CN108939055A - 重组人ph20在制备治疗甲状腺相关眼病药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属生物制药领域，涉及重组人PH20在制备治疗甲状腺相关眼病药物中的用途，尤其是重组人PH20在制备治疗甲状腺相关眼病所致急性期眼外肌水肿以及慢性期眼外肌纤维化药物中的用途。本发明经实验结果证实，甲状腺相关眼病患者的眼外肌成纤维细胞具备分泌透明质酸的能力，所述重组人PH20可显著降解该细胞分泌的透明质酸，所述的rHuPH20不仅可以降解透明质酸，解决急性期的水肿问题，而且在致病因子IGF‑1存在时，可以显著抑制成纤维细胞的增殖和分化，从而抑制纤维化；本发明为治疗甲状腺相关眼病提供了新的对策和手段。

Description

重组人PH20在制备治疗甲状腺相关眼病药物中的用途

技术领域

本发明属生物制药领域，涉及重组人PH20(亦称rHuPH20)在制备治疗甲状腺相关眼病药物中的用途，尤其是重组人PH20在制备治疗甲状腺相关眼病所致急性期眼外肌水肿以及慢性期眼外肌纤维化药物中的用途。

背景技术

资料公开了甲状腺相关眼病(Thyroid Eye Disease，以下简称“TED”)是一种累及眼眶和周围组织的自身免疫性疾病，以活动期的炎症、水肿以及非活动期的软组织纤维化为主要表现，为成年人最常见的眼眶疾病。研究显示，TED常与Graves’病相伴发生，其年发病率女性约为16/100000，男性约为3/100000。根据Bartalena的一项队列研究，Graves’病患者中约50％存在眼部症状，其中确诊为TED者约占20- 30％，发展为严重视力障碍者(因压迫性视神经病变或角膜溃疡等因素)约为3-5％。

Rundle及Wilson最先对TED的临床进程进行了准确描述，将其分为活动期和非活动期。活动期可持续3年，以炎症、充血、水肿为主要表现，常见症状包括眼睑退缩(92％)、眼球突出(62％)、眼外肌运动障碍(43％)、眼眶疼痛(30％)、流泪 (23％)和压迫性视神经病变(6％)；随后为非活动期，该期以眼外肌和眶内软组织的纤维化为主要特征，会导致患者眼肌运动协调性下降、眼球活动受限和斜视。目前对于TED活动性的判定标准为国际通用的CAS(Clinical Activity Score)评分，共包含7项：眼睑红、眼睑肿、结膜红、结膜肿、泪阜或皱襞炎症、眼眶自发痛、凝视痛，其中每项为1分，总分在3分及以上判定为活动期。

研究显示，TED在活动期和非活动期的发病机制并不完全相同，前者以水肿为主，后者以纤维化为主。有研究表明，TED患者的眼外肌成纤维细胞存在高表达的 IGF-1受体，可在IGF-1或IGF-1受体自身抗体的刺激下发挥下游效应，从而显著提高成纤维细胞分泌透明质酸的能力。透明质酸是细胞外基质的重要成分之一，具有强亲水性，可与大量水分子结合导致细胞外基质体积增加，最终出现TED活动期眼外肌水肿的临床表现。此外，眼外肌成纤维细胞还可在TGF-β的作用下分化为成肌纤维细胞，这类细胞以大量表达α-SMA为主要特征，使细胞具备自身收缩特性，加之该细胞可分泌大量的I型胶原，从而引起细胞外基质的三维构象扭曲，导致TED慢性期眼外肌纤维化的临床表现。

由于TED不同时期的发病机制不同，临床上采用的治疗方法也有所不同。TED 活动期常用的治疗方法包括激素冲击治疗、放疗、眼眶减压手术，以及尚有争议的利妥昔单抗全身化疗等，但上述方法均不能有效控制眼外肌体积，更不能改善眼球运动能力。非活动期患者常因斜视、复视就诊，由于此期以眼外肌纤维化为主，所以斜视矫正手术只能起到缓解作用，并不能彻底解决眼球运动协调性的问题。因此，临床上急需创伤小、效果好的内科治疗药物，以解决TED活动期的眼外肌水肿问题以及非活动期的眼外肌纤维化问题。

