CN101500589A - 半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用 - Google Patents

半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101500589A
CN101500589A CNA2006800091894A CN200680009189A CN101500589A CN 101500589 A CN101500589 A CN 101500589A CN A2006800091894 A CNA2006800091894 A CN A2006800091894A CN 200680009189 A CN200680009189 A CN 200680009189A CN 101500589 A CN101500589 A CN 101500589A
Authority
CN
China
Prior art keywords
galactose agglutinin
sequence
galactose
agglutinin
pharmaceutical composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA2006800091894A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101500589B (zh
Inventor
诺尔加汉·潘吉瓦尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TUFTS MED, University of
Original Assignee
TUFTS MED, University of
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TUFTS MED, University of filed Critical TUFTS MED, University of
Publication of CN101500589A publication Critical patent/CN101500589A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101500589B publication Critical patent/CN101500589B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1732—Lectins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/04—Artificial tears; Irrigation solutions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种治疗哺乳动物干眼症的方法，包括向患有上皮缺损的哺乳动物施以治疗有效剂量的半乳糖凝集素－1蛋白、半乳糖凝集素－3蛋白、半乳糖凝集素－7蛋白和/或半乳糖凝集素－8蛋白。本发明提供了药物及眼科组合物以及试剂盒，包括药物活性成分，适当的载体或者稀释液，其中药物活性成分是半乳糖凝集素－1蛋白、半乳糖凝集素－3蛋白、半乳糖凝集素－7蛋白和/或半乳糖凝集素－8蛋白。

