细胞，置于离心机中离心，条件：25℃，350g，离心5min，弃上清；

(6)重复上一步骤；

(7)加入500μl4％甲醛溶液固定细胞，4℃避光保存过夜；

(8)25℃，350g，离心5min，弃上清；

(9)加入500μl鞘液重悬细胞，滤网过滤，上机检测分析。

2.9.3小鼠脾脏Treg细胞的流式检测

2.9.3.1细胞表面染色

取制备好的脾脏单细胞悬液100μl置于流式管中，标号，依次加入小鼠FITC-CD4抗体2μl，小鼠Percp-Cy5.5-CD25抗体3μl，轻轻敲打混匀，常温避光孵育15分钟。

2.9.3.2胞内核因子染色

(1)上述各流式管中加入1ml破膜剂，室温避光破膜30分钟；

(2)各流式管中加入1ml破膜buffer(1×)，室温避光10分钟；

(3)各流式管置于离心机中25℃，1500rpm，离心5min，弃上清；

(4)各流式管中加入小鼠PE-Foxp3抗体3μl，室温避光孵育30分钟；

(5)加入1mlPBS溶液，重悬细胞，25℃，1500rpm，离心5min，弃上清；

(6)重复上一步骤；

(7)加入500μl4％甲醛溶液固定细胞，4℃避光保存过夜；

(8)25℃，350g，离心5min，弃上清；

(9)加入500μl鞘液重悬细胞，滤网过滤，上机检测分析。

2.9.4小鼠脾脏Th0细胞的流式检测

2.9.4.1细胞表面染色

(1)取制备好的脾脏单细胞悬液100μl置于流式管中，标号，依次加入小鼠FITC-CD4抗体2μl，小鼠Percp-Cy5.5-CD3e抗体3μl，小鼠PE-CD62L抗体3μl，轻轻敲打混匀，常温避光孵育15分钟；

(2)加入1mlPBS溶液，重悬细胞，25℃，1500rpm，离心5min，弃上清；

(3)重复上一步骤；

(4)加入500μl4％甲醛溶液固定细胞，4℃避光保存过夜；

(5)25℃，350g，离心5min，弃上清；

(6)加入500μl鞘液重悬细胞，滤网过滤，上机检测分析。

2.10RNA提取及RT-PCR方法对紧密连接蛋白的定量

总RNA以试剂盒(美国Invitrogen公司出品)进行提取，cDNA由TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix试剂盒(中国TransGenBiotech公司出品)合成。小鼠ZO-1、claudin-5以及occludin紧密连接蛋白的定量依靠RT-PCR实现，其中以β-actin作为内参基因。PCR反应条件是：预变性94℃30s，变性95℃20s，退火57℃20s，延伸72℃20s，循环次数40。以上具体操作方法依照仪器或试剂盒生产厂商的说明进行。引物序列如表3所示。其中mRNA的相对表达量通过根据系统自动生成的Ct值及熔解曲线，整理并分析数据，绘制柱状图。

分析方法如下：

Folds＝2^-ΔΔCt

ΔΔCt＝(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)

Ct1：处理样本待测基因的临界循环数

Ct2：处理样本持家基因(β-actin)的临界循环数

Ct3：对照样本待测基因的临界循环数

Ct4：对照样本持家基因(β-actin)的临界循环数。

表3RT-PCR引物序列

2.11利用Westernblotting对促炎性细胞因子表达量的测定

从小鼠体内切除视网膜和脉络膜，利用蛋白质分析仪进行总蛋白的定量，蛋白的分离依据以下方法执行：

(1)蛋白质样品预处理：

样品蛋白与4×SDS加样缓冲液按3：1(v/v)混匀，100℃水浴变性10min，12,000rpm离心5min，去除杂质。

(2)蛋白浓度的测定(考马斯亮蓝法)：

1)制作标准曲线；

2)根据样品数量，按试剂A：B为50：1的比例配制BCA试剂工作液，充分混匀；

3)各孔加入200μlBCA工作液，37℃放置30min；

4)完全溶解的蛋白标准品，取10μl加PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml；

5)将标准品按0μl，1μl，2μl，4μl，8μl，12μl，16μl，20μl依次加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl；