PH20(又称为Hyal-5)是精子顶体中的透明质酸酶，由SPAM-1(Sperm AdhesionMolecule-1)基因编码，主要分布于精子表面及顶体内膜中，在精卵结合过程中发挥降解透明质酸的作用。重组人PH20已在临床中有一定的应用，眼科领域主要作为局部麻醉的辅助用药，通过其对细胞外基质的降解作用促进麻醉药物的吸收和扩散，有临床研究发现该酶在消除眼科手术后的眼睑水肿问题上可取得显著疗效；重组人PH20的全身应用则主要作为皮下注射的辅助用药，其与免疫球蛋白共同进行皮下注射时，可显著促进药物的吸收和扩散，并减少免疫球蛋白局部堆积所导致的红肿、硬结等副作用。

目前，在甲状腺相关眼病领域尚无关于重组人PH20的研究，也无重组人PH20用于解决TED患者急性期眼外肌水肿、慢性期眼外肌纤维化问题的相关报道。

与本发明有关的参考文献有：

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发明内容

本发明的目的是提供重组人PH20(以下简写为rHuPH20)新的药用用途，涉及重组人PH20在制备治疗甲状腺相关眼病药物中的用途，尤其是rHuPH20在制备治疗甲状腺相关眼病所致急性期眼外肌水肿以及慢性期眼外肌纤维化药物中的用途。

本发明经实验证实，rHuPH20一方面可显著降解TED患者眼外肌成纤维细胞分泌的透明质酸，从而缓解眼外肌水肿；另一方面通过抑制成纤维细胞的增殖和分化，起到抑制眼外肌纤维化的作用。

具体而言，本发明进行了包括以下步骤的实验：

(1)TED患者眼外肌成纤维细胞的体外培养；

(2)rHuPH20降解透明质酸的最适浓度；

(3)rHuPH20对成纤维细胞增殖的抑制作用；

(5)rHuPH20对成纤维细胞分化的抑制作用；

(6)数据分析；

结果显示，

(1)体外培养可获得高纯度的TED患者眼外肌成纤维细胞

对TED患者眼外肌进行贴壁培养，并采用差时贴壁法进行传代和纯化，经荧光鉴定后95％以上的细胞表达成纤维细胞标志物Vimentin；其他标志物包括代表肌细胞的Desmin、代表上皮细胞的CK、以及代表内皮细胞的Factor VIII，荧光染色阳性率均低于1％。因此证实，体外培养可获得高纯度的眼外肌成纤维细胞；

(2)rHuPH20对成纤维细胞分泌的透明质酸有显著的降解作用

分别摸索不同浓度rHuPH20在作用48h、72h后对透明质酸的降解能力，结果显示rHuPH20可对成纤维细胞分泌的透明质酸起到显著的降解作用，且该作用呈浓度依赖性，在48h组、72h组其效应均于3ng/ml达到最大值，因此，本发明选择该浓度作为rHuPH20的工作浓度；

(3)IGF-1可显著促进成纤维细胞的增殖和透明质酸分泌

IGF-1可显著促进成纤维细胞增殖，且该促进作用呈浓度依赖性，随IGF-1浓度增加，增殖期成纤维细胞的比例增加，当IGF-1浓度达到10ng/ml时该促增殖效应达到最大，IGF-1对透明质酸分泌的促进作用也呈现相似趋势，在10ng/ml时效应达到峰值，因此，本发明选择10ng/ml为IGF-1的工作浓度；

(3)rHuPH20可在降解透明质酸的同时，显著抑制IGF-1的促增殖作用

rHuPH20对细胞增殖的影响试验结果显示，IGF-1可显著促进成纤维细胞增殖，在此基础上应用rHuPH20则表现出显著的抑增殖作用；测定各组细胞中培液上清的透明质酸浓度，结果显示IGF-1可显著促进透明质酸分泌；rHuPH20无论单独使用或与 IGF-1联合使用，均可发挥对透明质酸的降解作用；实验结果表明，透明质酸浓度的变化趋势与细胞增殖的变化趋势并不相符，提示透明质酸浓度并不是影响细胞增殖的关键因素，存在其他因素介导rHuPH20对细胞增殖的作用；