Description

半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用
技术领域
本发明提供了用于治疗干眼综合症的组合物、方法和试剂盒，其中含有半乳糖凝集素蛋白。
背景技术
干眼综合症(DES)是一种常见病症，在30至45岁的人群中有10％的人感染这一病症，在45岁以上的人群中有20％的人感染这一病症，并且这一数量还在渐增(参见Schein等人于1997年在《Am J Ophthamol》124，723-72上发表的文章；Brewitt和Sistani于2001年在《Surv of Ophthalmol》45：S119-S202上发表的文章)。干眼综合症能够引发眼睛刺痛，视力模糊和视力波动，并且增加了能够威胁视力的角膜感染及溃疡的危险。干眼综合症的组织学效应可以表现为眼表上皮细胞中的结膜杯状细胞的密度降低，这种眼表上皮细胞发生不正常的增殖和分化，由眼表上皮细胞分泌的粘液减少，并且分泌不正常的粘液物质(参见Murillo-Lopez和Pflugfelder于1996年在由Krachmer J，Mannis M，Holland E编辑的《The Cornea Mosby》一书中的文章“干眼症”，圣路易斯，MO.663-686；或者参见Dursun等人于2002年在《Invest Ophthamol & Vis Sci》43：632-638中的文章)。干眼症是一种慢性疾病，它的症状和迹象受环境因素的极大影响，例如湿度和空气流动，也取决于对某些用眼作业的需要，例如阅读或者使用计算机。
干眼综合症的典型症状表现为眼烧灼感，眼痒，异物感，眼刺痛，眼干燥，畏光，视觉疲劳以及眼红。干眼病是一种慢性疾病，它的症状和迹象受环境因素的极大影响，例如湿度和空气流动，也取决于对某些用眼作业的需要，例如阅读或者使用计算机(参见Rheinstrom于1999年在由Yanoff编辑的《眼科学》第一版中发表的文章“干眼症”，由Mosley国际有限公司编辑，圣路易斯，MO；或者参见Foulks于2003年在《眼表》1：20-30中发表的文章)。
尽管已经有很多种类的人工泪液可以使用，但所有这些人工泪液都只能短时间的缓解症状。到目前为止还没有药物能扭转这一局面。因此，本领域需要其他的药物制剂和组合物来治疗干眼综合症。特别的，需要治疗干眼综合症的制剂、组合物和治疗方法。
发明内容
本发明描述了一种治疗哺乳动物干眼症的方法，包括向哺乳动物施以治疗有效剂量的半乳糖凝集素蛋白。本发明的一种实施方式描述了一种预防哺乳动物干眼症的方法，包括：先确定需要预防干眼症的哺乳动物，然后向该哺乳动物施以治疗有效剂量的半乳糖凝集素蛋白。因此，本方法适用于下述需要被治疗或者被预防的哺乳动物，这类哺乳动物处于至少一种选自下述的状况：眼上皮缺损；预先使用了抗组胺剂；预先使用了消炎药；以及预先经过了受激准分子激光处理。例如，这种哺乳动物是人类。并且，所述的半乳糖凝集素选自半乳糖凝集素-8，半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-3。在某些实施方式中，干眼症是一种持续的综合症。例如，干眼症能够导致上皮磨损。进一步的，上皮磨损能够导致角膜缺损。
一般的，上述方法使用的半乳糖凝集素-8包含如序列4或者序列5所示的氨基酸序列。例如，半乳糖凝集素-8包含了与序列4或者序列5基本上同源的氨基酸序列。这里使用的术语“基本上同源”是指相对于序列4或者序列5的氨基酸序列来说，半乳糖凝集素-8具有至少60％的序列同一性，或者具有至少70％的序列同一性，或者具有至少80％的序列同一性，又或者具有至少90％的序列同一性。
一般的，上述方法使用的半乳糖凝集素-7包含如序列2所示的氨基酸序列。例如，半乳糖凝集素-7包含了与序列2在基本上同源的氨基酸序列。这里使用的术语“基本上同源”是指相对于序列2的氨基酸序列来说，半乳糖凝集素-7具有至少60％的序列同一性，或者具有至少70％的序列同一性，或者具有至少80％的序列同一性，又或者具有至少90％的序列同一性。在某些实施方式中，半乳糖凝集素-7包括了一种半乳糖凝集素-7半乳糖苷结合区域。
一般的，上述方法使用的半乳糖凝集素-3包含如序列1所示的氨基酸序列。例如，半乳糖凝集素-3包含了与序列1基本上同源的氨基酸序列。这里使用的术语“基本上同源”是指相对于序列1的氨基酸序列来说，半乳糖凝集素-3具有至少60％的序列同一性，或者具有至少70％的序列同一性，或者具有至少80％的序列同一性，又或者具有至少90％的序列同一性。在某些实施方式中，半乳糖凝集素-3包括了一种半乳糖凝集素-3半乳糖苷结合区域。
本发明的另一种实施方式涉及一种能够促进治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括药物学合适的载体或者稀释剂和一定量的半乳糖凝集素-8蛋白，其中半乳糖凝集素-8蛋白的量能够充分从而促进结膜和/或角膜上皮细胞的完好。本发明的另一种实施方式涉及一种能够促进治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括药物学合适的载体或者稀释剂和一定量的半乳糖凝集素-7蛋白，其中半乳糖凝集素-7蛋白的量能够充分促进结膜和/或角膜上皮细胞的完好。本发明的另一种实施方式涉及一种能够促进治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括药物学合适的载体或者稀释剂和一定量的半乳糖凝集素-3蛋白，其中半乳糖凝集素-3蛋白的量能够充分促进结膜和/或角膜上皮细胞的完好。本发明的另一种实施方式涉及一种能够促进治疗干眼症的药物组合物，所述药物组合物包括药物学合适的载体或者稀释剂和一定量的半乳糖凝集素-8蛋白，其中半乳糖凝集素-8蛋白的量能够充分促进结膜和/或角膜上皮细胞的完好。在上述任意的药物组合物中，所述干眼症是一种周期性发生的上皮磨损干眼疾病。例如，所述干眼疾病导致的损伤属于角膜缺损。进一步的，所述干眼症是由受激准分子激光laser角膜切除术引起的。
在这些涉及药物组合物的不同实施方式中，其中的半乳糖凝集素-8含有如序列4或者序列5所示的氨基酸序列，或者其中的半乳糖凝集素-8含有与序列4或者序列5的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。或者，所述半乳糖凝集素-8含有一种半乳糖凝集素-8的N-末端结构域，一种半乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域。或者，所述半乳糖凝集素-8含有一种半乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，以及一种半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域。例如，所述半乳糖凝集素-8含有一种半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域。或者，药物组合物中的半乳糖凝集素-7含有如序列2所示的氨基酸序列。例如，其中的半乳糖凝集素-7含有与序列2的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。或者，所述半乳糖凝集素-7含有一种半乳糖凝集素-7的半乳糖苷结合区域。或者，药物组合物中的半乳糖凝集素-3含有如序列1所示的氨基酸序列。例如，其中的半乳糖凝集素-3含有与序列1的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。或者，所述半乳糖凝集素-3含有一种半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域。
本发明进一步描述了治疗哺乳动物干眼疾病的方法，包括向该哺乳动物施以治疗有效剂量的物质，所述物质能够改变泪膜在角膜表面或者结膜表面上的分布。本发明还描述了治疗哺乳动物干眼疾病的方法，包括向患有干眼症的哺乳动物施以治疗有效剂量的物质，所述物质能够影响半乳糖凝集素-8蛋白的表达。例如，所述物质包括具有如序列4或者序列5所示的氨基酸序列的半乳糖凝集素-8蛋白。例如，所述物质包括具有与序列4或者序列5所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列的半乳糖凝集素-8蛋白。
附图说明
附图1描述了人类半乳糖凝集素-3的氨基酸序列和人类半乳糖凝集素-3组合物(Accession No.BAA22164 in GenBank，序列1)。
附图2描述了人类半乳糖凝集素-7的氨基酸序列和人类半乳糖凝集素-7组合物(Accession No.I55469 in GenBank，序列2)。
附图3描述的是采用渐进式多序列比对方法(CLUSTAL W软件)，将来自于人类半乳糖凝集素-3的氨基酸序列(序列1)、来自于野兔半乳糖凝集素-3的氨基酸序列(Genebank中的Accession No.JC4300)、来自于小鸡半乳糖凝集素-3的氨基酸序列(Genebank中的Accession No.AAB02856)、以及来自于仓鼠半乳糖凝集素-3的氨基酸序列(Genebank中的AccessionCAA55479)进行多序列比对。在该图中，第一条序列(上边)表示的是人类半乳糖凝集素-3的第1-250位氨基酸(序列1)，第二条序列表示的是仓鼠半乳糖凝集素-3的第1-245位氨基酸，第三条序列表示的是野兔半乳糖凝集素-3的第1-242位氨基酸，第四条序列(下边)表示的是小鸡半乳糖凝集素-3的第1-262位氨基酸。
附图4描述的是采用渐进式多序列比对方法(CLUSTAL W软件)，将来自于人类半乳糖凝集素-7的氨基酸序列(序列2)、来自于鼠类(rat)半乳糖凝集素-7的氨基酸序列(Genebank中的Accession No.P97590)、以及来自于小鼠(mouse)半乳糖凝集素-7的氨基酸序列(Genebank中的Accession No.O54974)、进行多序列比对。在该图中，第一条序列(上边)表示的是鼠类(rat)半乳糖凝集素-7的第1-136位氨基酸，第二条序列表示的是小鼠(mouse)半乳糖凝集素-7的第1-136位氨基酸，第三条序列(下边)表示的是人类半乳糖凝集素-7的第1-136位氨基酸(序列2)。
附图5是在PROSITE数据库中浏览人类半乳糖凝集素-3(序列1)所得的结果的概况。
附图6是在PROSITE数据库中浏览人类半乳糖凝集素-7(序列2)所得的结果的概况。
附图7描述的是人类半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域与来自于PFAM的hidden Markov model(HMM)数据库的保守氨基酸序列(PF00337)进行的序列比对。上边的序列表示的是保守氨基酸序列(PF00337，序列3)，而下边的氨基酸序列表示的是序列1的第117-247位氨基酸。
附图8描述的是人类半乳糖凝集素-7的半乳糖苷结合区域与来自于PFAM的hidden Markov model(HMM)数据库的保守氨基酸序列(PF00337)进行的序列比对。上边的序列表示的是保守氨基酸序列(PF00337，序列3)，而下边的氨基酸序列表示的是序列2的第5-135位氨基酸。
附图9中包含了一系列的角膜照片，这些角膜带有2毫米的磨损或者带有受激准分子激光伤口，这些带有伤口的角膜被允许在体内进行部分愈合，然后以石蜡切片的形式被进行半乳糖凝集素-3的免疫反应性分析。在附图9A的三幅照片中，(i)表示的是正常角膜的苏木素和曙红染色反应，(ii)表示的是被磨损后的角膜立即进行的苏木素和曙红染色反应，(iii)表示的是被受激准分子激光损伤后的角膜立即进行的苏木素和曙红染色反应。在附图9B的四幅照片中，(i)表示的是正常gal-3+/+小鼠角膜的免疫组织化学染色反应，(ii)表示的是被受激准分子激光损伤后的愈合型gal-3+/+小鼠角膜的免疫组织化学染色反应，(iii)表示的是正常gal-3-/-小鼠角膜的免疫组织化学染色反应，(iv)表示的是被受激准分子激光损伤后的愈合型gal-3-/-小鼠角膜的免疫组织化学染色反应。深色代表阳性免疫染色，WE代表伤口边缘；LE代表迁移性上皮细胞的前边缘；箭形代表上皮细胞；箭头代表白细胞/基质细胞。
附图10的图表举例说明了β-乳糖(Lac)和蔗糖(Suc)对受伤角膜上皮细胞的愈合速率的影响。
附图11的一组图表举例说明了野生型小鼠(gal-3+/+小鼠)和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3-/-小鼠)的受伤角膜上皮细胞的愈合速率，其中这些角膜伤口是由受激准分子激光治疗引起的，或者是由碱处理引起的，并且这些伤口被允许在体内或者体外进行愈合。
附图12的表格描述了通过使用cDNA微阵列技术以及半定量化PCR技术，检测出的野生型小鼠(gal-3+/+小鼠)和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3-/-小鼠)的半乳糖凝集素-7的基因表达中存在的区别，以及两者对管家基因进行的选择的区别(GAPDH代表D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶；RPS29代表核糖体蛋白S29；ODC代表鸟氨酸脱羧酶)。
附图13举例说明了通过使用(A)western印迹分析法，(B)免疫组织化学分析法，以及(C)使用小鼠胚胎纤维原细胞，检测出的野生型小鼠(gal-3+/+小鼠)和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3-/-小鼠)的半乳糖凝集素-7的表达中存在的区别。
附图14的图表举例说明了在半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3-/-小鼠)(附图14A)和野生型小鼠(gal-3+/+小鼠)(附图14B)中，外源性半乳糖凝集素-3对小鼠的受伤角膜上皮细胞的愈合速率的影响。
附图15的图表举例说明了当外源性半乳糖凝集素-3存在的情况下，β-乳糖(Lac)和蔗糖(Suc)对野生型小鼠(gal-3+/+小鼠)的受伤角膜上皮细胞的愈合速率的影响。
附图16包括A、B两个图表，(A)的图表举例说明了外源性半乳糖凝集素-7对野生型小鼠(gal-3+/+小鼠)的受伤角膜上皮细胞的愈合速率的影响，包括单独使用外源性半乳糖凝集素-7的情况、外源性半乳糖凝集素-7与β-乳糖(Lac)结合使用的情况、以及外源性半乳糖凝集素-7与蔗糖(Suc)结合使用的情况。(B)的图表对比了外源性半乳糖凝集素-7对于野生型小鼠(gal-3+/+小鼠)和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3- /-小鼠)的受伤角膜上皮细胞的愈合速率的影响。
附图17描述了人类半乳糖凝集素-1的氨基酸序列(序列6)。
附图18描述了人类半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序列(序列4)。
附图19表示出了人类半乳糖凝集素-1(序列6)的氨基酸序列，鼠类(rat)半乳糖凝集素-1的氨基酸序列，小鼠(mouse)半乳糖凝集素-1的氨基酸序列，以及仓鼠半乳糖凝集素-1的氨基酸序列，这些序列之间具有很高的序列同一性，因而，在哺乳动物当中，半乳糖凝集素-1的序列是高度保守的。阴影部分表示在四种哺乳动物的序列当中，此处的氨基酸残基是不相同的。鼠类和人类半乳糖凝集素-1的氨基酸序列具有90.4％的序列同一性；小鼠和人类半乳糖凝集素-1的氨基酸序列具有88.2％的序列同一性；仓鼠和人类半乳糖凝集素-1的氨基酸序列具有91.2％的序列同一性。该附图还表示出在不相同的氨基酸残基中，大多数残基发生的都是保守性变化，例如，由精氨酸取代位置19处的赖氨酸，由亮氨酸取代位置24处的缬氨酸，由丝氨酸取代位置73处的苏氨酸，以及由天冬氨酸取代位置136处的谷氨酸。
附图20表示的是人类半乳糖凝集素-8(序列4)的每种短形式(316个氨基酸)的氨基酸序列，以及与之相应的小鼠(mouse)半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序列，鼠类(rat)半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序列，小鸡半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序列，和青蛙半乳糖凝集素-8的短形式的氨基酸序列。在非人类半乳糖凝集素-8氨基酸序列中的划线部分代表为与人类鼠半乳糖凝集素-8序列进行序列比对而引入的缺口(gaps)。三种哺乳动物的半乳糖凝集素-8的氨基酸序列之间具有很高的序列同一性，具有78.2％的序列同一性，而在剩余的21.8％的不同之中，绝大部分变化都属于保守性变化，例如在人类半乳糖凝集素-8的位置20处是苯丙氨酸，而在小鼠和鼠类半乳糖凝集素-8的相应位置处为酪氨酸；在人类半乳糖凝集素-8的位置22处是甘氨酸，而在鼠类半乳糖凝集素-8的相应位置处为丝氨酸；在人类半乳糖凝集素-8的位置26处是甘氨酸，而在啮齿动物类半乳糖凝集素-8的相应位置处为天冬氨酸。而且，脊椎动物半乳糖凝集素-8与人类半乳糖凝集素-8具有43.0％的序列同一性，因此，半乳糖凝集素-8序列在哺乳动物中具有高度同一性，并且在脊椎动物中也是高度保守的。
附图21的柱形图表示出在小鼠模型中施用半乳糖凝集素对干眼综合症产生的影响，所述干眼综合症是由于在第0天注射白细胞介素-1α(在该图中用IL-1来表示)而引起的，以天数作为时间函数(as a function of time)。在第1天和第2天，以一天四次的频率向每个组中的5个小鼠模型以滴眼液的形式施用半乳糖凝集素-3，所述滴眼液中的半乳糖凝集素-3浓度为75微克/毫升或者150微克/毫升。对照组小鼠模型不注射白细胞介素-1α，也不向其施用滴眼液。对于“缓冲液”组中的小鼠模型，每天以四次的频率向其施以载体溶媒即可。使用Zoukhri，D等人在《Invest Ophthalmol Vis Sci》42(5)：925-932中发表的文章中所述的方法，通过荧光素清除试验来评价泪液的动力学特征，其中，较低的数值代表较好的泪液流动性。数据显示：使用半乳糖凝集素进行治疗能够使泪液的动力学特性恢复到正常水平，与没施用半乳糖凝集素的对照组动物相比，施用了半乳糖凝集素的动物在第2天的数据具有了p<0.05的统计显著性。
具体实施方式
本申请提及多种专利文献，科技文献以及其他出版物。上述文献和出版物的内容在此引入作为参考。此外，本申请提及到的所有网站的内容(截止到本申请的申请日之前)在此引入作为参考。
本发明在此提供了很多实施方式，这些实施方式都是基于结合了碳水化合物的蛋白——半乳糖凝集素能够促进泪膜在角膜表面或者结膜表面的分布这一原理来实现的。半乳糖凝集素是一类结合了半乳糖的蛋白质，它们能够高特异性的与黏蛋白上的O-联寡糖中的Galβ 1-4GlcNAC相结合。由于很多半乳糖凝集素都是二价的或者多价的，因而它们能够通过与分泌型黏蛋白的寡糖链的结合，来促进泪膜在角膜上皮细胞顶端表面或者结膜上皮细胞顶端表面的跨膜黏蛋白(或者其他糖蛋白)上的分布。
本发明提供了包含半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-3和/或半乳糖凝集素-7的药物组合物，能够有效的增强哺乳动物受伤组织的伤口的再上皮化(表皮再植)。本发明还提供了治疗哺乳动物组织的上皮损伤的方法，包括向患有上皮损伤的哺乳动物施以治疗有效剂量的半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7，半乳糖凝集素-8，或者半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的至少两种的组合物。当使用半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的组合物时，其中的任意一种半乳糖凝集素都可以在其他半乳糖凝集素之前施用、与其他半乳糖凝集素同时施用、或者在其他半乳糖凝集素之后施用。
本发明发现：当角膜出现损伤之后，半乳糖凝集素-3在迁移性角膜上皮细胞中表现为增量调节作用(见实施例1)。本发明同样发现：具有半乳糖凝集素-3缺陷型的小鼠的角膜跨上皮受激准分子laser损伤以及角膜碱烧灼性损伤的再上皮化(表皮再植)明显的慢于野生型小鼠(见实施例2)。本发明进一步发现：在半乳糖凝集素-3缺陷型的小鼠中，许多与损伤相关的基因(例如，tolloid-like蛋白和半乳糖凝集素-7)的表达都是不正常的(见实施例3)。此外，本发明证明了外源性半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7能够促进角膜损伤的再上皮化(表皮再植)(分别见实施例4和实施例5)。
半乳糖凝集素
外源性凝集素是一类蛋白质，因其具有特异性结合糖类并且凝集细胞的能力而得名(例如参见由Sharon于1993年在《生物化学科学发展趋势。》18：221中发表的文章)。已经表明，外源性凝集素参与了非常多种类的细胞活动，包括细胞与细胞间的相互作用，以及细胞与基质间的相互作用。外源性凝集素广泛分布于植物、无脊椎动物和哺乳动物中。动物外源性凝集素被分组为四个截然不同的家族：1)C类外源性凝集素；2)P类外源性凝集素；3)半乳糖凝集素(原来也被称为S类外源性凝集素)；以及4)正五聚蛋白(例如参见由Barondes等人于1994年在《生物化学杂志》269：20807中发表的文章)。
所有被详细分析过的哺乳动物半乳糖凝集素都能够识别β-乳糖和相关的β-半乳糖苷。尽管所有的哺乳动物半乳糖凝集素对小分子β-乳糖都表现出相似的亲和性，但它们对于更复杂的糖结合物却表现出明显不同的结合特异性(参见Henrick等人于1998年在《糖生物学》8：45上发表的文章；Sato等人于1992年在《生物化学杂志》267：6983上发表的文章；以及Seetharaman等人于1998年在《生物化学杂志》273：13047上发表的文章)。除了能够结合β-半乳糖苷这种糖类之外，半乳糖凝集素还具有红血球凝集活性。层粘连蛋白，一种含有多个聚乳糖胺链的天然产生的糖蛋白，已经被证明是某些半乳糖凝集素的天然配体。层粘连蛋白是基底膜中的一种组分，是位于所有上皮细胞之下并且围绕个体肌肉、脂肪和雪旺细胞的细胞外基质。已经知晓，在哺乳动物生长的过程中，细胞与基底膜之间的相互作用能够影响不同细胞类型的迁移和/或分化。半乳糖凝集素中不含有能指定膜移位的传统序列，但它们能够在细胞内进行分泌和定位。除了对β-半乳糖苷这种糖类具有相似的亲和性之外，半乳糖凝集素家族的成员在糖类识别结构域(CRD；也可以称为糖结合区域)具有明显的序列相似性，可以使用X光晶体结构分析确定上述序列中的相关氨基酸残基(参见Lobsanov等人于1993年在《生物化学杂志》267：27034上发表的文章；和Seetharaman等人在《Supra》上发表的文章)。半乳糖凝集素具有许多种类的生物学功能，包括细胞粘附(参见Cooper等人于1991年在《细胞生物学杂志。》115：1437中发表的文章)，生长调节(参见Wells等人于1991年在《细胞》64：91中发表的文章)，细胞迁移(参见Hughes于1992年在《Curr.Opin.Struct.Biol.》2：687中发表的文章)，肿瘤性转移(参见Raz等人于1990年在《Int.J.Cancer》46：871中发表的文章)和免疫应答(参见Offner等人于1990年在《J.Neuroimmunol》28：177中发表的文章)。目前，半乳糖凝集素家族具有12个被定义的真核成员。
半乳糖凝集素-3
典型的半乳糖凝集素-3蛋白家族成员(先前知晓的CBP-35(糖结合蛋白35)，Mac-2(巨噬细胞表面抗原2)，L-34，εBP(免疫球蛋白E结合蛋白)和RL-29)包含约240个氨基酸到约270个氨基酸，其分子量在约25kDa到约29kDa的范围。通常情况下，半乳糖凝集素-3由一种短的N-末端区域、一种含有半乳糖苷结合区域的C-末端区域、以及一种介于其间并富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的区域组成，后一区域是由7-10个重复氨基酸序列组成的(参见Liu等人于1996年在《生物化学》35：6073中发表的文章；以及Cherayil等人于1990年在《Proc.Natl.Acad.Sci.》，美国，87：7324中发表的文章)。这种氨基酸的前后重复与在骨胶原基因超家族中发现的相似。不同半乳糖凝集素-3蛋白中的氨基酸序列的重复次数不同，这种重复的次数随种类不同而不同。由于半乳糖凝集素-3蛋白具有的N-末端区域，使得该蛋白在结合到糖结合物配体表面之后能够经受聚合作用。
半乳糖凝集素-3能够在许多炎症细胞(例如，激活的巨噬细胞，嗜碱性粒细胞和肥大细胞)、上皮细胞及各种组织的成纤维细胞中表达(参见Perillo等人于1998年在《分子医学杂志》76：402中发表的文章)。它存在于细胞表皮上、细胞外基质(ECM)内、细胞质内以及细胞核内。细胞表皮上的半乳糖凝集素-3和细胞外基质内的半乳糖凝集素-3被认为是通过与互补的糖结合物的结合来介导细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用的，所述的互补的糖结合物中含有存在于许多细胞外基质和细胞表皮分子中的聚乳糖胺链。半乳糖凝集素-3被认为是通过与层粘连蛋白的结合来抑制细胞与基质的粘附作用的。在细胞核中，半乳糖凝集素-3是通过改变已知的细胞粘附分子(例如，整合蛋白α6β1和α4β7，参见Warlfield等人于1997年在《InvasionMetastasis》17：101中发表的文章；以及Matarrese等人于2000年在《Int.J.Canner》85：545中发表的文章)和细胞分裂素(例如，白细胞介素-1，参见Jeng等人于1994年在《Immunol.Lett》42：113中发表的文章)的表达来间接改变细胞与基质的相互作用的。在某些给定的器官例如肾脏中，半乳糖凝集素-3的表达受发育影响因素的调控，在受损伤之后，半乳糖凝集素-3在肺泡上皮细胞和肝细胞中的表达水平是上调的。已经表明，在细胞增殖过程中，半乳糖凝集素-3集中在某些细胞类型的细胞核中。在某些肿瘤中半乳糖凝集素-3的表达被加强，这表明半乳糖凝集素-3在细胞转移中起了作用。的确，半乳糖凝集素-3在病态的转移性细胞系中的过表达会导致转移倾向的显著增加(参见Raz等人在《Supra》中发表的文章)。
人类半乳糖凝集素-3有250个氨基酸长度，其分子量约为26.1kDa(序列1，附图1)。正如附图1、3、5和7中所描述的，人类半乳糖凝集素-3含有下述结构域、信号序列、或者其他结构特征(关于PS和PF前缀辨识数量的总说明，请查阅Sonnhammer等人于1997年在《蛋白质》28：405中发表的文章)：位于序列1的1-14位氨基酸残基处的N-末端结构域；位于序列1的15-116位氨基酸残基处的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域；位于序列1的117-247位氨基酸残基处的半乳糖苷结合区域；位于序列1的181-200位氨基酸处的一种galaptin信号序列(PROSITE数据库编号：PS00309)；位于序列1的4-7位氨基酸处的一种潜在的N-糖基化位点(PROSITE数据库编号：PS00001)；位于序列1的137-139位和194-196位的氨基酸处的两个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00005)；位于序列1的6-9位和175-178位的氨基酸处的两个潜在的酪蛋白II磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00006)；位于序列1的24-29位、27-32位、34-39位、43-48位、52-57位、61-66位、65-70位以及68-73位的氨基酸处的八个潜在的肉豆蔻酰化位点(PROSITE数据库编号：PS00008)。
这里定义的“半乳糖凝集素-3蛋白”可以包括一种半乳糖凝集素-3的“N-末端结构域”，一种半乳糖凝集素-3的“富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域”，和/或一种半乳糖凝集素-3的“半乳糖苷结合区域”。这些结构域将在后面进行进一步的描述。