6)加2μl样品到96孔板的样品孔中，加PBS到20μl；

7)酶标仪测定A562；

8)根据标准曲线计算出蛋白浓度；

(3)SDS-PAGE电泳胶的配制：

1)安装制胶用玻璃板；

2)配10％分离胶，混匀后将胶灌注于两玻璃板间至分离胶液面距离短玻璃板上沿约1.5cm处；

3)在分离胶上注入一层双蒸水，室温下放置30min；

4)分离胶与双蒸水间出现一条明显的界限时，倒去双蒸水，用滤纸吸干残留水分；

5)配制浓缩胶，混匀后将胶直接灌注于分离胶上，立即插入干净的梳子，室温下放置30min。

(4)SDS－PAGE电泳：

1)等浓缩胶充分聚合时，将支架和胶放入电泳槽中，再加入电泳缓冲液，拔去梳子；

2)取出蛋白Marker和蛋白样品，向孔内加蛋白Marker3μl和蛋白样品10μl；

3)蛋白样品在浓缩胶上加电压80V，持续约30min，使蛋白样品缓慢通过浓缩胶，再将电压调至120V，持续约60min，至溴酚蓝到达分离胶底部时，停止电泳。

(5)转膜：

1)将凝胶取下并浸泡在转膜缓冲液中，依据预染蛋白Marker的标记保留需要的凝胶部分，切去右上角作标记；

2)裁剪与凝胶相同大小的PVDF膜1张，于无水甲醇中激活15s，双蒸水中处理2min，然后浸于转膜液中平衡5min；Whatman滤纸6张，转膜缓冲液中平衡大于30s；

3)按照电源负极面、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸、电源正极面顺序的安装转膜系统，安装过程中小心赶走滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜之间的气泡；

4)盖上转膜仪，红对红、黑对黑连接电源；

5)冰浴中转膜：电压调至80V，持续60min；

6)关闭转膜仪，取出PVDF膜，减去一角作正反面标记，再用TBS-T漂洗。

(6)封闭：

将纤维素膜浸泡于5％脱脂奶粉中(5g奶粉+100mlTBS-T)，室温下摇床孵育1h。然后弃去奶粉，TBST冲洗5min×3次。

(7)一抗孵育：

小鼠抗IFN-γ抗体(1:500稀释)、兔抗IL-17A抗体(1:1000稀释)、兔抗TNF-α抗体(1:1000稀释)、兔抗IL-10抗体(1:500稀释)、兔抗TGF-β抗体(1:250稀释)、兔抗p65抗体(1:1000稀释)、兔抗STAT1抗体(1:1000稀释)、兔抗p-STAT1抗体(1:250稀释)、鼠抗STAT3抗体(1:5000稀释)、鼠抗p-STAT3抗体(1:2000稀释)、小鼠抗β-actin单克隆抗体(1:1000稀释)4℃摇床孵育过夜。TBS-T冲洗5min×3次。

(8)二抗孵育：

辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(1:10000-1:5000稀释)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(1:5000稀释)37℃摇床孵育1h。TBS-T冲洗5min×3次。

(9)显色：

1)取ECL发光试剂盒中的A和B溶液等体积混合避光备用；

2)在膜的蛋白面滴加ECL混合液；

3)应用Bio-Rad公司ChemiDocMP凝胶成像系统显像。

(10)目的条带的定量分析：

应用ImageJ分析软件测定每一个目的条带及其对应的内参β-actin的灰度值。按照相对灰度值＝目的条带灰度值/同一样品β-actin的灰度值计算每个样品相应指标的相对灰度值，代表目的蛋白的表达水平。利用统计软件分析各组相对灰度值，以去除蛋白质不均匀降解所造成的误差。

2.12统计学方法

采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。组间临床评分、组织病理学评分、流式细胞术测得Th1细胞、Th17细胞占单个核细胞百分比，Treg细胞、Th0细胞占CD4+T淋巴细胞百分比，视网膜两种紧密连接蛋白Westernblot的相对灰度值及qRT-PCR计算所得Folds值以均数±标准差(x±s)表示。采用两独立样本t检验比较对照组和伏立诺他治疗组之间的统计学差异。认为P<0.05为差异有统计学意义。