(4)rHuPH20通过改变细胞膜电位影响增殖，该效应可能与其降解产物有关

成纤维细胞在生理状态下膜电位平均为-55mV，加入IGF-1后细胞膜电位发生去极化，在联合应用rHuPH20后膜电位则有明显的复极化趋势，但单独使用rHuPH20反而导致细胞去极化；rHuPH20的降解产物是更小分子量的透明质酸，提示可能是不同分子量的透明质酸对细胞膜电位产生了影响；反转录PCR提示眼外肌成纤维细胞仅表达2型透明质酸合成酶(HAS-2)，且IGF-1可显著促进HAS-2的转录，提示加入IGF-1后成纤维细胞分泌的透明质酸分子量可能增加，因此rHuPH20的降解产物分子量也相应增加，从而起到了不同的下游效应；

(5)TGF-β1可显著促进成纤维细胞分化，因此作为促分化剂

TGF-β1作用不同时间对细胞分化的影响试验结果显示，TGF-β1可显著促进α SMA的表达，且随TGF-β1作用时间增长，成纤维细胞分化率增加，其中作用72h后分化率达到最大，故本发明选择72h作为成纤维细胞分化实验的合适时间点；

(6)rHuPH20与IGF-1联合使用可显著抑制细胞分化，单独使用rHuPH20则不能起到上述作用

根据IGF-1存在与否，分化实验分为rHuPH20组、IGF-1与rHuPH20联合使用组，结果显示，在IGF-1与rHuPH20联合作用下，成纤维细胞分化率显著降低，I型胶原分泌量也显著受到抑制，αSMA、Col-Iα1的定量PCR也显示有相同结果；单独使用rHuPH20则不能起到上述作用，不仅对成纤维细胞分化率无显著影响，而且有促进胶原分泌的趋势；另外，IGF-1本身对成纤维细胞分化有促进作用；因此，结果提示上述现象的作用机制可能与增殖实验类似，主要受到rHuPH20降解产物不同分子量的影响。

本发明经实验证实，所述的rHuPH20不仅可以降解透明质酸，解决急性期的水肿问题，而且在致病因子IGF-1存在时，可以显著抑制成纤维细胞的增殖和分化，从而抑制纤维化；进一步，所述的重组人PH20可用于制备治疗甲状腺相关眼病的药物，尤其制备治疗甲状腺相关眼病所致急性期眼外肌水肿以及慢性期眼外肌纤维化的药物。

本发明为治疗甲状腺相关眼病提供了新的对策和手段。

附图说明

图1，显示取甲状腺相关眼病患者的眼外肌组织进行原代培养和纯化，用荧光染色法鉴定其细胞类型为高纯度的成纤维细胞，其中，

A：波形蛋白(Vimentin)染色95％以上的细胞呈阳性，提示为成纤维细胞；(红Vimentin，蓝Dapi)；

B：平滑肌肌动蛋白-α(αSMA)呈弱阳性，提示该细胞有分化为成肌纤维细胞的潜能；(绿α-SMA，蓝Dapi)。

图2显示不同浓度的重组人PH20在作用48h及72h时，对成纤维细胞所分泌透明质酸的降解作用，其中，

A：取不同浓度重组人PH20(分别为0、0.4、0.8、1.5、3.0、12.0、20.0、50.0ng/ml)作用48h后，用ELISA法测定培液上清中透明质酸浓度，在3ng/ml时酶降解能力达到最大；

B：取不同浓度重组人PH20(分别为0、0.4、0.8、1.5、3.0、12.0、20.0、 50.0ng/ml)作用72h后，用ELISA法测定培液上清中透明质酸浓度，在3ng/ml时酶降解能力达到最大。

图3显示IGF-1可呈浓度依赖性促进成纤维细胞增殖，在10ng/ml时该效应达到峰值(10ng/ml vs 20ng/ml P＝0.492)。

图4显示IGF-1可呈浓度依赖性促进成纤维细胞分泌透明质酸，在10ng/ml时该效应达到峰值(10ng/ml vs 20ng/ml P＝0.487)。

图5显示IGF-1可显著促进成纤维细胞增殖(IGF-1组vs对照组P＝0.0001)，单独应用重组人PH20也可起到促增殖作用(PH20组vs对照组P＝0.0001)，但联合应用IGF-1与重组人PH20则表现出显著的抑增殖作用(IGF-1+PH20组vs IGF-1组 P＝0.0002)。