这里使用的半乳糖凝集素-3的“N-末端结构域”包含一种长约10-20个氨基酸的氨基酸序列，优选是长约14个氨基酸的氨基酸序列，并且该序列与序列1中的1-14位氨基酸具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的同一性。所述N-末端结构域可以包含一种N-糖基化位点(PROSITE数据库编号：PS00001)和/或一种酪蛋白激酶II磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00006)。所述N-糖基化位点具有下述重复序列：N-{P}-[ST]-{P}，而所述酪蛋白激酶II磷酸化位点具有下述重复序列：[ST]-X(2)-[DE]。在上述重复序列以及在本发明描述的其他基序或者信号序列中，使用标准IUPAC命名法用单个字母代表氨基酸。在这种表示形式中，每个要素之间用破折号(——)隔开；方括号([])表示该位置处可以接受的特定残基；X表示该位置处可以接受的任意氨基酸残基；圆括号(())内的数字表示该任意氨基酸残基的数量。在某些实施方式中，所述N-末端结构域包含序列1中的氨基酸L7和L11。如附图3中所示，在几个不同种类哺乳动物的半乳糖凝集素-3中，这些氨基酸是保守的，因此具有催化和/或结构作用。
这里使用的半乳糖凝集素-3的“富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域”包含一种长约60-140个氨基酸的氨基酸序列，更优选是长约80-120个氨基酸的氨基酸序列，或者是长约90-110个氨基酸的氨基酸序列，并且该序列与序列1中的15-116位氨基酸具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的同一性。所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域还可以包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或者八个N-肉豆蔻酰化位点(PROSITE数据库编号：PS00008)，这些位点具有下述重复序列：G-{EDRKHPFYW}-X(2)-[STAGCN]-{P}。在某些实施方式中，所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域包含下述来自序列1的氨基酸及氨基酸区域：G21，P23，G27，N28，P30，G32，G34，P37，Y41-P46，G53，Y55-G57，P61，G62，G66，P72，G73，G77，Y79-G81，P83，G87，Y89，P90，G99，Y101，P102，P106，Y107，A109，L114，以及V116。在几个不同种类哺乳动物的半乳糖凝集素-3中，这些氨基酸及氨基酸区域是保守的，因此具有催化和/或结构作用(参见附图3中用“*”表示的氨基酸)。
这里使用的半乳糖凝集素-3的“半乳糖苷结合区域”包含一种长约80-180个氨基酸的氨基酸序列，其与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列(序列3)进行序列比对的结果为至少150比特值(bit score)。优选的，半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域包含至少约100-160个氨基酸，更优选包含至少约110-150个氨基酸，或者包含至少约120-140个氨基酸，并且其与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列(序列3)进行序列比对的结果为至少150比特值(bit score)，更优选为至少175比特值(bit score)，最优选为200比特值(bit score)或者更高。
如果想将一种特定序列与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列进行序列比对以计算其比特值，可以使用从www.sanger.ac.uk/Software/Pfam中获得的默认参数进入PFAM数据库HMMs(例如PFAM数据库，2.1版本)针对想要比对的序列进行检索。对PFAM数据库的描述可以参见Sonnhammer等人在《Supra》中发表的文章，对HMMs数据库的详细描述可以参见例如Gribskov等人于1990年在《Meth.Enzymol》183：146中发表的文章，以及Stultz等人于1993年在《蛋白质科学》2：305中发表的文章。
半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域可以进一步包含一种、优选两个蛋白激酶C磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00005)；一种酪蛋白激酶II磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00006)；和/或一种galaptin信号序列(PROSITE数据库编号：PS00309)。所述蛋白激酶C磷酸化位点具有下述重复序列：[ST]-X-[RK]。所述galaptin信号序列具有下述重复序列：W-[GEK]-X-[EQ]-X-[KRE]-X(3，6)-[PCTF]-[LIVMF]-[NQEGSKV]-X-[GH]-X(3)-[DENKHS]-[LIVMFC]。在某些实施方式中，所述半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域包含下述来自序列1的氨基酸和氨基酸区域：P117，Y118，L120-L122，G125，P128，R129，L131-I134，G136-V138，N141，N143，R144，L147，F149，R151，G152，D154，A156-F163，E165，R169-N174，N179-G182，E184-R186，F190-E193，G195，P197-K199，Q201-L203，E205，D207-Q220，N222，R224，L228，I231，I236，G238-I240，以及L242-S244。在几个不同种类哺乳动物的半乳糖凝集素-3中，这些氨基酸及氨基酸区域是保守的，因此具有催化和/或结构作用(参见附图3中用“*”表示的氨基酸)。
本发明中的某些半乳糖凝集素-3蛋白包含如序列1所表示的人类半乳糖凝集素-3的氨基酸序列。本发明中的其他半乳糖凝集素-3蛋白包含的氨基酸序列在基本上同源于序列1表示的氨基酸序列。这里使用的术语“基本上同源”是指第一氨基酸序列包含了足够数量的、或者最少数量的与第二氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同的氨基酸残基，这样第一氨基酸序列与第二氨基酸序列就能够具有相同的结构区域和/或相同的功能活性。例如，某些氨基酸序列包含与序列1相同的结构区域，其与序列1具有至少60％或者65％的序列同一性，优选具有至少75％的序列同一性，更优选具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％的序列同一性，这种氨基酸序列被称为与序列1的氨基酸序列在基本上同源。特别的，那些经过偶然的或者故意的诱导改变的蛋白质，例如序列1中的某些氨基酸残基发生缺失、添加、取代或者修饰，也属于本发明定义的半乳糖凝集素-3蛋白的范围之内。同样可以意识到，这里定义的半乳糖凝集素-3蛋白可以包含从其他种类的哺乳动物中获得的半乳糖凝集素-3蛋白的氨基酸区域，所述的其他种类的哺乳动物包括但不局限于牛，犬科动物，猫科动物，公山羊，绵羊，猪类，鼠科动物以及马。
按照下面描述的方法进行序列间的同一性计算。要确定两个氨基酸序列间的同一性百分数，需要将两个序列一一对齐以达到最佳比较的目的(例如，可以在第一种序列和第二个序列中的一种或者两个中引入缺口(gaps)，以便达到最佳的对齐效果)。然后对相应的氨基酸位置或者核苷位置处的氨基酸残基进行比较。当第一种氨基酸序列某位置处的氨基酸残基或核苷与第二个氨基酸序列的相应位置处的氨基酸残基或核苷相同时，所述位置处的蛋白质就是相同的。两个序列间的同一性百分数是一种基于两个序列相同位置的数量的函数，还要考虑到为进行最佳比对而引入到两个序列中的缺口的数量，以及每个缺口的长度。
可以使用数学运算法则来完成序列的比对和两个序列的同一性百分数的计算。在一种优选的实施方式中，可以使用默认参数在比对软件程序中计算两个氨基酸序列的同一性百分数。适合的程序包括，例如，Thompson等人于1994年在《核酸研究》22：4673发表的文章中涉及的CLUSTAL W(渐进式多序列比对)程序(www.ebi.ac.uk/clustalw)，Tatusova和Madden于1999年在《FEMS Microbiol.Lett.》174：247发表的文章中涉及的BL2SEQ程序(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12eq/b12.html)，Notredame和Higgins于1996年在《核酸研究》24：1515发表的文章中涉及的SAGA程序(igs-server.cnrs-mrs.fr/～cnotred)，以及Morgenstern等人于1998年在《生物信息学》14：290发表的文章中涉及的DIALIGN程序(bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign)。
半乳糖凝集素-7
典型的半乳糖凝集素-7蛋白质家族成员以单体形式存在，所述单体包含约130个到140个氨基酸，其分子量约为15kDa到16kDa(例如，参见Magnaldo等人于1995年在《生物学发展》168：259中发表的文章；和Madsen等人于1995年在《生物化学杂志》270：5823中发表的文章)。半乳糖凝集素-7的表达与上皮细胞层化的发作有关(参见Timmons等人于1999年在《Int.J.Dev.Biol》43：229中发表的文章)。半乳糖凝集素-7被认为在细胞与基质、细胞与细胞间的相互作用中发挥作用。在细胞与细胞接触的区域中(例如，在人类表皮的上层)发现存在半乳糖凝集素-7；在软琼脂角化细胞中半乳糖凝集素-7的表达被急剧的负调节，并且在恶性角化细胞系中是缺失的。半乳糖凝集素-7对于常态角化细胞的维持来说可能是必需的(参见Madsen等人在《Supra》中发表的文章)。
人类半乳糖凝集素-7包含136个氨基酸，其分子量约为15.1kDa(见附图2中的序列2)。如附图2，4，6和8中所示，人类半乳糖凝集素-7含有下述结构域，信号序列或者其他结构特征：一种半乳糖苷结合区域，位于序列2的5-135位氨基酸残基处；一种galaptin信号序列(PROSITE数据库编号：PS00309)，位于序列2的70-89位氨基酸残基处；一种N-糖基化位点(PROSITE数据库编号：PS00001)，位于序列2的29-32位氨基酸残基处；一种蛋白激酶C磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00005)，位于序列2的132-134位氨基酸残基处；一种酪蛋白激酶II磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00006)，位于序列2的9-12位氨基酸残基处；以及两个肉豆蔻酰化位点(PROSITE数据库编号：PS00008)，位于序列2的13-18、44-49位的氨基酸残基处。
这里定义的“半乳糖凝集素-7蛋白”包含一种半乳糖凝集素-7的“半乳糖苷结合区域”。这个区域将在下面的内容中进一步描述。
这里使用的半乳糖凝集素-7的“半乳糖苷结合区域”包含一种长约80-180个氨基酸的氨基酸序列，其与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列(序列3)进行序列比对的结果为至少80比特值(bit score)。优选的，半乳糖凝集素-7的半乳糖苷结合区域包含至少约100-160个氨基酸，更优选包含至少约110-150个氨基酸，或者包含至少约120-140个氨基酸，并且其与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列(序列3)进行序列比对的结果为至少80比特值(bit score)，更优选为至少100比特值(bit score)，最优选为120比特值(bit score)或者更高。所述半乳糖凝集素-7的半乳糖苷结合区域可以包含一种N-糖基化位点(PROSITE数据库编号：PS00001)；一种蛋白激酶C磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00005)；一种酪蛋白激酶II磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00006)；一种或者两个肉豆蔻酰化位点(PROSITE数据库编号：PS00008)；和/或一种galaptin信号序列(PROSITE数据库编号：PS00309)。在某些实施方式中，所述半乳糖凝集素-7的半乳糖苷结合区域包含下述来自于序列2的氨基酸序列和氨基酸区域：M1，S2，H6，K7，L10，P11，G13，R15，G17-V19，R21-G24，V26，P27，A30，R32-Q43，D46-N63，K65，Q67，G68，W70-G76，G78，P80-L90，I92，G97-K99，V101，G103，D104，Y107，H109，F110，H112，R113，P115，V119，R120，V122-L130，S132，I135，以及F136。在几个不同种类哺乳动物的半乳糖凝集素-7中，这些氨基酸及氨基酸区域是保守的，因此具有催化和/或结构作用(参见附图4中用“*”表示的氨基酸)。
本发明中的某些半乳糖凝集素-7蛋白包含如序列2所表示的人类半乳糖凝集素-7的氨基酸序列。本发明中的其他半乳糖凝集素-7蛋白包含的氨基酸序列在基本上同源于序列2表示的氨基酸序列。特别的，那些经过偶然的或者故意的诱导改变的蛋白质，例如序列2中的某些氨基酸残基发生缺失、添加、取代或者修饰，也属于本发明定义的半乳糖凝集素-7蛋白的范围之内。同样可以意识到，这里定义的半乳糖凝集素-7蛋白可以包含从其他种类的哺乳动物中获得的半乳糖凝集素-7蛋白的氨基酸区域，所述的其他种类的哺乳动物包括但不局限于牛，犬科动物，猫科动物，公山羊，绵羊，猪类，鼠科动物以及马。
半乳糖凝集素-8
半乳糖凝集素-8是一类被广泛表达的蛋白，存在于例如肝脏、心脏、肌肉、肾脏、脾脏、下肢和大脑中，人类及鼠类半乳糖凝集素-8蛋白及半乳糖凝集素-8基因序列是可以获得的(例如参见Hadari等人于1997年在《Trends in Glycosci andGlycotechnol》9：103-112中发表的文章)。由于半乳糖凝集素-8具有很高的亲水活性，并且具有与黏蛋白上的O-联寡糖中的Galβ1-4GlcNAC相结合的能力，这使得半乳糖凝集素-8成为治疗干眼综合症的理想制剂。
目前已知两种半乳糖凝集素-8的氨基酸序列类型，一种是含316个氨基酸的序列类型(Accession编号O00214，建立于1997年11月1日)，另一种是含359个氨基酸的序列类型(Accession编号Q8TEV1，建立于2002年6月1日)。上述两个序列虽然主要长度相同或者相似，但其区别并不仅仅在于总长度不同，两者还有一些其他区别。使用单字母方法表示的316个氨基酸的序列类型如下(序列4)：
MLSLNNLQNI IYNPVIPYVG TIPDQLDPGT LIVICGHVPS DADRFQVDLQ NGSSVKPRAD  60
VAFHFNPRFK RAGCIVCNTL INEKWGREEI TYDTPFKREK SFEIVIMVLK DKFQVAVNGK  120
HTLLYGHRIG PEKIDTLGIY GKVNIHSIGF SFSSDLQSTQ ASSLELTEIS RENVPKSGTP  180
QLSLPFAARL NTPMGPGRTV VVKGEVNANA KSFNVDLLAG KSKDIALHLN PRLNIKAFVR
240
NSFLQESWGE EERNITSFPF SPGMYFEMII YCDVREFKVA VNGVHSLEYK HRFKELSSID  300
TLEINGDIHL LEVRSW                     316
长一些的氨基酸序列类型(359个氨基酸)如下(序列5)：
MMLSLNNLQN IIYSPVIPYV GTIPDQLDPG TLIVICGHVP SDADRFQVDL QNGSSVKPRA  60
DVAFHFNPRF KRAGCIVCNT LINEKWGREE ITYDTPFKRE KSFEIVIMVL KDKFQVAVNG  120
KHTLLYGHRI GPEKIDTLGI YGKVNIHSIG FSFSSDLQST QASSLELTEI SRENVPKSGT  180
PQLPSNRGGD ISKIAPRTVY TKSKDSTVNH TLTCTKIPPT NYVSKILPFA ARLNTPMGPG  240
GTVVVKGEVN ANAKSFNVDL LAGKSKHIAL HLNPRLNIKA FVRNSFLQES WGEEERNITS
300
FPFSPGMYFE MIIYCDVREF KVAVNGVHSL EYKHRFKELS SIDTLEINGD IHLLEVRSW   359
这里定义的“半乳糖凝集素-8蛋白”可以包含一种半乳糖凝集素-8的“N-末端结构域”，一种半乳糖凝集素-8的“富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域”，和/或一种半乳糖凝集素-8的“半乳糖苷结合区域”。这些结构域将在后面的内容中进行进一步描述。
这里使用的半乳糖凝集素-8的“N-末端结构域”包含一种长约10-20个氨基酸残基的氨基酸序列，优选是一种长约14个氨基酸残基的氨基酸序列，并且该序列与序列4或者序列5的1-14位氨基酸具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的同一性。所述N-末端结构域可以包含一种N-糖基化位点(PROSITE数据库编号：PS00001)和/或一种酪蛋白激酶II磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00006)。所述N-糖基化位点具有下述重复序列：N-{P}-[ST]-{P}，而所述酪蛋白激酶II磷酸化位点具有下述重复序列：[ST]-X(2)-[DE]。在上述重复序列和其他基序或者信号序列中，使用标准IUPAC命名法用单个字母代表氨基酸。在这种表示形式中，每个要素之间用破折号(——)隔开；方括号([])表示该位置处可以接受的特定残基；X表示该位置处可以接受的任意氨基酸残基；圆括号(())内的数字表示该任意氨基酸残基的数量。
这里使用的半乳糖凝集素-8的“富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域”包含一种长约60-140个氨基酸的氨基酸序列，更优选是长约80-120个氨基酸的氨基酸序列，或者是长约90-110个氨基酸的氨基酸序列，并且该序列与序列4和序列5中各自的15-116位氨基酸具有至少60％、70％、80％、90％、95％、99％或者100％的同一性。所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域还可以包含一种、两个、三个、四个、五个、六个、七个或者八个N-肉豆蔻酰化位点(PROSITE数据库编号：PS00008)，这些位点具有下述重复序列：G-{EDRKHPFYW}-X(2)-[STAGCN]-{P}。在某些实施方式中，所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域包含下述来自序列4的氨基酸及氨基酸区域：G20，P23，P28，G29，G36，P39，以及其他的对于本领域技术人员而言显而易见的类似残基。在几个不同种类哺乳动物的半乳糖凝集素-8中，这些氨基酸及氨基酸区域是保守的，因此具有催化和/或结构作用。在某些实施方式中，所述富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域包含下述来自序列5的氨基酸及氨基酸区域：G21，P24，P29，G30，G37，P40，以及其他的对于本领域技术人员而言显而易见的类似残基。
这里使用的半乳糖凝集素-3的“半乳糖苷结合区域”包含一种长约80-180个氨基酸的氨基酸序列，其与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列(序列3)进行序列比对的结果为至少150比特值(bit score)。优选的，半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域包含至少约100-160个氨基酸，更优选包含至少约110-150个氨基酸，或者包含至少约120-140个氨基酸，并且其与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列(序列3)进行序列比对的结果为至少150比特值(bit score)，更优选为至少175比特值(bit score)，最优选为200比特值(bit score)或者更高。
如果想将一种特定序列与PFAM数据库编号为PF00337的重复序列进行序列比对以计算其比特值，可以使用从www.sanger.ac.uk/Software/Pfam中获得的默认参数进入PFAM数据库HMMs(例如PFAM数据库，2.1版本)针对想要比对的序列进行检索。对PFAM数据库的描述可以参见Sonnhammer等人在《Supra》中发表的文章，对HMMs数据库的详细描述可以参见例如Gribskov等人于1990年在《Meth.Enzymol》183：146中发表的文章，以及Stultz等人于1993年在《蛋白质科学》2：305中发表的文章。
半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域可以进一步包含一种、优选两个蛋白激酶C磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00005)；一种酪蛋白激酶II磷酸化位点(PROSITE数据库编号：PS00006)；和/或一种galaptin信号序列(PROSITE数据库编号：PS00309)。所述蛋白激酶C磷酸化位点具有下述重复序列：[ST]-X-[RK]。所述galaptin信号序列具有下述重复序列：W-[GEK]-X-[EQ]-X-[KRE]-X(3，6)-[PCTF]-[LIVMF]-[NQEGSKV]-X-[GH]-X(3)-[DENKHS]-[LIVMFC]。在某些实施方式中，所述半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域包含下述来自序列4的氨基酸和氨基酸区域：L123-L124，G126，P131，R128，L140-I146，以及其他如前所述的相似位点。在几个不同种类哺乳动物的半乳糖凝集素-8中，这些氨基酸及氨基酸区域是保守的，因此具有催化和/或结构作用(参见附图3中用“*”表示的氨基酸)。
本发明中的某些半乳糖凝集素-8蛋白包含如序列4和序列5所表示的人类半乳糖凝集素-8的氨基酸序列。本发明中的其他半乳糖凝集素-8蛋白包含的氨基酸序列在基本上同源于序列4或者序列5表示的氨基酸序列。这里使用的术语“基本上同源”是指第一种氨基酸序列包含了足够数量的、或者最少数量的与第二个氨基酸序列中的比对氨基酸残基相同的氨基酸残基，这样第一种氨基酸序列与第二个氨基酸序列就能够具有相同的结构区域和/或相同的功能活性。例如，某些氨基酸序列包含与序列4或者序列5相同的结构区域，其与序列4或者序列5具有至少60％或者65％的序列同一性，优选具有至少75％的序列同一性，更优选具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％的序列同一性，这种氨基酸序列被称为与序列4或者序列5的氨基酸序列在基本上同源。特别的，那些经过偶然的或者故意的诱导改变的蛋白质，例如序列4或者序列5中的某些氨基酸残基发生缺失、添加、取代或者修饰，也属于本发明定义的半乳糖凝集素-8蛋白的范围之内。同样可以意识到，这里定义的半乳糖凝集素-8蛋白可以包含从其他种类的哺乳动物中获得的半乳糖凝集素-8蛋白的氨基酸区域，所述的其他种类的哺乳动物包括但不局限于牛，犬科动物，猫科动物，公山羊，绵羊，猪类，科动物以及马。
干眼综合症被认为是眼科学中的“普通感冒”，是导致病人向眼科医师抱怨的第二常见的症状。有将近150万美国人都患有干眼症。这种疾病是由于泪膜的结构缺陷或者功能缺陷而引起的。泪膜具有一种动态结构，其产生的泪液和翻转(turnover)都是保持眼表健康的重要因素。泪膜由三个层构成：黏蛋白层(最内层)，水液层(中间层)以及脂质层(最外层)。三个层中任意一层的功能紊乱都可以导致干眼疾病的发生。泪膜通过存在于其最内层的黏蛋白分子与上皮细胞的表面相连接。所述黏蛋白层能促进泪膜在角膜表面的均匀分布，是维持眼表适度湿润的必不可少的物质。如果黏蛋白分子没有黏附于眼球上，将会导致上皮缺损，即使使用了普通的水样泪液。泪膜的分布缺陷将导致眼表或者泪膜的伤害，并且造成干眼疾病。内层的黏蛋白层是由结膜杯状细胞、结膜上皮细胞和角膜上皮细胞分泌的。眼黏蛋白可以形成膜(例如MUCI和MUCU)，或者形成凝胶/分泌凝胶(例如MUC5AC)。
黏蛋白是一类大分子糖蛋白，其中O-联糖类占黏蛋白质量的至少一半。丰富的O-联糖侧链是使黏蛋白具有高亲水性的原因。人们认为，正是由于这种亲水特性，才使得水液层能够均匀分布于眼球之上。
本发明是基于半乳糖凝集素具有能治疗干眼综合症(DES)这一治疗学用途而完成的。这种用途是基于半乳糖凝集素具有的糖类结合特性而产生的，并不限于使用了任何特殊的方法。以眼药水形式局部施用半乳糖凝集素能够促进泪膜的分布，这一作用是通过将分泌型黏蛋白与跨膜黏蛋白相结合或者与存在于结膜上皮细胞表面和角膜上皮细胞表面的其他糖蛋白相结合而实现的。
本发明的实施例检验了在三个不同的患有干眼的小鼠模型中分别局部施用半乳糖凝集素溶液所产生的作用。在一种模型中，依照Pflugfelder实验室发表的方法(参见Dursun等人于2002年在《Invest Ophthamol & Vis Sci》43：632-638中发表的文章；以及Pflugfelder等人于2003年在《眼表》1：31-36中发表的文章)，通过在普通小鼠的尾部施用东莨菪碱片剂，导致小鼠泪液不足。第二个模型利用MRL/1pr自体免疫小鼠，其具有泪腺炎性病变(inflammatory lesions)，这个模型被认为具有干燥综合症(Sjogrens Syndrome)(参见Jabs等人于1991年在《InvestOphthamol & Vis Sci》32：371-380中发表的文章；以及Jabs等人于1997年在《当代眼科研究》16：909-916中发表的文章)。对第三个模型进行白细胞介素-1α的注射，从而得到一种等价于具有干燥综合症的动物模型(参见Zoukhri，D等人在《InvestOphthamol & Vis Sci》42(5)：925-932中发表的文章)。
对三个模型进行体内泪液试验、体内泪液清除试验以及体内角膜荧光素染色试验，并将结果与使用溶媒处理过的对照组动物进行比较，以确定在这些参数之下不同浓度的半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8单独使用或者组合使用而产生的作用。在体内试验之后，使用生化方法对分离的泪腺进行试验，使用组织病理学方法对眼表进行试验。进一步的，检验到在进行东莨菪碱处理之前先使用半乳糖凝集素溶液作预处理而产生的作用，这是半乳糖凝集素与β-乳糖——一种半乳糖凝集素抑制剂共同使用而产生的可能的作用。
实施例得到的数据表明，在上述动物模型中，半乳糖凝集素对与干眼综合症有关的可测量参数产生了统计学显著的影响。相比较于使用安慰剂处理过的动物，使用半乳糖凝集素处理过的动物的眼角膜的角膜荧光素染色减少，这有力的证明了半乳糖凝集素对于人类干眼综合症具有优秀的治疗潜能。由于两种动物模型代表了干眼综合症的不同形式，任何一种模型产生的阳性结果都有助于确定半乳糖凝集素在治疗干眼综合症中所起的作用，并指导临床治疗的重点，包括其他动物试验以确定为发挥最大药效、持续最长药效时间、以及半乳糖凝集素与角膜和外源性黏蛋白的最优结合特性而需要使用的半乳糖凝集素的最佳浓度。进一步的，对其进行毒性研究以确定一种安全的眼用剂量，在获得临床试验批准之前达到FDA的要求。