3实验结果

3.1伏立诺他干预下的临床改善状况

为了研究伏立诺他对小鼠EAU模型的治疗效果，所有的小鼠均通过双目间接检眼镜联合+90D前置镜观察其病情状况，从免疫后第9天开始直至第21天。由2名医师分别进行独立评分，与此同时采集小鼠眼底图像进行评价。结果表明，对照组小鼠存在严重的炎性渗出损伤、血管炎和视神经乳头水肿，而伏立诺他治疗组能够在一定程度上改善炎症反应及其损伤，同时伏立诺他治疗组能够显著减少临床评分(2.90±0.88vs0.95±1.07,P<0.01)。结果如图1、图2所示。

3.2伏立诺他对实验小鼠组织病理学损伤的缓解作用

本研究重点考察了伏立诺他对EAU小鼠组织病理学的改善作用。针对免疫后21天小鼠视网膜染色发现，其中对照组的视网膜图像充斥了血管炎和炎性渗出物，而伏立诺他治疗组能够缓解炎症反应同时降低组织病理学评分(1.58±0.74vs0.50±0.45,P<0.05)，结果如图3、图4所示。

3.3伏立诺他对血视网膜屏障完整性和视网膜血管的保护作用

进一步研究伏立诺他对视网膜保护作用，其中血视网膜屏障完整性的考察通过伊文思蓝染料进行表征。对于人类，遍布血管的视网膜可能因一些原发性诱因如糖尿病、遗传因素、环境刺激、年龄变化等而受到损失。因此探究EAU模型中的BRB损伤是至关重要的，因为这在一定程度上决定了免疫介导的血管炎的发生。对照组中通过伊文思蓝染色可以发现在视网膜血管周围存在大量荧光外渗现象，而相对应的，伏立诺他治疗组仅存在很少量的荧光物渗出(如图5所示)。此外，自伏立诺他治疗组中claudin-5(图中绿色)的表达量得到提升(如图6所示)。同时本研究进一步确定了紧密连接蛋白mRNA表达水平，在伏立诺他治疗组中，ZO-1(P<0.01)、claudin-5(P<0.01)和occludin(P>0.05)的mRNA表达水平均高于对照组(如图7所示)。

3.4伏立诺他对EAU模型中淋巴细胞亚群不平衡现象的调节作用

现有技术中，广泛认为引起葡萄膜炎的免疫因素存在多种免疫细胞类型，自身反应性抗原存在于原始T细胞中，原始T细胞在葡萄膜炎的发病、病程持续过程中的作用有别于多种效应细胞，并会与抗原呈递细胞相互作用。Th1淋巴细胞是EAU的一种致病效应细胞。近年许多研究者发现Th17淋巴细胞与包括自身免疫性疾病在内的多种炎性疾病有关，其中就包括葡萄膜炎和感染。此外，近年来发现在CD4⁺淋巴细胞亚群中Th17细胞与Treg细胞之间存在相互作用，它们对免疫应答存在着相反的作用关系。

因此，本研究利用流式细胞术对比了伏立诺他治疗组小鼠与对照组小鼠之间的脾脏T淋巴细胞亚群分布状况。结果显示，伏立诺他能够抑制CD4⁺IFN-γ⁺Th1细胞(1.04±0.22％vs0.44±0.19％,P<0.01)(如图8中A部分所示)和CD4⁺IL17⁺Th17细胞(0.75±0.26％vs0.33±0.12％,P<0.01)(如图8中B部分所示)；同时能够上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞数量(19.22±1.93％vs25.18±3.76％,P<0.01)(如图8中C部分所示)。此外，还发现在伏立诺他的作用下，其CD4⁺CD3⁺CD62L⁺Th0(21.74±2.52％vs30.56±2.81％,P<0.01)所占份额也出现了上升(如图8中D部分所示)。

3.5伏立诺他干预下促炎性细胞因子的抑制作用和抗炎性细胞因子的促进作用

为了考察EAU发病机理中伏立诺他的抗炎效应，利用westernblotting方法检测了作为促炎性细胞因子的TNF-α、IFN-γ、IL-17A蛋白表达水平以及作为抗炎性细胞因子的TGF-β和IL-10蛋白表达水平。实验结果显示，与对照组相比，伏立诺他治疗组能够抑制TNF-α、IFN-γ、IL-17A蛋白的表达量，IL-10表达水平得到提高，而TGF-β表达水平基本维持不变(如图9所示)。

3.6伏立诺他对视网膜中致病性巨噬细胞活性的抑制

巨噬细胞渗出被认为是EAU病理中的一种基本损伤。巨噬细胞可能会增加视网膜和脉络膜血管的通透性，破坏血视网膜屏障，导致更严重的细胞浸润。为了探究致病性巨噬细胞是否能够被伏立诺他抑制，本研究通过ICC染色来检测效应细胞。结果显示，伏立诺他治疗组的视网膜中巨噬细胞数量较少(如图10所示)，进一步研究表明致病性巨噬细胞的数量和活性都受到了抑制，同时在伏立诺他治疗组中几乎检测不到表达p65蛋白(红色)的巨噬细胞(绿色)(如图11所示)。这与前文所述的TNF-α表达水平的下降是一致的(如图9所示)。

同时，对p65蛋白表达水平的westernblotting检测结果与上述染色检测结果一致，即伏立诺他治疗组中的p65蛋白表达水平较之于对照组出现了显著下降(如图12所示)。

3.7炎性细胞中NF-κB和STAT信号通路的抑制效应

为了确定通过细胞哪种信号通路下调TNF-α、IFN-γ、IL-17A等促炎性细胞因子的表达，本研究利用westernblotting方法检测了STAT1、STAT3及其磷酸化物质还有p65蛋白。结果显示，伏立诺他能够抑制STAT1、p-STAT1、STAT3的表达，p-STAT3的表达未发生显著变化。如前文所述，伏立诺他能够显著降低p65蛋白的表达水平(如图12所示)。

4结论

本研究于免疫后的第9天起，每日连续观察PBS组与治疗组小鼠眼底发病的情况直至第21天，PBS组小鼠从第12天起开始出现发病迹象。在第21天对小鼠眼底损伤情况的临床评分中。光学显微镜检查结果显示，PBS对照组小鼠视网膜可见渗出、血管炎、出血，评分明显高于伏立诺他组，并且这种差异具有统计学意义。组织病理学检查，可见对照组小鼠视网膜水肿增厚，玻璃体腔大量单核细胞浸润，而伏立诺他组小鼠玻璃体腔渗出较少，视网膜结构更趋于正常。这些提示了伏立诺他对EAU有治疗性作用。

以上实验结果揭示了伏立诺他对视网膜血管屏障所起到的保护作用。视网膜染色图像显示在PBS对照组中可见伊文思蓝广泛弥散地从视网膜血管渗漏至周围血管间隙中，这提示了EAU免疫病理损伤介导下的视网膜血管通透性的增加和血-视网膜屏障的破坏。而应用伏立诺他干预的EAU小鼠未见到明显的荧光漏，说明治疗组小鼠的视网膜和脉络膜血管受到了保护。眼内微血管通透性的维持和血管屏障的完整性主要依赖于BRB紧密连接蛋白的完整性，亦即ZO-1,occludin-1以及claudin-5这3个紧密连接蛋白的表达量。免疫荧光结果显示，伏立诺他治疗小鼠紧密连接蛋白claudin-5的表达量明显增多，另外，本研究测定了两组小鼠视网膜紧密连接蛋白mRNA表达量，且发现伏立诺他组小鼠表达量升高。这与以上结果所见的荧光渗漏改变表现出一致性。

本研究通过流式细胞技术检测了PBS组和伏立诺他组小鼠脾脏的T淋巴细胞表型的分类情况。CD4+Th1细胞以及CD4+Th17细胞在PBS组小鼠的脾脏中明显克隆增殖并占据优势，而在伏立诺他治疗组中这两类细胞亚群的增殖得到了有效控制。这表明伏立诺他通过减少炎症性细胞的浸润来缓解EAU的严重程度，也就是说，通过下调能够产生IFN-γ和IL-17的淋巴细胞的数量来起到对小鼠眼内组织的保护作用可能是伏立诺他治疗EAU的机制之一。