图6显示IGF-1可显著促进透明质酸分泌(IGF-1组vs对照组P＝0.008)，重组人PH20在单独使用(PH20组vs对照组P＝0.0032)或与IGF-1联用(PH20+IGF-1组 vs IGF-1组P＝0.026)时，均可发挥对透明质酸的降解作用。

图7显示用单细胞膜片钳测定成纤维细胞在不同药物组的膜电位情况，可见其膜电位呈正态分布，且在不同药物作用下的膜电位改变不同，其中，

A：生理状态下，成纤维细胞膜电位主要分布在-50mV至-60mV，平均为-55mV；

B：在IGF-1组(10ng/ml)，成纤维细胞膜电位发生去极化，主要分布在-40mV 至-50mV，且去极化程度最大可至-22mV；

C：在IGF-1+PH20组，细胞膜电位出现超极化，主要分布在-50mV至-70mV，平均为-60mV；

D：在PH20(3ng/ml)组，成纤维细胞发生膜电位去极化，集中于-30mV至- 50mV，平均水平为-42mV。

图8显示用t检验对各组细胞膜电位情况进行统计分析，结果显示单独使用 IGF-1(IGF-1组vs对照组P＝0.024)、PH20(PH20组vs对照组P＝0.036)均可使细胞膜电位去极化，而联合使用IGF-1与PH20则起到了超极化的作用(IGF-1+PH20组 vs对照组P＝0.042)。

图9显示对三种透明质酸合成酶进行反转录PCR后证实，眼外肌成纤维细胞仅表达2型透明质酸合成酶(HAS-2)。

图10显示对2型透明质酸合成酶(HAS-2)进行定量PCR，TGF-β1作为成纤维细胞的促分化剂，抑制HAS-2转录(TGF-β1组vs对照组P＝0.031)，而IGF-1可显著促进HAS-2转录(IGF-1组vs对照组P＝0.047，IGF-1+TGFβ1组vs TGFβ1组 P＝0.0008)。

图11显示TGF-β1作用不同时间(12h、24h、48h、72h、96h)后对αSMA进行荧光染色，可见随作用时间延长，αSMA表达量上升，其中，

A：绿α-SMA，蓝DAPI；

B：绿α-SMA，蓝DAPI；

C：绿α-SMA，蓝DAPI；

D：绿α-SMA，蓝DAPI；

E：绿α-SMA，蓝DAPI。

图12显示以表达αSMA为细胞分化的标志，统计TGF-β1作用不同时间后成纤维细胞分化率，可见作用72h时分化率达到最大(72h vs 96h P＝0.38)。

图13显示在联合使用IGF-1的情况下，用αSMA荧光染色法探究重组人PH20对成纤维细胞分化的影响，其中可见，

A-D：不同药物组的αSMA染色阳性率不同；其中，A：绿α-SMA；B：绿α- SMA；C：绿α-SMA；D：绿α-SMA；

E：以αSMA染色阳性作为细胞分化的标志，对各组细胞分化率进行统计，结果显示重组人PH20可显著抑制细胞分化(IGF-1+TGF-β1+PH20组vs IGF-1+TGF-β1组 P＝0.0004)。

图14显示在联合使用IGF-1的情况下，测定培液上清中I型胶原浓度，结果显示重组人PH20可显著抑制I型胶原分泌(IGF-1+TGF-β1+PH20组vs IGF-1+TGF-β1 组P＝0.0001)。