泪液的最内层由黏蛋白组成，所述黏蛋白是由结膜杯状细胞、角膜上皮细胞以及结膜上皮细胞产生的。所述黏蛋白以分泌型黏蛋白的形式存在并被释放，或者所述黏蛋白仍然以跨膜黏蛋白的形式与上皮细胞相连接。这些分子是具有丰富O-联寡糖侧链的糖蛋白。这些侧链决定了黏蛋白具有高亲水特性，从而使水液层均匀分布于眼球之上。所述水液层由泪腺产生，占泪膜组成的约90％，其中绝大部分是由水组成的，所述水中含有溶解盐类，葡萄糖，溶酶菌，泪液特异性前血清白蛋白，乳铁传递蛋白，分泌型免疫球蛋白A以及其他蛋白。最外层的脂质层能延迟水分蒸发，它是由从睑板腺产生的皮脂腺组成的。眨眼动作可以使脂质层分布于泪膜表面(参见RheinstromSD于1999年发表的文章《干眼症》，收录于由Yanoff等人编著的《眼科学》第1版，Mosley国际有限公司，圣路易斯，MO)。
国家视力研究所将造成干眼症的情况分为两个主要的种类：水液层缺陷和蒸发缺陷。然而，临床表现通常是两种发病途径的结合(泪液的减少通常导致缺陷性油层分布的过多蒸发，而睑板腺疾病通常是与分泌不足性干眼症相关联的)。将水样泪液缺陷组次分类为干燥综合症型干眼症以及非干燥综合症型干眼症，能够发现两个组之间存在重大的区别，并强调了干燥综合征的炎性表达(参见Foulks于2003年在《眼表》1：20-30中发表的文章)。
水液层缺陷是最常见的导致干眼症的原因，这通常是因为泪腺分泌的泪液的减少造成的，尽管其原因也包括泪液蒸发的增多。导致分泌减少的原因包括干燥综合症，衰老性分泌不足，泪腺切除，维生素A缺失，类肉状瘤和淋巴瘤中的免疫泪腺损伤，感官缺失或者运动反应缺失，结膜瘢痕，以及隐形眼镜的佩带(参见Rolando和Zierhut于2001年在《Surv Ophthalmol.》45：S203-S210中发表的文章)。水液层的组成成分的改变，例如电解液浓度的增加，生长因子的缺失，或者前炎性细胞因子的出现，以及缓慢的泪液翻转(tear turnover)，都同样能够导致眼表损伤。
杯状细胞缺陷以及由此产生的黏蛋白水平的降低，伴随着很多形式的干眼症。某些细节处的失调会促使杯状细胞的缺失。这些失调包括维生素A的缺失，因为维生素A对于维持眼表的杯状细胞和黏蛋白是非常重要的，并且它能够调节结膜的失调，例如Stevens Johnson干燥综合症，沙眼，类天疱疮，以及化学烧伤。局部药物处理以及防腐剂的使用也同样能够损伤眼表和杯状细胞(参见Rheinstrom SD于1999年发表的文章《干眼症》，收录于由Yanoff等人编著的《眼科学》第1版，Mosley国际有限公司，圣路易斯，MO；以及Abelson等人于2003年在《RevOphthalmol》10：1中发表的文章)。
诊断技术除了能够用以评估病人的不适症状，已经证明该技术还能够用于确定干眼综合症的严重程度及其起因。可以通过无创性测量法使用荧光素溶液测定泪膜破裂时间(TBUT)，进而评估泪膜的不稳定性，并且测定生物显微技术观察到的首次泪膜破裂时间。可以使用经典的或者改进的泪液分泌试验(Schirmertest)对泪液进行评估。荧光素或者类似染料在眼表的着色程度按照惯例被用来诊断眼表改变(alteration)的严重程度。这些染料能够着色于被剥夺了黏蛋白保护的上皮表面，或者着色于暴露于上皮细胞膜的上皮表面。已经创建了一套标准化分级体系来量化损伤的严重程度。这些测试也同样被例行公事的用在临床试验中，以评估作为研究对象的干眼症治疗方法的治疗效果(参见Foulks于2003年在《眼表》1：20-30中发表的文章)。
人工泪液是目前干眼症治疗中的支柱。有很多种类的产品可以使用，但所有这些产品提供的都只是对症状的短时缓解。目前尚不存在药物能扭转这一局面。可以通过向盐类当中添加高分子量聚合体来制造人工泪液，高分子量聚合体是例如纤维素酯(甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素)或者聚乙烯醇。已经制备了其他的人工泪液成分，来尝试模拟泪液中的黏蛋白成分。研究表明，人工泪液中使用的防腐剂能够产生某些毒性，因此，已经能够得到以单位剂量装瓶的不含防腐剂的人工泪液(参见RheinstromSD于1999年发表的文章《干眼症》，收录于由Yanoff等人编著的《眼科学》第1版，Mosley国际有限公司，圣路易斯，MO；以及Abelson等人于2003年在《Rev Ophthalmol》10：1中发表的文章)。
随着人们对疾病的病理生理学机理的本质越来越接近，许多不同的治疗形式也已经被引入，包括那些针对于泪膜脂质层的功能失调以及针对于能导致疾病的潜在免疫性起因或者激素性起因的治疗方法(参见Brewitt等人于2001年在《Surv ofOphthalmol》45：S119-S202中发表的文章)。被研究的治疗方法包括使用例如15(S)-HETE(羟基-二十碳四烯酸)的局部促分泌素的方法(参见Gamache等人于2000年在《眼角膜》19：6：S88中发表的文章)，使用合成的P2Y2受体激动剂的方法(参见Jumblatt等人于1998年在《Exp Eye Res》67：341-346)，以及使用例如环孢菌素A和糖皮质激素的抗炎剂的方法(参见Pflugfelder于2003年在《眼表》1：31-36中发表的文章)。
已经知晓，黏蛋白对健康的眼泪膜生理机能起到一定的作用。黏蛋白是一类以蛋白为中枢(backbone)的大分子量糖蛋白，并且具有高含量的糖。除了用于构建黏蛋白层，黏蛋白自身还形成一种多糖蛋白复合物，其具有的支架样的结构能够帮助促进细胞粘附。它们还能够防御眼表损伤。黏蛋白还负责提供泪膜的亲水性。它可以稳定泪膜并且降低泪膜的表面张力，允许水液层均匀分布于眼球表面上。如果没有黏蛋白层，泪液将不能粘附于眼表，从而导致眼表易于损伤(参见Abelson等人于2003年在《RevOphthalmol》10：1中发表的文章)。
体内产生的两种主要类型的黏蛋白是：膜结合型黏蛋白(也被称为附膜黏蛋白)和分泌型黏蛋白。所述膜结合型黏蛋白(MUC1，MUC2以及MUC4)内含于细胞的脂质双分子层中。由角膜非杯状细胞及结膜非杯状细胞表达的膜结合型黏蛋白被认为能够促进由杯状细胞产生的分泌型黏蛋白(MUC5AC，MUC7)在眼表的分布。两种类型的黏蛋白的共同作用形成了一种机能正常的泪膜(参见Danjo等人于1998年在《Invest Ophthalmol VisSci》39：2602-2609中发表的文章；以及Watanabe于2002年在《眼角膜》21：S17-S22中发表的文章)。
结膜黏蛋白的缺陷是导致某些类型的干眼症的原因之一。可能的原因包括杯状细胞密度的降低，黏蛋白分布及其性质的改变，以及黏蛋白信使RNA表达的减弱(参见Gipson等人于2000年在《视网膜研究进展》16：1：81-98中发表的文章；或者Gilbard于2000年发表的文章“干眼疾病”，收录于Albert M等人编辑的《眼科学原理和实践》第2版，费城：W.B.Saunders公司：982-1001中)。维生素A的缺失，局部的药物治疗，包含防腐剂的滴剂的表达剂量以及生成瘢痕的结膜失调也都能够损伤杯状细胞和眼表(参见Danjo等人于1998年在《Invest Ophthalmol Vis Sci》39：2602-2609中发表的文章；以及Abelson等人于2003年在《RevOphthalmol》10：1中发表的文章)。
干眼症患者眼表的跨膜黏蛋白也发生了改变。研究者指出，与普通患者产生的黏蛋白相比，干眼症患者产生的跨膜黏蛋白例如MUC1是不能使蛋白糖基化的。其发生变化的结构潜在的改变了它们在眼表的机能，并且能够导致干眼病的进一步发展(参见Danjo等人于1998年在《Invest Ophthalmol Vis Sci》39：2602-2609中发表的文章)。
半乳糖凝集素在泪液不足中的作用
半乳糖凝集素是一类糖结合型蛋白质，是用于促进泪膜在角膜表面和结膜表面的分布的理想的选择。这类蛋白质以高亲和性的方式与黏蛋白相结合，特别是对于与黏蛋白的O-联糖侧链的结合来说。不需要被任何特殊理论和反应机理所限制，半乳糖凝集素能够通过将分泌型黏蛋白与跨膜黏蛋白(或者其他糖蛋白)结合的方式来促进泪膜在角膜表面和结膜表面的分布。在具有黏蛋白缺陷的眼睛中，外源性半乳糖凝集素可以延长或者加强黏蛋白的结合。并且，半乳糖凝集素能够通过将其自身与角膜表面的糖结合蛋白相结合的方式来促进泪膜更均匀的分布，即使是在黏蛋白缺失的环境中。
在非眼睛组织中，已经证实了黏蛋白与半乳糖凝集素之间存在相互作用。已经表明，半乳糖凝集素通过其与不同黏蛋白的强结合亲和力来调节黏蛋白的表达和产生。半乳糖凝集素-3以一种浓度依赖(concentration-dependent)的方式与来自人类结肠癌细胞中的黏蛋白相结合，并调节该黏蛋白的表达(参见Bresalier等人于1996年在《癌症研究》56：4354-4357中发表的文章；以及Dudas等人于2002年在《肠胃病学》118：1553中发表的文章)。在卵巢肿瘤细胞中，一种黏蛋白样的糖蛋白CA125与半乳糖凝集素-1相结合(参见Seelenmeyer等人与2002年在《细胞科学杂志》116：1305-1318中发表的文章)。
半乳糖凝集素构建了一种广泛分布的糖结合蛋白家族，其特点表现为它们与存在于许多细胞表面和细胞外基质(ECM)糖蛋白中的包含β-半乳糖苷的多糖的亲和力。在哺乳动物中，目前存在半乳糖凝集素家族中的14种成员(半乳糖凝集素-1到半乳糖凝集素-14)，因它们的糖识别区域(CRD)的结构相似性而定义。半乳糖凝集素是一类可溶性蛋白质。在细胞内，它们大量存在于细胞质中，并且已经在增生细胞的核内探测到半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3。在细胞外，它们存在于细胞表面和细胞外基质(ECM)当中。与某些生长因子(例如bFGF)和细胞因子(例如，白细胞介素-1)相类似，半乳糖凝集素中不含有经典信号序列或者跨膜结构域，它是由细胞通过非经典途径分泌的，这一非经典途径还没有被深入的理解。某些半乳糖凝集素具有广泛的组织分布，例如半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-8以及半乳糖凝集素-9，而其他半乳糖凝集素则表现出组织特异性，例如半乳糖凝集素-4，半乳糖凝集素-5以及半乳糖凝集素-6。半乳糖凝集素-1和半乳糖凝集素-3是两个被最广泛研究的半乳糖凝集素。在细胞外，这两种外源性凝集素被认为是通过与寡糖的结合而在细胞与细胞的粘附和细胞与基质的粘附中发挥作用，以截然不同的同系物的形式：纤维连结蛋白，层粘连蛋白，玻连蛋白以及整合蛋白类。绝大部分的半乳糖凝集素或者由于具有两个糖识别区域(CRD)，或者由于以同型二聚体的形式存在，因而在官能上是二价的。这种二价特性允许外源性凝集素一方面与分泌型黏蛋白糖蛋白的寡糖链相互作用，另一方面与跨膜黏蛋白的寡糖或者角膜顶面(apicalsurface)上的其他糖蛋白相互作用，以促进泪膜在眼表的分布。一些研究表明，半乳糖凝集素-3在鼠类角膜上皮细胞和人类角膜上皮细胞中表达。外源性半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7能够刺激小鼠动物模型的角膜伤口的再上皮化，同时在角膜上皮细胞的细胞迁移中发挥作用(参见Cao等人于2002年在《生物化学杂志》277：4229-4230中发表的文章；以及Cao等人于2003年在《主要眼科学》121：82-86中发表的文章)。
在对本发明实施例的初步研究中，使用了两种不同的角膜损伤愈合模型，过去发现，与野生型小鼠模型(半乳糖凝集素-3+/+)相比，半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠模型(半乳糖凝集素-3-/-)的伤口再上皮化表现的明显减慢。相反，在半乳糖凝集素-1缺陷型小鼠模型和野生型小鼠模型中，两者的角膜上皮细胞伤口闭合速率没有区别。外源性半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7以一种浓度依赖的方式加速了角膜碱性烧伤伤口的再上皮化。这个作用被竞争性糖(competing sugar)——β-乳糖所抑制，而不被不相关的二糖——蔗糖所抑制(参见Cao等人于2002年在《生物化学杂志》277：42299-4230中发表的文章；以及Cao等人于2003年在《主要眼科学》121：82-86中发表的文章)。
实施例
材料和方法
下述材料和方法用于本发明的所有实施例中。
具有疗效浓度的半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的人工泪液溶液
一种典型的人工泪液溶液，由半乳糖凝集素浓缩物制成，用于动物试验研究。所述溶液是缓冲液，PH中性，是等压的，并且包含例如羧甲基纤维素(CMC)或者羟丙基甲基纤维素(HMPC)之类的增稠剂以增加粘性。还制备了一种同样的对照组溶液，含有除半乳糖凝集素之外的所有成分。上述溶液中不含防腐剂，因为防腐剂能够恶化上皮损伤。因此，为每个实施例提供了新鲜的溶液，并在取液过程中对溶液进行冷冻。各种溶液不同的配方包括：人工泪液对照溶液；分别含有10微克/毫升半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7或者半乳糖凝集素-8或者它们两个两个(成对)的组合的人工泪液溶液；分别含有20微克/毫升半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7或者半乳糖凝集素-8或者它们两个两个(成对)的组合的人工泪液溶液；以及还含有0.1Mβ-乳糖的上述溶液，其中的β-乳糖是一种竞争性二糖，担当半乳糖凝集素抑制剂的作用。
在正常小鼠中使用东莨菪碱诱导其泪液不足，作为干眼综合症的一种动物模型
东莨菪碱是一种抗胆碱剂，作用于胆碱能毒蕈碱受体。透皮性东莨菪碱(scop)片剂通常被用来达到抗呕吐的目的，并且用于治疗人类的运动病。在一份公开的论文(参见Dursun等人于2002年在《Invest Ophthamol & Vis Sci》43：632-638中发表的文章)中，以这种方式使用东莨菪碱进行处理，其结果表现为泪液显著的、统计上的明显减少，与对照组相比，泪液的量减少到对照组的不到20％。；泪液荧光素清除和角膜羧基荧光素的吸收都增加了大约3倍。进一步的，将试验动物放入吹气头罩中，这些参数的增加表现的更为剧烈。此外，与对照组相比，使用东莨菪碱处理并被放置于吹气头罩中的小鼠的结膜杯状细胞的密度减少了多于90％。由于透皮性药片的运送体系能够提供受控制的、持续的给药途径，因而泪液的减少能持续超过24小时，这与局部使用阿托品的处理方法相反，后者的过程只能持续几个小时。重复施用新的东莨菪碱片剂可以进一步延长这种作用。
在这个实施例中使用C57BL/6型小鼠(由Charles RiverLaboratories，Wwilmington，MA提供)。这类小鼠有6周到8周大小，性别混合。使用电剃刀在经过麻痹的小鼠的尾巴上剃出一种长1英寸的部分。将透皮性东莨菪碱片剂(由Novartis，Summit，NJ提供)切成4小块儿，将每个单独的四分之一部分施用到剃了毛的尾巴上。经过48小时之后再次施用东莨菪碱片剂，以维持稳定的药物释放。将试验动物(小鼠)置于吹气头罩中1小时，在试验中的每一天此步骤进行3次。
MRL/1pr型自体免疫型小鼠
在这个试验中使用MRL/Mp-1pr/1pr(MRL/1pr)型小鼠(由Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME提供)。这类小鼠属于次同类系，在其生长到16周之内会发生自体免疫疾病，导致泪腺的炎性病变。根据病因学和逻辑学的评估，这类小鼠被指出是人类干燥综合症的模型(参见Jabs等人于1991年在《Invest Ophthamol& Vis Sci》32：371-380中发表的文章；以及Jabs等人于2001年在《当前眼科研究》16：909-916中发表的文章)。这里所述的实施例中使用的这类小鼠是至少16周大小的，性别混合。
对动物模型的泪液、泪液清除以及角膜染色的测量法
使用染有酚红的棉线(由Zone-quick，Oasis，Glendora，CA提供)来测定水样泪液。使用镊子夹住棉线，并通过动物的侧向眼角将其施用到眼表中，持续1分钟。利用棉线上的刻度，以毫米为单位，通过测量棉线湿润的程度来测量水样泪液。
利用2微升的1％的荧光素钠(由Alcon，Fort Worth，TX提供)，将其以液滴的形式施用到眼表之上以测量泪膜破裂时间(TBUT)。使用裂隙灯活组织显微镜检查泪膜，然后记录泪膜扩散的时间长短。
在进行了泪膜破裂时间的测量之后，立即进行荧光素染色，通过将2微升的1％的荧光素钠以液滴的形式施用到眼表之上的方式进行染色。在施用过后的5分钟之后，使用裂隙灯活组织显微镜对角膜的荧光素染色进行评估。荧光素染色法通常被应用于临床中，用以评价角膜表面的损伤。可以预期，患有干眼症的动物的角膜表面能够被荧光素染色，而正常的角膜表面不能够被染色。可以使用F1分级标准来记录荧光素染色的程度，这类似于在临床干眼症研究中所使用的。
等效治疗
设计出治疗进度表和测量进度表，以便对每一种短期效果(半乳糖凝集素处理过后2小时)和长期效果(半乳糖凝集素处理过后14小时)进行评估。可以预期，在执行了每天4次(4x/day)的治疗进度之后，半乳糖凝集素提供了一种长期的益处。对治疗进度的改进，对测量进度的改进，或者对能对角膜产生有益效果的必要剂量的改进都属于本发明所述实施例的等价治疗。例如，如果使用20微升/毫升的半乳糖凝集素进行治疗后能够发现应答，而使用10微升/毫升的半乳糖凝集素进行治疗后不能够发现应答，那么，一种另外的包含更高剂量(50微升/毫升)的实施例也属于等价治疗的范围之内。
半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7以及半乳糖凝集素-8的制备
本领域普通技术人员可以理解，本发明所述的半乳糖凝集素能够通过任何的可利用的资源来获得。这些资源包括但不局限于，从天然资源中分离的蛋白质，通过重组方法或者合成方法获得的蛋白质，例如通过固相程序。依照本发明，可以在重组DNA分子中使用编码半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的多核苷酸序列，以达到在适合的宿主细胞中指导本发明所述的半乳糖凝集素进行表达的目的。Cherayil等人、Madsen等人、以及Hadri等人在《supra》中发表的文章中分别详细的描述了对人类半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7以及半乳糖凝集素-8的克隆方法。为了能够表达出具有生物活性的半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7或者半乳糖凝集素-8，编码半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7以及半乳糖凝集素-8的核酸序列或者它们的功能性等价物被插入到一种适当的表达载体中，适当的载体是例如一种包含转录和翻译所述插入的编码序列所必需的元素的载体。可以使用本领域技术人员已知的方法来构建表达载体，所述表达载体包含一种编码半乳糖凝集素-1、编码半乳糖凝集素-3、编码半乳糖凝集素-7或者编码半乳糖凝集素-8的序列，以及适合的转录控制元件或翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术以及体内重组或者基因重组。可以使用本领域任何的已知技术来完成缺失、添加、取代反应的导入，例如使用基于PCR的诱变方法。这些技术被记载于Sambrook等人于1989年发表的文章《分子克隆：一种实验室手册》中，冷泉港出版社，Plainview，纽约；以及Ausubel等人于1989年发表的文章《分子生物学当代草案》中，John Wiley & Sons，纽约，NY。可以利用许多种类的表达载体/宿主体系来容纳和表达编码半乳糖凝集素-1、编码半乳糖凝集素-3、编码半乳糖凝集素-7或者编码半乳糖凝集素-8的序列。这些表达载体/宿主体系包括但不局限于：微生物，例如使用重组抗菌素、质粒DNA表达载体或者粘粒DNA表达载体转化的细菌；使用酵母表达载体转化的酵母菌；使用病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞体系；使用病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)转染的植物细胞体系；或者使用细菌表达载体(例如，Ti，pBR322，或者pET25b质粒)转化的植物细胞体系；或者动物细胞体系。可选择的，本发明所述的半乳糖凝集素可以通过使用化学方法合成一种整个的或者部分的半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7或者半乳糖凝集素-8的氨基酸序列而制成。例如，可以使用各种固相(solidphase)技术来完成肽的合成(参见Roberge等人于1995年在《科学》269：202中发表的文章)，也可以使用例如431A肽合成器(从Foster City应用生物系统获得，加拿大)依照制造商提供的说明书来完成肽的自动合成。
药物组合物
在本发明的一个方面，提供了一类药物组合物，其中这些药物组合物包括半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8，并且选择性的包括药物可接受载体。在某些实施方式中，这类组合物选择性的进一步包括一种或者多种额外的治疗剂。在某些实施方式中，所述额外的治疗剂是选自生长因子、消炎药、升压剂、胶原酶抑制剂、局部使用的类固醇、金属基质蛋白酶抑制剂、抗坏血酸、血管紧张素II、血管紧张素III、钙网蛋白、四环素、纤维连接蛋白(纤连蛋白)、血小板反应蛋白、转化生长因子(TGF)、角质细胞生长因子(KGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、神经元分化因子(NDF)、肝细胞生长因子(HGF)、维生素B族例如生物素以及透明质酸。
这里使用的术语“药物可接受载体”包括任何的以及所有的溶剂，稀释液，或者其他液体溶媒，分散剂或者悬浮剂，表面活性剂，等压剂，增稠剂或者乳化剂，防腐剂，固体粘合剂，润滑剂及其类似物，对于这些药物可接受载体的选择应当适应所需求的特定用药形式。在1995年由巴拿马(PA)Easton的Mack出版社出版、由Gennaro编辑的《雷明顿制药科学》一书中公开了用于制备药物组合物的各种载体，以及制备药物组合物的方法。可以作为药物可接受载体的物质的一些例子包括但不局限于：糖类，例如葡萄糖和蔗糖；淀粉类，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素，和醋酸纤维素；粉末状黄芪胶；麦芽；凝胶；滑石粉；赋形剂，例如可可油和蜡状栓剂；油类，例如花生油，棉花籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；乙二醇类，例如丙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热源的水；等压性盐；林格氏溶液；普通酒精，和磷酸缓冲液，以及其他没有毒性的可以兼容的润滑剂，例如十二烷基磺酸钠和硬脂酸镁，还包括着色剂，释放剂，涂层剂，甜味剂，风味剂以及芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以使用在本发明的组合物中，根据配方设计师的判断来选择。
治疗有效剂量
在另一方面，根据本发明所述的治疗方法，在此描述了一种让眼睛接触药物组合物以治疗干眼症的方法。因此，本发明提供了一类治疗干眼症的方法，包括向需要接受治疗的生物体施用一类治疗有效剂量的药物组合物，所述药物组合物中含有包括半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8在内的活性成分，施用的剂量和时间以能够达到所希望的效果而必需的剂量和时间为准。可以意识到，本发明的方法包括施用本发明所述的药物组合物作为一种治疗措施，来促进泪膜在角膜表面和结膜表面的分布，或者将其作为一种预防措施，用以减少与干眼症相关的并发症(例如，作为一种伤口冲洗溶液，在炎性环境下使用抗组胺剂进行的外科手术或者治疗的过程中和/或过程之后使用)。在本发明的某些实施方式中，所述药物组合物的“治疗有效剂量”是指能够有效改善干眼症的量。所述组合物在本发明所述的方法中，可以以任何有效的剂量以及任何能有效治疗眼睛的给药路径来施用。因此，这里所说的“能够有效改善干眼症的量”是指能够改善泪膜的足够的药物组合物的量。确切的剂量由不同的医师根据需要治疗的病人的个体情况来选择。对给药剂量和给药方式进行调整，以提供充足水平的活性成分或者维持所希望的药效。需要考虑的其他额外因素包括疾病状况的严重程度，例如干眼的程度，疾病的历史；患者的年龄、以及性别；用药期间的饮食，用药时间和用药频率；药物的结合；反应的敏感性；以及治疗的耐受性/应答性。长效的药物组合物可以以一天数次、一天一次、3到4天一次、一周一次、或者两周一次的频率给药，这取决于特定组合物的半衰期及其清除速率。
优选以单位剂量形式配制本发明中的活性成分，以达到减少用药次数并保持剂量均匀的目的。术语“单位剂量”在这里是指适合于需要被治疗的患者的体质的离散的活性成分单元。然而，可以理解，本发明所述组合物每天施用的总剂量将由主治医师来决定，并且在合理的医疗鉴定的范围之内。对于任何活性成分来说，其治疗有效剂量最初都可以通过细胞结构测试或者动物模型试验来评估，动物模型通常使用小鼠，兔，狗，或者猪。这些动物模型还可以用来确定所希望的给药浓度范围以及给药路径。当已经选择了直接施用于眼睛作为给药路径时，上述信息还可以被用来确定有效剂量，以及针对人类的其他的给药路径。治疗有效剂量是指能够改善症状或者状况的活性成分的量。可以在细胞培养中或者实验性动物中使用标准化制药程序来检测活性成分的治疗功效以及毒性，例如使用ED50(对试验模型中的50％来说是治疗有效的剂量)和LD50(对试验模型中的50％来说是致命的剂量)来检测。毒性作用和治疗性作用的剂量比称为治疗指数，可以使用比例关系LD50/ED50来表示。治疗指数大的药物组合物是优选的。从细胞培养测试以及动物模型研究中获得的数据被用来制定人类使用的剂量范围。
药物组合物的施用
当活性成分以所需要的剂量与适合的药物可接受载体配制完毕之后，本发明所述的药物组合物可以通过局部施用的给药方式施用于人类以及其他哺乳动物，例如以眼用的方式(通过粉末、药膏、或者滴剂)，例如直接应用于眼睛。可以选择的、其他的给药路径也是能够预想到的，例如口服，直肠给药，肠胃外给药，池内给药，阴道内给药，腹腔内给药，上颌给药或者鼻腔内给药，依照需要治疗的症状的严重程度来选择。
眼部给药的液体配药形式包括缓冲液，增溶剂，优选的稀释液例如水，防腐剂例如thymosol，用以调节溶液的一种或者多种生物高聚物或者聚合物，例如聚乙二醇，羟丙基甲基纤维素，透明质酸钠，丙烯酸钠或者罗望子胶。
口服给药的液体配药形式包括但不局限于，药物可接受乳液，微乳液，溶液，悬浮液，糖浆以及中药西剂。除了活性成分之外，所述液体配药形式还可以包含本领域通常使用的惰性稀释液，例如水或者其他溶液，增溶剂和乳化剂，例如普通酒精，异丙醇，氨基甲酸乙酯，乙酸乙酯，苯甲醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油类(特别的，棉花籽油，落花生油，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油，以及芝麻油)，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释液，所述口服组合物还可以包括辅助剂，例如润湿剂，乳化和悬浮剂，甜味剂，风味剂以及芳香剂。
局部给药或者透皮性给药的本发明药物组合物的配药形式包括：药膏，药贴，乳霜，洗液，凝胶体，粉末，溶液，吸入剂或者片剂。在无菌环境下将所述活性成分与药物可接受载体进行混合，同时也可以加入任何需要的防腐剂或者缓冲剂。例如，眼部感染或者皮肤感染者可以使用液态的滴剂、喷雾、乳液或者乳霜状的配药形式进行处理。用药的性质可以是治疗性的，或者也可以是预防性的。预防性的组合物可以存在于或者被施用于潜在伤口的位置处，或者伤口的发源处，例如隐形眼镜，隐形眼镜清洗溶液和残渣溶液，存放或者携带隐形眼镜的容器，佩带隐形眼镜的装置，眼药水，外科冲洗溶液，滴耳液，眼罩，以及使用于眼部区域的化妆品，包括眼霜，乳液，眉笔，眼线，和眼影。本发明包括那些含有本发明公开的组合物的眼科装置或者用品，外科手术装置或者用品，听力装置或者用品(用品的例子例如纱布，绷带或者带条)，以及这些装置或者用品的制造方法或者使用方法。本发明公开的组合物可以是被涂覆、注入、粘结在上述装置上，或者使用本发明公开的组合物处理过上述装置。