本研究发现在EAU模型中，随着Th1和Th17细胞的克隆增殖，CD62L⁺的T细胞数目处于明显的下降趋势，说明体内免疫系统的广泛激活和大量初始T淋巴细胞的活化。而伏立诺他能够抑制和延缓这种非正常性的T细胞激活，在治疗组小鼠的脾脏中可见CD4⁺CD3⁺CD62L⁺的T细胞较PBS对照组有显著地增长，这从另一个角度体现了伏立诺他能够抑制过度激活的免疫系统并使其沉默，起到维持机体免疫稳态的作用。

由于自身免疫性疾病的发生和发展在一定程度上取决于CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的自然调节性T细胞负性调节能力的异常或被抑制，因此本研究考察了EAU发病过程中nTreg细胞数量的变化和伏立诺他是否对该T细胞亚群产生影响。以上的结果证实了伏立诺他对于自身免疫性疾病的免疫调理作用不仅在于减少前两类效应T淋巴细胞亚群对于组织的损伤作用，更重要的是它可以活化nTreg细胞，重建效应T细胞和调节性T细胞之间的免疫平衡，从而修复机体的自身免疫稳态，发挥免疫调理作用。

流式细胞术的结果显示，破坏性T细胞的克隆表达被伏立诺他有效控制。本研究进一步利用WesternBlotting检测了刺激原始T细胞向Th1细胞分化的转录因子STAT-1，以及刺激其向Th17细胞分化的转录因子STAT-3的表达。以上的结果表明，伏立诺他能够抑制STAT-1及STAT-3的表达量。磷酸化的STAT-1及STAT-3的表达同样被伏立诺他抑制。因此有理由相信，抑制效应T细胞分化过程中的信号通路是伏立诺他抑制自身免疫性疾病的作用机制之一。

本研究通过免疫组织化学染色和免疫荧光染色表明，巨噬细胞的激活被伏立诺他抑制。伏立诺他组小鼠视网膜巨噬细胞浸润较少。由于受到IκB的抑制，存在于细胞胞浆内的NF-κB处于静止状态。IκB降解后，p50/p65被释放，进入细胞核，活化固有免疫和炎症反应中起重要作用的细胞因子的转录基因。这一信号转导通路在很多炎性分子(包括TNF-α)的活化中起到重要作用。伏立诺他能够抑制视网膜中表达p65的巨噬细胞，抑制TNF-α的表达量。另外，以上结果还还表明，伏立诺他组小鼠视网膜p65表达量显著降低。综上，有理由认为伏立诺他能够通过降低p65表达水平，减弱巨噬细胞活性，减少p65进入细胞核，抑制TNF-α的转录。

综上所述，伏立诺他是治疗EAU模型的有效药物，对于缓解疾病的发生，限制症状的发展，有着确切的疗效。因此，本研究充实了HDAC抑制剂伏立诺他在治疗自身免疫性疾病中的疗效价值，尤其是在眼科免疫炎症性疾病的应用这一空白领域得到了一定的扩展。具体来看，伏立诺他抑制Th1、Th17细胞，促进Treg细胞，抑制巨噬细胞活性，从而缓解EAU。伏立诺他的抗炎症作用依赖于对STAT及NF-κB通路的调节。本研究为HDAC抑制剂，如伏立诺他等，用于治疗炎症性疾病，如葡萄膜炎，提供了证据。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>天津医科大学总医院

<120>伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ATTTACCCGTCAGCCCTTCT20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

TCGCAAACCCACACTATCTC20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ATCGGTGAAGTAGGCACCAA20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

CTGCCCTTTCAGGTTAGCAG20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

TGAATGGCAAGCGATCATAC20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

TGCCTGAAGTCATCCACACT20

Claims (10)

1.伏立诺他用于制备免疫调节药物的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是抑制STAT-1信号通路的药物。

3.根据权利要2所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是通过抑制STAT-1信号通路而抑制初始T细胞向Th1淋巴细胞分化的药物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是抑制STAT-3信号通路量的药物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是通过抑制STAT-3信号通路而抑制初始T细胞向Th17淋巴细胞分化的药物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是上调CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺的nTreg细胞数量的药物。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是抑制NF-κBP65表达的药物。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是上调紧密连接蛋白claudin-5表达量的药物。

9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于所述免疫调节药物是自身免疫疾病治疗药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述自身免疫疾病是自身免疫性葡萄膜炎。