图15显示在联合使用IGF-1的情况下，以2^-△△CT为统计方法，分析不同实验组αSMA、Col-Iα1在mRNA水平的转录情况，其中，

A：重组人PH20对αSMA转录起到了显著的抑制作用(IGF-1+TGF-β1+PH20组 vsIGF-1+TGF-β1组P＝0.007)；

B：重组人PH20对Col-Iα1转录起到了显著的抑制作用(IGF-1+TGF-β1+PH20 组vsIGF-1+TGF-β1组P＝0.002)。

图16显示不联合使用IGF-1，观察重组人PH20对αSMA表达的影响，其中，

A-D：TGF-β1可显著促进αSMA表达，而重组人PH20不能起到抑制作用；其中，A：绿α-SMA；B：绿α-SMA；C：绿α-SMA；D：绿α-SMA；

E：单独使用重组人PH20无法抑制成纤维细胞分化(TGF-β1+PH20组vs TGF-β 1组P＝0.48)。

图17显示不联合使用IGF-1，则重组人PH20无法起到抑制I型胶原分泌的作用(TGF-β1+PH20组vs TGF-β1组P＝0.83)。

图18显示不联合使用IGF-1，αSMA、Col-Iα1的转录均未被重组人PH20抑制，其中，

A：重组人PH20不能抑制αSMA转录，反而有一定的促进趋势(TGF-β1+PH20组vsTGF-β1组P＝0.063)；

B：重组人PH20不能抑制Col-Iα1转录(TGF-β1+PH20组vs TGF-β1组 P＝0.41)。

图19显示用αSMA荧光染色法探究IGF-1对成纤维细胞分化的影响，其中，

A-D：TGF-β1可显著促进成纤维细胞分化，而IGF-1对αSMA荧光染色阳性率无显著影响；其中，A：绿α-SMA；B：绿α-SMA；C：绿α-SMA；D：绿α- SMA；

E：以αSMA染色阳性率作为统计成纤维细胞分化率的指标，则IGF-1对成纤维细胞分化无显著影响(IGF-1+TGF-β1组vs IGF-1组P＝0.74)。

图20显示IGF-1可显著促进I型胶原的分泌(IGF-1+TGF-β1组vs TGF-β1组 P＝0.0087)。

图21显示以2^-△△CT为统计方法，分析IGF-1对αSMA、Col-Iα1转录的影响，其中，

A：I6F-1对αSMA转录起到了显著的促进作用(IGF-1+TGF-β1组vs TGF-β1 组P＝0.006)；

B：IGF-1对Col-Iα1转录起到了显著的促进作用(IGF-1+TGF-β1组vs IGF-1 组P＝0.0004)。

具体实施方式

实施例1

1、材料和方法

(1)试剂和抗体

高糖DMEM培养液(Gibco 11965092)、重组人PH20(Abcam ab132258)、重组人IGF-1(R&D 291-G1-200)、重组人TGF-β1(PeproTech 100-21)、兔抗人α-SMA (Abcam ab5694)、小鼠抗人Vimentin(Abcam ab8978)、驴抗兔-488(Invitrogen A21206)、驴抗小鼠Cy3(Jackson ImmunoResearch，715165150)、TRIZOL(Life 135306)、反转录试剂盒(TAKARARR047A)、荧光定量PCR试剂盒(TAKARA RR420A)、PCR高保真酶(TAKARA R040A)、透明质酸检测试剂盒(Cloud-Clone CEA182Ge)、I型胶原测定试剂盒(Abcam ab210966)、BrdU检测试剂盒(Roche 11647229001)

(2)成纤维细胞原代培养

在眶减压术中，从患者眼外肌肌腹处切取肌肉组织5*5*5mm³，然后立即放入不含FBS的培养液中，于4℃冰箱保存。原代培养操作需在取材后4小时内完成，将肌肉组织在预冷的HBSS中洗涤后，仔细去除周围纤维结缔组织、肌外膜和大血管，然后修剪成0.5*0.5*0.5mm³的小块，并以1cm为间隔接种在六孔板内，放入37℃细胞培养箱中静置15-20min，待组织较为干燥时取出并加入含有20％FBS的培养液，持续培养5-7 天(每3天换液一次)后可以观察到接种组织周围有细胞爬出；

(3)细胞增殖

将细胞传代于96孔板中，24h后换无血清培养基进行12h饥饿，随后加入不同药物作用48h。接着根据试剂盒要求，在细胞培养液中加入BrdU于细胞培养箱中孵育 2h，然后按说明书进行操作，并分别在370nm、492nm处用酶标仪读数；