所述的药膏、药片、乳霜和凝胶体中除含有本发明所述的活性成分之外，还可以包括赋形剂，例如动物脂肪和植物脂肪，油类，蜡，石蜡，淀粉，黄芪胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅树脂，斑脱土，硅酸，滑石粉，氧化锌，或者它们的混合物。
所述的药物粉末和喷雾中除含有本发明所述的活性成分之外，还可以包括赋形剂，例如滑石，硅酸，氢氧化铝，硅酸钙，聚酰胺粉末，或者这些物质的混合物。药物喷雾还可以额外包括常用的推进剂，例如氟氯烃。
透皮性片剂具有的附加的优点是能够为机体提供控释的活性成分。这类配药形式可以通过将组合物溶解于或者分散于适合的介质中来获得。也可以向其中加入吸收促进剂，以增加所述组合物进入皮肤的流量。其速率的控制可以通过加入速率控制膜或者通过将所述组合物分散于一种多聚物基质或者凝胶中来实现。
注射类药物的制备，例如无菌注射型液体或者油质悬浮液，可以根据本领域已知的技术使用适当的分散剂或者润湿剂以及悬浮剂进行配制。其中，无菌注射类组合物也可以是存在于非毒性肠胃外可接受的稀释液或者溶剂中的无菌注射型溶液，悬浮液或者乳化液，例如，在1，3-丁二醇中存在的组合物溶液。这些可接受溶媒和溶剂可以使用水，林格氏溶液，U.S.P以及等压的氯化钠溶液。除此之外，无菌的不挥发性油类通常作为一种溶剂或者悬浮介质来使用。为了达到这个目的，任何温和的不挥发性油类都可以使用，包括合成的单甘油酯或者甘油二酯。除此之外，脂肪酸类也可以被用于注射类药物组合物的制备当中，例如油酸。所述的注射类组合物可以是无菌的，例如将其通过一种细菌截留过滤器进行过滤，或者以无菌固体组合物形式将杀菌剂导入注射类组合物中，其中杀菌剂在使用之前可以预先被溶解于或者分散于蒸馏水或者其他无菌注射型介质中。为了达到延长活性成分的作用的目的，通常希望能够通过皮下注射或者肌肉注射来减慢对活性成分的吸收。肠胃外给药形式的活性成分的延时吸收可以通过将所述活性成分溶解于或者悬浮于一种油性溶媒中来实现。将活性成分在例如聚交酯-聚乙二醇这样的生物可降解聚合物中制成活性成分微胶囊基质，可以得到可注射用的补给形式(depot forms)的药物。根据活性成分与聚合物的比例，以及所使用的特定聚合物的性质，可以控制活性成分的释放速率。其他的生物可降解聚合物的例子包括：聚环原酯和聚酸酐。可注射用的补给形式的药物还可以通过使用脂质体或者微乳液包裹活性成分的方法进行制备，其中的脂质体或者微乳液是能够被集体组织所兼容的。
直肠给药或者阴道给药形式的组合物优选是栓剂，可以通过将本发明的活性成分与适当的非刺激性赋形剂或者载体进行混合的方法来制备，其中非刺激性赋形剂或者载体的例子是可可油，聚乙二醇或者一种蜡状栓剂，所述蜡状栓剂在环境温度下呈固态，但在机体温度下呈液态，因此可以在直肠腔内或者阴道腔内融化，并且释放活性成分。
口服给药形式的固体配药形式包括：胶囊，片剂，丸剂，粉末以及颗粒。在这类固体配药形式中，活性成分与至少一种惰性药物可接受赋形剂或者载体进行混合，其中惰性药物可接受赋形剂或者载体的例子是柠檬酸钠，或者磷酸二钙和/或a)充填物或者添加物，例如淀粉，蔗糖，葡萄糖，甘露醇，以及硅酸，b)结合剂，例如羧甲基纤维素，藻酸盐，凝胶，聚乙烯基吡咯烷酮，蔗糖，以及阿拉伯树胶，c)保湿剂，例如甘油，d)崩解剂，例如琼脂-琼脂，碳酸钙，马铃薯淀粉或者木薯淀粉，褐藻酸，某些硅酸盐类，以及碳酸钠，e)溶液阻滞剂，例如石蜡，f)吸收加速剂，例如季胺组合物，g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，例如高岭土和斑脱土，以及i)润滑剂，例如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，十二烷基磺酸钠，和它们的混合物。
相似类型的固体组合物还可以作为芯物质添加到软胶囊或者硬芯(hard-filled)凝胶胶囊中，使用乳糖和高分子量聚乙二醇及其类似物作为赋形剂。固体配药形式的片剂，糖衣丸，胶囊，丸剂以及颗粒可以使用涂层剂和成壳物质例如肠溶涂层、控释涂层和制药领域公知的其他涂层来制备。在这类固体配药形式中，活性成分可以与至少一种惰性稀释液例如蔗糖或者淀粉进行混合。这类配药形式还可以包括通常使用的其他物质来替代惰性稀释液，例如片剂润滑剂和其他片剂辅助剂例如硬脂酸镁和微晶纤维素。如果该配药形式是胶囊，片剂以及丸剂，其还可以包含缓冲剂。上述物质可以选择性的含有包埋剂，并且可以以组合物的形式仅仅释放活性成分，或者可以选择的以一种延时的方式优先释放肠道内某个部分的活性成分。可以使用的包埋组合物的例子包括聚合物以及蜡。
药物组合物的用途
正如前面所讨论并且在实施例中详细描述的那样，半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8能够通过将分泌型黏蛋白的寡糖链结合到跨膜黏蛋白(或者其他糖蛋白)之上而成为促进泪膜分布的有效促进剂。总之，可以相信，这些半乳糖凝集素能够在临床应用中有效刺激(促进)干眼症的治愈。
总之，本发明表明：这些半乳糖凝集素能够在临床应用中有效刺激(促进)与任何上皮组织有关联的疾病的治愈，这些上皮组织包括但不局限于：皮肤上皮细胞；角膜上皮细胞；胃肠道内层；肺上皮细胞；肾小管内表皮；血管内表皮；子宫内表皮；阴道内表皮；尿道内表皮；或者呼吸道内表皮。本发明在其不同的实施方式中包含了对于各种上皮损伤类型的治疗，包括但不局限于：外科损伤，切除损伤，水泡，溃疡，缺损，磨损，腐蚀，破口，疖子，切口，痛处，以及由暴露于热源或者化学物质导致的烧伤。这些损伤可以发生在正常个体中，或者发生在那些由于患有某些疾病而导致伤口不能正常愈合的个体中，后者的例子包括糖尿病，角膜营养失调，尿毒症，营养不良，维生素缺失，肥胖，传染病，免疫抑制，以及由使用类固醇进行的组织治疗、放射治疗、非甾体消炎药(NSAID)、抗肿瘤药和抗代谢药而引起的并发症。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8，例如这里使用的，能够有效的促进真皮损伤之后的真皮重建。可选择的，本发明显示出，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能够增强皮肤移植物在伤口床上的黏附，并且能够刺激其从伤口床上再上皮化。适合的皮肤移植物包括但不局限于：自体移植物，人造皮肤，同种异体移植物，自体真皮移植物，自体上皮移植物，avacular移植物，布-布二氏移植片，骨移植物，胚组织移植物，(脊椎动物)皮肤移植物，延时移植物，真皮移植物，上皮移植物，筋膜移植物，全层角膜移植片(full thickness grafts)，异种移植物，奇形移植物，同种移植物，增生移植物，角膜板层移植物，网状植皮移植物，黏膜移植物，奥-提二氏移植物，omenpal移植物，修补移植物，带蒂移植物，全层角膜移植片(penetratinggrafts)，皮片移植物，以及中厚皮片移植物。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8在这里被用来有效治疗皮炎、疱疹，在这类皮炎疱疹中，水泡形成在真皮表皮连接处。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8在这里被用来有效治疗表皮松懈症，这是一种上皮与其下的真皮之间的黏附缺陷，能够导致频繁的、开放性的、疼痛的水泡的产生。半乳糖凝集素通过加速这类损伤的再上皮化来治疗表皮松懈症。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8在这里进一步被用来有效治疗天疱疮疾病和类天疱疮疾病，其中，前者包括上皮细胞内的细胞与细胞之间黏附性的缺失，后者包括真皮表皮连接处的细胞与细胞之间黏附性的缺失。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8被用来治疗各种溃疡，这些溃疡包括但不局限于：糖尿病足溃疡，真皮溃疡，褥疮溃疡，动脉溃疡，以及静脉瘀血。
本发明包含用以促进角膜组织愈合的方法。这包括治疗由下列途径引起的角膜上皮缺陷：角膜溃疡，热伤害，放射伤害，小水疱病，角膜磨损或者破口，为矫正近视而进行的准分子激光外科手术，异物，以及无菌化角膜浅层渗透；该方法包括治疗由下列途径引起的化学烧伤：暴露于酸或者碱(例如，氢氟酸，蚁酸，无水氨，骨泥，和石炭酸)或者其他化学制剂例如白磷，金属元素，硝酸盐，烃类，以及焦油；该方法包括治疗下列类型的角膜病：例如神经营养性角膜病，糖尿病性角膜病，和Thygeson浅层点状角膜病；该方法还包括治疗下述类型的角膜炎：例如病毒性角膜炎(例如：变态疱疹性角膜炎或者疱疹样角膜炎)以及细菌性角膜炎；该方法还包括治疗下述类型的角膜营养不良：例如格子样角膜营养不良，上皮基底膜营养不良(EBMD)以及Fuch’s角膜内皮营养不良。
使用这里所述的方法，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能够有效治疗胃肠溃疡并且帮助加速黏膜内层的愈合、腺体黏膜的重生以及十二指肠黏膜内层的愈合。炎性肠疾病，例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎，能够分别导致小肠黏膜表面或大肠黏膜表面的破坏。因此，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8可以被用来促进黏膜表面的修复，以帮助更快速的愈合，并且能够阻止或者削弱炎性肠疾病的发展进程。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8被期望与黏蛋白相结合，促进黏蛋白黏附于上皮细胞的顶面(apicalsurface)，因此可以被用来保护胃肠道远离摄取的或者外科手术中带来的有害物质。半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8可以被用来减轻内脏毒性所产生的副作用，其中内脏毒性来自于细菌感染疗法，真菌感染疗法，放射疗法，化学疗法或者其他疗法。半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-3、和/或半乳糖凝集素-7能够被用来例如预防性的或者治疗性的阻止或者削弱黏膜炎，食道炎，或者胃炎(例如，用来治愈与口腔溃疡、食道溃疡、肠内溃疡、结肠溃疡、直肠溃疡、和肛门溃疡相关联的损伤)。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能够有效的促进尿路上皮的愈合。包括尿路上皮细胞在内的组织层容易在许多治疗行为中受到损伤，包括导管插入术，外科手术，或者细菌感染疗法(例如，使用一种能够引起两性间传播的疾病例如淋病的制剂进行感染的方法)。本发明同样包括用以促进女性生殖道中的组织愈合的方法，包括向患者施以治疗有效剂量的半乳糖凝集素-8、半乳糖凝集素-3、和/或半乳糖凝集素-7。女性生殖道组织损伤可以由各种各样的情形导致，包括使用假丝酵母感染，使用Trichomonis感染，使用加德纳菌感染，淋病，衣原体感染，支原体感染，以及其他两性间传播的疾病。
使用这里所述的方法，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能够有效的促进肾脏上皮细胞的修复，因而能够减轻或者治愈肾脏和病理学疾病例如急性肾衰竭、慢性肾衰竭以及晚期肾脏疾病。使用本发明所述的方法，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能够有效的促进乳房组织的修复，因而可以被用来促进由外科手术、外伤或者肿瘤导致的乳房组织损伤的愈合。使用这里所述的方法，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8能够有效的促进由外伤、外科手术或者化学制剂导致的脑组织损伤的愈合，并且减轻由外伤、外科手术或者化学制剂导致的脑组织损伤的程度。
半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8可以被预防性的施用，以减轻或者阻止由各种病理形态导致的肺部损伤。例如，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8可以被用来促进肺泡和支气管上皮细胞的修复，用以阻止、削弱或者治愈急性或者慢性肺部疾病。肺气肿，一种能够导致累积性的肺泡缺损和吸入性损伤的疾病，是由例如吸烟和烧伤引起的，并能够导致支气管上皮细胞和肺泡的坏死。肺气肿能够通过施用半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8被有效治疗，而其损伤可归因于化学疗法、放射疗法、肺癌、哮喘、黑肺(煤尘肺)以及其他肺损伤情况。
可以预期，本发明包括的治疗方法不局限于治疗人类的伤口，也可以被用来治疗其他任何哺乳动物，这类哺乳动物包括但不局限于：牛科，犬科，猫科，公山羊，绵羊，猪科，鼠科，以及马科。当治疗一种给定种类的哺乳动物的伤口时，优选但不是必须的是，使用的半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8具有与该物种自身存在的半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和/或半乳糖凝集素-8的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
本发明记载的这些实施例中的所有动物治疗试验都符合“视力和眼科学研究联合会决议——眼科研究中动物的使用方法”的规定(Association for Research in Vision and OphthalmologyResolution on the Use of Animals in Vision Research)，并且遵照NIH指南中关于“实验性动物的保护和使用”的建议(therecommendations of the NIH Guide for the Care and Use ofLaboratory Animals)。
实施例1-半乳糖凝集素-3在受伤的迁移性角膜上皮细胞的增 量调节作用
为了确定在受伤后的愈合角膜的上皮细胞中，半乳糖凝集素3的表达水平是否发生变化，使用带有2毫米受激准分子激光器切口和磨损伤口的小鼠角膜，并允许上述切口和伤口在体内进行部分愈合，然后使用兔类抗人类半乳糖凝集素-3mAb M3/38(美国典型微生物保藏中心，Rockville，MD)对小鼠角膜进行免疫染色处理。角膜上皮细胞是一种基层鳞状上皮细胞。在鼠科动物中，角膜上皮细胞占整个角膜厚度的20-25％，它由5到6层细胞层组成。在上皮细胞基底膜之下的是角膜基质，在鼠科动物中，角膜基质占整个角膜厚度的70-80％。磨损伤口使上皮细胞发生移位，而完整的留下了角膜基质。相反，被广泛应用于矫正近视的受激准分子激光治疗在移除上皮细胞的同时也移除了里面的角膜基质。
通过肌肉内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10体重)使瑞士韦伯斯特小鼠(Taconic实验动物服务中心，Germantown，纽约)被麻醉。阿佛丁是通过混合2.5克的2，2，2三溴丁醇、5毫升的2-甲基-2-丁醇(Aldrich，Milwaukee，WI)和195毫升的蒸馏水而制得的。将普鲁卡因滴眼液(ALCAINETM，购买自Alcon实验室，Fort Worth，得克萨斯州)作为局部麻醉剂施用于角膜之上。在第一组小鼠中，使用APEX PLUSTM受激准分子激光器(Summit Technology of Waltham，MA)对小鼠的右眼进行透皮性受激准分子激光切除术(2毫米光学区，42到44微米切除深度，PTK模式)。在第二组小鼠中，使用Alger刷(Alger EquipmentCompany of Lago Vista，得克萨斯州)对小鼠的右眼制造2毫米的磨损伤口。
在进行过上述手术后，所有的动物都接受肌肉内注射丁丙诺啡(0.3毫克/毫升，注射0.2毫升，BUPRENEXTM，购买自Reckitt&Colman制药公司，Richmond，梵蒂冈)作为止痛剂。给动物施用抗生素药膏(VETROPOLYCINTM，购买自Pharmaderm，Melville，纽约)，并允许角膜在体内进行部分愈合16到18小时。在愈合阶段的最后，使用前述方法对动物进行麻醉，并通过使其颈部脱臼的方法将动物致死。将动物眼球固定于福尔马林中2小时，然后再将其用固体石蜡进行包埋。在平行于眼轴的位置处进行组织切片(5微米厚度)。使用间二甲苯脱去组织切片上的石蜡，再使用分级的乙醇溶液(100％，70％和30％)对切片进行再水合(re-hydrated)。为了进行免疫染色，按顺序使用3％双氧水(37℃，10分钟)、2.5％正常山羊血清对组织切片进行诱导，两者的作用分别为阻碍内源性过氧化物酶活性以及阻碍非特异性结合。然后，组织切片按照顺序先进行mAb M3/38(未稀释的杂交瘤液体，1小时)的诱导，然后用生物素化抗兔类免疫球蛋白G(1：200，Vector实验室，Burlingame，加拿大)诱导1小时，用新鲜制备的抗生物素蛋白D和生物素过氧化物酶的混合物(Vector实验室)诱导20小时，最后用二氨基联苯胺(DAB)-双氧水试剂(Kirkegaard & Perry实验室，Gaithersburg，MD)进行诱导。使用不相关的mAb或者只使用介质处理组织切片，以得到阴性对照组。
如附图9中所示，正常角膜的石蜡切片(附图9A和9B)与愈合型角膜的石蜡切片(附图9C和9D)的免疫组织化学染色试验表明：与正常上皮细胞相比，在两种角膜伤口愈合的动物模型中，使用mAb M3/38进行处理的愈合角膜的迁移性上皮细胞的前边缘的染色现象更加明显，尤其是在基底细胞层和中间细胞层处。在愈合角膜上皮细胞和正常角膜上皮细胞中，在细胞与基质连接点的位置处的免疫染色现象更加明显。虽然正常角膜的基质细胞不能够与mAb M3/38发生反应，但在愈合角膜内的基质中的细胞强烈的表达半乳糖凝集素-3，尤其是在迁移性上皮细胞内的区域中。
当允许角膜在包含非必需氨基酸、L-谷氨酸盐、抗生素和0.4％小牛血清白蛋白(BSA)的不含血清的Eagle’s培养液中进行16到18小时的器官培养以进行愈合的时候，角膜上皮细胞中的半乳糖凝集素-3具有类似的免疫反应性。然而，被允许进行体外愈合的角膜的前基质中缺乏表达半乳糖凝集素-3的细胞，这表明，被允许进行体内愈合的角膜基质中的半乳糖凝集素-3阳性细胞最可能是白细胞而不是角膜细胞。
为了确定半乳糖凝集素-3的糖识别区域是否在受伤的角膜上皮细胞的片层迁移中发挥作用，在二糖β-乳糖和蔗糖存在以及不存在的情况下，将带有2毫米受激准分子激光切口和磨损伤口的角膜进行器官培养愈合。其中，β-乳糖中包含半乳糖，能够结合半乳糖凝集素，而蔗糖中缺乏半乳糖，不能结合半乳糖凝集素。在这些试验中，当β-乳糖存在时，角膜伤口的再上皮化速率明显减慢，而蔗糖的存在与否则不产生影响。如附图10中所示，愈合速率以平方毫米/小时来表示，在各个不同组中的结果是(至少两个试验的±SEM平均值)：仅用介质组，0.088±0.003(N＝29)；介质中加入β-乳糖组，0.063±0.003(N＝19)；介质中加入蔗糖组：0.084±0.004(N＝10)。
实施例2-野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠的角膜上 皮伤口的闭合
为了确定在半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中的角膜伤口的再上皮化是否被削弱，使用四种不同的角膜伤口愈合模型进行试验。通过目标性阻断半乳糖凝集素-3基因来获得半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠(gal-3-/-)，其方法如Hsu等人于2000年在《Am.J.Pathol》156：1073发表的文章中所述。特别的，使用抗新霉素基因阻断编码糖识别区域的基因区域。这包括使用一种抗抗生素基因来取代一种0.5kb的基因区内4-基因区外-5(intron4-exon5)的片断。使用Southern印迹法以及Western印迹法来证实所述半乳糖凝集素-3基因已经被灭活。
主要的，带有受激准分子激光切口的角膜(如实施例1中所述)或者带有碱烧伤伤口的角膜被允许在体内或者体外进行部分愈合(如实施例1中所述)。为了造成碱性伤害，使用环锯(trephine)制作一种2毫米的过滤板(Whatman50，Whatman国际，梅德斯通，英国)，将其浸泡于0.5N的NaOH中，然后将其至于第二组小鼠的右眼的角膜表面处，放置时间30秒。然后使用过量的PBS漂洗眼睛。在愈合阶段的最后，使用亚甲基蓝进行染色，使伤口区域显现。然后在标准距离处对染色伤口进行拍照，根据染色伤口映出的图形将伤口区域的轮廓描绘在。使用SIGMASCANTM软件(SPSS芝加哥科学，IL)对这些轮廓进行数字化和量化分析。对于不同的伤口愈合型gal-3+/+小鼠模型的伤口闭合速率的分析表明：在gal-3+/+小鼠模型中，以平方毫米/小时表示伤口闭合速率，由受激准分子激光切除术损伤的角膜中的伤口闭合速率慢于由碱烧伤损伤的角膜中的伤口闭合速率。同样的，不管造成损伤的方法如何，在体内进行愈合的角膜的伤口闭合速率要快于在器官培养中进行愈合的角膜的伤口闭合速率。如附图11中所示，gal-3+/+小鼠模型中的伤口闭合速率为：受激准分子激光切除术损伤/体内愈合组：0.076±0.003平方毫米/小时，受激准分子激光切除术损伤/体外愈合组：0.050±0.003平方毫米/小时，碱烧伤损伤/体内愈合组：0.182±0.003平方毫米/小时，碱烧伤损伤/体外愈合组：0.106±0.005平方毫米/小时。其中每个组的结果都代表了至少两次试验的±SEM平均值(每组中N＝9或者更多)。gal-3+/+小鼠模型组与gal-3-/-小鼠模型组的比较表明：不论角膜是由受激准分子激光切除术带来损伤，还是由碱处理带来损伤，也不论角膜被允许在体内愈合还是在体外愈合，以平方毫米/小时表示的伤口闭合速率在gal-3-/-小鼠模型组中明显的慢于gal-3+/+小鼠模型组。在不同的gal-3-/-小鼠模型组中的伤口闭合速率为：受激准分子激光切除术损伤/体内愈合组：0.060±0.004平方毫米/小时，受激准分子激光切除术损伤/体外愈合组：0.036±0.005平方毫米/小时，碱烧伤损伤/体内愈合组：0.150±0.008平方毫米/小时，碱烧伤损伤/体外愈合组：0.081±0.004平方毫米/小时。同样的，其中每个组的结果都代表了至少两次试验的±SEM平均值(每组中N＝8或者更多)。
实施例3-半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中受伤的迁移性角膜上 皮细胞的基因表达类型
为了尝试理解在gal-3-/-小鼠模型中角膜上皮细胞伤口的再上皮化受干扰的原因，使用cDNA微阵列技术比较了愈合型gal-3+/+小鼠模型与gal-3-/-小鼠模型的角膜中的基因表达类型，得到的结果进一步通过半定量化RT-PCR来证实。
利用实施例1中描述的方法，在30个gal-3+/+小鼠模型和30个gal-3-/-小鼠模型的右眼进行透上皮性受激准分子激光切口(直径2毫米)。允许角膜在体内进行20到24小时的部分愈合。在愈合阶段的最后，将动物致死并分离角膜，分离后将角膜立即放入液态氮中，送至Clontech实验室，Palo Alto，加拿大，在该实验室中利用SMARTTM cDNA技术分析基因表达类型。主要的，使用由ATLASTM纯化全部RNA标记体系(Pure Total RNALabeling System)提供的试剂分离出全部RNA。从30个gal-3+/+小鼠角膜和30个gal-3-/-小鼠角膜中分离得到的RNA的量分别为3.5微克和2.6微克。gal-3+/+小鼠角膜和gal-3-/-小鼠角膜的RNA制备的A260：A280比率分别为1.48和1.37。两组制备方法中核糖体RNA28S：18S的比率都为1.8。这确保了提取(制备)出的RNA的质量是令人满意的。为了制备探针，先使用175纳克的RNA、一种经过修饰的oligo(dT)前体(CDS前体)、POWERSCRIPTTM逆转录酶、以及SMARTTM II寡核苷酸来合成单链cDNA。对照组的制备包括样品的培养，其中不使用逆转录酶。使用长距离(LD)-PCR进行cDNA的扩增反应。为了确定扩增反应循环的最适宜次数，分别在第15周期、第18周期、第21周期和第24周期收集等量的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。在适宜的扩增周期例如第23周期时产生的扩增双链cDNA的量在1到1.6微克之间。根据用于ATLASTM微阵列的SMARTTMcDNA探针合成技术(Clontech)的操作手册中描述的方法，使用Klenow酶以及33P-αATP对扩增的cDNA(500纳克)进行放射性同位素标记。将被标记的探针通过NUCLEOSPINTM过滤装置进行过滤纯化，然后与小鼠1.2k-IATLASTM尼龙cDNA微阵列(Clontech)进行杂交。这是一种宽的光谱排列，由大约1200个小鼠基因构成。进行杂交之后，将膜暴露于扫描测定仪中，然后使用ATLASIMAGETM2.0软件(Clontech)进行分析。通过半定量化RT-PCR对得到的数据进行校验。
为进行RT-PCR，先使用前面描述的步骤从愈合型gal-3+/+小鼠和gal-3-/-小鼠的角膜中提取全部的RNA和单链cDNA。PCR扩增反应在50微升容积的容器内进行，使用14纳克的cDNA，从Clontech公司购买获得的常用的基因特异性前体，以及从ADVANTAGETM2型PCR试剂盒(Clontech)中得到的其他试剂。使用的退火温度为68℃，反应过程取决于PCR扩增反应进行的循环次数。为了对管家基因进行分析，在每隔5个循环周期时收集5微升等量的扩增产物，从第18循环周期开始收集，然而，为了对不同的基因表达反应进行分析，在每隔一种循环周期时收集扩增产物，从第28循环周期开始收集。使用1.5％琼脂糖/ethedium溴化物凝胶电泳方法分析在不同循环周期收集的扩增产物(附图12)。
这些试验表明：与gal-3+/+小鼠的愈合型角膜相比，gal-3-/-小鼠的愈合型角膜中的半乳糖凝集素-7、其他半乳糖苷结合型蛋白、以及tolloid-like蛋白(TLL)、金属蛋白酶的mRNA转录水平被显著的降低。总之，与gal-3+/+小鼠的愈合型角膜相比，gal-3-/-小鼠的愈合型角膜中的半乳糖凝集素-7的基因转录减少12倍(附图12)，TLL的基因转录减少14倍(数据未显示)。通过使用微阵列技术(附图12)和半定量化RT-PCR技术(附图12，其中GAPDH代表D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶；RPS29代表核糖体蛋白S29；ODC代表鸟氨酸脱羧酶)进行探测，发现在gal-3+/+小鼠的愈合型角膜和gal-3-/-小鼠的愈合型角膜中，各种管家基因的mRNA转录表达水平相似。
为了确定在gal-3-/-小鼠的愈合型角膜中的半乳糖凝集素-7蛋白的表达水平是否同样下降，使用去垢剂取出gal-3+/+小鼠的愈合型角膜和gal-3-/-小鼠的愈合型角膜进行Western印迹分析(附图13A)，并使用gal-3+/+小鼠的愈合型角膜和gal-3-/-小鼠的愈合型角膜的石蜡切片对抗半乳糖凝集素-7多克隆抗体进行免疫组织化学研究(附图13B)。将分析出的免疫反应性分为强(+++)、中(++)、弱(+)、或者阴性(不反应)(-)几个等级。与gal-3+/+小鼠的愈合型角膜相比，在gal-3-/-小鼠的愈合型的迁移性角膜上皮细胞中检测到显著降低的半乳糖凝集素-7免疫反应性。其结果表现为：gal-3+/+小鼠：+++36/42，++5/42，+或者更少1/42；gal-3-/-小鼠：+++3/42，++26/42，+或者更少13/42。同样的，在细胞培养基中生长的gal-3-/-小鼠胚胎纤维原细胞(MEF)与在细胞培养基中生长的gal-3+/+小鼠胚胎纤维原细胞相比，前者表达降低水平的半乳糖凝集素-7(附图13C)。