(4)膜电位测定

电极内液：细胞膜片钳记录膜电位所用的电极内液的成分为(单位是mM)：Potassium D-gluconate 120，NaCl 5，EGTA 2，HEPES 10，ATP-Mg 4，GTP-Na 0.3，phosphocreatine 10，EGTA 1，CaCl2 0.1，MgCl2 1，用KOH将pH调节至7.2，渗透压调节至280-290mOsm/L[119]；

记录液：细胞膜片钳记录膜电位所用的记录液的成分为(单位是mM)：NaCl 135，KCl 3，Cacl2 2，MgCl2 1，HEPES 10，Glucose 11，sucrose 10，PH 7.4，渗透压调节至300-320mOsm/L；

细胞破膜后，选取Ra值和漏电流值都比较小且基线比较稳定的细胞，进行膜电位的记录3min，然后给予10mV去极化电压刺激3min，接着撤去10mV去极化电压观测膜电位是否能够回到之前的水平，如果可以则证明细胞状态良好，膜电位结果可信；

(5)反转录PCR

提取mRNA后反转录为cDNA，随后以cDNA为模板进行普通PCR，方法参照PCR高保真酶说明书，然后以3％琼脂糖凝胶跑电泳，在紫外灯下观察结果。引物序列如下： HAS-1上游3’-CTCGGAGATTCGGTGGACTA-5’，下游3’-CGCTGATGCAGGATACACAG- 5’，产物244bp；HAS-2上游3’-TGAACAAAACAGTTGCCCTTT-5’，下游3’- TTCCCATCTATGACCATGACAA-5’，产物长度127bp；HAS-3上游3’- GAGATGTCCAGATCCTCAACAA-5’，下游3’-CCCACTAATACACTGCACAC-5’，产物长度 128bp；

(6)免疫荧光染色

将培液吸除后用PBS洗涤2遍，加入3％PFA固定20min，然后用0.3％Triton破膜10min，接着加入3％BSA封闭1小时，随后分别加入不同的一抗包括α-SMA (1∶200)、Vimentin(1∶500)4℃孵育16-18h，然后加入相应的二抗(1∶1000稀释)室温孵育1h，最后用1∶1000Dapi染色5min后充分洗涤，在荧光显微镜下观察；

(7)定量PCR

在细胞中加入TRIZOL进行裂解，用氯仿去除蛋白后加入异丙醇使mRNA析出， 75％酒精洗涤两次后得到mRNA，测定浓度大于80ng/ul为合格mRNA。根据反转录试剂盒说明书进行操作得到cDNA，并完成荧光定量PCR。所用引物序列如下：GADPH上游 3’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-5’，下游3’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-5’，产物长度87bp；α-SMA上游3’-CAGGGCTGTTTTCCCATCCAT-5’，下游3’- GCCATGTTCTATCGGGTACTT-5’，产物长度142bp；Col-IA1上游3’- AAGACATCCCACCAATCACC-5’，下游3’-CGTCATCGCACAACACCTT-5’，产物长度120bp；

(8)数据分析

对荧光染色结果的分析：随机选取9个视野进行细胞核(Dapi+)计数和蛋白染色计数，从而计算出蛋白染色阳性的细胞比例；

对定量PCR结果的分析：以GADPH的CT值为内参，将α-SMA的CT值减去GADPH 的CT值后，得到△CT。将第一代细胞的△CT作为对照，其他代细胞的△CT减去第一代细胞的△CT后，得到△△CT。那么以第一代细胞α-SMA的表达量为1，其他各代细胞α-SMA的表达量为2-△△CT；

其他数据分析：对符合正态分布的数据资料用t检验进行分析；

2、结果显示，

(1)体外培养可获得高纯度的TED患者眼外肌成纤维细胞

在眶减压术中切取少量眼外肌组织，去除肌外膜、大血管和纤维脂肪组织后，将肌肉剪成小块进行贴壁培养。5-7天后可见细胞从组织块周围爬出，待细胞爬满后进行差时贴壁传代，培养至90％融合后用荧光染色法对细胞进行鉴定，结果发现95％以上的细胞表达成纤维细胞标志物Vimentin(图1A)，同时可以观察到弱表达的α-SMA (图1B)，提示细胞有分化为成肌纤维细胞的潜能；其他标志物包括代表肌细胞的 Desmin、代表上皮细胞的CK、以及代表内皮细胞的Factor VIII，荧光染色阳性率均低于1％。因此证实，体外培养可获得高纯度的眼外肌成纤维细胞；

(2)rHuPH20对成纤维细胞分泌的透明质酸有显著的降解作用

成纤维细胞培养至90％融合后，对细胞进行12h饥饿处理，然后在培养液中加入不同浓度的rHuPH20，以摸索不同浓度rHuPH20对透明质酸的降解能力。由于后续的细胞增殖、分化实验作用时间点分别为48h、72h，因此对酶降解能力的摸索也分48h 组、72h组进行，最终用ELISA法测定培液上清中的透明质酸浓度。结果显示， rHuPH20可对成纤维细胞分泌的透明质酸起到显著的降解作用，且该作用呈浓度依赖性，在48h组(图2A)、72h组(图2B)其效应均于3ng/ml达到最大值，因此选择该浓度作为后续实验的工作浓度；

(3)IGF-1可显著促进成纤维细胞的增殖和透明质酸分泌

在细胞培养液中加入不同浓度IGF-1，在作用48h后，分别测定成纤维细胞的增殖情况(BrdU法)和培液上清中的透明质酸浓度。结果发现，IGF-1可显著促进成纤维细胞增殖，且该促进作用呈浓度依赖性(图3)，随IGF-1浓度增加，增殖期成纤维细胞的比例增加，当IGF-1浓度达到10ng/ml时该促增殖效应达到最大(10ng/ml vs 20ng/ml P＝0.492)。IGF-1对透明质酸分泌的促进作用也呈现相似趋势，在 10ng/ml时效应达到峰值(图4)，因此选择10ng/ml为IGF-1的工作浓度；

(3)rHuPH20可在降解透明质酸的同时，显著抑制IGF-1的促增殖作用

首先探究rHuPH20对细胞增殖的影响，从BrdU结果可以看出(图5)，IGF-1可显著促进成纤维细胞增殖(vs对照组P＝0.0001)，在此基础上应用rHuPH20则表现出显著的抑增殖作用(vs IGF-1组P＝0.0002)。值得注意的是，单独应用rHuPH20 不仅不能抑制增殖，反而起到了促增殖作用(vs对照组P＝0.0001)，该效应的原因会在下文中进行分析；

然后测定各组细胞中培液上清的透明质酸浓度(图6)，其结果与之前的结论相符，IGF-1可显著促进透明质酸分泌；rHuPH20无论单独使用或与IGF-1联合使用，均可发挥对透明质酸的降解作用。但透明质酸浓度的变化趋势与细胞增殖的变化趋势并不相符，提示透明质酸浓度并不是影响细胞增殖的关键因素，存在其他因素介导 rHuPH20对细胞增殖的作用；

(4)rHuPH20通过改变细胞膜电位影响增殖，该效应可能与其降解产物有关

成纤维细胞在生理状态下膜电位主要分布在-50mV至-60mV区间(图7A)，平均为-55mV。在加入IGF-1后，细胞膜电位发生去极化，主要分布在-40mV至-50mV区间 (图7B)，且去极化程度最大可至-22mV。在联合应用rHuPH20后，成纤维膜电位则主要分布在-50mV至-70mV区间(图7C)，平均为-60mV，与单独使用IGF-1时相比有明显的复极化趋势。但是值得注意的是，单独使用rHuPH20反而导致细胞去极化(图 7D)，细胞膜电位的分布区间集中于-30mV至-50mV，平均水平为-42mV。将各组中成纤维细胞的膜电位结果进行数据统计后发现(图8)，联合使用rHuPH20和IGF-1不单单可以起到复极化作用，而且较生理状态下的成纤维细胞还有明显超极化的趋势 (P＝0.032)；