实施例4-在野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中，外 源性半乳糖凝集素-3对小鼠角膜伤口的再上皮化的刺激
我们已经证明，在gal-3-/-小鼠模型中，其角膜上皮细胞的伤口闭合速率受到干扰(见实施例2)，现在希望确定是否外源性半乳糖凝集素-3也能够对在器官培养中进行愈合的角膜的再上皮化产生刺激作用。在这项研究中，将带有碱烧伤伤口的gal-3+/+小鼠角膜和gal-3-/-小鼠角膜放在不含血清的培养液中进行诱导培养，该过程在不同剂量的重组半乳糖凝集素-3存在和不存在的情况下进行。
重组型的全长人类半乳糖凝集素-3是在大肠埃希氏菌中制备的，并且采用先前描述的方法进行纯化(参见Yang等人于1998年在《生物化学》37：4086中发表的文章)。根据实施例2中描述的方法，使用碱浸泡过的过滤板在经过麻醉的小鼠的双眼上制造碱烧伤伤口(直径2毫米)。在受伤之后，将动物模型致死并分离得到眼球，在外源性半乳糖凝集素-3存在或者不存在的情况下对眼球进行18到20小时的诱导培养。把动物模型的左眼作为对照组，仅使用不含血清的介质对其进行诱导培养。将动物右眼在不含血清的介质中进行诱导培养，所述介质中还包含下述的各种待测试剂：(i)半乳糖凝集素-3(5到20微克/毫升)，(ii)半乳糖凝集素-3(10微克/毫升)，并加入0.1M的β-乳糖，(iii)半乳糖凝集素-3(10微克/毫升)，并加入0.1M的蔗糖，(iv)0.1M的β-乳糖，或者(v)0.1M的蔗糖。在愈合阶段的最后，剩余的未愈合伤口区域被染色、拍照、并且使用SIGMASCANTM软件(SPSS芝加哥科学，IL)进行量化分析，采用实施例2所述的方法进行。其中每个组都包含三只眼球的最小值，并且所有试验都进行了至少两次。
在gal-3-/-小鼠模型中，外源性半乳糖凝集素-3对角膜伤口的再上皮化速率不产生任何影响(附图14A)，但是在gal-3+ /+小鼠模型中，浓度为10微克/毫升和20微克/毫升的外源性半乳糖凝集素-3通过浓度依赖的方式刺激角膜伤口的闭合速率(附图14B)(浓度为0和5微克/毫升时：0.090±0.010平方毫米/小时；浓度为10微克/毫升时：0.129±0.010平方毫米/小时；浓度为20微克/毫升时：0.154±0.004平方毫米/小时；所有数值都是取至少两次试验的±SEM平均值，N＝7或者更多)。如附图15中所示，在gal-3+/+小鼠模型中，半乳糖凝集素-3对于角膜上皮细胞伤口的闭合速率的刺激效应被β-乳糖特异性的抑制，而不被蔗糖所抑制(10微克/毫升半乳糖凝集素-3：0.127±0.010平方毫米/毫升；10微克/毫升半乳糖凝集素-3加上0.1Mβ-乳糖：0.103±0.014平方毫米/毫升；10微克/毫升半乳糖凝集素-3加上0.1M蔗糖：0.130±0.003平方毫米/毫升。所有数值都是取至少两次试验的±SEM平均值，N＝7或者更多)。
实施例5-在野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中，外 源性半乳糖凝集素-7对小鼠角膜伤口的再上皮化的刺激
在一种单独的研究中，使用cDNA微阵列技术(例如在实施例3中使用到的)对正常小鼠角膜和gal-3+/+小鼠的愈合角膜的基因表达类型进行比较，发现：在愈合角膜中，半乳糖凝集素-7的表达被显著的增量调节。这个发现与实施例3中描述的研究结果一同表明：在gal-3-/-小鼠的愈合角膜中，半乳糖凝集素-7的表达被负调节(减量调节)，因而需要设计一类试验以确定外源性半乳糖凝集素-7是否会对在器官培养中愈合的角膜的再上皮化产生刺激作用。在这项研究中，将带有碱性烧伤伤口的gal-3-/-小鼠角膜在不含血清的培养液中进行诱导培养，这种培养是在不同剂量的重组半乳糖凝集素-7存在以及不存在的情况下进行的。
重组型的全长人类半乳糖凝集素-7是在大肠埃希氏菌中制备的，通过将cDNA(以EST克隆的形式从美国典型培养保藏中心获得，马纳萨斯，梵蒂冈)克隆到pET25b质粒(从Novagen公司购买获得，麦迪逊，WI)中的方法。根据实施例2中描述的方法，使用碱浸泡过的过滤板在经过麻醉的小鼠的双眼上制造碱烧伤伤口(直径2毫米)。在受伤之后，将动物模型致死并分离得到眼球，在外源性半乳糖凝集素-7存在或者不存在的情况下对眼球进行18到20小时的诱导培养。把动物模型的左眼作为对照组，仅使用不含血清的介质对其进行诱导培养。将动物右眼在不含血清的介质中进行诱导培养，所述介质中还包含下述的各种待测试剂：(i)半乳糖凝集素-7(20微克/毫升)，(ii)半乳糖凝集素-7(20微克/毫升)，并加入0.1M的β-乳糖，或者(iii)半乳糖凝集素-7(20微克/毫升)，并加入0.1M的蔗糖。在愈合阶段的最后，剩余的未愈合伤口区域被染色、拍照、并且使用SIGMASCANTM软件(SPSS芝加哥科学，IL)进行量化分析，采用实施例2所述的方法进行。其中每个组都包含六只眼球的最小值，并且所有试验都进行了至少两次。
如附图16中所示，外源性半乳糖凝集素-7刺激伤口闭合速率(仅使用介质：0.036±0.006平方毫米/小时；20微克/毫升半乳糖凝集素-7：0.072±0.004平方毫米/小时；所有数值都是取至少两次试验的±SEM平均值，N＝10或者更多)。如附图16中所示，半乳糖凝集素-7对于角膜上皮细胞伤口的闭合速率的刺激效应被β-乳糖特异性的抑制，而不被蔗糖所抑制(20微克/毫升半乳糖凝集素-7：0.072±0.004平方毫米/小时；20微克/毫升半乳糖凝集素-7加上0.1Mβ-乳糖：0.050±0.004平方毫米/小时；20微克/毫升半乳糖凝集素-7加上0.1M蔗糖：0.079±0.007平方毫米/小时。所有数值都是取至少两次试验的±SEM平均值，N＝9或者更多)。如附图16中所示，当将外源性半乳糖凝集素-7加入到gal-3+/+小鼠的受伤角膜而不是gal-3-/-小鼠的受伤角膜中时，角膜伤口的闭合速率被进一步提高了(0.094±0.003gal-3+/+平方毫米/小时)。
实施例6-在野生型小鼠和半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠中，皮 肤上皮细胞伤口的闭合
通过腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对gal-3+/+小鼠和gal-3-/-小鼠进行麻醉。在进行激光处理之前，使用刀片将小鼠背部区域的毛剃掉。使用受激准分子激光器(Summit Technology of Waltham，MA)在小鼠背部制造长6毫米的透上皮性皮肤伤口。手术之后，向伤口表面施用抗生素药膏，并且在皮下注射丁丙诺啡(2毫克/千克体重)以减轻术后的疼痛。伤口被允许在体内进行部分愈合，并且在手术后24小时、48小时和72小时时进行检查。在愈合阶段的最后，再次使用腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对小鼠进行麻醉，并且使用Sigma扫描软件对伤口区域进行拍照和量化分析。对比两组小鼠模型(例如，gal-3+/+小鼠和gal-3-/-小鼠)的伤口闭合速率。然后，通过使小鼠吸入二氧化碳或者给予过量剂量的戊巴比妥将动物致死。
实施例7-外源性半乳糖凝集素-3对皮肤伤口再上皮化的影响
通过腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对动物模型(小鼠：57BL/6以及129种混合的遗传背景；年龄：6周到8周大；性别：混合)进行麻醉。在进行激光处理之前，使用刀片将小鼠背部区域的毛剃掉。使用受激准分子激光器(SummitTechnology of Waltham，MA)在小鼠背部制造两个长6毫米的透上皮性皮肤伤口(每侧一种伤口)。手术之后，向伤口表面施用抗生素药膏，并且在皮下注射丁丙诺啡(2毫克/千克体重)以减轻术后的疼痛。伤口被允许在体内进行部分愈合。每隔4到6个小时，向右侧伤口上施用含有半乳糖凝集素-3的药膏，向左侧伤口上仅仅施用载体作为对照组。在愈合阶段的最后(24到48小时)，再次使用腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对小鼠进行麻醉，并且使用Sigma扫描软件对伤口区域进行拍照和量化分析。对比两组小鼠模型(例如，经过半乳糖凝集素-3处理的小鼠以及对照组小鼠)的伤口闭合速率。然后，通过使小鼠吸入二氧化碳或者给予过量剂量的戊巴比妥将动物致死。
实施例8-外源性半乳糖凝集素-7对皮肤伤口再上皮化的影响
通过腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对动物模型(小鼠：57BL/6以及129种混合的遗传背景；年龄：6周到8周大；性别：混合)进行麻醉。在进行激光处理之前，使用刀片将小鼠背部区域的毛剃掉。使用受激准分子激光器(SummitTechnology of Waltham，MA)在小鼠背部制造两个长6毫米的透上皮性皮肤伤口(每侧一种伤口)。手术之后，向伤口表面施用抗生素药膏，并且在皮下注射丁丙诺啡(2毫克/千克体重)以减轻术后的疼痛。伤口被允许在体内进行部分愈合。每隔4到6个小时，向右侧伤口上施用含有半乳糖凝集素-7的药膏，向左侧伤口上仅仅施用载体作为对照组。在愈合阶段的最后(24到48小时)，再次使用腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对小鼠进行麻醉，并且使用Sigma扫描软件对伤口区域进行拍照和量化分析。对比两组小鼠模型(例如，经过半乳糖凝集素-7处理的小鼠以及对照组小鼠)的伤口闭合速率。然后，通过使小鼠吸入二氧化碳或者给予过量剂量的戊巴比妥将动物致死。
实施例9-外源性半乳糖凝集素-8或者半乳糖凝集素-1对白 化病变种型兔的干眼症的影响
通过腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对动物模型(兔：白化病变种型；年龄：6周到8周大；性别：混合)进行麻醉。通过每天重复进行1.0％阿托品硫酸盐输液的方法使每个小兔模型都患上干眼症(参见Burgalassi，S等人于1997年在《眼科学研究》31：229-235中发表的文章)。通过泪液分泌试验以及在荧光染色后对角膜的检查结果来评估每个动物模型患有的干眼综合症。
每隔4到6个小时，向每个动物模型的右眼施用含有半乳糖凝集素-8溶液的滴眼液，而对其左眼仅仅施用载体溶液，作为对照组。在愈合阶段的最后(24到48小时)，再次使用腹膜内注射1.25％阿佛丁(0.2毫升/10克体重)对动物模型进行麻醉，并且使用Sigma扫描软件对眼部区域进行拍照和量化分析。评估两组眼球(经过半乳糖凝集素-8处理的右眼，以及作为对照组的左眼)的眼球表面以及干眼症的症状，并且对两组眼球表面进行比较。然后，通过使小鼠吸入二氧化碳或者给予过量剂量的戊巴比妥将动物致死，并且通过标准化毒物学标准对其进行分析。
人类和其他脊椎动物体内的各种半乳糖凝集素-8蛋白的氨基酸序列(附图18以及序列4和序列5)在本质上是等同的(附图20)，尤其是那些其他哺乳动物种类。类似的，人类和其他哺乳动物体内的各种半乳糖凝集素-1蛋白的氨基酸序列(附图19以及序列6)也是在基本上同源的。保守变化和非保守(lessconservation)变化发生的位点表明：这些位点上的残基可以发生变化，以获得其他功能性半乳糖凝集素-8蛋白和/或半乳糖凝集素-1蛋白，其中这些蛋白能够治愈干眼综合症以及其他眼部适应症。
实施例10-天仙子碱动物模型：使用半乳糖凝集素治疗干眼综合 症(DES)，以及在进行天仙子碱处理之前，使用半乳糖凝集素 溶液进行预处理所产生的作用
根据下面的治疗方案所描述的方法施用人工泪液溶液，其中每毫升溶液中含有0微克、10微克或者20微克半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的一种或者两种。在每个时间点对每个动物模型的一只眼睛进行处理，每次使用10微升滴剂。在一组施用过天仙子碱片剂的动物模型中，以每天4次的频率在一只眼睛上施用10微克/毫升半乳糖凝集素溶液，在施用天仙子碱片剂之后立即开始施用半乳糖凝集素溶液。向接受半乳糖凝集素处理的动物模型组的小鼠施以每种浓度的半乳糖凝集素溶液。将所述的处理过的动物模型组和处理过的眼睛打乱顺序任意排列，然后再将其编码，以保证测量是在完全随机的情况下进行的。每种动物模型的一只眼睛接受一种处理溶液，另一只眼睛接受对照滴眼液处理。在每个时间点在两边进行分别测量。
实施例11-天仙子碱(ScoDalomine)动物模型：施用半乳糖凝 集素-3和β-乳糖——一种半乳糖凝集素抑制剂的组合治疗
重复进行与实施例1相同的步骤，其中使用添加了0.1Mβ-乳糖的10微克/毫升半乳糖凝集素溶液，以确定半乳糖凝集素的作用是否能够被竞争性二糖所抑制。
对天仙子碱动物模型的治疗方案
第一天-基线测量(baseline measurements)(泪液，泪膜破裂时间，荧光素染色)
施用天仙子碱
第二天-在施用天仙子碱24小时候进行预处理测量(第二天，0时间点)
在测量之后的0小时、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
在1-2小时、4-5小时、8-9小时的时候将动物暴露于吹气面罩
第三天-在0时间点施用新的天仙子碱片剂
在0时间点、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
在前次处理之后的2小时后进行测量(第三天，时间2小时)
在1-2小时、4-5小时、8-9小时的时候将动物暴露于吹气面罩
第四天-测量(第四天，0时间点)
在0时间点、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
在1-2小时、4-5小时、8-9小时的时候将动物暴露于吹气面罩
第五天-在0时间点施用新的天仙子碱片剂
在0时间点、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
在1-2小时、4-5小时、8-9小时的时候将动物暴露于吹气面罩
第六天-测量(第六天，0时间点)
实施例12-在自体免疫型MRL/1pr小鼠模型中，半乳糖凝集素- 1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8在 干眼综合症中所起的作用
将经过处理的动物模型组和经过处理的眼睛打乱顺序任意排列，然后再将其编码，以保证测量是在完全随机的情况下进行的。每种动物模型的一只眼睛接受一种处理溶液，另一只眼睛接受对照滴眼液处理。在每个时间点在两边进行分别测量。
治疗方案
第一天-基线测量(baseline measurements)(泪液，泪膜破裂时间，荧光素染色)
在0时间点、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
第二天-在0时间点、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
在前次处理之后的2小时后进行测量(第二天，时间2小时)
第三天-测量(第三天，0时间点)
在测量之后的0小时、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
第四天-在0小时、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
在前次处理之后的2小时后进行测量(第四天，时间2小时)
第五天-在0小时、4小时、8小时和12小时的时候施用半乳糖凝集素或者对照滴眼液
第六天-测量(第六天，0时间点)
实施例13-半乳糖凝集素-3对患有干眼综合症的生物体的 修复
为了确定半乳糖凝集素在治疗干眼综合症中所起的作用，需要借助一组使用白细胞介素-1处理的动物模型体系，使用四组小鼠模型，每组5只，按照如下方法对小鼠进行处理。在其中三组中，依照处理患有干燥综合症的小鼠模型的标准方法(参见Zoukhri，D等人在《Invest Ophthalmol Vis Sci》42(5)：925-932中发表的文章)，在第0天给小鼠注射白细胞介素-1(IL-1)。然后，从第一天开始，以每天四次的频率向注射过白细胞介素-1的小鼠再施用75微克/毫升或者150微克/毫升的滴眼液，所述滴眼液中含有半乳糖凝集素-3。另外一组小鼠模型以相似的方式仅使用缓冲液进行处理，每天处理4次(不含半乳糖凝集素)。按照前面描述的方法(参见Zoukhri等人发表的文章)使用荧光清除法对每个小鼠的干眼症的程度进行评估。
附图21表示出：早在治疗的第一天，与对照组小鼠相比，在使用了每次75微克/毫升或者每次150微克/毫升半乳糖凝集素-3处理过的小鼠中，由荧光清除法测量到其泪液分泌是增强的，并且在第二天，经过半乳糖凝集素-3处理的小鼠的干眼症状被全部治愈。事实上，在使用低剂量(75微克/毫升)半乳糖凝集素处理的情况中，在第二天已经观察到泪液分泌有些改善，最适宜的用药剂量甚至可以低于这个数值。在附图21中，表示半乳糖凝集素处理过的模型组第二天的数值的柱形图上方的星号的含义是：与患有干眼症并且仅仅使用缓冲溶媒处理的对照模型组中测得的数值相比，前者的数值具有统计显著性，其值p<0.05。总之，在使用半乳糖凝集素-3处理一天到两天后，半乳糖凝集素-3能够治疗干眼症并且治愈其症状。我们已知，在哺乳动物体内含有的半乳糖凝集素具有相当高程度的同一性，并且已知在半乳糖凝集素蛋白家族的不同成员中存在功能性氨基酸序列和特异性氨基酸序列的保守同一性，因此可以预期，半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的任何一种，或者这些半乳糖凝集素的混合物，它们在治愈干眼症和其他相关综合症中都具有相似的有效作用。
结论
本发明证明了半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7在角膜伤口的再上皮化过程中起到一定作用。实施例1的免疫组织化学研究表明：在角膜受到损伤之后，半乳糖凝集素-3以高密度的形式聚集在角膜上皮细胞的细胞与基质的连接处位点上，这是一种能够影响细胞与基质间的相互反应及由此产生的细胞迁移的理想位点。在实施例2中，与野生型小鼠相比，半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠的角膜伤口的再上皮化过程表现出明显的缓慢。实施例3表明：在角膜受到损伤之后，与野生型小鼠相比，半乳糖凝集素-3缺陷型小鼠的半乳糖凝集素-7表达水平明显降低。在实施例4和实施例5中，外源性重组半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7表现出能够刺激gal-3+/+小鼠的角膜伤口的再上皮化。实施例6-8提供了用以测定半乳糖凝集素对伤口再上皮化的作用的方法。实施例9-12提供了用以测定半乳糖凝集素对干眼综合症的治疗效果的方法。实施例13表示出半乳糖凝集素对干眼症产生的快速有效的修复作用。实施例1还进一步证明了半乳糖凝集素-3对于角膜上皮细胞伤口闭合速率的刺激性作用会被包含相关半乳糖苷化学结构的竞争性二糖(β-乳糖)所抑制，但是不会被不相关的化学结构不相干的二糖(蔗糖)所影响。这个结果表明，外源性半乳糖凝集素对角膜的有益作用直接由糖类识别结构域(CRD)所产生。
不需要结合任何的特殊理论，关于半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8能够促进干眼综合症的修复这一机制，本发明给出了下述答复。
正如前面所提到的，半乳糖凝集素-3被认为是通过与互补的糖结合物的结合来介导细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用的，所述的互补的糖结合物中含有存在于许多细胞外基质和细胞表皮分子中的聚乳糖胺链，例如某些纤维连接蛋白亚型、层粘连蛋白亚型、以及整合蛋白亚型(参见Liu于2000年在《免疫学临床》97：79中发表的文章；以及Perillo于《Supra》中发表的文章)。然而，本发明中发现外源性半乳糖凝集素-3不会加速gal-3-/-小鼠的伤口的再上皮化(参见实施例4)，这表明：细胞内半乳糖凝集素-3对于伤口愈合的过程具有显著的贡献，最优选的，通过影响特异性细胞表面受体和/或细胞外基质受体的表达，来依次影响细胞与基质间的相互作用和细胞迁移。这一观点与某些公开的论文相一致，这些论文中记载，与不表达半乳糖凝集素-3或者表达少量半乳糖凝集素-3的亲本细胞系相比，半乳糖凝集素-3在乳腺癌细胞系中的稳定过表达导致了α4β7整合蛋白和α6β1整合蛋白水平的提升，并且加强了其与包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白和玻连蛋白在内的各种细胞外基质分子的黏附(参见Wwarfield在《supra》中发表的文章“supra andMattarese”)。在另外一篇论文中(Dudas等人于2000年在《胃肠病学》118：1553中发表的文章)，经过半乳糖凝集素-3转染的结肠癌肿瘤细胞系表达了升高水平的特异性黏蛋白——MUC2，这是外源性凝集素自身的主要配体(参见Bresalier等人于1996年在《肿瘤研究》56：4353中发表的文章)。外源性半乳糖凝集素-3对于gal-3+/+小鼠的伤口的再上皮化的刺激性作用能够被乳糖所抑制，这一事实提出了一种令人感兴趣的可能性，即细胞内半乳糖凝集素-3可能的确调节了某些蛋白的糖基化，所述蛋白是外源性凝集素自身的细胞表面受体或者细胞外基质受体。由于在某些情况下，发现外源性凝集素在核内与核糖核蛋白复合物联接在一起，并且能够作为前体-mRNA剪接因子(参见Dagher等人于1995年在《Proc.Natl.Acad.Sci》美国92：1213中发表的文章)，因此，有人提出细胞内半乳糖凝集素-3具有在核基质上产生作用的潜能，以影响复杂的生物反应过程。同样的，Wang等人已经证明，在前列腺癌细胞中，半乳糖凝集素-3与核基质联接在一起，并且与双链DNA和RNA相结合(参见Wang等人于1995年在《生物化学、生物物理学研究交流》217：292中发表的文章)。
使用小鼠cDNA微阵列技术对愈合型gal-3+/+小鼠角膜和gal-3-/-小鼠角膜的基因表达类型进行的分析表明，与野生型小鼠相比，gal-3-/-小鼠的愈合型角膜表达了显著降低水平的半乳糖凝集素-7(参见实施例3和实施例5)。半乳糖凝集素-7首次被报道于1994年(参见Barondes于《supra》中发表的文章)，它的特征被分析的并不像半乳糖凝集素-3那样清楚。不同于半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7表现出显著程度的组织特异性。在成年动物中，半乳糖凝集素-7的表达受到上皮细胞的限制，形成或者必定会形成分层的状态(参见Timmons等人于《supra》中发表的文章)。半乳糖凝集素-7蛋白被认为是在细胞与基质、细胞与细胞间的相互反应以及细胞凋亡中起作用(参见Leonidas于1998年在《生物化学》37：13930；以及Bernerd等人于1999年在《Proc.Natl.Acad.Sci.》美国96：11329中发表的文章)。通常，在半乳糖凝集素-7的表达和角质细胞增殖过程中存在一种逆向相关(inverse correlation)，且在经过SV40转化的角质细胞和上皮细胞肿瘤细胞系中，半乳糖凝集素-7的表达被抑制。本发明中发现外源性半乳糖凝集素-3不会对gal-3-/-小鼠的角膜伤口的再上皮化产生刺激作用，并且gal-3-/-小鼠的愈合型角膜中包含了降低水平的半乳糖凝集素-7，这一发现表明：半乳糖凝集素-3可以通过调节半乳糖凝集素-7来产生对伤口再上皮化的影响，至少部分通过调节半乳糖凝集素-7来产生对伤口再上皮化的影响。的确，研究发现，不同于半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7以乳糖抑制性的方式加速gal-3-/-小鼠的角膜伤口的再上皮化。同样的，gal-3-/-小鼠的胚胎纤维原细胞表达降低水平的半乳糖凝集素-7。
不管这些反应中包含怎样的反应机制，关于半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7能够刺激角膜伤口的再上皮化这一发现为上皮细胞伤口的治疗方案提供了一种明显的提示，尤其是对于非愈合型上皮细胞伤口来说。目前，对于永久性角膜上皮缺陷的治疗仍然是一种主要的临床难题。而且，进一步的需要能够有效治疗术后移植性损伤、老年人患有的慢性损伤、褥疮溃疡以及皮肤静脉瘀血溃疡的方法。许多已知的生长因子(例如，表皮生长因子，转化细胞生长因子，成纤维细胞生长因子，角质细胞生长因子，肝细胞生长因子)能够刺激细胞增殖，在角膜内以及在皮肤上皮细胞伤口的愈合过程中对其进行有效性测试，所有生长因子取得的结果均是令人失望的(参见Eaglstein于1997年在《北美外科临床》77：689中发表的文章；Singer和Clark于1999年在《N.Engl.J.Med.》341：738中发表的文章；Zieske和Gipson于2000年在“眼科学原理和实践”中第364：372页中发表的文章，该书由D.M.Albert和F.A.Jakobiec编辑，W.B，Saunders公司，费城，PA；Schultz等人于1994年在《眼睛》8：184中发表的文章；Kandarakis等人于1984年在《美国眼科学杂志》98：411中发表的文章；以及Singh和Foster于1987年在《美国眼科学杂志》103：802中发表的文章)。在这些论文当中，使用生长因子对伤口再上皮化的加速程度远不及本发明中描述的半乳糖凝集素对伤口再上皮化的加速程度。同样的，使用例如表皮生长因子之类的生长因子处理角膜上皮细胞会导致增生(参见Singh和Foster于1989年在《角膜》8：45中发表的文章)，这是一种明显不希望发生的情况。在这个方面，半乳糖凝集素-3和半乳糖凝集素-7的临床应用比生长因子更具吸引力，这是因为外源性凝集素没有表现出能够在上皮细胞中诱导细胞进行有丝分裂的性质。在过去的十年里，人们发现了受激准分子激光切削术能够修正角膜轮廓以矫正近视的能力。每个星期，成千上万次的受激准分子激光切削手术被用以帮助近视患者摆脱眼镜和隐形眼镜带来的困扰。考虑到世界范围内有25-30％的人群患有近视，可以估算，在一种计算年(given year)里，仅在美国就将进行将近五十万次这样的手术。在某些案例中，在受激准分子激光手术之后，上皮细胞的愈合将产生一种延迟。这种延迟是我们非常不希望看到的，因为它使角膜处于易患术后模糊、感染性角膜炎和溃疡的危险之中。再一次的，基于半乳糖凝集素的治疗方法可以帮助在这些案例中促进伤口的再上皮化。
其他实施方式
基于本发明在此公开的内容具有的详述性和具体操作性，本领域技术人员很容易想到本发明的其他实施方式。这里记载的详述和实施例仅仅被看作是示范例，本发明的真实范围由后面的权利要求来表征。
序列表
<110>塔夫斯大学
<120>半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用
<130>34724-051
<140>PCT application
<141>April 13，2006
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>250
<212>PRT
<213>现代人
<400>1
Figure A200680009189D00841
Figure A200680009189D00851
<210>2
<211>136
<212>PRT
<213>现代人
<400>2
Figure A200680009189D00852
<210>3
<211>139
<212>PRT
<213>现代人
<400>3
Figure A200680009189D00853
Figure A200680009189D00861
<210>4
<211>317
<212>PRT
<213>现代人
<400>4
Figure A200680009189D00862
Figure A200680009189D00871
<210>5
<211>359
<212>PRT
<213>现代人
<400>5
Figure A200680009189D00872
Figure A200680009189D00881
<210>6
<211>135
<212>PRT
<213>现代人
<400>6
Figure A200680009189D00891