rHuPH20的降解产物是更小分子量的透明质酸，其下游效应的产生主要与不同的浓度及不同的分子量有关。由于前文已证实透明质酸浓度与细胞增殖无关，因此考虑可能是不同分子量的透明质酸对细胞膜电位产生了影响。对三种透明质酸合成酶进行反转录PCR后结果显示(图9)，眼外肌成纤维细胞仅表达HAS-2，未发现HAS-1和 HAS-3在mRNA水平的转录。对HAS-2进行荧光定量PCR后发现(图10)，IGF-1均可显著促进HAS-2的转录(vsIGF1P＝0.0048)，提示加入IGF-1后成纤维细胞分泌的透明质酸分子量可能增加，因此rHuPH20的降解产物分子量也相应增加，起到了不同的下游效应；

(5)TGF-β1可显著促进成纤维细胞分化，因此应用为促分化剂

对成纤维细胞进行低密度传代后培养24h，然后更换为无血清培养液饥饿12h，充分洗涤之前的培养液后，加入含有不同浓度TGF-β1的无血清培养液，作用至12h、24h、48h、72h、96h后进行荧光染色观察(图11)，结果发现TGF-β1可显著促进αSMA的表达，且随TGF-β1作用时间增长，成纤维细胞分化率增加(图12)，作用72h后成纤维细胞分化率达最大(72hvs 96h P＝0.38)，故选择72h作为成纤维细胞分化实验的合适时间点；

(6)rHuPH20与IGF-1联合使用可显著抑制细胞分化，单独使用rHuPH20则不能起到上述作用；

由于rHuPH20对细胞增殖的作用受到IGF-1的影响，故将分化实验分二组进行，分别是rHuPH20组，以及IGF-1与rHuPH20联合使用组。在不同药物组作用72h后，从αSMA荧光染色、I型胶原ELISA测定，和αSMA、Col-Iα1定量PCR三个角度，分析不同药物组的细胞分化情况。结果发现，在IGF-1与rHuPH20联合作用下，其分化率较单独使用IGF-1时显著降低(图13)，I型胶原分泌量也显著受到抑制(图 14)，且对αSMA、Col-Iα1进行mRNA水平的定量PCR后也再次验证了上述结论(图 15)；

单独使用rHuPH20则不能起到上述作用，从荧光染色结果来看，应用rHuPH20对成纤维细胞分化率无显著影响(图16)，定量PCR结果也证实αSMA的转录量无显著改变(图18A)。从I型胶原浓度的ELISA测定结果来看(图17)，rHuPH20不仅不能抑制胶原分泌，反而有一定的促进胶原分泌的趋势。同样，从转录水平来看(图 18B)，Col-IA1的转录量也未被抑制；

为了排除IGF-1对细胞分化的抑制作用，从上述三个角度分别测定IGF-1对分化的影响，经数据统计后可以看出，加入IGF-1后成纤维细胞的分化率无显著影响(图 19)，但I型胶原分泌量有一定增加(图20)，且定量PCR也进一步验证了上述结果 (图21)；因此，单独使用rHuPH20无法抑制成纤维细胞分化，而联合应用IGF-1及 rHuPH20则可以抑制分化，考虑该现象的作用机制可能与增殖实验类似，主要受到 rHuPH20降解产物不同分子量的影响(图10)。

本发明所述的rHuPH20不仅可以降解透明质酸，而且在致病因子IGF-1存在时，可显著抑制成纤维细胞的增殖和分化，从而在缓解TED急性期眼外肌水肿的同时，起到抑制疾病慢性期眼外肌纤维化的作用。

Claims (5)

1.重组人PH20在制备治疗甲状腺相关眼病药物中的用途。

2.重组人PH20在制备甲状腺相关眼病所致急性期眼外肌水肿以及慢性期眼外肌纤维化药物中的用途。

3.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的重组人PH20降解甲状腺相关眼病患者眼外肌成纤维细胞所分泌的透明质酸。

4.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的重组人PH20通过其对透明质酸的降解产物改变细胞膜电位，影响甲状腺相关眼病患者眼外肌成纤维细胞的增殖。

5.按权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的重组人PH20通过其对透明质酸的降解产物作用于细胞，抑制甲状腺相关眼病患者眼外肌成纤维细胞增殖和分化。