Claims (57)

1.一种治疗哺乳动物干眼症的方法，包括向所述哺乳动物施以治疗有效剂量的半乳糖凝集素蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中进一步包括在给药之前，先确定所述哺乳动物是需要预防干眼症的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中需要接受预防或者治疗的哺乳动物的特征是具有至少一种选自下述的状况：眼上皮缺损；预先使用了抗组胺剂；预先使用了消炎药；以及预先经过了受激准分子激光处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述的哺乳动物是人类。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素蛋白是选自半乳糖凝集素-1，半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述的干眼症是一种持续的综合症。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述的干眼症能够导致上皮磨损。
8.根据权利要求5所述的方法，其中所述的上皮磨损会产生角膜缺损。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括序列4或者序列5所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括一种与序列4或者序列5所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述的基本上同源是指与序列4或者序列5所示的氨基酸序列相比，具有至少60％的序列同一性，至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
12.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括一种半乳糖凝集素-8的N-末端结构域，一种半乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，以及一种半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域。
13.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括一种半乳糖凝集素-3的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，和一种半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域。
14.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-7蛋白包括一种半乳糖凝集素-7的N-末端结构域，一种半乳糖凝集素-7的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，以及一种半乳糖凝集素-7的半乳糖苷结合区域。
15.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括一种半乳糖凝集素-1的N-末端结构域，一种半乳糖凝集素-1的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，以及一种半乳糖凝集素-1的半乳糖苷结合区域。
16.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-7蛋白包括序列2所示的氨基酸序列。
17.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-7蛋白包括一种与序列2所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述的基本上同源是指与序列2所示的氨基酸序列相比，具有至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
19.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括序列1所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括一种与序列1所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的基本上同源是指与序列1所示的氨基酸序列相比，具有至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
22.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括一种半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域。
23.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1包括序列6所示的氨基酸序列。
24.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括一种与序列6所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述的基本上同源是指与序列6所示的氨基酸序列相比，具有至少60％的序列同一性，至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
26.根据权利要求5所述的方法，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括一种半乳糖凝集素-1的半乳糖苷结合区域。
27.一种对干眼症的治疗具有促进作用的药物组合物，所述组合物包括一种药物可接受载体或者稀释液，以及一定剂量的至少一种选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的半乳糖凝集素蛋白，所述半乳糖凝集素的剂量足够促进结膜上皮细胞和/或角膜上皮细胞的完整性。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的干眼症是具有周期性上皮腐蚀的干眼疾病。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述的干眼疾病造成的伤口属于角膜伤口。
30.根据权利要求28所述的药物组合物，其中所述的干眼症是由受激准分子激光切削术引起的。
31.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括序列4或者序列5所示的氨基酸序列。
32.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括与序列4或者序列5所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
33.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括一种半乳糖凝集素-8的N-末端结构域，和一种半乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域。
34.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括一种半乳糖凝集素-8的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，和一种半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域。
35.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-8蛋白包括一种半乳糖凝集素-8的半乳糖苷结合区域。
36.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述的基本上同源是指与序列4或者序列5所示的氨基酸序列相比，具有至少60％的序列同一性，至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
37.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-7蛋白包括序列2所示的氨基酸序列。
38.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-7蛋白包括与序列2所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
39.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-7蛋白包括一种半乳糖凝集素-7的半乳糖苷结合区域。
40.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述的基本上同源是指与序列2所示的氨基酸序列相比，具有至少60％的序列同一性，至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
41.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括序列1所示的氨基酸序列。
42.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括与序列1所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述的基本上同源是指与序列1所示的氨基酸序列相比，具有至少60％的序列同一性，至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
44.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括一种半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域。
45.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括一种半乳糖凝集素-3的N-末端结构域，和一种半乳糖凝集素-3的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域。
46.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-3蛋白包括一种半乳糖凝集素-3的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，和一种半乳糖凝集素-3的半乳糖苷结合区域。
47.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括序列6所示的氨基酸序列。
48.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括与序列6所示的氨基酸序列在基本上同源的氨基酸序列。
49.根据权利要求48所述的药物组合物，其中所述的基本上同源是指与序列6所示的氨基酸序列相比，具有至少60％的序列同一性，至少70％的序列同一性，至少80％的序列同一性，或者至少90％的序列同一性。
50.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括一种半乳糖凝集素-1的N-末端结构域，和一种半乳糖凝集素-1的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域。
51.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括一种半乳糖凝集素-1的富含脯氨酸、甘氨酸和酪氨酸的结构域，和一种半乳糖凝集素-1的半乳糖苷结合区域。
52.根据权利要求27所述的药物组合物，其中所述的半乳糖凝集素-1蛋白包括一种半乳糖凝集素-1的半乳糖苷结合区域。
53.一种治疗哺乳动物干眼疾病的方法，包括向该哺乳动物施以治疗有效剂量的能够影响泪膜在角膜表面或者结膜表面上的分布的物质。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述的物质是至少一种选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8的蛋白。
55.一种治疗哺乳动物干眼疾病的方法，包括向患有干眼症的哺乳动物施以治疗有效剂量的物质，所述物质能够影响半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的至少一种蛋白的表达。
56.一种用于治疗干眼症的试剂盒，其包括一种容器盒，溶于一种药物可接受载体或者稀释液中的选自半乳糖凝集素-1、半乳糖凝集素-3、半乳糖凝集素-7和半乳糖凝集素-8中的至少一种蛋白，以及使用说明书。
57.根据权利要求56所述的试剂盒，其中所述蛋白以单位剂量形式存在。
CN200680009189.4A 2005-04-13 2006-04-13 半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用 Expired - Fee Related CN101500589B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/104,677 US7189697B2 (en) 2004-04-13 2005-04-13 Compositions and uses of a galectin for treatment of dry eye syndrome
US11/104,677 2005-04-13
PCT/US2006/013785 WO2006113311A2 (en) 2005-04-13 2006-04-13 Compositions and uses of a galectin for treatment of dry eye syndrome

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101500589A true CN101500589A (zh) 2009-08-05
CN101500589B CN101500589B (zh) 2014-06-18

Family

ID=37115683

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200680009189.4A Expired - Fee Related CN101500589B (zh) 2005-04-13 2006-04-13 半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用

Country Status (9)

Country Link
US (1) US7189697B2 (zh)
EP (1) EP1874337B1 (zh)
JP (1) JP5146835B2 (zh)
KR (2) KR20140054347A (zh)
CN (1) CN101500589B (zh)
CA (1) CA2604583C (zh)
ES (1) ES2505643T3 (zh)
MX (1) MX2007012725A (zh)
WO (1) WO2006113311A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9206134B2 (en) 2011-07-22 2015-12-08 Beijing Betta Pharmaceuticals Co. Ltd. Polymorphic forms of compounds as prolyl hydroxylase inhibitor, and uses thereof
CN112601757A (zh) * 2018-06-07 2021-04-02 帕利昂制药有限公司 用于检测糖类和/或治疗siglec介导的障碍的多聚体蛋白

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6967021B2 (en) * 2001-04-27 2005-11-22 Trustees Of Tufts College Use of Galectin-3 to promote the re-epithelialization of wounds
US20070185014A1 (en) * 2006-02-09 2007-08-09 The Schepens Eye Research Institute, Inc. Methods and compositions for modulating conjunctival goblet cells
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
DK1994155T4 (da) 2006-02-13 2022-07-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Polynukleotid- og polypeptidsekvenser involveret i fremgangsmåden med knogleremodellering
WO2008036717A2 (en) * 2006-09-19 2008-03-27 Emory University Use of soluble galectin-3 (gal-3) for cancer treatment
GB0622694D0 (en) * 2006-11-14 2006-12-27 Serentis Ltd Use of opioid compounds in wound healing
US7963655B2 (en) 2007-05-04 2011-06-21 Abbott Medical Optics Inc. Methods and devices for measuring tear film and diagnosing tear disorders
CA2797347C (en) 2009-04-28 2016-11-01 Joseph W. Sassani Methods and compositions for treating dry eye
WO2010144874A2 (en) * 2009-06-12 2010-12-16 University Of Southern California Clusterin pharmaceuticals and treatment methods using the same
US9636355B2 (en) 2011-09-22 2017-05-02 Theo Holdings, Llc Hypertonic dextran solution and methods of treating and preventing recurrent corneal erosion
WO2013192157A1 (en) * 2012-06-18 2013-12-27 Duke University Non-human model for wound healing
ES2723885T3 (es) 2012-07-19 2019-09-03 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpos anti-Siglec-15
WO2016122169A1 (ko) * 2015-01-26 2016-08-04 주식회사 바이오코즈글로벌코리아 뉴레귤린을 포함하는 상처 또는 안구건조증의 치료용 약학 조성물
EP3429557A4 (en) * 2016-03-14 2020-02-26 Capricor, Inc. METHOD FOR TREATING EYE INFLAMMATION AND CHEMICAL INJURIES OF THE EYE WITH EXTRA-CELLULAR VESICLES
US10456447B2 (en) * 2016-10-05 2019-10-29 Consejo Nacional de Investigacions Cientificas y Técnicas Therapeutic modulation of skin immune system with Gal-7

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3058920B2 (ja) * 1996-04-19 2000-07-04 一男 坪田 アルブミンを有効成分とする医薬組成物
US5869289A (en) * 1996-10-09 1999-02-09 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human galectin homolog
AU9301998A (en) * 1997-09-05 1999-03-22 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The Composition and methods using galectin-1
WO2001068123A2 (en) * 2000-03-13 2001-09-20 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Monocyte chemoattractant activity of galectin-3
US6967021B2 (en) * 2001-04-27 2005-11-22 Trustees Of Tufts College Use of Galectin-3 to promote the re-epithelialization of wounds
US6770622B2 (en) * 2001-06-08 2004-08-03 Gary A. Jarvis N-terminally truncated galectin-3 for use in treating cancer
PL369960A1 (en) * 2001-10-11 2005-05-02 Alcon, Inc. Methods for treating dry eye by a combination of an antiinflammatory steroid and a muc-1 secretagogue

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9206134B2 (en) 2011-07-22 2015-12-08 Beijing Betta Pharmaceuticals Co. Ltd. Polymorphic forms of compounds as prolyl hydroxylase inhibitor, and uses thereof
CN112601757A (zh) * 2018-06-07 2021-04-02 帕利昂制药有限公司 用于检测糖类和/或治疗siglec介导的障碍的多聚体蛋白

Also Published As

Publication number Publication date
US7189697B2 (en) 2007-03-13
EP1874337A4 (en) 2010-07-14
EP1874337B1 (en) 2014-09-03
WO2006113311A3 (en) 2009-04-16
KR20140054347A (ko) 2014-05-08
KR101589742B1 (ko) 2016-01-28
WO2006113311A2 (en) 2006-10-26
JP2008536857A (ja) 2008-09-11
JP5146835B2 (ja) 2013-02-20
MX2007012725A (es) 2008-04-09
KR20070119030A (ko) 2007-12-18
CA2604583A1 (en) 2006-10-26
CA2604583C (en) 2015-06-02
CN101500589B (zh) 2014-06-18
US20060189514A1 (en) 2006-08-24
EP1874337A2 (en) 2008-01-09
ES2505643T3 (es) 2014-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101500589B (zh) 半乳糖凝集素组合物及其治疗干眼综合症的应用
RU2137449C1 (ru) Фармацевтическая композиция, изделие, содержащее ее, и способ коррекции дефектов преломления в глазу млекопитающего
EP2276496B1 (en) Therapeutic modulation of ocular surface lubrication
TW201615187A (zh) 用於舒緩及減輕近視之醫藥組合物及其製備方法與用途
EP2464375B1 (en) Prg4 treatment for interstitial cystitis
US20160361388A1 (en) Method and composition for the treatment of moderate to severe keratoconjunctivitis sicca
WO2007101354A1 (en) Methods of treating, reducing and inhibiting the appearance of ageing in the skin
JP2009535328A (ja) コンパートメント症候群の治療における使用のための抗分泌性タンパク質
Nelson et al. Topical fibronectin in the treatment of keratoconjunctivitis sicca
CN104640559B (zh) 含c‑肽的用于预防或治疗糖尿病性血管渗漏诱导的疾病的组合物
Boneva et al. Hyalocyte functions and immunology
US20100004163A1 (en) Composition and Uses of a Galectin for Treatment of Dry Eye Syndrome
CN108939055A (zh) 重组人ph20在制备治疗甲状腺相关眼病药物中的用途
CN105188731B (zh) 用于治疗眼部疾病的蛋白质slurp-1
JP2009542609A (ja) 薬剤
Hamdi The effect of topical parasympathomimetics on corneal epithelial healing in rabbits
Cai et al. Toxicology study of long-term administration of rhKGF-2 eye drops on rabbit corneas
RU2706703C1 (ru) Раствор увлажняющий офтальмологический
RU2347572C1 (ru) Способ локальной терапии аутоиммунного артрита
Fiore et al. YKL-40 and graft rejection
US7115408B1 (en) Method of stabilizing hyaluronidase with annexin II
AU2007222865B2 (en) Methods of treating, reducing and inhibiting the appearance of ageing in the skin
Eftimoska et al. Expression of Fibronectin and Tenascin after Direct Capping of the Pulp with Mineral Trioxide Aggregate and Biodentine®. Open-Access Maced J Med Sci. 2020 Apr 30; 8 (D): 64-69
TW201519902A (zh) 絲胺酸蛋白酶抑制蛋白：治療β細胞再生之方法及功能
Rich et al. Stimulation of corneal endothelial wound healing in cats by mesodermal growth factor

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140618

Termination date: 20190413

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee