CN112601757A - 用于检测糖类和/或治疗siglec介导的障碍的多聚体蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明总的来说涉及包含凝集素结构域的多肽、包含所述多肽的多聚体蛋白以及所述多肽或多聚体蛋白在糖类(例如含有唾液酸的糖类或Siglec配体)的检测或Siglec介导的障碍的治疗中的用途。

Description

用于检测糖类和/或治疗SIGLEC介导的障碍的多聚体蛋白
与相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月7日提交的美国临时专利申请号62/681,849和2018年11月2日提交的美国临时专利申请62/755,285的优先权和利益，每个所述临时申请整体通过参考并入本文。
技术领域
本发明总的来说涉及用于检测糖类例如Siglec配体的方法和组合物以及用于治疗Siglec介导的障碍的方法。
背景技术
Siglec(唾液酸结合性免疫球蛋白类型的凝集素)是结合唾液酸的细胞表面蛋白。Siglec包含凝集素家族的表面受体，其与唾液酸聚糖结合，并主要以细胞类型和分化依赖性方式表达在造血系统的细胞上。Siglec是I型跨膜蛋白，其中氨基端位于细胞外空间中，羧基端位于胞质溶胶中。每个Siglec含有N-端V-组免疫球蛋白样结构域(Ig结构域)，其充当唾液酸的结合受体。Siglec是凝集素，并且由于凝集素结构域是免疫球蛋白折叠，因此被分类在I型凝集素组中。所有Siglec都利用没有结合活性的居间的C2-组结构域从细胞表面延伸出来。Siglec的差异在于这些C2-组结构域的数目。由于这些蛋白含有Ig结构域，因此它们是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。
存在至少14种不同的哺乳动物Siglec，它们一起在细胞表面受体-配体相互作用的基础上提供了大量不同功能。这些受体-聚糖相互作用尤其可以介导细胞粘附和细胞信号传导。尽管唾液酸通常在糖蛋白和脂类的末端位置处遍在表达，但各个Siglec只识别非常特定的、独特的唾液酸聚糖结构，这取决于接近末端的糖类组成部分的身份和连键。
越来越多的证据支持聚糖和唾液酸聚糖特别是在肿瘤进展的各种病理生理学步骤中的作用。聚糖调控肿瘤增殖、侵袭、血性转移和血管生成(Fuster等，(2005)Nat.Rev.Cancer 5(7):526-42)。在癌症中，细胞表面糖缀合物的唾液酸化常常改变，导致作为该疾病的特定标志物的唾液酸化的肿瘤相关糖类抗原的表达。由于唾液酸化的聚糖参与许多生物学过程，它们被肿瘤细胞的表达通常与肿瘤的侵袭性和转移潜力的提高相关。
然而，Siglec配体的非均质性在开发特异性针对特定配体的检测试剂(例如抗体)中造成困难。此类检测试剂可用于许多目的，包括作为生物标志物策略的一部分在特定Siglec配体表达的基础上分类癌症类型。因此，在本领域中对改进的Siglec检测方法和试剂存在着需求。
发明内容
本发明部分是基于可用于在例如感兴趣的样品中检测Siglec配体和/或在需要的对象中治疗Siglec介导的障碍的重组多肽的发现。在某些实施方式中，重组多肽被缔合(非共价和/或共价地)，以产生用于检测Siglec配体和/或在需要的对象中治疗Siglec介导的障碍的多聚体蛋白。
一方面，本发明提供了一种分离的多肽，其包含凝集素结构域、三聚化结构域和二聚化结构域。在某些实施方式中，所述凝集素结构域、三聚化结构域和二聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。在某些实施方式中，所述凝集素结构域、二聚化结构域和三聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。例如，在某些实施方式中，所述多肽还包含连接物。在某些其他实施方式中，所述多肽还在所述凝集素结构域与三聚化结构域之间包含连接物，并且在某些其他实施方式中，所述多肽还在所述二聚化结构域与三聚化结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种分离的多肽，其包含第一凝集素结构域、第二凝集素结构域和二聚化结构域。在某些实施方式中，所述第一凝集素结构域和第二凝集素结构域是一致的。在某些实施方式中，所述第一凝集素结构域、第二凝集素结构域和二聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。在某些实施方式中，所述第一凝集素结构域、二聚化结构域和第二凝集素结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。
在上述方面的某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域或其变体。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec细胞外结构域或其变体。所述Siglec唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域或细胞外结构域所源自的Siglec可以是哺乳动物的Siglec，例如人类、猴、狗、大鼠或小鼠Siglec。
在某些实施方式中，所述Siglec是人类Siglec。在某些实施方式中，所述Siglec可以是Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14或Siglec-15。在某些实施方式中，所述Siglec可以是Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10或Siglec-11。在某些实施方式中，所述Siglec可以是Siglec-3、Siglec-7或Siglec-9。在某些实施方式中，所述Siglec可以是Siglec-7或Siglec-9。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：51。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13、SEQID NO：14、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66。
在某些实施方式中，所述Siglec是小鼠Siglec。所述小鼠Siglec可以是例如SigE、SigF、SigG或SigF。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含C型凝集素结构域。所述C型凝集素可以是例如CLEC1A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC2B、CD69(CLEC2C)、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、CLEC3B、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D、CLEC4E、CLEC4F、CLEC4G、ASGR1(CLEC4H1)、ASGR2(CLEC4H2)、FCER2(CLEC4J)、CD207(CLEC4K)、CD209(CLEC4L)、CLEC4M、CLEC5A、CLEC6A、CLEC7A、OLR1(CLEC8A)、CLEC9A、CLEC10A、CLEC11A、CLEC12A、CLEC12B、CD302(CLEC13A)、LY75(CLEC13B)、PLA2R1(CLEC13C)、MRC1(CLEC13D)、MRC2(CLEC13E)、CLEC14A、CLEC16A、CLEC17A、KLRA1、KLRB1(CLEC5B)、KLRC1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRD1、KLRF1(CLEC5C)、KLRG1(CLEC15A)、KLRG2(CLEC15B)或KLRK1。在某些实施方式中，所述C型凝集素选自CLEC4A、CLEC12A和CLEC12B。
在某些实施方式中，所述三聚化结构域是天然三聚化结构域或合成三聚化结构域。在某些实施方式中，所述三聚化结构域选自T4噬菌体纤维蛋白(foldon)、网格蛋白、热休克因子1、胶原蛋白、血细胞凝集素、GCN4、基于GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋肽三聚化结构域。在某些实施方式中，所述三聚化结构域选自基于GCN4的异亮氨酸拉链和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域。在某些实施方式中，所述三聚化结构域是T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，例如SEQ ID NO：5。
在某些实施方式中，所述二聚化结构域是天然二聚化结构域或合成二聚化结构域。在某些实施方式中，所述二聚化结构域选自免疫球蛋白Fc结构域、基于亮氨酸拉链的、基于卷曲螺旋的和基于螺旋的二聚化结构域。在某些实施方式中，所述二聚化结构域是免疫球蛋白Fc结构域，例如小鼠或人类免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域是小鼠IgG2a免疫球蛋白Fc结构域，例如包含SEQ ID NO：6的小鼠IgG2a免疫球蛋白Fc结构域。在某些实施方式中，所述连接物包含SEQ ID NO：69。
在某些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。在某些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ IDNO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：67。
另一方面，本发明涉及一种多聚体蛋白，其包含本文中所公开的多肽。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白是二聚体、三聚体、六聚体或十二聚体。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白是六聚体。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白包含6个分开的本文中所描述的多肽，它们复合以产生六聚体蛋白。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白包含两个分开的多肽，它们通过每个多肽的二聚化结构域(例如通过共价键或非共价缔合)二聚化以产生二聚体蛋白。
在某些实施方式中，当通过表面等离子体共振或生物层干涉量度法测量时，所述多聚体蛋白以0.01nM至100nM的KD结合糖类配体。在某些实施方式中，所述KD是10nM、1nM、0.1nM或更低。在某些实施方式中，所述KD是1nM、0.1nM或更低。在某些实施方式中，所述糖类配体是Siglec配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14和Siglec-15配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10和Siglec-11配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec 3、Siglec-7和Siglec-9配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-7和Siglec-9配体。
在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸、唾液酸化路易斯X、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(其中S表示硫酸酯)。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸和唾液酸化路易斯X。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7C2-组结构域、第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三Siglec-7 C2-组结构域和第四Siglec-7 C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7 C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7 C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、Fc结构域和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9C2-组结构域、第一连接物、第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三Siglec-9 C2-组结构域和第四Siglec-9C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9 C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如通过一个或多个共价键)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9 C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、Fc结构域和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-3C2-组结构域、第一连接物、第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-3 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-3C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域和第二Siglec-3 C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、Siglec-3C2-组结构域、Fc结构域和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
在某些实施方式中，所述多聚体蛋白已用唾液酸酶处理以降低所述蛋白的唾液酸含量。在某些实施方式中，所述已用唾液酸酶处理的多聚体蛋白的唾液酸含量低于尚未用所述唾液酸酶处理的相似或一致的多聚体蛋白的唾液酸含量的50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含本文中所描述的多聚体蛋白。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗Siglec介导的障碍(例如癌症或炎性障碍)的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的本文中描述的多聚体蛋白或药物组合物，从而在所述对象中治疗所述Siglec介导的障碍。
另一方面，本发明涉及一种检测样品中的糖类的方法。所述方法包括将所述样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述糖类的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-糖类复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在。
另一方面，本发明涉及一种在癌症对象中检测糖类的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述糖类的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-糖类复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在。在某些实施方式中，所述糖类是Siglec配体。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec抑制剂的治疗有响应的癌症对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec抑制剂，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达一种或多种Siglec配体的癌细胞。在某些实施方式中，所述Siglec配体是Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10或Siglec-11配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体是Siglec-7或Siglec-9配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸、唾液酸化路易斯X、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(其中S表示硫酸酯)。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸和唾液酸化路易斯X。
在某些实施方式中，所述Siglec抑制剂是抗Siglec抗体。所述抗Siglec抗体可以是例如抗Siglec-3抗体、抗Siglec-5抗体、抗Siglec-6抗体、抗Siglec-7抗体、抗Siglec-8抗体、抗Siglec-9抗体、抗Siglec-10抗体或抗Siglec-11抗体。在某些实施方式中，所述抗Siglec抗体是抗Siglec-3抗体、抗Siglec-7抗体或抗Siglec-9抗体。在某些实施方式中，所述抗Siglec抗体是抗Siglec-7抗体或抗Siglec-9抗体。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-3抑制剂(例如抗Siglec-3抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-3配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-3配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-3抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-5抑制剂(例如抗Siglec-5抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-5配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-5配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-5抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-6抑制剂(例如抗Siglec-6抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-6配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-6配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-6抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-7抑制剂(例如抗Siglec-7抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-7配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-7配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-7抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-8抑制剂(例如抗Siglec-8抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-8配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-8配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-8抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-9抑制剂(例如抗Siglec-9抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-9配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-9配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-9抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-10抑制剂(例如抗Siglec-10抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-10配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-10配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-19抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种鉴定可能对使用Siglec-11抑制剂(例如抗Siglec-11抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-11配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-11配体复合物，以及如果有的话，检测所述复合物的存在，其中所述复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec-11抑制剂的治疗有响应。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-3抑制剂(例如抗Siglec-3抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-3配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-5抑制剂(例如抗Siglec-5抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-5配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-6抑制剂(例如抗Siglec-6抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-6配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-7抑制剂(例如抗Siglec-7抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-7配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-8抑制剂(例如抗Siglec-8抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-8配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-9抑制剂(例如抗Siglec-9抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-9配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-10抑制剂(例如抗Siglec-10抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-10配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症或炎性障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-11抑制剂(例如抗Siglec-11抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-11配体的癌细胞。
在某些实施方式中，所述样品选自组织样品、体液样品或细胞样品。在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌。在某些实施方式中，所述上皮癌是子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌、输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌或肝癌。
本发明的这些和其他方面和特点将在下面的详细描述和权利要求书中描述。
附图说明
参考下述附图可以更完全地理解本发明。
图1描绘了各种不同的示例性重组蛋白构型，其中图1A描绘了被称为“二聚体”的二聚和二价蛋白构型，图1B描绘了被称为“蜻蜓”的二聚和四价蛋白构型，图1C描绘了被称为“蝴蝶”的二聚和四价蛋白构型，并且图1D描绘了被称为“水螅”的六聚和六价蛋白构型。
图2A是一系列十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(“SDS-PAGE”)凝胶，描绘了Siglec-7二聚体、蜻蜓、蝴蝶和水螅。每块凝胶示出了在非还原(non-red)和还原(red)条件下的纯化蛋白。图2B是一系列孔径排阻层析高效液相色谱(“SEC-HPLC”)图，描绘了Siglec-7二聚体、蜻蜓、蝴蝶和水螅。每张图示出了在280nM处的吸光值。670kDa、158kDa和44kDa分子量标准品的保留时间被注明。
图3A是线图，示出了通过Octet结合分析确定的Siglec-7水螅、蜻蜓、蝴蝶和二聚体与唾液酸聚合物的结合。可商购的Siglec-7二聚体(R&D systems)被用作对照。图3B是线图，示出了通过Octet结合分析确定的Siglec-7水螅结合的动力学。Siglec-7水螅具有0.1±0.025nM的表观结合亲和性。图3C是线图，示出了通过荧光活化细胞分拣(“FACS”)测量的Siglec-7水螅、蜻蜓、蝴蝶和二聚体与表达唾液酸聚糖的T47D癌细胞的结合。
图4A是示出了通过FACS确定的Siglec-7水螅与用或未用唾液酸酶处理的T47D细胞的结合的图。图4B是示出了通过FACS确定的Siglec-7水螅和Siglec-7R124K水螅与T47D细胞的结合的线图。图4C是示出了通过Octet确定的Siglec-7水螅和Siglec-7 R124K水螅与唾液酸聚合物的结合的线图。
图5A是描绘了Siglec-9水螅的SEC-HPLC图。所述图示出了在280nM处的吸光值。670kDa、158kDa、44kDa、17kDa和1.4kDa分子量标准品的保留时间被注明。图5B是示出了通过Octet结合分析确定的Siglec-9水螅和二聚体的结合的线图。图5C是示出了通过FACS测量的Siglec-9水螅与表达唾液酸聚糖的HT-29乳腺癌细胞的结合的线图。图5D是示出了通过FACS测量的Siglec-9水螅与HT-29UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶敲除(“HT-29GNEKO”)细胞的结合的线图。
图6A是示出了通过FACS确定的Siglec-9水螅和Siglec-9 R120K水螅与K562细胞的结合的线图。图6B是示出了通过Octet确定的Siglec-9水螅和Siglec-9R120K水螅与唾液酸聚合物的结合的线图。
图7A是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与T47D乳腺癌细胞的结合的线图。图7B是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与K562髓系白血病细胞的结合的线图。图7C是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与BT-20乳腺癌细胞的结合的线图。图7D是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与EMT6乳腺癌细胞的结合的线图。图7E是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与HT-29结肠癌细胞的结合的线图。图7F是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与HT-29GNE KO细胞的结合的线图。图7G是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与A549肺癌细胞的结合的线图。图7H是描绘了通过FACS测量的Siglec-7水螅和Siglec-9水螅与A549 GNE KO细胞的结合的线图。
图8A描绘了如实施例2中所述使用Siglec-9水螅通过免疫组织化学对Siglec-9配体染色的黑素瘤肿瘤组织样品和相应的非癌组织样品的图像。图8B描绘了如实施例2中所述使用Siglec-9水螅通过免疫组织化学对Siglec-9配体染色的乳腺癌肿瘤组织样品和相应的非癌组织样品的图像。染色信号被定性分为用-、+、++、+++、++++和+++++表示的6个组，其中-指示阴性染色，+至+++++指示越来越强的染色。
图9描绘了在实施例3中描述的结合测定法中使用的100种N-聚糖阵列(ZBiotech,Colorado)中的聚糖结构。
图10描绘了Siglec-9水螅与图9中示出的100种N-聚糖阵列的结合。结合在两种不同缓冲液中确定：DB1(50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.8))；和DB2(25mM乙酸钠(pH 6.0))。Siglec-9水螅结合含有α2,3和α2,6-唾液酸连键的聚糖结构。
图11描绘了在实施例3中描述的结合测定法中使用的Neu5Ac/Neu5Gc聚糖阵列(ZBiotech,Colorado)中的聚糖结构。
图12描绘了Siglec-9水螅与图11中示出的Neu5Ac/Neu5Gc聚糖阵列的结合。结合在50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.8)中确定。Siglec-9水螅结合含有α2,3和α2,6-唾液酸连键的聚糖结构。
图13描绘了在实施例3中描述的结合测定法中使用的鞘糖脂聚糖阵列(ZBiotech,Colorado)中的聚糖结构。
图14描绘了Siglec-7水螅与图13中示出的鞘糖脂聚糖阵列的结合。结合在50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.8)中确定。Siglec-7水螅结合G11、G12、G13、G14、G15、G18、G19、G20、G21、G22、G23、G25、G27、G28、G30、G31和G32聚糖结构，其各自含有α2,8-唾液酸连键。此外，Siglec-7水螅结合G1、G2、G26、G37、G38和G48聚糖结构，其各自含有α2,3-唾液酸连键。
图15描绘了石蜡包埋的人类肿瘤活检玻片的连续切片用Siglec-7水螅(水螅-7；左)和Siglec-9水螅(水螅-9；右)的代表性IHC染色。也示出了伴随的H-评分。图15A和15B描绘了具有各种H-评分的独立的结肠直肠癌样品的染色，图15C描绘了具有各种H-评分的独立的肺癌样品的染色。
图16描绘了通过在所指示的癌症之间的平均H-评分进行的Siglec-7水螅(S7-配体)、Siglec-9水螅(S9-配体)和MAL II IHC染色的比较。
图17描绘了某些示例性水螅构型的示意图。示出了具有Siglec-9 ECD的水螅-9、具有Siglec-7 ECD的水螅-7和具有Siglec-3 ECD的水螅3的1.0版构建物。1.0版构建物包含6个多肽，每个多肽以N至C端的方向包含Siglec ECD(圆圈表示V-组结构域，椭圆表示C2-组结构域)、三聚化(foldon)结构域(菱形)和Fc结构域(波浪线和矩形)。示出了具有Siglec-3 ECD的水螅-3的2.0版构建物。2.0版构建物包含6个多肽，每个多肽以N至C端的方向包含Siglec ECD、Fc结构域和三聚化(foldon)结构域。
图18A-D提供了各种不同水螅3版本(水螅3 1.0版“Sig3水螅”(图18B)；水螅3 1.1版(图18C)；水螅3 2.0版(图18D))与Siglec-3的FC二聚体(Sig3，图18A)相比的SEC层析图。水螅3 2.0版的预期分子量(MW)为340kD。670kD和158kD的MW标准品的保留时间也被示出。
图19描绘了FACS结合分析，其示出了与具有GNE敲除的A549(“GNE KO”，不存在唾液酸的株系)相比A549细胞被水螅3的唾液酸依赖性染色。
图20A描绘了结合曲线，其示出了与失去结合(LOB)的水螅3突变体R121K和R121A相比，水螅3与表达唾液酸的K562癌细胞的结合。图20B描绘了FACS结合分析，其示出了与失去结合(LOB)的水螅3突变体R121K和R121A相比，K562细胞表面配体被水螅3的唾液酸依赖性染色。术语“2ndary”表示阴性对照。
图21描绘了两块SDS-PAGE凝胶，即非还原凝胶和还原凝胶。WT水螅9构建物聚集(参见在非还原凝胶顶部处较高MW的结构)。移除两个半胱氨酸残基的水螅9构建物的双重突变(DM)形式(C141S和C278Y)显示出较少的聚集。
图22描绘了SEC层析图，其示出了水螅9的WT形式与水螅9双重突变(DM)构建物(包含C141S和C278Y突变)相比显示出另外的较高MW的结构，表明所述WT形式与所述DM相比表现出更多的聚集。
图23描绘了三个FACS曲线图和相应的条形图，示出了水螅3的唾液酸酶预处理(使用霍乱弧菌(VC)唾液酸酶或产脲节杆菌(Arthro)唾液酸酶)提高了与K562细胞表面配体的结合。
图24提供的图显示出用VC唾液酸酶预处理水螅9构建物提高了得率(例如在一个实验中对于WT来说从24％提高到55％，或在另一个实验中从27％提高到65％)。
详细描述
本发明部分是基于可用于在例如感兴趣的样品中检测Siglec配体和/或在需要的对象中治疗Siglec介导的障碍的重组多肽的发现。在某些实施方式中，重组多肽被缔合(非共价和/或共价地)，以产生可用于检测例如感兴趣的样品中的Siglec配体和/或在需要的对象中治疗Siglec介导的障碍的多聚体蛋白。
I.Siglec和Siglec生物学
Siglec(唾液酸结合性免疫球蛋白类型的凝集素)是结合唾液酸的细胞表面蛋白。Siglec包含凝集素家族的表面受体，其与唾液酸聚糖结合，并主要以细胞类型和分化依赖性方式表达在造血系统的细胞上。存在至少14种不同的哺乳动物Siglec，它们一起在细胞表面受体-配体相互作用的基础上提供了大量不同功能。这些受体-聚糖相互作用尤其可以介导细胞粘附和细胞信号传导。尽管唾液酸通常在糖蛋白和脂类的末端位置处遍在表达，但各个Siglec只识别非常特定的、独特的唾液酸聚糖结构，这取决于接近末端的糖类组成部分的身份和连键。
Siglec是I型跨膜蛋白，其中氨基端位于细胞外空间中，羧基端位于胞质溶胶中。每个Siglec含有N-端V-组免疫球蛋白样结构域(Ig结构域)，其充当唾液酸的结合受体。Siglec是凝集素，并且由于所述凝集素结构域是免疫球蛋白折叠，因此被分类在I型凝集素组中。所有Siglec都利用没有结合活性的居间的C2-组结构域从细胞表面延伸出来。Siglec的差异在于这些C2-组结构域的数目。由于这些蛋白含有Ig结构域，因此它们是免疫球蛋白超家族(IgSF)的成员。
大多数Siglec、特别是CD33样Siglec，在它们的胞质结构域中含有基于酪氨酸的免疫受体抑制性基序(ITIM)。它们的作用是下调参与磷酸化的信号传导途径，例如由基于酪氨酸的免疫受体活化基序(ITAM)诱导的信号传导途径。
由于它们的含有ITIM的胞质结构域，因此大多数CD33样Siglec干扰细胞信号传导，从而抑制免疫细胞活化。一旦结合到它们的配体，这些Siglec通过它们的ITIM结构域召集抑制性蛋白例如SHP磷酸酶。在配体结合后包含在所述ITIM中的酪氨酸变得磷酸化并充当含有SH2结构域的蛋白如SHP磷酸酶的停泊位点。这导致细胞蛋白的去磷酸化并下调活化信号传导途径。
由于细胞类型特异性表达模式、细胞内吞性质、在某些淋巴瘤/白血病上的高表达和调节受体信号传导的能力，Siglec已成为有吸引力的治疗靶点。到目前为止，基于Siglec靶向的疗法包括直接靶向肿瘤细胞的基于抗体和聚糖的策略。目前，几种直接靶向恶性细胞表面上的Siglec的基于抗体的疗法正经历临床评估并被继续开发，用于治疗淋巴瘤/白血病和自身免疫疾病(Angata等，(2015)Trends in Pharmacological Sciences,36(10):645–660)。
越来越多的证据支持聚糖和唾液酸聚糖特别是在肿瘤进展的各种病理生理学步骤中的作用。聚糖调控肿瘤增殖、侵袭、血性转移和血管生成(Fuster等，(2005)Nat.Rev.Cancer 5(7):526-42)。在癌症中，细胞表面糖缀合物的唾液酸化常常改变，导致作为该疾病的特定标志物的唾液酸化的肿瘤相关糖类抗原的表达。由于唾液酸化的聚糖参与许多生物学过程，它们被肿瘤细胞的表达通常与肿瘤的侵袭性和转移潜力的提高相关。
示例性人类Siglec-1蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：15中(NCBI参考序列：NP_075556.1)，并且编码示例性人类Siglec-1蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：16中(NCBI参考序列：NM_023068.3)。示例性人类Siglec-2蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：17中(NCBI参考序列：NP_001762.2)，并且编码示例性人类Siglec-2蛋白的DNA序列提供在SEQID NO：18中(NCBI参考序列：NM_001771.3)。示例性人类Siglec-3蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：19中(NCBI参考序列：NP_001763.3)，并且编码示例性人类Siglec-3蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：20中(NCBI参考序列：NM_001772.3)。示例性人类Siglec-4蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：21中(NCBI参考序列：NP_002352.1)，并且编码示例性人类Siglec-4蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：22中(NCBI参考序列：NM_002361.3)。示例性人类Siglec-5蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：23中(NCBI参考序列：NP_003821.1)，并且编码示例性人类Siglec-5蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：24中(NCBI参考序列：NM_003830)。示例性人类Siglec-6蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：25中(NCBI参考序列：NP_001236.4)，并且编码示例性人类Siglec-6蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：26中(NCBI参考序列：NM_198845.5)。示例性人类Siglec-7蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：27中(NCBI参考序列：NP_055200.1)，并且编码示例性人类Siglec-7蛋白的DNA序列提供在SEQID NO：28中(NCBI参考序列：NM_014385.3)。示例性人类Siglec-8蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：29中(NCBI参考序列：NP_055257.2)，并且编码示例性人类Siglec-8蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：30中(NCBI参考序列：NM_014442.2)。示例性人类Siglec-9蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：31中(NCBI参考序列：NP_055256.1)，并且编码示例性人类Siglec-9蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：32中(NCBI参考序列：NM_014441.2)。示例性人类Siglec-10蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：33中(NCBI参考序列：NP_149121.2)，并且编码示例性人类Siglec-10蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：34中(NCBI参考序列：NM_033130.4)。示例性人类Siglec-11蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：35中(NCBI参考序列：NP_443116.2)，并且编码示例性人类Siglec-11蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：36中(NCBI参考序列：NM_052884.2)。示例性人类Siglec-12蛋白的氨基酸序列提供在SEQ IDNO：37中(NCBI参考序列：NP_443729.1)，并且编码示例性人类Siglec-12蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：38中(NCBI参考序列：NM_053003.3)。示例性人类Siglec-14蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：39中(NCBI参考序列：NP_001092082.1)，并且编码示例性人类Siglec-14蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：40中(NCBI参考序列：NM_001098612.1)。示例性人类Siglec-15蛋白的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：41中(NCBI参考序列：NP_998767.1)，并且编码示例性人类Siglec-15蛋白的DNA序列提供在SEQ ID NO：42中(NCBI参考序列：NM_213602.2)。
II.多肽
本公开提供了一种分离的多肽，其包含一个或多个凝集素结构域、一个或多个二聚化结构域和/或一个或多个三聚化结构域。所述凝集素、二聚化和/或三聚化结构域可以以任何方向连接在一起(例如共价连接)。所述凝集素、二聚化和/或三聚化结构域可以直接地或间接地例如通过连接物连接在一起。
例如，多肽可以包含凝集素结构域、三聚化结构域和二聚化结构域。在某些实施方式中，所述凝集素结构域、三聚化结构域和二聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。
多肽可以包含第一凝集素结构域、第二凝集素结构域和二聚化结构域。在某些实施方式中，所述第一凝集素结构域和第二凝集素结构域是一致的。在某些实施方式中，所述第一凝集素结构域、第二凝集素结构域和二聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。在某些实施方式中，所述第一凝集素结构域、二聚化结构域和第二凝集素结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。
在某些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述多肽包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列或与SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
序列一致性可以以本领域技术范围之内的各种不同方式确定，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。使用被程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所利用的算法的BLAST(基本局部比对搜索工具)分析(Karlin等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Altschul，(1993)J.Mol.Evol.36,290-300；Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402，通过参考并入本文)被定制用于序列相似性搜索。对于搜索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)Nature Genetics 6:119-129，其完全通过参考并入本文。本领域技术人员可以确定适合于度量比对的参数，包括为了在所比较的序列的全部长度内实现最大比对所需的任何算法。用于直方图、描述、比对、期望(即用于报告与数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和过滤器的搜索参数处于默认设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919，完全通过参考并入本文)。四个blastn参数可以如下调整：Q＝10(空位生成罚分)；R＝10(空位延长罚分)；wink＝1(在沿着查询序列的每个第wink位置处产生单次命中)；和gapw＝16(设置在其中产生带空位比对的窗口宽度)。等同的Blastp参数设置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。搜索也可以使用NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information))BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，打开空位的成本[整数]：默认＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，延长空位的成本[整数]：默认＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配的罚分[整数]：默认＝-3；-r，核苷酸匹配的奖励[整数]：默认＝1；-e，预期值[实数]：默认＝10；-W，字长[整数]：默认＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，blast延伸的以位为单位的衰减(X)：默认＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，带空位比对的X衰减值(以位为单位)：默认＝对所有程序来说15，不适用于blastn；和–Z，带空位比对的最终X衰减值(以位为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。也可以使用用于成对蛋白质比对的ClustalW(默认参数可以包括例如Blosum62矩阵，并且空位打开罚分＝10，空位延长罚分＝0.1)。可以在GCG软件包10.0版中获得的序列之间的Bestfit比较使用DNA参数GAP＝50(空位生成罚分)和LEN＝3(空位延长罚分)，并且蛋白质比较中的等同设置是GAP＝8和LEN＝2。
a.凝集素结构域
当在本文中使用时，凝集素结构域是指能够与糖类结合的氨基酸序列。凝集素结构域通常源自于凝集素蛋白(凝集素)。凝集素根据结构分为不同家族，包括钙联蛋白家族凝集素、C型凝集素、P型凝集素、I型凝集素(包括Siglec)、R型凝集素、半乳糖凝集素,F-盒凝集素、纤胶凝蛋白、几丁质酶样凝集素、F型凝集素和内凝集素。适合于本文中的用途的凝集素结构域可以源自于结合甘露糖的凝集素例如伴刀豆球蛋白A(ConA)、小扁豆凝集素(LCH)和雪花莲凝集素(GNA)，结合半乳糖/N-乙酰半乳糖胺的凝集素例如蓖麻毒素或蓖麻凝集素或RCE120(RCA)、花生凝集素(PNA)、木菠萝素(AIL)和毛苕子凝集素(VVL)，结合N-乙酰葡萄糖胺的凝集素例如小麦胚芽凝集素(WGA)，结合N-乙酰神经氨酸的凝集素例如接骨木凝集素(SNA)、怀槐白细胞凝集素(MAL)和怀槐血细胞凝集素(MAH)，以及结合岩藻糖的凝集素例如荆豆凝集素(UEA)和橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含来自于Siglec蛋白的凝集素结构域。Siglec是由2-17个细胞外结构域构成的细胞表面跨膜受体。例如，凝集素结构域可以包含Siglec唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域或其变体和/或Siglec细胞外结构域或其变体。在某些实施方式中，Siglec唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域的变体或Siglec细胞外结构域的变体是与野生型对应物相比具有一个或多个氨基酸改变，但与野生型对应物相比保留至少20％的结合亲和性、至少30％的结合亲和性、至少40％的结合亲和性、至少50％的结合亲和性、至少60％的结合亲和性、至少70％的结合亲和性、至少80％的结合亲和性、至少90％的结合亲和性、至少95％的结合亲和性或至少100％的结合亲和性的Siglec唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域或Siglec细胞外结构域。所述Siglec唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域或细胞外结构域所源自的Siglec可以是哺乳动物的Siglec，例如人类、猴、狗、大鼠或小鼠Siglec。
在某些实施方式中，所述Siglec是人类Siglec。在某些实施方式中，所述Siglec可以是Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14或Siglec-15。在某些实施方式中，所述Siglec可以是Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10或Siglec-11。在某些实施方式中，所述Siglec可以是Siglec-7或Siglec-9。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-1 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：15的第21-136位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：15的第21-136位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-1细胞外结构域，例如SEQ ID NO：15的第20-1642位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：15的第20-1642位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-2 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：17的第24-122位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：17的第24-122位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-2细胞外结构域，例如SEQ ID NO：17的第20-688位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：17的第20-688位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-3 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：19的第23-139位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：19的第23-139位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-3细胞外结构域，例如SEQ ID NO：19的第18-260位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：19的第18-260位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-4 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：21的第22-139位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：21的第22-139位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-4细胞外结构域，例如SEQ ID NO：21的第20-157位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：21的第20-157位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-5 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：23的第21-140位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：23的第21-140位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-5细胞外结构域，例如SEQ ID NO：23的第17-442位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：23的第17-442位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-6 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：25的第31-141位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：25的第31-141位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-6细胞外结构域，例如SEQ ID NO：25的第27-348位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：25的第27-348位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-7 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：27的第26-144位氨基酸残基、SEQ ID NO：27的第31-122位氨基酸残基、SEQID NO：1或SEQ ID NO：43。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：27的第26-144位氨基酸残基、SEQ ID NO：27的第31-122位氨基酸残基、SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：43具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-7 V-组免疫球蛋白样结构域和1个Siglec-7 C2-组结构域，例如SEQ ID NO：3。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：3具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-7细胞外结构域例如Siglec-7 V-组免疫球蛋白样结构域和2个Siglec-7 C2-组结构域，例如SEQ ID NO：27的第19-357位氨基酸残基或SEQ ID NO：13。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：27的第19-357位氨基酸残基或SEQ ID NO：13具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-8 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：29的第27-151位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：29的第27-151位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-8细胞外结构域，例如SEQ ID NO：29的第17-364位氨基酸残基。某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：29的第17-364位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-9 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：31的第23-144位氨基酸残基、SEQ ID NO：31的第23-140位氨基酸残基、SEQID NO：2或SEQ ID NO：44。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：31的第23-144位氨基酸残基、SEQ ID NO：31的第23-140位氨基酸残基、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：44具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-9 V-组免疫球蛋白样结构域和1个Siglec-9 C2-组结构域，例如SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：4具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-9细胞外结构域，例如Siglec-9 V-组免疫球蛋白样结构域和2个Siglec-9C2-组结构域，例如SEQ ID NO：31的第18-348位氨基酸残基或SEQ ID NO：14。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：31的第18-348位氨基酸残基或SEQ ID NO：14具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-10 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：33的第23-140位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：33的第23-140位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-10细胞外结构域，例如SEQ ID NO：33的第17-551位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：33的第17-551位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-11 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：35的第34-153位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：35的第34-153位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-11细胞外结构域，例如SEQ ID NO：35的第28-562位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：35的第28-562位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-12 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：37的第24-142位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：37的第24-142位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-12细胞外结构域，例如SEQ ID NO：37的第19-482位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：37的第19-482位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-14 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：39的第21-140位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：39的第21-140位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-14细胞外结构域，例如SEQ ID NO：39的第17-359位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：39的第17-359位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-15 V-组免疫球蛋白样结构域，例如SEQ ID NO：41的第44-150位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：41的第44-150位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-15细胞外结构域，例如SEQ ID NO：41的第20-264位氨基酸残基。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含与SEQ ID NO：41的第20-264位氨基酸残基具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-3 V-组免疫球蛋白样结构域例如SEQ ID NO：51、Siglec-7 V-组免疫球蛋白样结构域例如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：43或Siglec-9V-组免疫球蛋白样结构域例如SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：44。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-3 V-组免疫球蛋白样结构域和1个Siglec-3C2-组结构域，例如SEQ ID NO：52。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-7 V-组免疫球蛋白样结构域和1个Siglec-7 C2-组结构域，例如SEQID NO：3。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-9 V-组免疫球蛋白样结构域和1个Siglec-9 C2-组结构域，例如SEQ ID NO：4。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-7 V-组免疫球蛋白样结构域和2个Siglec-7 C2-组结构域，例如SEQ ID NO：13。在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含Siglec-9V-组免疫球蛋白样结构域和2个Siglec-9 C2-组结构域，例如SEQ ID NO：14。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含至少一个野生型半胱氨酸残基的替换。例如，在某些实施方式中，所述凝集素结构域来自于人类Siglec-9，并且所述凝集素结构域包含对应于野生型人类Siglec-9的第141位的位置处的半胱氨酸残基的替换，例如对应于野生型人类Siglec-9的第141位的位置处的半胱氨酸残基被丝氨酸替换(C141S)。在某些实施方式中，所述凝集素结构域来自于人类Siglec-9，并且所述凝集素结构域包含对应于野生型人类Siglec-9的第278位的位置处的半胱氨酸残基的替换，例如对应于野生型人类Siglec-9的第278位的位置处的半胱氨酸残基被苏氨酸替换(C278T)。
在某些实施方式中，所述Siglec是小鼠Siglec。所述小鼠Siglec可以是例如SigE、SigF、SigG或SigF。
在某些实施方式中，所述凝集素结构域包含C型凝集素结构域。所述C型凝集素可以是例如CLEC1A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC2B、CD69(CLEC2C)、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、CLEC3B、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D、CLEC4E、CLEC4F、CLEC4G、ASGR1(CLEC4H1)、ASGR2(CLEC4H2)、FCER2(CLEC4J)、CD207(CLEC4K)、CD209(CLEC4L)、CLEC4M、CLEC5A、CLEC6A、CLEC7A、OLR1(CLEC8A)、CLEC9A、CLEC10A、CLEC11A、CLEC12A、CLEC12B、CD302(CLEC13A)、LY75(CLEC13B)、PLA2R1(CLEC13C)、MRC1(CLEC13D)、MRC2(CLEC13E)、CLEC14A、CLEC16A、CLEC17A、KLRA1、KLRB1(CLEC5B)、KLRC1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRD1、KLRF1(CLEC5C)、KLRG1(CLEC15A)、KLRG2(CLEC15B)或KLRK1。在某些实施方式中，所述C型凝集素选自CLEC4A、CLEC12A和CLEC12B。
b.二聚化结构域
当在本文中使用时，二聚体是指两个单体(两个单体亚基)的复合物，并且二聚化结构域是指介导或以其他方式促进二聚体中的两个单体之间的共价和/或非共价缔合或相互作用的氨基酸序列。因此，二聚体可以包含偏好性结合到第二二聚化结构域的第一二聚化结构域。二聚体可以是其中两个单体亚基一致的同二聚体或其中两个单体亚基不同的异二聚体。同样地，二聚化结构域可以是同二聚化结构域，其中所述同二聚化结构域偏好性结合到一致的第二二聚化结构域，或者是异二聚化结构域，其中所述异二聚化结构域偏好性结合到不同的第二二聚化结构域。
当与结构域相关联使用时，术语“偏好性结合”或“特异性结合”是指结构域与特定靶分子(例如蛋白质、糖类、糖蛋白或糖脂)的结合和/或缔合比与所述靶分子之外的分子的结合和/或缔合(i)更加稳定，(ii)更加快速，(iii)具有更强亲和性，(iv)具有更长持续时间或(v)(i)-(iv)中的任两项或更多项的组合。例如，特异性或偏好性结合第二二聚化结构域的第一二聚化结构域是以例如比它与另外的结构域的结合更强的亲和性、亲和力、更加容易和/或更长持续时间结合第二二聚化结构域的第一二聚化结构域。当通过表面等离子体共振确定时，所述第一二聚化结构域可能对所述第二二聚化结构域具有约100nM、50nM、20nM、15nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.5nM、0.1nM或0.01nM或更强的亲和性。例如，所述第一二聚化结构域可能对所述第二二聚化结构域具有在约0.01nM至约100nM、约0.1nM至约100nM或约1nM至约100nM范围内的亲和性。应该理解，偏好性结合到第一靶分子的结构域可以或可以不偏好性结合到第二靶分子。因此，“偏好性结合”不必定要求(尽管它可以包括)专一结合。
在某些实施方式中，所述二聚化结构域是天然二聚化结构域或合成二聚化结构域。在某些实施方式中，所述二聚化结构域选自免疫球蛋白Fc结构域、基于亮氨酸拉链的、基于卷曲螺旋的和基于螺旋的二聚化结构域。
在某些实施方式中，所述二聚化结构域是免疫球蛋白Fc结构域(在本文中也被称为Fc结构域)，例如小鼠或人类免疫球蛋白Fc结构域。当在本文中使用时，除非另有指明，否则术语“免疫球蛋白Fc结构域”是指免疫球蛋白重链恒定区的一个片段，其单独地或与第二免疫球蛋白Fc结构域相组合，能够与Fc受体结合。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域。免疫球蛋白Fc结构域可以包括例如免疫球蛋白CH2和CH3结构域和免疫球蛋白铰链区。免疫球蛋白铰链区、CH2和CH3结构域之间的边界在本领域中是公知的，并且可以在例如PROSITE数据库(可以在万维网网站prosite.expasy.org处获得)中找到。
在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域是人类免疫球蛋白Fc结构域，例如人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域是结合FcγRIIB1或FcγRIIB2 Fc受体的Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域是小鼠免疫球蛋白Fc结构域，例如小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgM、IgA、IgD或IgE Fc结构域。在某些实施方式中，所述免疫球蛋白Fc结构域是小鼠IgG2a免疫球蛋白Fc结构域、，例如包含SEQ ID NO：6的小鼠IgG2a免疫球蛋白Fc结构域。
c.三聚化结构域
当在本文中使用时，三聚体是指三个单体(三个单体亚基)的复合物，并且三聚化结构域是指介导或以其他方式促进三聚体中的三个亚基之间的共价和/或非共价缔合或相互作用的氨基酸序列。因此，三聚体可以包含偏好性结合到第二三聚化结构域和第三三聚化结构域的第一三聚化结构域。三聚体可以是其中三个单体亚基一致的同三聚体或其中三个单体亚基不同的异三聚体。同样地，三聚化结构域可以是同三聚化结构域，其中所述同三聚化结构域偏好性结合到一致的第二和第三三聚化结构域，或者是异三聚化结构域，其中所述异三聚化结构域偏好性结合到不同的第二或第三三聚化结构域。
在某些实施方式中，所述三聚化结构域是天然三聚化结构域或合成三聚化结构域。在某些实施方式中，所述三聚化结构域选自T4噬菌体纤维蛋白(foldon)、网格蛋白、热休克因子1、胶原蛋白、血细胞凝集素、GCN4、基于GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋肽三聚化结构域。在某些实施方式中，所述三聚化结构域选自基于GCN4的异亮氨酸拉链和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域。在某些实施方式中，所述三聚化结构域是T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，例如SEQ ID NO：5。
d.连接物
在某些实施方式中，所述凝集素、二聚化和/或三聚化结构域被直接连接或融合在一起以形成所述多肽。在其他实施方式中，所述凝集素、二聚化和/或三聚化结构域可以通过一个或多个居间的连接物序列共价连接在一起。
所述连接物可以与凝集素、二聚化和/或三聚化结构域的一个或多个天然氨基酸偶联，其中所述氨基酸(例如半胱氨酸)可以通过定点突变引入。所述连接物可以包括一个或多个非天然氨基酸。设想了在某些情况下，含有例如一个或多个巯基反应性基团(例如马来酰亚胺)的连接物可以共价连接所述凝集素、二聚化和/或三聚化结构域中的半胱氨酸，所述半胱氨酸是天然存在的半胱氨酸残基或是定点突变的产物。
所述连接物可以是可切割连接物或不可切割连接物。任选地或此外，所述连接物可以是柔性连接物或非柔性连接物。
所述连接物的长度应该足够长以允许所述凝集素、二聚化和/或三聚化结构域连接而彼此没有空间位阻，并且足够短以保留所述多肽的目标活性。所述连接物优选地足够亲水以避免或最小化所述多肽的不稳定性。所述连接物优选地足够亲水以避免或最小化所述多肽的不溶性。所述连接物应该在体内足够稳定(例如它不被血清、酶等切割)以允许所述融合蛋白在体内可操作。
所述连接物可以具有约1埃
Figure BDA0002936553750000301
至约
Figure BDA0002936553750000302
的长度或约
Figure BDA0002936553750000303
至约
Figure BDA0002936553750000304
的长度或约
Figure BDA0002936553750000305
至约
Figure BDA0002936553750000306
的长度或约
Figure BDA0002936553750000307
至约
Figure BDA0002936553750000308
的长度。所述连接物可以具有大于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、27、30埃或更大的长度，和/或具有小于约110、100、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、
Figure BDA0002936553750000309
或更小的长度。此外，所述连接物可以具有约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110和
Figure BDA00029365537500003010
的长度。
在某些实施方式中，所述连接物包含多肽连接物，其连接或融合所述多肽的凝集素、二聚化和/或三聚化结构域。例如，设想了可以使用常规的重组DNA技术产生并表达编码直接或间接(例如通过含有氨基酸的连接物)连接到二聚化和/或三聚化结构域的凝集素结构域的基因。例如，可以将凝集素结构域的氨基端连接到二聚化或三聚化结构域的羧基端。在使用连接物时，所述连接物优选地含有亲水性氨基酸残基例如Gln、Ser、Gly、Glu、Pro、His和Arg。在某些实施方式中，所述连接物是含有1-25个氨基酸残基、1-20个氨基酸残基、2-15个氨基酸残基、3-10个氨基酸残基、3-7个氨基酸残基、4-25个氨基酸残基、4-20个氨基酸残基、4-15个氨基酸残基、4-10个氨基酸残基、5-25个氨基酸残基、5-20个氨基酸残基、5-15个氨基酸残基或5-10个氨基酸残基的肽。示例性连接物包括富含甘氨酸和丝氨酸的连接物，例如(GlyGlyPro)n(SEQ ID NO：70)或(GlyGlyGlyGlySer)n(SEQ ID NO：71)，其中n是1-5。在某些实施方式中，所述连接物是(GlyGlyGlyGlySer)3(SEQ ID NO：72)。在某些实施方式中，所述连接物是(Gly4Ser)2(SEQ ID NO：69)。另外的示例性连接物序列公开在例如George等，(2003)Protein Engineering 15:871–879和美国专利号5,482,858和5,525,491中。
e.多聚体蛋白
另一方面，本发明涉及一种多聚体蛋白，其包含本文中所公开的多肽。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白是二聚体、三聚体、六聚体或十二聚体。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白是六聚体。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白包含6个分开的本文中所描述的多肽，它们复合以产生六聚体蛋白。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白包含两个分开的多肽，它们通过每个多肽的每个二聚化结构域二聚化以产生二聚体蛋白。
在某些实施方式中，当通过表面等离子体共振或生物层干涉量度法测量时，所述多聚体蛋白以0.01nM至100nM的KD结合糖类配体。在某些实施方式中，所述KD是10nM、1nM、0.1nM或更低。在某些实施方式中，所述KD是1nM、0.1nM或更低。在某些实施方式中，所述糖类配体是Siglec配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14和Siglec-15配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10和Siglec-11配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-7和Siglec-9配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸、唾液酸化路易斯X、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(其中S表示硫酸酯)。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸和唾液酸化路易斯X。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一基于Siglec的唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一基于Siglec的C2-组结构域、第二基于Siglec的唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二基于Siglec的C2-组结构域和Fc结构域。所述两个多肽可以在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述第一基于Siglec的C2-组结构域与第二基于Siglec的唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一基于Siglec的唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一基于Siglec的C2-组结构域、第二基于Siglec的C2-组结构域、Fc结构域、第二基于Siglec的唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三基于Siglec的C2-组结构域和第四基于Siglec的C2-组结构域所述两个多肽可以在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述Fc结构域与第二基于Siglec的唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一基于Siglec的唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一基于Siglec的C2-组结构域、第二基于Siglec的C2-组结构域、三聚化结构域(例如T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域)和Fc结构域。在所述多肽的任何组分之间可以任选地使用连接物。在某些实施方式中，a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、一个或多个C2-组结构域、任选的连接物、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域。在某些实施方式中，a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、一个或多个(例如一个或两个)C2-组结构域、Fc结构域、任选的连接物、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域。在所述多肽的任何组分之间可以任选地使用连接物。在某些实施方式中，a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-3C2-组结构域、第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-3 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述第一Siglec-3 C2-组结构域与第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-3C2-组结构域、第二Siglec-3 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三Siglec-3 C2-组结构域和第四Siglec-3C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述Fc结构域与第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-3 C2-组结构域、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、Siglec-3 C2-组结构域、任选的连接物、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、Siglec-3 C2-组结构域、Fc结构域、任选的连接物、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7C2-组结构域、第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述第一Siglec-7 C2-组结构域与第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三Siglec-7 C2-组结构域和第四Siglec-7 C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述Fc结构域与第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7 C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、一个或多个(例如一个或两个)Siglec-7 C2-组结构域(s)、Fc结构域、任选的连接物、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9C2-组结构域、第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述第一Siglec-9 C2-组结构域与第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三Siglec-9 C2-组结构域和第四Siglec-9C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。在某些实施方式中，每个多肽在所述Fc结构域与第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域之间包含连接物。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9 C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
另一方面，本发明提供了一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、一个或多个(例如一个或两个)Siglec-9 C2-组结构域、一个或多个(例如一个或两个)Fc结构域、任选的连接物、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化(共价和/或非共价地)；c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)；并且e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(共价和/或非共价地)。
在某些实施方式中，所述多聚体蛋白包含含有SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的多肽。在某些实施方式中，多聚体蛋白包含含有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：67或与其具有80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列的多肽。在某些实施方式中，所述多聚体蛋白包含的多肽含有SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ IDNO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：67，其中前19个氨基酸(MGWSCIILFLVATATGVHS，前导序列)不存在。
II.制造多肽和/或多聚体蛋白的方法
用于生产多肽和/或多聚体蛋白例如本文中所公开的多肽和/或多聚体蛋白、抗体或抗体偶联物例如本文中所公开的抗体或抗体偶联物的方法在本领域中是已知的。例如，编码凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的DNA分子可以化学合成或通过重组DNA方法合成。例如，所述凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的序列可以被合成，或通过常规的杂交技术或聚合酶链反应(PCR)技术使用适合的合成核酸引物从文库克隆。可以将得到的编码感兴趣的凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的DNA分子连接到其他适合的核苷酸序列包括例如表达控制序列，以产生编码所需抗体的常规基因表达构建物(即表达载体)。确定的基因构建物的产生在本领域的常规技术范围之内。
可以将编码所需重组多肽的核酸并入(连接)到表达载体中，所述表达载体可以通过常规的转染或转化技术引入到宿主细胞中。示例性的宿主细胞是原本不产生IgG蛋白的大肠杆菌细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、人类胚胎肾293(HEK293)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人类肝细胞癌细胞(例如Hep G2)和骨髓瘤细胞。可以将转化的宿主细胞在允许所述宿主细胞表达编码所述包含凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的多肽的基因的条件下生长。
具体的表达和纯化条件随着所使用的表达系统而变。例如，如果要在大肠杆菌中表达基因，首先通过将所述工程化的基因放置在适合的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列下游，将它克隆在表达载体中。所述表达的蛋白可能被分泌。所述表达的蛋白可能积累在折射体或包涵体中，它们可以在通过弗氏压碎器或超声处理破碎细胞后被收获。然后将所述折射体溶解，并且可以通过本领域中已知的方法将所述蛋白重新折叠和/或切割。
如果所述工程化基因将要在真核宿主细胞例如CHO细胞中表达，首先将它插入到含有适合的真核启动子、分泌信号、多聚A序列和终止密码子的表达载体中。任选地，所述载体或基因构建物可以含有增强子和内含子。在涉及包含抗体或其部分的融合蛋白的实施方式中，所述表达载体任选地含有编码全部或一部分恒定区的序列，以便能够表达全部或一部分重链或轻链。所述基因构建物可以使用常规技术引入到真核宿主细胞中。
所述宿主细胞表达包含凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域或其部分的多肽。在涉及多聚体蛋白的某些实施方式中，将宿主细胞用表达包含凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的多肽的单一载体转染。在某些实施方式中，将宿主细胞用超过一种表达载体(例如各自编码不同的多肽)共转染，所述载体在表达时将形成多聚体蛋白。
编码包含凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的多肽的DNA可以使用PCR通过重叠延伸来组装，并克隆到表达载体例如pCEP(Invitrogen)中。编码包含凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的多肽的表达载体可以例如使用ExpiFectamine(Invitrogen)转染到宿主细胞中。包含凝集素结构域、二聚化结构域和/或三聚化结构域的多肽可以通过将用编码这种多肽的表达载体转染的宿主细胞例如Expi293细胞在允许所述多肽在转染后表达例如6天的条件下生长(培养)来生产。在表达后，所述多肽可以使用本领域中已知的技术来收获并纯化或分离(即回收)，例如使用亲和标签例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或组氨酸标签或通过蛋白A树脂。
在某些实施方式中，本发明的表达的多肽被分泌到宿主细胞的周质中并从周质回收。蛋白质回收通常包括一般来说通过诸如渗透冲击、超声处理或裂解的手段来破碎所述微生物。一旦细胞破碎后，可以通过离心或过滤除去细胞碎片或完整细胞。所述蛋白质可以例如通过亲和树脂层析进一步纯化。或者，蛋白质可以被运输到培养基中并在其中分离。可以将细胞从培养物中移除并将培养上清液过滤并浓缩，用于进一步纯化产生的蛋白质。所述表达的多肽可以使用公知的方法例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定进一步分离和鉴定。
在某些实施方式中，可以将所述多肽和/或多聚体蛋白用唾液酸酶处理，以提高表达、稳定性、回收率和/或与唾液酸的结合亲和性。适合于在这里使用的唾液酸酶包括霍乱弧菌(VC)唾液酸酶或产脲节杆菌唾液酸酶。在某些实施方式中，与未用唾液酸酶处理的多肽和/或多聚体蛋白相比，回收率提高至少25％、50％、75％、100％、150％、200％、500％。在某些实施方式中，与未用唾液酸酶处理的多肽和/或多聚体蛋白相比，回收率提高约25％至约500％之间，例如约25％至约200％、约25％至约150％、约25至约75％、约25％至约50％、约50％至约500％、约50％至约200％、约50％至约150％、约50％至约100％、约50％至约75％、约75％至约500％、约75％至约200％、约75％至约150％、约75％至约100％、约100％至约500％、约100％至约200％、约100％至约150％、约150％至约500％、约150％至约200％或约200％至约500％。
在某些实施方式中，与未用唾液酸酶处理的多肽和/或多聚体蛋白相比，结合亲和性(例如与唾液酸的)提高至少约25％至约500％，例如约25％至约200％、约25％至约150％、约25至约75％、约25％至约50％、约50％至约500％、约50％至约200％、约50％至约150％、约50％至约100％、约50％至约75％、约75％至约500％、约75％至约200％、约75％至约150％、约75％至约100％、约100％至约500％、约100％至约200％、约100％至约150％、约150％至约500％、约150％至约200％或约200％至约500％。结合亲和性可以通过本领域中已知的任何方法来测量，包括例如FACS分析、Octet结合分析或聚糖阵列。
在某些实施方式中，所述已用唾液酸酶处理的多聚体蛋白的唾液酸含量低于未用唾液酸酶处理的相似或一致的多聚体蛋白的唾液酸含量的50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
III.药物组合物
对于治疗性应用来说，优选地将多肽和/或多聚体蛋白与可药用载体组合。当在本文中使用时，术语“可药用”是指那些在健全的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。可药用载体包括任何标准的制药用载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物也可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。可药用载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和试剂对药物活性物质的用途在本领域中是已知的。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有用于修改、维持或保留例如所述组合物的pH、摩尔渗透压浓度、黏度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或穿透性的配制材料。在这些实施方式中，适合的配置材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)，抗微生物剂，抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)，缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)，增量剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)，螯合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))，络合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)，填充剂，单糖、二糖和其他糖类(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)，蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)，着色、调味和稀释剂，乳化剂，亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)，低分子量多肽，成盐平衡离子(例如钠)，防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)，溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)，糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)，悬浮剂，表面活性剂或润湿剂(例如泊洛沙姆、PEG、失水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯例如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯、曲拉通、氨丁三醇、卵磷脂、胆甾醇、泰洛沙泊)，稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)，渗涨度增强剂(例如碱金属卤化物、优选为氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)，递送介质，稀释剂，赋形剂和/或药用辅料(参见《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第18版(MackPublishing Company,1990))。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有纳米粒子，例如聚合纳米粒子、脂质体或胶束(参见Anselmo等，(2016)Bioeng.Transl.Med.1:10-29)。
在某些实施方式中，药物组合物可以含有持续或受控递送剂型。用于配制持续或受控递送手段例如脂质体载体、生物溶蚀性微粒或多孔珠和积存注射物的技术对于本领域技术人员来说也是已知的。持续释放制剂可以包括例如多孔聚合微粒或采取造型制品例如膜或微胶囊形式的半透性聚合物基质。持续释放基质可以包括聚酯、水凝胶、聚乳酸、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、聚(甲基丙烯酸2-羟基乙基酯)、乙烯-乙酸乙烯酯或聚D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物也可以包括脂质体，其可以通过本领域中已知的几种方法中的任一者来制备。
含有本文中公开的多肽和/或多聚体蛋白的药物组合物可以以剂量单元形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与其目标给药途径相容。给药途径的实例是静脉内(IV)、真皮内、吸入、透皮、局部、透粘膜、鞘内和直肠给药。优选的给药途径是IV输注。有用的剂型可以通过制药学领域中已知的方法来制备。例如参见《Remington制药学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)第18版(Mack PublishingCompany,1990)。适合于肠胃外给药的剂型组分包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶液、非挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂，抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂例如EDTA，缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的试剂例如氯化钠或右旋糖。
对于静脉内给药来说，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。所述载体应该在制造和储存条件下稳定，并且应该被防腐以对抗微生物。所述载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)的溶剂或分散介质及其适合的混合物。
药物剂型优选是无菌的。灭菌可以通过任何适合的方法来实现，例如通过无菌过滤膜过滤。在所述组合物被冷冻干燥的情况下，过滤除菌可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行。
本文中描述的组合物可以局部或系统性给药。给药通常是肠胃外给药。在优选实施方式中，所述药物组合物皮下给药，在甚至更优选的实施方式中，静脉内给药。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬液和乳液。
通常，活性组分例如多肽和/或多聚体蛋白的治疗有效量在0.1mg/kg至100mg/kg，例如1mg/kg至100mg/kg、1mg/kg至10mg/kg的范围内。给药的量将取决于诸如待治疗的疾病或指征的类型和程度、患者的总体健康、抗体的体内效能、药物剂型和给药途径等变量。初始剂量可以提高到高于上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平。或者，初始剂量可以低于最佳剂量，并且在治疗过程中可以逐渐提高每日剂量。人类剂量可以例如在被设计用于在0.5mg/kg至20mg/kg之间运行的常规的I期剂量递增研究中进行优化。给药频率可以随着诸如给药途径、剂量、血清半衰期和待治疗的疾病等因素而变。示例性的给药频率是每天一次、每周一次和每两周一次。优选的给药途径是肠胃外例如静脉内输注。在某些实施方式中，多肽和/或多聚体蛋白被冷冻干燥，然后在给药时在缓冲盐水中重构。
IV.检测方法
本文中描述的组合物和方法可用于检测样品例如来自于对象的样品中的糖类例如Siglec配体。可以使用本领域中已知的技术在来自于感兴趣的对象的组织、体液和/或细胞样品中检测所述糖类。所述体液样品可以是例如血液、血清或血浆。所述组织样品可以是例如肿瘤组织。所述细胞样品可以是例如癌细胞样品。应该理解，所述肿瘤组织或任何样品可以使用本领域中已知的技术保存或加工，例如福尔马林固定的石蜡包埋切片。
本发明提供了一种在来自于对象例如人类的样品例如体液样品、组织样品和/或细胞样品中检测糖类例如Siglec配体的存在和/或对其进行定量的方法。所述方法包括将所述样品与本文中描述的多聚体蛋白中的任一者合并，并且在所述样品中存在所述糖类的情况下检测包含所述多聚体蛋白和糖类例如Siglec配体的复合物的存在和/或对所述复合物进行定量。
本发明还提供了一种鉴定可能对使用Siglec抑制剂例如抗Siglec抗体的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于对象例如人类的样品例如体液样品、组织样品和/或细胞样品与本文中描述的多聚体蛋白中的任一者合并，并且在所述样品中存在所述糖类的情况下检测包含所述多聚体蛋白和糖类例如Siglec配体的复合物的存在和/或对所述复合物进行定量。复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec抑制剂的治疗有响应。
在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14和Siglec-15配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10和Siglec-11配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自Siglec-7和Siglec-9配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸、唾液酸化路易斯X、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(其中S表示硫酸酯)。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸和唾液酸化路易斯X。
在某些实施方式中，所述Siglec抑制剂是抗Siglec抗体。所述抗Siglec抗体可以是例如抗Siglec-3抗体、抗Siglec-5抗体、抗Siglec-6抗体、抗Siglec-7抗体、抗Siglec-8抗体、抗Siglec-9抗体、抗Siglec-10抗体或抗Siglec-11抗体。在某些实施方式中，所述抗Siglec抗体是抗Siglec-3抗体、抗Siglec-7抗体或抗Siglec-9抗体。在某些实施方式中，所述抗Siglec抗体是抗Siglec-7抗体或抗Siglec-9抗体。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-3抑制剂(例如抗Siglec-3抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-3配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-3配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-3抑制剂的治疗有响应。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-5抑制剂(例如抗Siglec-5抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-5配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-5配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-5抑制剂的治疗有响应。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-6抑制剂(例如抗Siglec-6抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-6配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-6配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-6抑制剂的治疗有响应。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-7抑制剂(例如抗Siglec-7抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-7配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-7配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-7抑制剂的治疗有响应。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-8抑制剂(例如抗Siglec-8抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-8配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-8配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-8抑制剂的治疗有响应。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-9抑制剂(例如抗Siglec-9抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白(例如包含含有SEQ ID NO：8的多肽的多聚体蛋白)在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-9配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-9配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-9抑制剂的治疗有响应。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-10抑制剂(例如抗Siglec-10抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-10配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-10配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-10抑制剂的治疗有响应。
本发明还涉及一种鉴定可能对使用Siglec-11抑制剂(例如抗Siglec-11抗体)的治疗有响应的患有癌症或炎性障碍的对象的方法。所述方法包括将来自于所述对象的样品与本文中描述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec-11配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec-11配体复合物，以及如果有的话检测所述复合物的存在和/或量，其中复合物的存在和/或量表明所述对象将对使用Siglec-11抑制剂的治疗有响应。
设想了可以使用本领域中已知的各种不同技术来检测和/或测量多聚体蛋白-糖类如Siglec配体的复合物的存在和/或量。在一种方法中，可以将所述多聚体蛋白偶联到可检测标记物例如放射性标记物、荧光标记物、视觉标记物、酶标记物或在诊断或预后测定法中有用的其他常规可检测标记物。或者，多聚体蛋白-糖类如Siglec配体的复合物的存在和/或量可以使用第二试剂例如与所述多聚体蛋白结合的试剂如抗体来检测和/或测量，所述第二试剂用可检测标记物例如放射性标记物、荧光标记物、视觉标记物、酶标记物或在诊断或预后测定法中有用的其他常规可检测标记物标记。
V.治疗性用途
本文中公开的组合物和方法可用于在对象中治疗Siglec介导的障碍。当在本文中使用时，术语“Siglec介导的障碍”是指由Siglec分子、例如由Siglec分子与Siglec配体之间的相互作用所介导、增强或以其他方式促进的障碍。
Siglec介导的障碍的实例包括例如癌症、炎性障碍和自身免疫障碍。
本发明提供了一种在需要的对象中治疗Siglec介导的障碍的方法。所述方法包括向所述对象单独地或与另一种治疗剂相组合给药有效量的重组多肽和/或多聚体蛋白，以在所述对象中治疗所述Siglec介导的障碍。在某些实施方式中，所述Siglec介导的障碍是Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14或Siglec-15介导的障碍。在某些实施方式中，所述Siglec介导的障碍是Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10或Siglec-11介导的障碍。
当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性药剂(例如根据本发明所述的重组多肽和/或多聚体蛋白)的量。有效量可以在一次或多次给药、施用或剂量中给药，并且不打算限于特定剂型或给药途径。
当在本文中使用时，“治疗”意味着在对象例如人类中治疗疾病。这包括：(a)抑制所述疾病，即停止其发展；和(b)缓解所述疾病，即引起疾病状态的减退。当在本文中使用时，术语“对象”和“患者”是指将要通过本文中描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿猴、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等)，更优选地包括人类。
本文中描述的方法和组合物可以单独地或与其他治疗剂和/或治疗模式相组合使用。当在本文中使用时，术语“相组合”给药被理解为意味着在所述对象患有所述障碍期间将两种(或更多种)不同治疗递送到所述对象，使得所述治疗对所述患者的效果在时间点上交叠。在某些实施方式中，在第二种治疗的递送开始时第一种治疗的递送仍在进行，使得在给药方面存在交叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的某些实施方式中，治疗由于组合给药而更加有效。例如，与在不存在第一种治疗的情况下给药第二种治疗时观察到的效果相比，所述第二种治疗更加有效，例如使用较少的第二种治疗观察到了等同的效果，或者所述第二种治疗更大程度地减轻症状，或对于所述第一治疗观察到类似的情况。在某些实施方式中，递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的减轻高于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减轻。所述两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或超过累加。所述递送可以使得当第二种治疗被递送时所述递送的第一种治疗的效果仍然可检测。在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与一种或多种另外的疗法例如IDO抑制剂或免疫检查点抑制剂例如PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、腺苷A2A受体抑制剂、B7-H3抑制剂、B7-H4抑制剂、BTLA抑制剂、KIR抑制剂、LAG3抑制剂、TEVI-3抑制剂、VISTA抑制剂或TIGIT抑制剂相组合。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec抑制剂，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达所述Siglec的一种或多种配体的癌细胞。
在某些实施方式中，所述Siglec配体是Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10或Siglec-11配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体是Siglec-7或Siglec-9配体。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸、唾液酸化路易斯X、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc(其中S表示硫酸酯)。在某些实施方式中，所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸和唾液酸化路易斯X。
在某些实施方式中，所述Siglec抑制剂是抗Siglec抗体。所述抗Siglec抗体可以是例如抗Siglec-3抗体、抗Siglec-5抗体、抗Siglec-6抗体、抗Siglec-7抗体、抗Siglec-8抗体、抗Siglec-9抗体、抗Siglec-10抗体或抗Siglec-11抗体。在某些实施方式中，所述抗Siglec抗体是抗Siglec-7抗体或抗Siglec-9抗体。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-3抑制剂(例如抗Siglec-3抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-3配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-5抑制剂(例如抗Siglec-5抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-5配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-6抑制剂(例如抗Siglec-6抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-6配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-7抑制剂(例如抗Siglec-7抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-7配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-8抑制剂(例如抗Siglec-8抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-8配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-9抑制剂(例如抗Siglec-9抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-9配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-10抑制剂(例如抗Siglec-10抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-10配体的癌细胞。
另一方面，本发明涉及一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec-11抑制剂(例如抗Siglec-11抗体)，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过本文中描述的方法被鉴定为包含表达Siglec-11配体的癌细胞。
癌症的实例包括实体肿瘤、软组织肿瘤、造血系统肿瘤和转移病灶。造血系肿瘤的实例包括白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性髓性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)例如转化的CLL、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金病、恶性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、多发性骨髓瘤或莱特尔综合征(莱特尔转化)。实体肿瘤的实例包括恶性肿瘤例如各种不同器官系统的肉瘤、腺癌和上皮癌，例如影响头颈部(包括咽)、甲状腺、肺(小细胞或非小细胞肺癌(NSCLC))、乳腺、淋巴系、胃肠(例如口腔、食道、胃、肝、胰腺、小肠、结肠和直肠、肛管)、生殖器和生殖泌尿道(例如肾、尿路上皮、膀胱、卵巢、子宫、宫颈、子宫内膜、前列腺、睾丸)、CNS(例如神经或神经胶质细胞如成神经细胞瘤或神经胶质瘤)或皮肤(例如黑素瘤)的恶性肿瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是上皮癌，例如上调唾液酸化聚糖的表达的上皮癌。示例性的上皮癌包括但不限于子宫内膜癌、结肠癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌或输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌和肝癌。上皮癌还包括癌例如腺泡癌、腺泡状癌、腺样囊性癌、腺囊癌、腺瘤癌、肾上腺皮质癌、肺泡癌、肺泡细胞癌、基底细胞癌、基底样细胞癌、基底样癌、基底鳞状细胞癌、细支气管肺泡癌、细支气管癌、支气管癌、脑样癌、胆管细胞癌、绒毛膜癌、胶样癌、粉刺性癌、子宫体癌、筛状癌、铠甲状癌、皮肤癌、柱状癌、柱状细胞癌、导管癌、硬癌、胚胎性癌、髓样癌、表皮样癌、腺样上皮细胞癌、外生性癌、溃疡性癌、纤维癌、胶样癌、胶状癌、巨细胞癌、巨细胞癌、腺癌、粒层细胞癌、毛发基质癌、血样癌、肝细胞癌、许特耳氏细胞癌、透明质癌、肾上腺样癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮内癌、上皮内癌、Krompecher’s癌、Kulchitzky细胞癌、大细胞癌、豆状癌、豆状癌、脂肪瘤癌、淋巴上皮癌、髓样癌、髓样癌、黑色素癌、软癌、粘液癌、粘液癌、粘液细胞癌、粘液表皮样癌、粘液癌、粘液癌、粘液瘤样癌、鼻咽癌、燕麦细胞癌、骨化性癌、骨样癌、乳头状癌、门脉周癌、浸润前癌、棘细胞癌、软糊状癌、肾脏肾细胞癌、储备细胞癌、肉瘤样癌、施奈德癌、硬癌、阴囊癌、印戒细胞癌、单纯癌、小细胞癌、马铃薯状癌、球状细胞癌、梭形细胞癌、海绵状癌、鳞状癌、鳞状细胞癌、弦癌、血管扩张性癌、血管扩张性癌、移行细胞癌、结节性皮癌、结节性皮癌、疣状癌和绒毛状癌。在某些实施方式中，所述上皮癌是子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌、输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌或肝癌。
在某些实施方式中，所述癌症是乳腺癌。在某些实施方式中，所述癌症是腺癌。在某些实施方式中，所述癌症是转移癌症。在某些实施方式中，所述癌症是难治性癌症。
示例性炎性障碍包括慢性炎性障碍(例如类风湿性关节炎、哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、牙周炎、溃疡性结肠炎和克罗恩病、窦炎和活动性肝炎)和急性炎性障碍(例如急性支气管炎、急性阑尾炎、皮炎、扁桃体炎、感染性脑膜炎和窦炎)。示例性自身免疫障碍包括1型糖尿病、类风湿性关节炎(RA)、银屑病/银屑病性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮(狼疮)、炎性肠病、阿狄森氏病、格雷夫斯病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血和乳糜泻。
所公开的在对象中治疗炎性障碍的方法的某些实施方式包括向所述对象给药有效量的本发明的重组多肽和/或多聚体蛋白，所述重组多肽和/或多聚体蛋白包含结合FcγRIIB1或FcγRIIB2 Fc受体的Fc结构域。
在整个本说明书中，在组合物被描述成具有、包括或包含特定组分的情况下或过程和方法被描述成具有、包括或包含特定步骤的情况下，设想了另外存在基本上由所叙述的组分构成或由其构成的本发明的组合物，并且另外存在基本上由所叙述的过程步骤构成或由其构成的本发明的过程和方法。
在本申请中，在要素或组分被描述为包括在所叙述的要素或组分名单中和/或选自所述名单的情况下，应该理解所述要素或组分可以是所叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自所叙述的要素或组分中的两者或更多者。
此外，应该理解，本文中描述的组合物或方法的要素和/或特点可以以不背离本公开的精神和范围的各种不同方式组合，不论在本文中明示还是暗示。例如，在指称特定化合物的情况下，该化合物可用于本发明的组合物的各种不同实施方式中和/或本发明的方法中，除非从上下文另有理解。换句话说，在本申请中，实施方式以能够书写并描绘清楚简明的申请的方式描述和描绘，但是应当理解并且可以理解，在不脱离本文的教导和发明的情况下可以对实施方式进行各种不同的组合或分离。例如，应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点可以适用于本文中描述和描绘的发明的所有方面。
应当理解，表述“……中的至少一者”分别包括在所述表述之后的每个所叙述的对象以及所叙述的对象中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个所叙述的对象相关联的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”、“含有”、包括其语法等同形式的使用，通常应该被理解为开放性且非限制性的，例如不排除另外的未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
在定量值之前使用术语“约”的情况下，除非另有具体陈述，否则本发明还包括所述具体定量值本身。当在本文中使用时，除非另有指明或推断，否则术语“约”是指与所述标称值相差±10％。
应该理解，步骤顺序或用于执行某些行动的顺序是不重要的，只要本发明仍然可操作即可。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有的实例或示例性语言例如“例如”或“包括”的使用仅打算更好地说明本发明，并且除非宣称，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言均不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践来说是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1
本实施例描述了包括被称为“蜻蜓”的二聚和四价构建物(参见图1B)、被称为“蝴蝶”的二聚和四价构建物(参见图1C)和被称为“水螅”的六聚和六价构建物(参见图1D)在内的各种不同Siglec结合构建物的构建，以及它们选择性结合唾液酸配体的能力。所述构建物含有源自于人类Siglec-7或Siglec-9的凝集素结构域。
如图1B中所示，所述蜻蜓构建物通过将含有N-端V-组免疫球蛋白样结构域和1个C2-组结构域的截短的人类Siglec细胞外结构域(ECD)的两个重复序列融合到Fc结构域的N-端来产生。通过所述Fc结构域的二聚化产生含有4个凝集素结构域的四价构建物。
如图1C中所示，所述蝴蝶构建物通过将含有Siglec N-端V-组免疫球蛋白样结构域和2个C2-组结构域的Siglec ECD融合到Fc结构域的N-端和C-端两端来产生。通过所述Fc结构域的二聚化产生含有4个凝集素结构域的四价构建物。
如图1D中所示，所述水螅构建物通过将含有Siglec N-端V-组免疫球蛋白样结构域和2个C2-组结构域的Siglec ECD融合到三聚化结构域(foldon)的N-端，然后融合到Fc结构域来产生。通过所述Fc结构域的二聚化和通过所述foldon结构域的三聚化产生含有6个凝集素结构域的六价构建物。
如图1A中所示，Siglec二聚体通过将含有Siglec N-端V-组免疫球蛋白样结构域和2个C2-组结构域的Siglec ECD融合到Fc结构域的N-端来产生。通过所述Fc结构域的二聚化产生含有2个凝集素结构域的二价构建物。
简单来说，所有构建物如下制备。将编码相关结构域的DNA使用PCR通过重叠延伸来组装，并克隆到哺乳动物表达载体pCEP(Invitrogen)中。使用ExpiFectamine(Invitrogen)，按照制造商的说明书将Expi293细胞用所述表达载体瞬时转染。在转染后6天收获上清液。蛋白质使用蛋白A树脂(Repligen)，按照制造商的说明书来纯化。
将Siglec-7水螅(由核酸序列SEQ ID NO：46编码的氨基酸序列SEQ ID NO：7)、蜻蜓(由核酸序列SEQ ID NO：47编码的氨基酸序列SEQ ID NO：9)、蝴蝶(由核酸序列SEQ IDNO：48编码的氨基酸序列SEQ ID NO：11)和二聚体(由核酸序列SEQ ID NO：50编码的氨基酸序列SEQ ID NO：49)表达、纯化，并使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行表征。如图2A中所示，所有四种蛋白质具有高纯度(>95％)，并在变性、非还原和还原条件下迁移到预期的表观分子量(MW)处。多聚体Siglec-7水螅、蜻蜓、蝴蝶和二聚体的组装使用孔径排阻层析(SEC-HPLC)来表征。如图2B中所示，Siglec-7水螅组装成多聚体分子并具有对应于MW≥400kDa的保留时间。Siglec-7二聚体、蜻蜓和蝴蝶具有比Siglec-7水螅更长的保留时间，与预期较低的MW相一致。
确定了Siglec-7水螅、蜻蜓、蝴蝶和二聚体的相对结合亲和性。也包括可商购的Siglec-7二聚体(R&D Systems)作为对照。Octet结合分析通过使用链亲合素包被的Octet生物传感器捕获生物素化的唾液酸聚合物Neu5Acα2-3Galb1-4(Fuca1-3)(6-HSO3)GlcNAcb-PAA-生物素(Glycotech#01-095)来进行。在含有0.1％BSA和0.02％Tween20的PBS缓冲液中100s的基线步骤后，将带有捕获的配体的生物传感器浸泡在含有100nM Siglec-7水螅、Siglec-7蜻蜓、Siglec-7蝴蝶或Siglec-7二聚体的孔中5分钟，然后是在含有0.1％BSA和0.02％Tween20的PBS缓冲液中3分钟的解离时间。如图3A中所示，Siglec-7水螅以比Siglec-7蜻蜓、蝴蝶或二聚体的信号更高的信号结合到所述唾液酸聚合物。由于Siglec-7水螅具有所测试的构建物中最高的结合信号，因此确定了Siglec-7水螅的结合动力学。结合动力学如上所述来测定，区别在于Siglec-7水螅的浓度为44nM至67pM(使用1:3稀释液)并且结合和解离时间为15分钟。如图3B中所示，Siglec-7水螅以0.1±0.025nM的表观结合亲和性结合到所述唾液酸聚合物。
也使用表达内源唾液酸Siglec配体的T47D乳腺癌细胞进行了FACS结合分析。将细胞与浓度为100nM至1.7pM(使用1:3稀释液)的Siglec-7水螅、蜻蜓、蝴蝶和二聚体温育。细胞表面上结合的Siglec-7构建物使用Alexa488标记的抗Fc第二抗体(Invitrogen)和流式细胞仪来检测。如图3C中所示，Siglec-7水螅以0.6nM的表观亲和性结合到表达唾液酸的T47D癌细胞。这个表观亲和性比Siglec-7蜻蜓、蝴蝶或二聚体的表观亲和性高至少100倍。
合在一起，这些结果显示Siglec-7水螅、Siglec-7蜻蜓和Siglec-7蝴蝶与Siglec-7二聚体相比以更高的表观亲和性与Siglec-7配体结合，其中Siglec-7水螅具有最高的表观亲和性。
Siglec-7水螅对唾液酸的特异性，通过使用已用唾液酸酶处理以除去细胞表面上的唾液酸的T47D细胞进行结合实验来证实。将T47D细胞用125nM细菌(霍乱弧菌)唾液酸酶在37℃处理1.5小时。包含未处理的T47D细胞作为阳性对照。Siglec-7水螅结合通过如上所述的FACS来测定。如图4A中所示，唾液酸酶处理废止了Siglec-7水螅与T47D细胞的结合。这些结果显示Siglec-7水螅与细胞的结合由唾液酸识别所介导。
通过将关键的结合配体的精氨酸残基(R124)用赖氨酸替换(R124K)以产生丧失结合能力的Siglec-7水螅突变体，进一步确认了Siglec-7水螅的选择性结合。FACS结合和Octet结合分析如上所述来进行。如图4B和图4C中所示，与野生型Siglec-7水螅相比，所述R124K替换显著降低了与T47D细胞和唾液酸聚合物的结合。
合在一起，这些结果显示Siglec-7水螅结合由唾液酸识别所介导。
将Siglec-9水螅(由核酸序列SEQ ID NO：45编码的氨基酸序列SEQ ID NO：8)表达、纯化，并使用SEC-HPLC进行表征。如图5A中所示，Siglec-9水螅组装成非均质的多聚体分子，MW≥300kDa并在SEC-HPLC中具有多个峰。Siglec-9水螅的非均质性可能是Siglec-9ECD结构域的二聚化的结果。
如上所述进行Octet结合分析以确定Siglec-9水螅和Siglec-9二聚体的相对结合亲和性。如图5B中所示，与二聚体构建物相比，Siglec-9水螅以更高的信号结合到唾液酸聚合物。也使用HT-29乳腺癌细胞如上所述进行了FACS结合分析。如图5C中所示，Siglec-9水螅以14.3nM的表观亲和性结合到表达唾液酸的HT-29癌细胞。合在一起，这些结果显示Siglec-9水螅与Siglec-9二聚体相比以更高的表观亲和性与Siglec-9配体结合。
Siglec-9水螅对唾液酸的特异性通过使用UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)缺陷的工程化的HT-29细胞进行结合实验来证实。GNE是唾液酸生物合成的限速酶，因此GNE缺陷的HT-29细胞(HT-29GNE KO)不呈递唾液酸Siglec配体。包含野生型HT-29细胞作为阳性对照。如图5D中所示，Siglec-9水螅不与所述HT-29GNE KO细胞结合。
通过将关键的结合配体的精氨酸残基(R120)用赖氨酸替换(R120K)以产生丧失结合能力的Siglec-9水螅突变体，进一步确认了Siglec-9水螅的选择性结合。Siglec-9水螅与K562细胞(其据报道表达Siglec配体)的结合如上所述通过FACS来测定，并且Siglec-9水螅与唾液酸聚合物的结合如上所述通过Octet来测定。如图6A和图6B中所示，与野生型Siglec-9水螅相比，所述R120K替换显著降低了与K562细胞和唾液酸聚合物的结合。
合在一起，这些结果显示Siglec-9水螅结合由唾液酸识别所介导。
实施例2
本实施例描述了Siglec-7和Siglec-9水螅构建物在细胞和组织样品中的结合活性。
将包括T47D乳腺癌细胞、K562髓系白血病细胞、BT20乳腺癌细胞、EMT6乳腺癌细胞、HT-29结肠癌细胞(野生型和GNE KO两者)和A549肺癌细胞(野生型和GNE KO两者)在内的癌细胞与Siglec-7水螅或Siglec-9水螅温育。将癌细胞和Siglec水螅(从300nM开始1:3连续稀释)在PBS中在4℃温育30mins，然后将细胞清洗，并且如实施例1中所述通过FACS测定Siglec水螅结合。
如图7A-H中所示，在T47D乳腺癌细胞、K562髓系白血病细胞、BT20乳腺癌细胞、EMT6乳腺癌细胞、HT-29结肠癌细胞和A549肺癌细胞上观察到Siglec-配体的不同表达水平(正如通过Siglec水螅结合所度量的)。正如预期，A549和HT-29GNE KO敲除细胞表现出很低或没有Siglec-7或Siglec-9水螅结合。
通过比较配体染色的荧光强度的几何平均值，将通过水螅结合观察到的Siglec-7和-9配体的表达情况与以前在Jandus等(2014)J.Clin.Invest.,124:1810-1820中观察到的表达情况进行比较。通过分别用Siglec-7水螅和Siglec-9水螅染色观察到的Siglec-7和-9配体得表达情况与Jandus等人中的结果相符。例如，Jandus等人发现，K562细胞的Siglec-7配体表达比Siglec-9配体表达高约3倍，A549细胞的Siglec-9配体表达比Siglec-7配体表达高约4倍，K562细胞比A549细胞的Siglec-7配体表达更高，并且A549与K562细胞之间的Siglec-9配体表达相当。水螅染色显示出K562细胞和A549细胞具有相同的表达情况。
使用Siglec-9水螅来确定来自于不同供体的原发性乳腺癌和黑素瘤肿瘤组织样品和相应的非癌性组织样品中Siglec-9配体的表达。
将组织样品包埋在石蜡中并以5μm切片。将切片固定在带正电荷的载片(Fisher)上。在使用之前将载片在60℃下干热烘烤至少1小时。组织切片的脱蜡使用标准条件和有机溶剂(与100％二甲苯温育5分钟共4次)和一系列乙醇溶液(与100％、70％和30％乙醇分别温育2分钟)，最后直至蒸馏水，以将所述组织充分水化并允许第一抗体和其他检测试剂的正确结合。在将组织切片脱蜡后，使用商品化蒸锅(97℃以上20分钟)作为热源，使用BioGenix缓冲液(Citra Plus Buffer，pH 7.1，BioGenix，目录号HK081-20K)并且不用蛋白酶K消化，使用蒸汽热诱导表位恢复来进行抗原修复。免疫组织化学使用标准流程，在BondRx自动染色仪(Leica Biosystems)上，在使用酶处理(1:1000)的情况下进行。将1:1000稀释的Siglec-9水螅与载片温育，并通过山羊抗小鼠IgG2a第二抗体(Thermofisher，目录号P131983)进行检测。按照制造商的流程使用键合聚合物细化检测(Bond Polymer RefineDetection)(Leica Biosystems)。然后将切片用苏木精复染，脱水，并使用TissueTek-Prisma和盖片机(Sakura)盖片。在Aperio AT2(Leica Biosystems)上进行全载片扫描(40x)。
如图8A和8B中所示，黑素瘤和乳腺癌肿瘤组织样品与相应的非癌组织样品相比具有更高染色。染色信号被定性分成用-、+、++、+++、++++和+++++表示的6个组，其中-指示阴性染色，并且+至+++++指示越来越强的染色。黑素瘤样品具有++至+++++范围内的染色，而非癌皮肤组织样品具有+的染色。乳腺癌样品具有+至+++的染色，而非癌乳腺组织样品具有-的染色。合在一起，这些结果显示在黑素瘤与乳腺癌肿瘤之间Siglec-9配体的表达不同，并且相对于非癌组织，黑素瘤和乳腺癌肿瘤每一者中的Siglec-9配体表达被上调。
实施例3
本实施例描述了Siglec-7和Siglec-9水螅构建物对可以从Z Biotech(Aurora,CO)获得的一系列聚糖阵列的结合活性。水螅构建物与所述阵列的结合如下测定：
(1)将阵列用阻断缓冲液(Z Biotech)阻断1小时；
(2)将阵列用所指示的缓冲液简短清洗两次(每孔100μL)；
(3)供应在所指示的缓冲液中的Siglec-7和Siglec-9水螅并温育2小时；
(4)将阵列用清洗缓冲液(Z Biotech)清洗；
(5)施加10μg/ml抗小鼠IgG抗体-Cy3(fCy3 AffiniPure山羊抗小鼠IgG(完整IgG)抗体，Fcγ片段特异性)；
(6)将阵列用清洗缓冲液(Z Biotech)清洗；以及
(7)将阵列用微阵列扫描仪在532nm波长处扫描。
图9是在结合测定法中使用的100种N-聚糖阵列(Z Biotech,Colorado)的图例。图10描绘了在缓冲液DB1和DB2中4nM的Siglec-9水螅与所述100种N-聚糖阵列的结合。Siglec-9水螅结合含有α2,3和α2,6-唾液酸连键的聚糖结构。
图11是在结合测定法中使用的Neu5Ac/Neu5Gc聚糖阵列(Z Biotech,Colorado)的图例。图12描绘了在50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.8)中4nM的Siglec-9水螅与所述Neu5Ac/Neu5Gc聚糖阵列的结合。同样地，Siglec-9水螅结合含有α2,3和α2,6-唾液酸连键的聚糖结构。
图13是在结合测定法中使用的鞘糖脂聚糖阵列(Z Biotech,Colorado)的图例。图14描绘了在50mM磷酸钠缓冲液(pH 5.8)中20nM的Siglec-7水螅与所述鞘糖脂聚糖阵列的结合。Siglec-7水螅结合含有α2,8-唾液酸连键的聚糖结构G11、G12、G13、G14、G15、G18、G19、G20、G21、G22、G27、G28、G30、G31和G32。另外，Siglec-7水螅结合含有α2,3-唾液酸连键的聚糖结构G1、G2、G26和G38。
本实施例证实了Siglec-9水螅结合含有α2,3和α2,6连接的唾液酸的聚糖，并且Siglec-7水螅结合含有α2,8连接的二唾液酸和某些α2,3连接的唾液酸的聚糖。
实施例4
本实施例描述了Siglec-7和Siglec-9水螅构建物对福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)人类组织的结合活性。。
简单来说，免疫组织化学(IHC)测定如下进行：
(1)将FFPE组织块以4-5μm的厚度切片，并将切片固定在带正电荷的毛细管间隙载玻片(Fisher,22-230-900)上。所述载片在使用之前烘烤(60℃，干热)。
(2)将组织切片脱蜡，所述脱蜡使用有机溶剂(100％二甲苯，更换四次)和一系列乙醇溶液(100％、70％、30％乙醇)，最后用蒸馏水，以将所述组织充分水化并允许Siglec-7水螅、Siglec-9水螅或其他试剂的正确结合。
(3)在将组织切片脱蜡后进行抗原修复。如Ladner等，(2000)CANCER RES.60:3493-3503中所述，使用商品化蒸锅(97℃以上20分钟)作为热源，将蒸汽热诱导表位恢复(SHIER)溶液抽取到在成对的显微镜载片之间形成的毛细管间隙中。
(4)按照表1中概述的通用程序，使用TechMate仪器平台和MIP ENV程序(其不包括用蛋白酶K进行酶消化以进一步暴露表位)通过IHC对样品进行测试。在IHC期间使用第一检测试剂的顺序检测，其对Siglec-配体具有高水平特异性。最终通过施加比色发色体(DAB；GBI Labs,C09-100)将Siglec-7水螅或Siglec-9水螅的位置可视化，所述发色体在辣根过氧化物酶聚合物(HRP聚合物，Agilent Dako,K4001)存在下在配体位点处沉淀出分立的不溶性反应产物。使用苏木精(蓝色染色剂；QML-SB,100005)将细胞核复染以评估细胞和组织形态。
表1
Figure BDA0002936553750000581
(5)将载片拆开，在蒸馏水中漂洗，在一系列乙醇溶液(70％、95％、100％乙醇)并在有机溶剂(100％二甲苯，四次更换)中脱水，然后使用CytoSeal(Thermo Scientific，8312-4，8310-4)永久性盖片，用于解释和储存。将载片在显微镜下检查以评估染色。
使用SHIER 7(Citra Plus，pH 7.1，BioGenex，HK081-20K)溶液暴露出FFPE组织中的表位。在热诱导表位修复后，使用运行QML搭档软件v3.96的TechMate仪器(RocheDiagnostics)自动执行过程步骤。这个自动化平台使用毛细管间隙法进行所有试剂更换，直至并包括复染和居间的缓冲液清洗。所有步骤在室温(25℃)下进行。
使用含有山羊血清(QML-SB，300003)的试剂制作缓冲液(RMB，来自于QML-SB)来制备Siglec-7水螅(最终工作浓度为0.35μg/ml)、Siglec-9水螅(最终工作浓度为0.5μg/ml)和小鼠IgG2a阴性对照抗体的工作稀释液。Siglec-7水螅或Siglec-9水螅在FFPE切片中配体-第一检测试剂相互作用位点处的靶识别使用被设计用于检测小鼠第一抗体的来自于Dako的单价EnVision-Plus HRP试剂盒(K4001)。
所有病理学分析和评分由通过职业验证的病理学家进行。Siglec-7水螅和Siglec-9水螅在一部分肿瘤和正常细胞中具有反应性。反应性主要位于在细胞质膜处，但在细胞质(弥散、颗粒状或局域性)和细胞核中也观察到染色。用于对通过IHC在福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)肿瘤样品中所检测到的结合的Siglec-7水螅或Siglec-9水螅分别进行评分的指导方针如下文所描述。
对于完全或部分细胞质膜表达来说，由通过职业验证的病理学家对Siglec-7水螅或Siglec-9水螅染色进行半定量评分。完全或部分细胞质膜染色包括在细胞外、积累在细胞之间或膜结合的质膜周信号。对于Siglec-7水螅或Siglec-9水螅染色来说，评分的主要分量是强度差异的百分率、H-评分和评分百分数(如下文所述)。对于结肠直肠样品来说，对肿瘤细胞的最终顶端质膜染色进行评分。肿瘤细胞中似乎是黏蛋白(不是Siglec-7配体或Siglec-9配体)的顶端染色不被评分。当Siglec-7水螅或Siglec-9水螅染色作为弥散性细胞质染色存在时，它在整个肿瘤中均匀表达，并使用0-3的相对量表指派总平均强度评分。在这种量表上，0表示不存在弥散性细胞质染色，1表示弱的弥散性细胞质染色，2表示中等的弥散性细胞质染色，3表示强烈的弥散性细胞质染色。此外，细胞质Siglec-7水螅和Siglec-9水螅染色可以表现为“局域性”。所述局域性图案被观察为在细胞质中与高尔基体相一致的深色染色口袋。局域性细胞质染色图案的存在或不存在的单独评分被提供为“是”或“否”(Y/N)。细胞质Siglec-7水螅或Siglec-9水螅染色也可以表现为“颗粒状”，在细胞质内具有与内质网(ER)相一致的小的针点状深色染色。由于通常在所有肿瘤中普遍观察到这种染色，因此未对其指派单独的评分。如果细胞质颗粒在质膜下方排成行，则它们被包括在质膜染色的评分中。偶尔在肿瘤细胞核中观察到Siglec-7水螅或Siglec-9水螅染色(通常为1+)。在对肿瘤组织进行评分时，评分不包括在基质、非肿瘤区域和邻近的正常组织中的任何周围染色。
为了获得对各种癌症指征中在肿瘤细胞质膜处的Siglec-7水螅或Siglec-9水螅染色的全面理解，使用了标准的评分百分数和H-评分方法两者来捕获观察到的反应性的图案。两种方法都需要记录Siglec-7水螅或Siglec-9水螅质膜染色处于4点半定量量表(0、1+、2+、3+)的相应差异强度处的肿瘤细胞的百分率。在这种量表上：0＝零、负或非特异性染色，1+＝低或弱染色，2+＝中等或温和染色，3+＝高或强染色。
评分百分数通过将在≥1+、≥2+或≥3+处的强度的百分率相加来计算。≥1+评分百分数＝(在1+处的％)+(在2+处的％)+(在3+处的％)，≥2+评分百分数＝(在2+处的％)+(在3+处的％)，并且≥3+评分百分数＝(在3+处的％)。因此，评分至0至100的范围内。
H-评分通过将表达强度(棕色染色)乘以它们在4点半定量量表(0、1+、2+、3+)上的相应差异强度的细胞的百分率相加来计算。H-评分＝[(在<1处的％)x 0]+[(在1+处的％)x1]+[(在2+处的％)x 2]+[(在3+处的％)x 3]。因此，评分在0至300的范围内。
图15描绘了各种不同的石蜡包埋的人类肿瘤活检样品载片的连续切片用Siglec-7水螅(左侧)或Siglec-9水螅(右侧)的代表性IHC染色以及伴随的H-评分。图15A和15B显示了独立的结肠直肠癌样品的染色的一系列H-评分，而图15C显示了独立的肺癌样品的染色的一系列H-评分。
实施例5
本实施例描述了肿瘤微阵列(TMA)用Siglec-7水螅、Siglec-9水螅或生物素标记的怀槐凝集素(MAL II；目录号B-1265，来自于Vector Labs,Burlingame,CA)的染色。
图16描绘了在所指示的癌症(黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌HER2+乳腺癌(BRCA)、膀胱癌和肾癌)中通过平均H-评分进行的Siglec-7水螅(S7-配体)和Siglec-9水螅(S9-配体)染色的比较。
实施例6
本实施例描述了水螅3构建物的构建和结合活性。设计并表达了各种不同的Siglec-3水螅(“水螅3”)。图17描绘了包含6个多肽的水螅-3 1.0版构建物，每个多肽以N至C端的方向包含Siglec-3 ECD(圆圈表示V-组结构域、椭圆形表示C2-组结构域)、三聚化(foldon)结构域(菱形)和Fc结构域(波浪线和矩形)。水螅-3 2.0版构建物以N至C端的方向包含Siglec-3 ECD、Fc结构域和三聚化(foldon)结构域。还产生了1.1版，其与1.0版一致，但在所述Siglec ECD与foldon结构域之间包括(Gly4Ser)2(SEQ ID NO：69)连接物。通过所述Fc结构域的二聚化和通过所述foldon结构域的三聚化产生了含有6个凝集素结构域的六价构建物。
应该理解，可以为本文中所描述的任何凝集素结合结构域构建1.0、1.1和2.0版本。
水螅3v1.0、水螅3v1.1和水螅3v2.0构建物被表达、纯化并使用SEC-HPLC进行表征。水螅3v1.0的氨基酸序列被提供为SEQ ID NO：53，其由核酸序列SEQ ID NO：54编码。水螅3v1.1的氨基酸序列被提供为SEQ ID NO：55，其由核酸序列SEQ ID NO：56编码。水螅3v2.0的氨基酸序列被提供为SEQ ID NO：57，其由核酸序列SEQ ID NO：58编码。
如图18B中所示，水螅3v1.0组装成MW<300kDa的多聚体分子，并且通过SEC-HPLC发现它具有与人类Sig3-hIgG1Fc二聚体相当的尺寸(图18A)。不希望受到理论限制，设想了水螅3v1.0的尺寸可能是两个Siglec-3 ECD结构域二聚化的结果。如图18C中所示，水螅3v1.1组装成MW<300kDa的多聚体分子，表明在Siglec-3 ECD与Foldon结构域之间添加连接物不产生具有水螅3的预测MW的分子。如图18D中所示，水螅3v2.0组装成MW≥300kDa的多聚体分子，表明将Foldon结构域放置在Fc结构域的c-端产生了具有水螅3的预测MW的分子。将水螅3v2.0用于下述的实验中。
通过使用UDP-N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)缺陷的工程化A549细胞进行结合实验，证实了水螅3对唾液酸的特异性。GNE是唾液酸生物合成的限速酶，结果，GNE缺陷的A549细胞(A549 GNE KO)不呈递显著量的唾液酸Siglec配体。野生型A549细胞被包括作为阳性对照。如图19中所示，水螅3极少与A549 GNE KO细胞结合。
使用K562 CML细胞如上所述进行FACS结合分析。如图20A中所示，水螅3以nM级的表观亲和性结合到表达唾液酸的K562癌细胞。通过将关键的结合配体的精氨酸残基(R121)用赖氨酸(R121K)或丙氨酸(R121A)替换以产生失去结合能力的水螅3突变体(水螅3LOB)，进一步验证了水螅3的选择性结合。FACS结合分析如上所述来进行。如图20A和图20B中所示，与野生型水螅3相比，R121K和R121A替换显著降低了与K562细胞的结合。
合在一起，这些结果显示水螅3结合由唾液酸识别所介导。
实施例7
本实施例示出了水螅9三重突变构建物的产生，其与野生型版本的水螅9相比聚集更少。
如实施例1中所述产生水螅9野生型(WT)，并产生在C141S和C278Y处具有突变的双重突变版本(“水螅9双重突变体(DM)”)。如图21中所示，与水螅9DM相比水螅9WT显得具有更多的半胱氨酸偶联的聚集体，正如由非还原泳道所示出的。图22通过SEC显示，与水螅9DM相比水螅9WT具有更多的聚集体。
实施例8
本实施例显示，用唾液酸酶处理水螅构建物可以提高所述构建物的稳定性和/或回收得率。
将含有水螅3或水螅9的上清液载样到蛋白A树脂上，并用PBS充分清洗。将该树脂用50mM Hepes pH6.8+50mM NaCl重悬浮成50％悬液，并向所述悬液添加霍乱弧菌(VC)或产脲节杆菌唾液酸酶。将其在室温温育3小时。模拟处理是仅仅树脂在50mM Hepes pH6.8+50mM NaCl中的悬液。在温育后，使用50mM Hepes pH6.8+50mM NaCl进行另一次清洗，然后用pH3.9的1M精氨酸洗脱水螅3或水螅9。如图23中所示，将K562细胞用这些构建物染色并通过流式细胞术进行分析。所述唾液酸酶预处理的水螅3构建物与模拟处理的水螅3相比显示出与K562细胞结合的显著提高。在图24中，比较了使用或不使用唾液酸酶预处理的水螅9WT、水螅9WT LOB和水螅9DM的回收得率。从水螅9构建物移除唾液酸显得导致稳定性和/或回收得率的提高。
通过参考并入
本文中提到的每个专利和科学文献的全部公开内容为所有目的通过参考并入本文。
等同物
在不背离本发明的精神或本质特征的情况下，本发明可以以其他特定形式来体现。因此，前述实施方式在所有方面都应被认为是说明性的，而不是限制本文所述的发明。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是前述说明书指示，并且落于权利要求书的等同性含义和范围之内的所有改变都应被涵盖在其中。
序列表
SEQ ID NO：1
YSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVT
SEQ ID NO：2
LTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTH
SEQ ID NO：3
QKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYP
SEQ ID NO：4
QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYP
SEQ ID NO：5
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO：6
EPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO：7
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SEQ ID NO：8
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SEQ ID NO：9
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SEQ ID NO：10
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SEQ ID NO：11
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SEQ ID NO：14
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SEQ ID NO：15
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SEQ ID NO：16
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SEQ ID NO：17
MHLLGPWLLLLVLEYLAFSDSSKWVFEHPETLYAWEGACVWIPCTYRALDGDLESFILFHNPEYNKNTSKFDGTRLYESTKDGKVPSEQKRVQFLGDKNKNCTLSIHPVHLNDSGQLGLRMESKTEKWMERIHLNVSERPFPPHIQLPPEIQESQEVTLTCLLNFSCYGYPIQLQWLLEGVPMRQAAVTSTSLTIKSVFTRSELKFSPQWSHHGKIVTCQLQDADGKFLSNDTVQLNVKHTPKLEIKVTPSDAIVREGDSVTMTCEVSSSNPEYTTVSWLKDGTSLKKQNTFTLNLREVTKDQSGKYCCQVSNDVGPGRSEEVFLQVQYAPEPSTVQILHSPAVEGSQVEFLCMSLANPLPTNYTWYHNGKEMQGRTEEKVHIPKILPWHAGTYSCVAENILGTGQRGPGAELDVQYPPKKVTTVIQNPMPIREGDTVTLSCNYNSSNPSVTRYEWKPHGAWEEPSLGVLKIQNVGWDNTTIACAACNSWCSWASPVALNVQYAPRDVRVRKIKPLSEIHSGNSVSLQCDFSSSHPKEVQFFWEKNGRLLGKESQLNFDSISPEDAGSYSCWVNNSIGQTASKAWTLEVLYAPRRLRVSMSPGDQVMEGKSATLTCESDANPPVSHYTWFDWNNQSLPYHSQKLRLEPVKVQHSGAYWCQGTNSVGKGRSPLSTLTVYYSPETIGRRVAVGLGSCLAILILAICGLKLQRRWKRTQSQQGLQENSSGQSFFVRNKKVRRAPLSEGPHSLGCYNPMMEDGISYTTLRFPEMNIPRTGDAESSEMQRPPPDCDDTVTYSALHKRQVGDYENVIPDFPEDEGIHYSELIQFGVGERPQAQENVDYVILKH
SEQ ID NO：18
ATGCATCTCCTCGGCCCCTGGCTCCTGCTCCTGGTTCTAGAATACTTGGCTTTCTCTGACTCAAGTAAATGGGTTTTTGAGCACCCTGAAACCCTCTACGCCTGGGAGGGGGCCTGCGTCTGGATCCCCTGCACCTACAGAGCCCTAGATGGTGACCTGGAAAGCTTCATCCTGTTCCACAATCCTGAGTATAACAAGAACACCTCGAAGTTTGATGGGACAAGACTCTATGAAAGCACAAAGGATGGGAAGGTTCCTTCTGAGCAGAAAAGGGTGCAATTCCTGGGAGACAAGAATAAGAACTGCACACTGAGTATCCACCCGGTGCACCTCAATGACAGTGGTCAGCTGGGGCTGAGGATGGAGTCCAAGACTGAGAAATGGATGGAACGAATACACCTCAATGTCTCTGAAAGGCCTTTTCCACCTCATATCCAGCTCCCTCCAGAAATTCAAGAGTCCCAGGAAGTCACTCTGACCTGCTTGCTGAATTTCTCCTGCTATGGGTATCCGATCCAATTGCAGTGGCTCCTAGAGGGGGTTCCAATGAGGCAGGCTGCTGTCACCTCGACCTCCTTGACCATCAAGTCTGTCTTCACCCGGAGCGAGCTCAAGTTCTCCCCACAGTGGAGTCACCATGGGAAGATTGTGACCTGCCAGCTTCAGGATGCAGATGGGAAGTTCCTCTCCAATGACACGGTGCAGCTGAACGTGAAGCACACCCCGAAGTTGGAGATCAAGGTCACTCCCAGTGATGCCATAGTGAGGGAGGGGGACTCTGTGACCATGACCTGCGAGGTCAGCAGCAGCAACCCGGAGTACACGACGGTATCCTGGCTCAAGGATGGGACCTCGCTGAAGAAGCAGAATACATTCACGCTAAACCTGCGCGAAGTGACCAAGGACCAGAGTGGGAAGTACTGCTGTCAGGTCTCCAATGACGTGGGCCCGGGAAGGTCGGAAGAAGTGTTCCTGCAAGTGCAGTATGCCCCGGAACCTTCCACGGTTCAGATCCTCCACTCACCGGCTGTGGAGGGAAGTCAAGTCGAGTTTCTTTGCATGTCACTGGCCAATCCTCTTCCAACAAATTACACGTGGTACCACAATGGGAAAGAAATGCAGGGAAGGACAGAGGAGAAAGTCCACATCCCAAAGATCCTCCCCTGGCACGCTGGGACTTATTCCTGTGTGGCAGAAAACATTCTTGGTACTGGACAGAGGGGCCCGGGAGCTGAGCTGGATGTCCAGTATCCTCCCAAGAAGGTGACCACAGTGATTCAAAACCCCATGCCGATTCGAGAAGGAGACACAGTGACCCTTTCCTGTAACTACAATTCCAGTAACCCCAGTGTTACCCGGTATGAATGGAAACCCCATGGCGCCTGGGAGGAGCCATCGCTTGGGGTGCTGAAGATCCAAAACGTTGGCTGGGACAACACAACCATCGCCTGCGCAGCTTGTAATAGTTGGTGCTCGTGGGCCTCCCCTGTCGCCCTGAATGTCCAGTATGCCCCCCGAGACGTGAGGGTCCGGAAAATCAAGCCCCTTTCCGAGATTCACTCTGGAAACTCGGTCAGCCTCCAATGTGACTTCTCAAGCAGCCACCCCAAAGAAGTCCAGTTCTTCTGGGAGAAAAATGGCAGGCTTCTGGGGAAAGAAAGCCAGCTGAATTTTGACTCCATCTCCCCAGAAGATGCTGGGAGTTACAGCTGCTGGGTGAACAACTCCATAGGACAGACAGCGTCCAAGGCCTGGACACTTGAAGTGCTGTATGCACCCAGGAGGCTGCGTGTGTCCATGAGCCCGGGGGACCAAGTGATGGAGGGGAAGAGTGCAACCCTGACCTGTGAGAGCGACGCCAACCCTCCCGTCTCCCACTACACCTGGTTTGACTGGAATAACCAAAGCCTCCCCTACCACAGCCAGAAGCTGAGATTGGAGCCGGTGAAGGTCCAGCACTCGGGTGCCTACTGGTGCCAGGGGACCAACAGTGTGGGCAAGGGCCGTTCGCCTCTCAGCACCCTCACCGTCTACTATAGCCCGGAGACCATCGGCAGGCGAGTGGCTGTGGGACTCGGGTCCTGCCTCGCCATCCTCATCCTGGCAATCTGTGGGCTCAAGCTCCAGCGACGTTGGAAGAGGACACAGAGCCAGCAGGGGCTTCAGGAGAATTCCAGCGGCCAGAGCTTCTTTGTGAGGAATAAAAAGGTTAGAAGGGCCCCCCTCTCTGAAGGCCCCCACTCCCTGGGATGCTACAATCCAATGATGGAAGATGGCATTAGCTACACCACCCTGCGCTTTCCCGAGATGAACATACCACGAACTGGAGATGCAGAGTCCTCAGAGATGCAGAGACCTCCCCCGGACTGCGATGACACGGTCACTTATTCAGCATTGCACAAGCGCCAAGTGGGCGACTATGAGAACGTCATTCCAGATTTTCCAGAAGATGAGGGGATTCATTACTCAGAGCTGATCCAGTTTGGGGTCGGGGAGCGGCCTCAGGCACAAGAAAATGTGGACTATGTGATCCTCAAACATTGA
SEQ ID NO：19
MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ
SEQ ID NO：20
TCTGCTCACACAGGAAGCCCTGGAAGCTGCTTCCTCAGACATGCCGCTGCTGCTACTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCCCTGGCTATGGATCCAAATTTCTGGCTGCAAGTGCAGGAGTCAGTGACGGTACAGGAGGGTTTGTGCGTCCTCGTGCCCTGCACTTTCTTCCATCCCATACCCTACTACGACAAGAACTCCCCAGTTCATGGTTACTGGTTCCGGGAAGGAGCCATTATATCCAGGGACTCTCCAGTGGCCACAAACAAGCTAGATCAAGAAGTACAGGAGGAGACTCAGGGCAGATTCCGCCTCCTTGGGGATCCCAGTAGGAACAACTGCTCCCTGAGCATCGTAGACGCCAGGAGGAGGGATAATGGTTCATACTTCTTTCGGATGGAGAGAGGAAGTACCAAATACAGTTACAAATCTCCCCAGCTCTCTGTGCATGTGACAGACTTGACCCACAGGCCCAAAATCCTCATCCCTGGCACTCTAGAACCCGGCCACTCCAAAAACCTGACCTGCTCTGTGTCCTGGGCCTGTGAGCAGGGAACACCCCCGATCTTCTCCTGGTTGTCAGCTGCCCCCACCTCCCTGGGCCCCAGGACTACTCACTCCTCGGTGCTCATAATCACCCCACGGCCCCAGGACCACGGCACCAACCTGACCTGTCAGGTGAAGTTCGCTGGAGCTGGTGTGACTACGGAGAGAACCATCCAGCTCAACGTCACCTATGTTCCACAGAACCCAACAACTGGTATCTTTCCAGGAGATGGCTCAGGGAAACAAGAGACCAGAGCAGGAGTGGTTCATGGGGCCATTGGAGGAGCTGGTGTTACAGCCCTGCTCGCTCTTTGTCTCTGCCTCATCTTCTTCATAGTGAAGACCCACAGGAGGAAAGCAGCCAGGACAGCAGTGGGCAGGAATGACACCCACCCTACCACAGGGTCAGCCTCCCCGAAACACCAGAAGAAGTCCAAGTTACATGGCCCCACTGAAACCTCAAGCTGTTCAGGTGCCGCCCCTACTGTGGAGATGGATGAGGAGCTGCATTATGCTTCCCTCAACTTTCATGGGATGAATCCTTCCAAGGACACCTCCACCGAATACTCAGAGGTCAGGACCCAGTGAGGAACCCACAAGAGCATCAGGCTCAGCTAGAAGATCCACATCCTCTACAGGTCGGGGACCAAAGGCTGATTCTTGGAGATTTAACACCCCACAGGCAATGGGTTTATAGACATTATGTGAGTTTCCTGCTATATTAACATCATCTTAGACTTTGCAAGCAGAGAGTCGTGGAATCAAATCTGTGCTCTTTCATTTGCTAAGTGTATGATGTCACACAAGCTCCTTAACCTTCCATGTCTCCATTTTCTTCTCTGTGAAGTAGGTATAAGAAGTCCTATCTCATAGGGATGCTGTGAGCATTAAATAAAGGTACACATGGAAAACACCAGTC
SEQ ID NO：21
MIFLTALPLFWIMISASRGGHWGAWMPSSISAFEGTCVSIPCRFDFPDELRPAVVHGVWYFNSPYPKNYPPVVFKSRTQVVHESFQGRSRLLGDLGLRNCTLLLSNVSPELGGKYYFRGDLGGYNQYTFSEHSVLDIVNTPNIVVPPEVVAGTEVEVSCMVPDNCPELRPELSWLGHEGLGEPAVLGRLREDEGTWVQVSLLHFVPTREANGHRLGCQASFPNTTLQFEGYASMDVKYPPVIVEMNSSVEAIEGSHVSLLCGADSNPPPLLTWMRDGTVLREAVAESLLLELEEVTPAEDGVYACLAENAYGQDNRTVGLSVMYAPWKPTVNGTMVAVEGETVSILCSTQSNPDPILTIFKEKQILSTVIYESELQLELPAVSPEDDGEYWCVAENQYGQRATAFNLSVEFAPVLLLESHCAAARDTVQCLCVVKSNPEPSVAFELPSRNVTVNESEREFVYSERSGLVLTSILTLRGQAQAPPRVICTARNLYGAKSLELPFQGAHRLMWAKIGPVGAVVAFAILIAIVCYITQTRRKKNVTESPSFSAGDNPPVLFSSDFRISGAPEKYESERRLGSERRLLGLRGEPPELDLSYSHSDLGKRPTKDSYTLTEELAEYAEIRVK
SEQ ID NO：22
ATGATATTCCTCACGGCACTGCCTCTGTTCTGGATTATGATTTCAGCCTCCCGAGGGGGTCACTGGGGTGCCTGGATGCCCTCGTCCATCTCGGCCTTCGAAGGCACGTGCGTCTCCATCCCCTGCCGCTTTGACTTCCCGGATGAGCTGCGGCCCGCTGTGGTGCATGGTGTCTGGTACTTCAATAGCCCCTACCCCAAGAACTACCCCCCGGTGGTCTTCAAGTCGCGCACCCAAGTAGTCCACGAGAGCTTCCAGGGCCGCAGCCGCCTCCTGGGGGACCTGGGCCTGCGAAACTGCACCCTCCTGCTCAGCAACGTCAGCCCCGAGCTGGGCGGGAAGTACTACTTCCGTGGGGACCTGGGCGGCTACAACCAGTACACCTTCTCAGAGCACAGCGTCCTGGATATCGTCAACACCCCCAACATCGTGGTGCCCCCAGAGGTGGTGGCAGGCACGGAGGTGGAGGTCAGCTGCATGGTGCCGGACAACTGCCCAGAGCTGCGCCCTGAGCTGAGCTGGCTGGGCCACGAGGGGCTGGGGGAGCCCGCTGTGCTGGGCCGGCTGCGGGAGGACGAGGGCACCTGGGTGCAGGTGTCACTGCTGCACTTCGTGCCCACGAGGGAGGCCAACGGCCACAGGCTGGGCTGCCAGGCCTCCTTCCCCAACACCACCCTGCAGTTCGAGGGCTACGCCAGCATGGACGTCAAGTACCCCCCGGTGATTGTGGAGATGAACTCCTCGGTGGAGGCCATCGAGGGCTCCCACGTGAGCCTGCTCTGTGGGGCTGACAGCAACCCCCCGCCGCTGCTGACCTGGATGCGGGACGGGACAGTCCTCCGGGAGGCGGTGGCCGAGAGCCTGCTCCTGGAGCTGGAGGAGGTGACCCCCGCCGAAGACGGCGTCTATGCCTGCCTGGCCGAGAATGCCTATGGCCAGGACAACCGCACCGTGGGGCTCAGTGTCATGTATGCACCCTGGAAGCCAACAGTGAACGGGACAATGGTGGCCGTAGAGGGGGAGACGGTCTCTATCTTGTGCTCCACACAGAGCAACCCGGACCCTATTCTCACCATCTTCAAGGAGAAGCAGATCCTGTCCACGGTCATCTACGAGAGCGAGCTGCAGCTGGAGCTGCCGGCCGTGTCACCCGAGGATGATGGAGAGTACTGGTGTGTGGCTGAGAACCAGTATGGCCAGAGGGCCACCGCCTTCAACCTGTCTGTGGAGTTCGCCCCTGTGCTCCTCCTGGAGTCCCACTGCGCGGCAGCCCGAGACACGGTGCAGTGCCTGTGCGTGGTGAAGTCCAACCCGGAGCCGTCCGTGGCCTTTGAGCTGCCATCGCGCAATGTGACCGTGAACGAGAGCGAGCGGGAGTTCGTGTACTCGGAGCGCAGCGGCCTCGTGCTCACCAGCATCCTCACGCTGCGGGGGCAGGCCCAGGCCCCGCCCCGCGTCATCTGCACCGCGAGGAACCTCTATGGCGCCAAGAGCCTGGAGCTGCCCTTCCAGGGAGCCCATCGACTGATGTGGGCCAAGATCGGGCCTGTGGGCGCCGTGGTCGCCTTTGCCATCCTGATTGCCATCGTCTGCTACATTACCCAGACACGCAGGAAAAAGAACGTGACAGAGAGCCCCAGCTTCTCGGCAGGGGACAACCCTCCCGTCCTGTTCAGCAGCGACTTCCGCATCTCTGGGGCACCAGAGAAGTACGAGAGCGAGAGGCGCCTGGGATCTGAGAGGAGGCTGCTGGGCCTTCGGGGTGAGCCCCCAGAGCTGGACCTGAGCTATTCTCACTCGGACCTGGGGAAACGGCCCACCAAGGACAGCTACACGCTGACGGAGGAGCTAGCTGAGTATGCTGAAATCCGGGTCAAGTGA
SEQ ID NO：23
MLPLLLLPLLWGGSLQEKPVYELQVQKSVTVQEGLCVLVPCSFSYPWRSWYSSPPLYVYWFRDGEIPYYAEVVATNNPDRRVKPETQGRFRLLGDVQKKNCSLSIGDARMEDTGSYFFRVERGRDVKYSYQQNKLNLEVTALIEKPDIHFLEPLESGRPTRLSCSLPGSCEAGPPLTFSWTGNALSPLDPETTRSSELTLTPRPEDHGTNLTCQMKRQGAQVTTERTVQLNVSYAPQTITIFRNGIALEILQNTSYLPVLEGQALRLLCDAPSNPPAHLSWFQGSPALNATPISNTGILELRRVRSAEEGGFTCRAQHPLGFLQIFLNLSVYSLPQLLGPSCSWEAEGLHCRCSFRARPAPSLCWRLEEKPLEGNSSQGSFKVNSSSAGPWANSSLILHGGLSSDLKVSCKAWNIYGSQSGSVLLLQGRSNLGTGVVPAALGGAGVMALLCICLCLIFFLIVKARRKQAAGRPEKMDDEDPIMGTITSGSRKKPWPDSPGDQASPPGDAPPLEEQKELHYASLSFSEMKSREPKDQEAPSTTEYSEIKTSK
SEQ ID NO：24
GTGCGCGTCCACAGCTCTCACTCACCCTCCGGCTTCCTGTCGGGGCTTTCTCAGCCCCACCCCACGTTTGGACATTTGGAGCATTTCCTTCCCTGACAGCCGGACCTGGGACTGGGCTGGGGCCCTGGCGGATGGAGACATGCTGCCCCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTGTGGGGGGGGTCCCTGCAGGAGAAGCCAGTGTACGAGCTGCAAGTGCAGAAGTCGGTGACGGTGCAGGAGGGCCTGTGCGTCCTTGTGCCCTGCTCCTTCTCTTACCCCTGGAGATCCTGGTATTCCTCTCCCCCACTCTACGTCTACTGGTTCCGGGACGGGGAGATCCCATACTACGCTGAGGTTGTGGCCACAAACAACCCAGACAGAAGAGTGAAGCCAGAGACCCAGGGCCGATTCCGCCTCCTTGGGGATGTCCAGAAGAAGAACTGCTCCCTGAGCATCGGAGATGCCAGAATGGAGGACACGGGAAGCTATTTCTTCCGCGTGGAGAGAGGAAGGGATGTAAAATATAGCTACCAACAGAATAAGCTGAACTTGGAGGTGACAGCCCTGATAGAGAAACCCGACATCCACTTTCTGGAGCCTCTGGAGTCCGGCCGCCCCACAAGGCTGAGCTGCAGCCTTCCAGGATCCTGTGAAGCGGGACCACCTCTCACATTCTCCTGGACGGGGAATGCCCTCAGCCCCCTGGACCCCGAGACCACCCGCTCCTCGGAGCTCACCCTCACCCCCAGGCCCGAGGACCATGGCACCAACCTCACCTGTCAGATGAAACGCCAAGGAGCTCAGGTGACCACGGAGAGAACTGTCCAGCTCAATGTCTCCTATGCTCCACAGACCATCACCATCTTCAGGAACGGCATAGCCCTAGAGATCCTGCAAAACACCTCATACCTTCCGGTCCTGGAGGGCCAGGCTCTGCGGCTGCTCTGTGATGCTCCCAGCAACCCCCCTGCACACCTGAGCTGGTTCCAGGGCTCCCCTGCCCTGAACGCCACCCCCATCTCCAATACCGGGATCTTGGAGCTTCGTCGAGTAAGGTCTGCAGAAGAAGGAGGCTTCACCTGCCGCGCTCAGCACCCGCTGGGCTTCCTGCAAATTTTTCTGAATCTCTCAGTTTACTCCCTCCCACAGTTGCTGGGCCCCTCCTGCTCCTGGGAGGCTGAGGGTCTGCACTGCAGATGCTCCTTTCGAGCCCGGCCGGCCCCCTCCCTGTGCTGGCGGCTTGAGGAGAAGCCGCTGGAGGGGAACAGCAGCCAGGGCTCATTCAAGGTCAACTCCAGCTCAGCTGGGCCCTGGGCCAACAGCTCCCTGATCCTCCACGGGGGGCTCAGCTCCGACCTCAAAGTCAGCTGCAAGGCCTGGAACATCTATGGGTCCCAGAGCGGCTCTGTCCTGCTGCTGCAAGGGAGATCGAACCTCGGGACAGGAGTGGTTCCTGCAGCCCTTGGTGGTGCTGGTGTCATGGCCCTGCTCTGTATCTGTCTGTGCCTCATCTTCTTTTTAATAGTGAAAGCCCGCAGGAAGCAAGCAGCTGGGAGACCAGAGAAAATGGATGATGAAGACCCCATTATGGGTACCATCACCTCGGGTTCCAGGAAGAAGCCCTGGCCAGACAGCCCCGGAGATCAAGCATCTCCTCCTGGGGATGCCCCTCCCTTGGAAGAACAAAAGGAGCTCCATTATGCCTCCCTTAGTTTTTCTGAGATGAAGTCGAGGGAGCCTAAGGACCAGGAGGCCCCAAGCACCACGGAGTACTCGGAGATCAAGACAAGCAAGTGAGGATTTGCCCAGAGTTCAGTCCTGGCTGGAGGAGCCACAGCCTGTCTGGGGGAAAGGACAAGTCAGGGACCACTTGCTGAAGCACGAAGAGCCCTTGTGGCAATGTTAACATTAACTGATGTTTAAGTGCTCCAAGCAGATGGAATTAGAGAGGTGGGCTCAAATCTAGGCCCTGGCACTGTCATCAAGCAATTCACTGCATCCCTCTGTGCCTCAGTTTCCCATTCTGTAAATCAGAGATCATGCATGCTACCTCAAAGGTTGTTGTGAACATTAAAGAAATCAACACATGGAAATCAACCAACATGGGTCCTGGAACAGGGCGTTGTGCTCAGTGCTTTCTGGTCTCTCTTCCTTGAATAGAAAGGTCCTGCTGGCAAGTTCTCTCAAGGCTGGGGATGACCAGGCACAAAAAACAGGGCAGCAATATGTTGGTGTCACTCCCCTTCCCAAAACTCTTCGAAGACTCCCTAGGAAAGACCAGCCCCTCAGCCTGGCACTTGGTTCATGATGTGGGATCTTATATCCTTGCCAGAGTCATATCTTTGCCCACTTTTACCTGCAATCCTTGCATCATATTCCTTTGGCTCCAGTCCTTCATTTATGAGACCCATAGGAATCCTTCCAACAGCCAAAGAGTTGAGTCTAACTCTTTCCTGCCCAAACCCATTCACGGCCCCCTGGCCTTAGACAATATATCACAAGCATCTCCCCTGACACATAAAGTC
SEQ ID NO：25
MQGAQEASASEMLPLLLPLLWAGALAQERRFQLEGPESLTVQEGLCVLVPCRLPTTLPASYYGYGYWFLEGADVPVATNDPDEEVQEETRGRFHLLWDPRRKNCSLSIRDARRRDNAAYFFRLKSKWMKYGYTSSKLSVRVMALTHRPNISIPGTLESGHPSNLTCSVPWVCEQGTPPIFSWMSAAPTSLGPRTTQSSVLTITPRPQDHSTNLTCQVTFPGAGVTMERTIQLNVSYAPQKVAISIFQGNSAAFKILQNTSSLPVLEGQALRLLCDADGNPPAHLSWFQGFPALNATPISNTGVLELPQVGSAEEGDFTCRAQHPLGSLQISLSLFVHWKPEGRAGGVLGAVWGASITTLVFLCVCFIFRVKTRRKKAAQPVQNTDDVNPVMVSGSRGHQHQFQTGIVSDHPAEAGPISEDEQELHYAVLHFHKVQPQEPKVTDTEYSEIKIHK
SEQ ID NO：26
GCGGGACACAGTCTCTTCTCCTCTGCTCTTCTTTGGGCAGGTCTCTGGGTCTCAAAGTTTCCGTCTGCTCTGTGCAGAGGGAGTGGAGCTCCGAGGGCTTGTGGCTTCGCAGTTCCTCTTCTGTGAACAGCCGAGATCACGCGCTCCTCCCCAGCCACCCGTTCCTCCCCGCAGTCCTTCCCCTCCACTCCCTTCCCCTTCTCTGCTCATGCAGGGAGCCCAGGAAGCCTCCGCCTCAGAGATGCTACCGCTGCTGCTGCCCCTGCTGTGGGCAGGGGCCCTGGCTCAGGAGCGGAGATTCCAGCTGGAGGGGCCAGAGTCACTGACGGTGCAGGAGGGTCTGTGCGTCCTCGTACCCTGCAGATTGCCCACTACCCTTCCAGCCTCGTACTATGGTTATGGCTACTGGTTCCTGGAAGGGGCTGATGTTCCAGTGGCCACAAACGACCCAGACGAAGAAGTGCAGGAGGAGACCCGGGGCCGATTCCACCTCCTCTGGGATCCCAGAAGGAAGAACTGCTCCCTGAGCATCAGAGATGCCCGGAGGAGGGACAATGCTGCATACTTCTTTCGGTTGAAGTCCAAATGGATGAAATACGGTTATACATCTTCCAAGCTCTCTGTGCGTGTGATGGCCCTGACCCACAGGCCCAACATCTCCATCCCAGGGACCCTGGAGTCTGGCCATCCCAGCAATCTGACCTGCTCTGTGCCCTGGGTCTGTGAGCAGGGGACGCCCCCCATCTTCTCCTGGATGTCAGCTGCCCCCACCTCCCTGGGCCCCAGGACCACCCAGTCCTCGGTGCTCACAATCACCCCACGGCCCCAGGACCACAGCACCAACCTCACCTGTCAGGTGACGTTCCCTGGAGCCGGTGTGACCATGGAGAGAACCATCCAGCTCAATGTCTCCTCCTTCAAAATCCTGCAAAACACCTCGTCCCTCCCTGTCCTGGAGGGCCAGGCTCTGCGGCTGCTCTGTGATGCTGACGGCAACCCCCCTGCACACCTGAGCTGGTTCCAGGGCTTCCCCGCCCTGAACGCCACCCCCATCTCCAATACCGGGGTCCTGGAGCTGCCTCAAGTAGGGTCTGCAGAAGAAGGAGATTTCACCTGCCGTGCTCAGCATCCTCTGGGCTCCCTGCAAATCTCTCTGAGTCTCTTTGTGCATTGGAAACCAGAAGGCAGGGCTGGTGGTGTCCTGGGAGCAGTCTGGGGAGCTAGCATCACAACCCTGGTTTTCCTCTGTGTTTGCTTCATCTTCAGAGTGAAGACTAGAAGGAAGAAAGCAGCCCAGCCAGTGCAAAACACGGATGATGTGAACCCCGTCATGGTCTCAGGCTCCAGGGGTCATCAGCACCAGTTCCAGACAGGCATAGTTTCAGACCACCCTGCTGAGGCTGGCCCCATCTCAGAAGATGAGCAGGAGCTCCACTACGCTGTCCTACACTTCCACAAGGTGCAACCTCAGGAACCAAAGGTCACCGACACTGAGTACTCAGAAATCAAGATACACAAGTGAGGAATTGTCCAAAGCCATAACCTTGATTGGAGAGAACATGGTACCTCTCAGTGTATTGGTTACTAGGGCTGCCACAGCAATGTACCACAAACCGAGTGACATAAACACAGAACTTTATTTTCGTATAGTTTCAGATGTTAGAGGTCTGAGAACAAGGTGTTATCAGGGTTGGTCCCTTCTAAGGCCTCTCTTGTTGGCTTGTAGATGGCTGTCTCCTCCTTGTGTCTTCACATGGTCTTTCCTCTGAGTGTGTTTGTGTCCTAATCTTCTCTTCTTATAAAGACACTAGTCATATTGGATTAGGGCCTCCCCATGACCTAATTTAAATAAATTAACTATTTAAAGACCCTCCAAATACAGTAACCTTCTGAGATATTGAGATTTAGGACTTCCAACATATGAATTTTAGAAGGGAACAATTTAGCCCATAACACTGTGTCCAATTCTTTTAAAATTAATGTTTTTGTTGTAAATGGACTATATAAATACCTTCGTATATATGGCAGACCACAGGACTTCTGTCCAAGAGAACTGAGTTCAACTCCATCTATGCCAGCTATTGAGCAAGTCGCTTTATGTCCCTGCTCTGTAAGGCAGGGAAATAATTTCCATCTAACCAGATTATTGTGAAAGGTCAAAGAAAGCATACAGCTAACATACAGCTTTGTTAGCTGTAAAACAGCTAACAAAGGCCCTGACACAAAGGTTTTCATAAAGTCTGTATATTTTTGTAAATGAATGCCTTGTATCTGGCTTTGGCTAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGAGATGGAGTCTTGCTGTATCTCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCGATCTTGGCTCAGTGCAAGCTTCGCCCCCTGGGTTCACACCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGCACCCACCACCACACCCGGCTAATTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACCGTGTTAGCCAGGATGGTCTTGATCTCCTGACCTCGTGATCTGCCCTCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGAGATTACAGGCATGAGCCACCGCACCCGGCTTTGATTAGCTGTTTTAACAGACGGTTTCTGCTGGCAATTTCTTCTAAGGCTGAAAAGGAGTAGGCCCAGAGGCCACAGCACCAGGTGTCTGTGTCACCCCCTGTTCAGAACTCTTCACGACTCCCCAAAATAAGGTTTCCATCCATCATCTTTCTGCTCAAGGCTCTCTACATGATCTTGTCCATCCAGATTTCCCCAGATCAATTCCTCACCAGTCACCAATACCCCATGTCCATTTCCACAGCTTCCTCTTACAAATCCCAGTCTCCACTATTCCAGTGAAATTGAAGAAAGCATTTAATGAAGACCAACTATTAAGGAAAATTCTTAAGAGTAGCCATGAAAAATAAAAAGATAGATTACACTTAAAAGACCACAGTTAGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGTGGGTGGATCACTGGAGGTCAGGAGTTCGAGACTGGTCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAATACAAAAATTAGCTCGGTGTGGTGGCACTTGCCTGTAATCCCAGGTACTTCTGCAGGTTGAAGCAGGAGAATTGCTTGAACCTGGGAGGTGGAGGTTGAAGTGAGCTGAGATTGCATCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCGAGACTCCAACTCAGAAAAAGCAAAACAAAACAAACAAACAAGCAAAAAACCACAATTAGACTGACAGCTGACTTTTTTAGGAGCAATATTGGAAGGCTAAATGCAATAGAAAGATGTCTTTGATGGCTTAAGAGAAATAAATGTTGTTTTAGAAAGCCTACTCAATGAAAACACATTTTAAGACTGAAAGTGAAATATAGATATTTTAAGGAAAACCAAAATATGTGAGTGTTAATAAAGAAAAGATTTCTCAAATAAATTCTAAAACATATAATTCAGGTATTAGGAAAGTGATCCCAGATTAGATTTTTGAGATCCAAAAAAAATGAAAACCTAGGAAAGTAGCAAATATGTGAGCAAAATGAAACAAATACTTGTTGTAAAAATGATGGTTTGTAGAGGGGTCAAACATCAAATGTAATATTGAAATACCAATATTATATAGCCCAGAAACTATAATAACATAAAGTTCAGAAGAGTGTAAATAGAATTTATATTACATAAAGTCTTTATATTTTTCCAGAGAAAATTAAATGTTATGATGAATGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：27
MLLLLLLPLLWGRERVEGQKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGGAGATALVFLSFCVIFIVVRSCRKKSARPAADVGDIGMKDANTIRGSASQGNLTESWADDNPRHHGLAAHSSGEEREIQYAPLSFHKGEPQDLSGQEATNNEYSEIKIPK
SEQ ID NO：28
GCAGTTCCTGAGAGAAGAACCCTGAGGAACAGACGTTCCCTCGCGGCCCTGGCACCTCCAACCCCAGATATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTCTGGGGGAGGGAGAGGGTGGAAGGACAGAAGAGTAACCGGAAGGATTACTCGCTGACGATGCAGAGTTCCGTGACCGTGCAAGAGGGCATGTGTGTCCATGTGCGCTGCTCCTTCTCCTACCCAGTGGACAGCCAGACTGACTCTGACCCAGTTCATGGCTACTGGTTCCGGGCAGGGAATGATATAAGCTGGAAGGCTCCAGTGGCCACAAACAACCCAGCTTGGGCAGTGCAGGAGGAAACTCGGGACCGATTCCACCTCCTTGGGGACCCACAGACCAAAAATTGCACCCTGAGCATCAGAGATGCCAGAATGAGTGATGCGGGGAGATACTTCTTTCGTATGGAGAAAGGAAATATAAAATGGAATTATAAATATGACCAGCTCTCTGTGAACGTGACAGCCTTGACCCACAGGCCCAACATCCTTATCCCCGGTACCCTGGAGTCTGGCTGCTTCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGTGAGCAGGGGACGCCCCCTATGATCTCCTGGATGGGGACCTCTGTGTCCCCCCTGCACCCCTCCACCACCCGCTCCTCAGTGCTCACCCTCATCCCACAGCCCCAGCACCACGGCACCAGCCTCACCTGTCAGGTGACCTTGCCTGGGGCCGGCGTGACCACGAACAGGACCATCCAACTCAATGTGTCCTACCCTCCTCAGAACTTGACTGTGACTGTCTTCCAAGGAGAAGGCACAGCATCCACAGCTCTGGGGAACAGCTCATCTCTTTCAGTCCTAGAGGGCCAGTCTCTGCGCTTGGTCTGTGCTGTTGACAGCAATCCCCCTGCCAGGCTGAGCTGGACCTGGAGGAGTCTGACCCTGTACCCCTCACAGCCCTCAAACCCTCTGGTACTGGAGCTGCAAGTGCACCTGGGGGATGAAGGGGAATTCACCTGTCGAGCTCAGAACTCTCTGGGTTCCCAGCACGTTTCCCTGAACCTCTCCCTGCAACAGGAGTACACAGGCAAAATGAGGCCTGTATCAGGAGTGTTGCTGGGGGCGGTCGGGGGAGCTGGAGCCACAGCCCTGGTCTTCCTCTCCTTCTGTGTCATCTTCATTGTAGTGAGGTCCTGCAGGAAGAAATCGGCAAGGCCAGCAGCGGACGTGGGAGACATAGGCATGAAGGATGCAAACACCATCAGGGGCTCAGCCTCTCAGGGTAACCTGACTGAGTCCTGGGCAGATGATAACCCCCGACACCATGGCCTGGCTGCCCACTCCTCAGGGGAGGAAAGAGAGATCCAGTATGCACCCCTCAGCTTTCATAAGGGGGAGCCTCAGGACCTATCAGGACAAGAAGCCACCAACAATGAGTACTCAGAGATCAAGATCCCCAAGTAAGAAAATGCAGAGGCTCGGGCTTGTTTGAGGGTTCACGACCCCTCCAGCAAAGGAGTCTGAGGCTGATTCCAGTAGAATTAGCAGCCCTCAATGCTGTGCAACAAGACATCAGAACTTATTCCTCTTGTCTAACTGAAAATGCATGCCTGATGACCAAACTCTCCCTTTCCCCATCCAATCGGTCCACACTCCCCGCCCTGGCCTCTGGTACCCACCATTCTCCTCTGTACTTCTCTAAGGATGACTACTTTAGATTCCGAATATAGTGAGATTGTAACGTGAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：29
MLLLLLLLPLLWGTKGMEGDRQYGDGYLLQVQELVTVQEGLCVHVPCSFSYPQDGWTDSDPVHGYWFRAGDRPYQDAPVATNNPDREVQAETQGRFQLLGDIWSNDCSLSIRDARKRDKGSYFFRLERGSMKWSYKSQLNYKTKQLSVFVTALTHRPDILILGTLESGHSRNLTCSVPWACKQGTPPMISWIGASVSSPGPTTARSSVLTLTPKPQDHGTSLTCQVTLPGTGVTTTSTVRLDVSYPPWNLTMTVFQGDATASTALGNGSSLSVLEGQSLRLVCAVNSNPPARLSWTRGSLTLCPSRSSNPGLLELPRVHVRDEGEFTCRAQNAQGSQHISLSLSLQNEGTGTSRPVSQVTLAAVGGAGATALAFLSFCIIFIIVRSCRKKSARPAAGVGDTGMEDAKAIRGSASQGPLTESWKDGNPLKKPPPAVAPSSGEEGELHYATLSFHKVKPQDPQGQEATDSEYSEIKIHKRETAETQACLRNHNPSSKEVRG
SEQ ID NO：30
AGTTTCTGAGAGAAGAACCCTGAGGAACAGACGTTCCCTGGCGGCCCTGGCGCCTTCAAACCCAGACATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTCTGGGGGACAAAGGGGATGGAGGGAGACAGACAATATGGGGATGGTTACTTGCTGCAAGTGCAGGAGCTGGTGACGGTGCAGGAGGGCCTGTGTGTCCATGTGCCCTGCTCCTTCTCCTACCCCCAGGATGGCTGGACTGACTCTGACCCAGTTCATGGCTACTGGTTCCGGGCAGGAGACAGACCATACCAAGACGCTCCAGTGGCCACAAACAACCCAGACAGAGAAGTGCAGGCAGAGACCCAGGGCCGATTCCAACTCCTTGGGGACATTTGGAGCAACGACTGCTCCCTGAGCATCAGAGACGCCAGGAAGAGGGATAAGGGGTCATATTTCTTTCGGCTAGAGAGAGGAAGCATGAAATGGAGTTACAAATCACAGTTGAATTACAAAACTAAGCAGCTGTCTGTGTTTGTGACAGCCCTGACCCATAGGCCTGACATCCTCATCCTAGGGACCCTAGAGTCTGGCCACTCCAGGAACCTGACCTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGTAAGCAGGGGACACCCCCCATGATCTCCTGGATTGGGGCCTCCGTGTCCTCCCCGGGCCCCACTACTGCCCGCTCCTCAGTGCTCACCCTTACCCCAAAGCCCCAGGACCACGGCACCAGCCTCACCTGTCAGGTGACCTTGCCTGGGACAGGTGTGACCACGACCAGTACCGTCCGCCTCGATGTGTCCTACCCTCCTTGGAACTTGACCATGACTGTCTTCCAAGGAGATGCCACAGCATCCACAGCCCTGGGAAATGGCTCATCTCTTTCAGTCCTTGAGGGCCAGTCTCTGCGCCTGGTCTGTGCTGTCAACAGCAATCCCCCTGCCAGGCTGAGCTGGACCCGGGGGAGCCTGACCCTGTGCCCCTCACGGTCCTCAAACCCTGGGCTGCTGGAGCTGCCTCGAGTGCACGTGAGGGATGAAGGGGAATTCACCTGCCGAGCTCAGAACGCTCAGGGCTCCCAGCACATTTCCCTGAGCCTCTCCCTGCAGAATGAGGGCACAGGCACCTCAAGACCTGTATCACAAGTGACACTGGCAGCAGTCGGGGGAGCTGGAGCCACAGCCCTGGCCTTCCTGTCCTTCTGCATCATCTTCATCATAGTGAGGTCCTGCAGGAAGAAATCGGCAAGGCCAGCAGCGGGCGTGGGGGATACAGGCATGGAAGATGCAAAGGCCATCAGGGGCTCGGCCTCTCAGGGACCCCTGACTGAATCCTGGAAAGATGGCAACCCCCTGAAGAAGCCTCCCCCAGCTGTTGCCCCCTCGTCAGGGGAGGAAGGAGAGCTCCATTATGCAACCCTCAGCTTCCATAAAGTGAAGCCTCAGGACCCGCAGGGACAGGAGGCCACTGACAGTGAATACTCGGAGATCAAGATCCACAAGCGAGAAACTGCAGAGACTCAGGCCTGTTTGAGGAATCACAACCCCTCCAGCAAAGAAGTCAGAGGCTGATTCTCATAGAACAAGAACCCTCTAGAGCCCCATGCTATGCAGTAGGTCACCAGGGCTCCCTCCTCCTGTCTAACCAAAACTTGGACCAATGTCTCCCCTTTCCCCGGCTACCAGGGACCCATCCCTGCCTCTAGCTTCTACTACCCACCATTCTCCTCTCGACCTCTCTGAGGTTGACTATTTTAGATTCCACATAGAGATGAGGTCATGTGGTACTTGCCTCTCTGTGTGTGGCTCATTTTACACAAAAAAATATCCCCTAGGTTCATCCATGTTCTCTCAAATGACAGAATCAAGCACTGAATATTTTTTTTTCTTTGAGAGATGGAGTTTCGCTCTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTTCAATCTCTGCTCACTGCAACCTCCACCTCCTGGGTTCAAACGATTCTCCTGCCTCAGCTTCCCAAGTAGCTGGTACTACAGGCGTGTGTCACCACGCCCAGCTAATTTTTGTATTTTTTAGTAGAGACGGGGTTTCACTATAAGTGGGCCAGGCTAGTCTCAAACTCCTGACCTCAAGTGATCTGCCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTTCAGGCATGAGCCACCGCACCCAGCTTGCATTGAATATTTTCAAGGAGCTAAAAGAAGATTTTAAATGGTCTCACAAAAACAGATAAATATTTGCACAGATGGGTGTGCTAATCATTGTGCCTTGATGGTTCCACGATGTATCCGGGTGTGGAAATCTCACTGGGTCTCTCTCAAGGCCACTCGGCTACTCAGGACAGGGCTGGAATTTAAAGCCTGTCCGATTCTGAGGTCTCTTCTCTCATCTAGCACTGAGTCAAGCAATCAGCAGGCTGGGCACCCCTTAGCCATAAGTTTTCAGGAAATAAATTCCTTGAGGGCATTGACTTTTACAAAAGAGGGAGCAGCAATGGCCTAGAGTCTCAGGAACAAGACAGGTGCACTGAGGAGATGAAGGCCGGGACCCCCTGCCCAACCTGTATGGCGGGTCTGTACTTATTTTGTTTACCCCCAATTTAAAACGTTTTTTTTTATTGCAGGTTGTTTGTTTGATATGGTTTGGCTGTGTCCCCACCCAAATCTTATCTAGAATTGTAATCAGAATTATAATCCCCATGTGTTGGGGGAGGGACCTGGTGGGAGGTGATAGGATCATGGGGGTGGTTCCCCCATGCTGTTCTGATAGTGAGTGAGTTATCACGAGATCTGATGGTTTTGTAAGTGGTGGTTTCCCCTGCTCTTCTCTCTTGCCTGCCACCATGTAAGATGTGCCTGGTTCCCCTTCCGCCATGATTGTAAGTTTCCTGAGGCCTCCCCCGCCATGTGGAACTGTGAGTCAATTACACCTCTTTCATTTATAAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：31
MLLLLLPLLWGRERAEGQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGVVGGAGATALVFLSFCVIFVVVRSCRKKSARPAAGVGDTGIEDANAVRGSASQGPLTEPWAEDSPPDQPPPASARSSVGEGELQYASLSFQMVKPWDSRGQEATDTEYSEIKIHR
SEQ ID NO：32
TAGGGCCTCCTCTAAGTCTTGAGCCCGCAGTTCCTGAGAGAAGAACCCTGAGGAACAGACGTTCCCTCGCGGCCCTGGCACCTCTAACCCCAGACATGCTGCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTCTGGGGGAGGGAGAGGGCGGAAGGACAGACAAGTAAACTGCTGACGATGCAGAGTTCCGTGACGGTGCAGGAAGGCCTGTGTGTCCATGTGCCCTGCTCCTTCTCCTACCCCTCGCATGGCTGGATTTACCCTGGCCCAGTAGTTCATGGCTACTGGTTCCGGGAAGGGGCCAATACAGACCAGGATGCTCCAGTGGCCACAAACAACCCAGCTCGGGCAGTGTGGGAGGAGACTCGGGACCGATTCCACCTCCTTGGGGACCCACATACCAAGAATTGCACCCTGAGCATCAGAGATGCCAGAAGAAGTGATGCGGGGAGATACTTCTTTCGTATGGAGAAAGGAAGTATAAAATGGAATTATAAACATCACCGGCTCTCTGTGAATGTGACAGCCTTGACCCACAGGCCCAACATCCTCATCCCAGGCACCCTGGAGTCCGGCTGCCCCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGTGAGCAGGGGACACCCCCTATGATCTCCTGGATAGGGACCTCCGTGTCCCCCCTGGACCCCTCCACCACCCGCTCCTCGGTGCTCACCCTCATCCCACAGCCCCAGGACCATGGCACCAGCCTCACCTGTCAGGTGACCTTCCCTGGGGCCAGCGTGACCACGAACAAGACCGTCCATCTCAACGTGTCCTACCCGCCTCAGAACTTGACCATGACTGTCTTCCAAGGAGACGGCACAGTATCCACAGTCTTGGGAAATGGCTCATCTCTGTCACTCCCAGAGGGCCAGTCTCTGCGCCTGGTCTGTGCAGTTGATGCAGTTGACAGCAATCCCCCTGCCAGGCTGAGCCTGAGCTGGAGAGGCCTGACCCTGTGCCCCTCACAGCCCTCAAACCCGGGGGTGCTGGAGCTGCCTTGGGTGCACCTGAGGGATGCAGCTGAATTCACCTGCAGAGCTCAGAACCCTCTCGGCTCTCAGCAGGTCTACCTGAACGTCTCCCTGCAGAGCAAAGCCACATCAGGAGTGACTCAGGGGGTGGTCGGGGGAGCTGGAGCCACAGCCCTGGTCTTCCTGTCCTTCTGCGTCATCTTCGTTGTAGTGAGGTCCTGCAGGAAGAAATCGGCAAGGCCAGCAGCGGGCGTGGGAGATACGGGCATAGAGGATGCAAACGCTGTCAGGGGTTCAGCCTCTCAGGGGCCCCTGACTGAACCTTGGGCAGAAGACAGTCCCCCAGACCAGCCTCCCCCAGCTTCTGCCCGCTCCTCAGTGGGGGAAGGAGAGCTCCAGTATGCATCCCTCAGCTTCCAGATGGTGAAGCCTTGGGACTCGCGGGGACAGGAGGCCACTGACACCGAGTACTCGGAGATCAAGATCCACAGATGAGAAACTGCAGAGACTCACCCTGATTGAGGGATCACAGCCCCTCCAGGCAAGGGAGAAGTCAGAGGCTGATTCTTGTAGAATTAACAGCCCTCAACGTGATGAGCTATGATAACACTATGAATTATGTGCAGAGTGAAAAGCACACAGGCTTTAGAGTCAAAGTATCTCAAACCTGAATCCACACTGTGCCCTCCCTTTTATTTTTTTAACTAAAAGACAGACAAATTCCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：33
MLLPLLLSSLLGGSQAMDGRFWIRVQESVMVPEGLCISVPCSFSYPRQDWTGSTPAYGYWFKAVTETTKGAPVATNHQSREVEMSTRGRFQLTGDPAKGNCSLVIRDAQMQDESQYFFRVERGSYVRYNFMNDGFFLKVTALTQKPDVYIPETLEPGQPVTVICVFNWAFEECPPPSFSWTGAALSSQGTKPTTSHFSVLSFTPRPQDHNTDLTCHVDFSRKGVSAQRTVRLRVAYAPRDLVISISRDNTPALEPQPQGNVPYLEAQKGQFLRLLCAADSQPPATLSWVLQNRVLSSSHPWGPRPLGLELPGVKAGDSGRYTCRAENRLGSQQRALDLSVQYPPENLRVMVSQANRTVLENLGNGTSLPVLEGQSLCLVCVTHSSPPARLSWTQRGQVLSPSQPSDPGVLELPRVQVEHEGEFTCHARHPLGSQHVSLSLSVHYSPKLLGPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSLRWWLGEELLEGNSSQDSFEVTPSSAGPWANSSLSLHGGLSSGLRLRCEAWNVHGAQSGSILQLPDKKGLISTAFSNGAFLGIGITALLFLCLALIIMKILPKRRTQTETPRPRFSRHSTILDYINVVPTAGPLAQKRNQKATPNSPRTPLPPGAPSPESKKNQKKQYQLPSFPEPKSSTQAPESQESQEELHYATLNFPGVRPRPEARMPKGTQADYAEVKFQ
SEQ ID NO：34
GCCCCCAGGAGACCCAGAGGACAACTGGGCAAGGTGGGCCGGAGAGTGTGGGGGAAGGCAAAGGAGTTCTGTGAGCTCAGCGTCTGAAGCTCATTTCATGCATCAGGCCCCAGGGCTCAGCTTCCGCCTTCGGCTTCCCCTTCTGCCAAGAGCCCTGAGCCACTCACAGCACGACCAGAGAACAGGCCTGTCTCAGGCAGGCCCTGCGCCTCCTATGCGGAGATGCTACTGCCACTGCTGCTGTCCTCGCTGCTGGGCGGGTCCCAGGCTATGGATGGGAGATTCTGGATACGAGTGCAGGAGTCAGTGATGGTGCCGGAGGGCCTGTGCATCTCTGTGCCCTGCTCTTTCTCCTACCCCCGACAAGACTGGACAGGGTCTACCCCAGCTTATGGCTACTGGTTCAAAGCAGTGACTGAGACAACCAAGGGTGCTCCTGTGGCCACAAACCACCAGAGTCGAGAGGTGGAAATGAGCACCCGGGGCCGATTCCAGCTCACTGGGGATCCCGCCAAGGGGAACTGCTCCTTGGTGATCAGAGACGCGCAGATGCAGGATGAGTCACAGTACTTCTTTCGGGTGGAGAGAGGAAGCTATGTGAGATATAATTTCATGAACGATGGGTTCTTTCTAAAAGTAACAGCCCTGACTCAGAAGCCTGATGTCTACATCCCCGAGACCCTGGAGCCCGGGCAGCCGGTGACGGTCATCTGTGTGTTTAACTGGGCCTTTGAGGAATGTCCACCCCCTTCTTTCTCCTGGACGGGGGCTGCCCTCTCCTCCCAAGGAACCAAACCAACGACCTCCCACTTCTCAGTGCTCAGCTTCACGCCCAGACCCCAGGACCACAACACCGACCTCACCTGCCATGTGGACTTCTCCAGAAAGGGTGTGAGCGCACAGAGGACCGTCCGACTCCGTGTGGCCTATGCCCCCAGAGACCTTGTTATCAGCATTTCACGTGACAACACGCCAGCCCTGGAGCCCCAGCCCCAGGGAAATGTCCCATACCTGGAAGCCCAAAAAGGCCAGTTCCTGCGGCTCCTCTGTGCTGCTGACAGCCAGCCCCCTGCCACACTGAGCTGGGTCCTGCAGAACAGAGTCCTCTCCTCGTCCCATCCCTGGGGCCCTAGACCCCTGGGGCTGGAGCTGCCCGGGGTGAAGGCTGGGGATTCAGGGCGCTACACCTGCCGAGCGGAGAACAGGCTTGGCTCCCAGCAGCGAGCCCTGGACCTCTCTGTGCAGTATCCTCCAGAGAACCTGAGAGTGATGGTTTCCCAAGCAAACAGGACAGTCCTGGAAAACCTTGGGAACGGCACGTCTCTCCCAGTACTGGAGGGCCAAAGCCTGTGCCTGGTCTGTGTCACACACAGCAGCCCCCCAGCCAGGCTGAGCTGGACCCAGAGGGGACAGGTTCTGAGCCCCTCCCAGCCCTCAGACCCCGGGGTCCTGGAGCTGCCTCGGGTTCAAGTGGAGCACGAAGGAGAGTTCACCTGCCACGCTCGGCACCCACTGGGCTCCCAGCACGTCTCTCTCAGCCTCTCCGTGCACTACTCCCCGAAGCTGCTGGGCCCCTCCTGCTCCTGGGAGGCTGAGGGTCTGCACTGCAGCTGCTCCTCCCAGGCCAGCCCGGCCCCCTCTCTGCGCTGGTGGCTTGGGGAGGAGCTGCTGGAGGGGAACAGCAGCCAGGACTCCTTCGAGGTCACCCCCAGCTCAGCCGGGCCCTGGGCCAACAGCTCCCTGAGCCTCCATGGAGGGCTCAGCTCCGGCCTCAGGCTCCGCTGTGAGGCCTGGAACGTCCATGGGGCCCAGAGTGGATCCATCCTGCAGCTGCCAGATAAGAAGGGACTCATCTCAACGGCATTCTCCAACGGAGCGTTTCTGGGAATCGGCATCACGGCTCTTCTTTTCCTCTGCCTGGCCCTGATCATCATGAAGATTCTACCGAAGAGACGGACTCAGACAGAAACCCCGAGGCCCAGGTTCTCCCGGCACAGCACGATCCTGGATTACATCAATGTGGTCCCGACGGCTGGCCCCCTGGCTCAGAAGCGGAATCAGAAAGCCACACCAAACAGTCCTCGGACCCCTCTTCCACCAGGTGCTCCCTCCCCAGAATCAAAGAAGAACCAGAAAAAGCAGTATCAGTTGCCCAGTTTCCCAGAACCCAAATCATCCACTCAAGCCCCAGAATCCCAGGAGAGCCAAGAGGAGCTCCATTATGCCACGCTCAACTTCCCAGGCGTCAGACCCAGGCCTGAGGCCCGGATGCCCAAGGGCACCCAGGCGGATTATGCAGAAGTCAAGTTCCAATGAGGGTCTCTTAGGCTTTAGGACTGGGACTTCGGCTAGGGAGGAAGGTAGAGTAAGAGGTTGAAGATAACAGAGTGCAAAGTTTCCTTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCTTTCTCTCTCTCTCTCTCTTTCTCTCTCTTTTAAAAAAACATCTGGCCAGGGCACAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGTTGAGGTGGGCAGATCGCCTGAGGTCGGGAGTTCGAGACCAGCCTGGCCAACTTGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCTGGGCATGGTGGCAGGCGCCTGTAATCCTACCTACTTGGGAAGCTGAGGCAGGAGAATCACTTGAACCTGGGAGACGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCACACCATTGCACGCCAGCCTGGGCAACAAAGCGAGACTCCATCTCAAAAAAAAAATCCTCCAAATGGGTTGGGTGTCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTAAGGTGGGTGGATTGCTTGAGCCCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGGGCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACAAAAAATACAAAACATAGCTGGGCTTGGTGGTGTGTGCCTGTAGTCCCAGCTGTCAGACATTTAAACCAGAGCAACTCCATCTGGAATAGGAGCTGAATAAAATGAGGCTGAGACCTACTGGGCTGCATTCTCAGACAGTGGAGGCATTCTAAGTCACAGGATGAGACAGGAGGTCCGTACAAGATACAGGTCATAAAGACTTTGCTGATAAAACAGATTGCAGTAAAGAAGCCAACCAAATCCCACCAAAACCAAGTTGGCCACGAGAGTGACCTCTGGTCGTCCTCACTGCTACACTCCTGACAGCACCATGACAGTTTACAAATGCCATGGCAACATCAGGAAGTTACCCGATATGTCCCAAAAGGGGGAGGAATGAATAATCCACCCCTTGTTTAGCAAATAAGCAAGAAATAACCATAAAAGTGGGCAACCAGCAGCTCTAGGCGCTGCTCTTGTCTATGGAGTAGCCATTCTTTTGTTCCTTTACTTTCTTAATAAACTTGCTTTCACCTTAAAAAAA
SEQ ID NO：35
MVPGQAQPQSPEMLLLPLLLPVLGAGSLNKDPSYSLQVQRQVPVPEGLCVIVSCNLSYPRDGWDESTAAYGYWFKGRTSPKTGAPVATNNQSREVEMSTRDRFQLTGDPGKGSCSLVIRDAQREDEAWYFFRVERGSRVRHSFLSNAFFLKVTALTKKPDVYIPETLEPGQPVTVICVFNWAFKKCPAPSFSWTGAALSPRRTRPSTSHFSVLSFTPSPQDHDTDLTCHVDFSRKGVSAQRTVRLRVAYAPKDLIISISHDNTSALELQGNVIYLEVQKGQFLRLLCAADSQPPATLSWVLQDRVLSSSHPWGPRTLGLELRGVRAGDSGRYTCRAENRLGSQQQALDLSVQYPPENLRVMVSQANRTVLENLGNGTSLPVLEGQSLRLVCVTHSSPPARLSWTRWGQTVGPSQPSDPGVLELPPIQMEHEGEFTCHAQHPLGSQHVSLSLSVHYPPQLLGPSCSWEAEGLHCSCSSQASPAPSLRWWLGEELLEGNSSQGSFEVTPSSAGPWANSSLSLHGGLSSGLRLRCKAWNVHGAQSGSVFQLLPGKLEHGGGLGLGAALGAGVAALLAFCSCLVVFRVKICRKEARKRAAAEQDVPSTLGPISQGHQHECSAGSSQDHPPPGAATYTPGKGEEQELHYASLSFQGLRLWEPADQEAPSTTEYSEIKIHTGQPLRGPGFGLQLEREMSGMVPK
SEQ ID NO：36
CGAGGCTCCTCCTCTGTGGATGGTCACTGCCCCTCCACCAGGCTTCCTGCTGGAGGAGTTTCCTTCCCAGCCAGGCCGGCCCAGAAGCCAGATGGTCCCGGGACAGGCCCAGCCCCAGAGCCCAGAGATGCTGCTGCTGCCCCTGCTGCTGCCCGTGCTGGGGGCGGGGTCCCTGAACAAGGATCCCAGTTACAGTCTTCAAGTGCAGAGGCAGGTGCCGGTGCCGGAGGGCCTGTGTGTCATCGTGTCTTGCAACCTCTCCTACCCCCGGGATGGCTGGGACGAGTCTACTGCTGCTTATGGCTACTGGTTCAAAGGACGGACCAGCCCAAAGACGGGTGCTCCTGTGGCCACTAACAACCAGAGTCGAGAGGTGGAAATGAGCACCCGGGACCGATTCCAGCTCACTGGGGATCCCGGCAAAGGGAGCTGCTCCTTGGTGATCAGAGACGCGCAGAGGGAGGATGAGGCATGGTACTTCTTTCGGGTGGAGAGAGGAAGCCGTGTGAGACATAGTTTCCTGAGCAATGCGTTCTTTCTAAAAGTAACAGCCCTGACTAAGAAGCCTGATGTCTACATCCCCGAGACCCTGGAGCCCGGGCAGCCGGTGACGGTCATCTGTGTGTTTAACTGGGCTTTCAAGAAATGTCCAGCCCCTTCTTTCTCCTGGACGGGGGCTGCCCTCTCCCCTAGAAGAACCAGACCAAGCACCTCCCACTTCTCAGTGCTCAGCTTCACGCCCAGCCCCCAGGACCACGACACCGACCTCACCTGCCATGTGGACTTCTCCAGAAAGGGTGTGAGCGCACAGAGGACCGTCCGACTCCGTGTGGCCTATGCCCCCAAAGACCTTATTATCAGCATTTCACATGACAACACGTCAGCCCTGGAACTCCAGGGAAACGTCATATATCTGGAAGTTCAGAAAGGCCAGTTCCTGCGGCTCCTCTGTGCTGCTGACAGCCAGCCCCCTGCCACGCTGAGCTGGGTCCTGCAGGACAGAGTCCTCTCCTCGTCCCACCCCTGGGGCCCCAGAACCCTGGGGCTGGAGCTGCGTGGGGTAAGGGCCGGGGATTCAGGGCGCTACACCTGCCGAGCGGAGAACAGGCTTGGCTCCCAGCAGCAAGCCCTGGACCTCTCTGTGCAGTATCCTCCAGAGAACCTGAGAGTGATGGTTTCCCAAGCAAACAGGACAGTCCTGGAAAACCTCGGGAACGGCACATCCCTCCCGGTCCTGGAGGGCCAAAGCCTGCGCCTGGTCTGTGTCACCCACAGCAGCCCCCCAGCCAGGCTGAGCTGGACCCGGTGGGGACAGACCGTGGGCCCCTCCCAGCCCTCAGACCCCGGGGTCCTGGAGCTGCCACCCATTCAAATGGAGCACGAAGGAGAGTTCACCTGCCACGCTCAGCACCCTCTGGGCTCCCAGCACGTCTCTCTCAGCCTCTCCGTGCACTACCCTCCACAGCTGCTGGGCCCCTCCTGCTCCTGGGAGGCTGAGGGTCTGCACTGCAGCTGCTCCTCCCAGGCCAGCCCGGCCCCCTCTCTGCGCTGGTGGCTTGGGGAGGAGCTGCTGGAGGGGAACAGCAGTCAGGGCTCCTTCGAGGTCACCCCCAGCTCAGCCGGGCCCTGGGCCAACAGCTCCCTGAGCCTCCATGGAGGGCTCAGCTCCGGCCTCAGGCTCCGCTGTAAGGCCTGGAACGTCCACGGGGCCCAGAGTGGCTCTGTCTTCCAGCTGCTACCAGGGAAGCTGGAGCATGGGGGAGGACTTGGCCTGGGGGCTGCCCTGGGAGCTGGCGTCGCTGCCCTGCTCGCTTTCTGTTCCTGCCTTGTCGTCTTCAGGGTGAAGATCTGCAGGAAGGAAGCTCGCAAGAGGGCAGCAGCTGAGCAGGACGTGCCCTCCACCCTGGGACCCATCTCCCAGGGTCACCAGCATGAATGCTCGGCAGGCAGCTCCCAAGACCACCCGCCCCCAGGTGCAGCCACCTACACCCCGGGGAAGGGGGAAGAGCAGGAGCTCCACTATGCCTCCCTCAGCTTCCAGGGCCTGAGGCTCTGGGAGCCTGCGGACCAGGAGGCCCCCAGCACCACCGAGTACTCGGAGATCAAGATCCACACAGGACAGCCCCTGAGGGGCCCAGGCTTTGGGCTTCAATTGGAGAGGGAGATGTCAGGGATGGTTCCAAAGTGAAGAGGTCTCCATGGCAACAGGACACCAGCAAGTGTGTGGGAGTCGCACTGGTGTGACGGCCAGAACTGGACTCAGATTTCAGCCCCATCCCCAATGAAGAGCTTGAGTTTGAAGATTATACTTTTTTTGAGACAGGGTCTGACTCTGTCCTCCAGGCCAGAGTCCAGTGGTGCAATCTCAGCTCACTGTAGCCTCAACCTGCCAGGTTGAAGTGAGCCTCCCATTTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAATTGTGAGCCACCATGCCAGGCTCATTGTTATATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTTGCCATGTTTCCCTGGCTGGTCTCAGACTCCTGGGCTCAAGCAATCTGCCCGCCTCTGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGACGTGAGCCACCACAGCTGGCTGAAGATTATACTTTCAATTCAGAGCGAGTTTGAAGATGACACTTTGAGGCATCGTGTCTATGGTTCATTACTACAGAAGCTTCTCTGGATGTGTAAAGCACAGGAAACCAGGCAGAGGAGGCACAGGGTGCTCTCCAGAACGAGAAGCCAGCTCCTGGAGTTGTTTGCTGCAACTGCCATTCCCCGTTGATGACCATGCTCTTCCTTCAGAAGAGGGAGAGTGAGAGGACCAAGTCCAAGTGGTTCCCATTTGAACATTTAAAAAAAAAAAAAAGGCTGGGCATGGTGGCTCACGCCTGTAATCTCAACACTTTGGGAGGCTGAAGTGGGTGGATCACAAGTCAGGAGTTCAAGACCAGCCTGGGCAAGATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCATGGTGGCGGGCGCCTAAAATCCCAGCTACTCGGGAGACTAGGCAGAGAATTGGTTGAACCCGGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCGTCCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGTGAGACTCTGTTTCTAAATAAATAAATGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO：37
MLLLLLLLPPLLCGRVGAKEQKDYLLTMQKSVTVQEGLCVSVLCSFSYPQNGWTASDPVHGYWFRAGDHVSRNIPVATNNPARAVQEETRDRFHLLGDPQNKDCTLSIRDTRESDAGTYVFCVERGNMKWNYKYDQLSVNVTASQDLLSRYRLEVPESVTVQEGLCVSVPCSVLYPHYNWTASSPVYGSWFKEGADIPWDIPVATNTPSGKVQEDTHGRFLLLGDPQTNNCSLSIRDARKGDSGKYYFQVERGSRKWNYIYDKLSVHVTALTHMPTFSIPGTLESGHPRNLTCSVPWACEQGTPPTITWMGASVSSLDPTITRSSMLSLIPQPQDHGTSLTCQVTLPGAGVTMTRAVRLNISYPPQNLTMTVFQGDGTASTTLRNGSALSVLEGQSLHLVCAVDSNPPARLSWTWGSLTLSPSQSSNLGVLELPRVHVKDEGEFTCRAQNPLGSQHISLSLSLQNEYTGKMRPISGVTLGAFGGAGATALVFLYFCIIFVVVRSCRKKSARPAVGVGDTGMEDANAVRGSASQGPLIESPADDSPPHHAPPALATPSPEEGEIQYASLSFHKARPQYPQEQEAIGYEYSEINIPK
SEQ ID NO：38
ATGCTACTGCTGCTGCTACTGCTGCCACCCCTGCTCTGTGGGAGAGTGGGGGCTAAGGAACAGAAGGATTACCTGCTGACAATGCAGAAGTCCGTGACGGTGCAGGAGGGCCTGTGTGTCTCTGTGCTTTGCTCCTTCTCCTACCCCCAAAATGGCTGGACTGCCTCCGATCCAGTTCATGGCTACTGGTTCCGGGCAGGGGACCATGTAAGCCGGAACATTCCAGTGGCCACAAACAACCCAGCTCGAGCAGTGCAGGAGGAGACTCGGGACCGATTCCACCTCCTTGGGGACCCACAGAACAAGGATTGTACCCTGAGCATCAGAGACACCAGAGAGAGTGATGCAGGGACATACGTCTTTTGTGTAGAGAGAGGAAATATGAAATGGAATTATAAATATGACCAGCTCTCTGTGAATGTGACAGCGTCCCAGGACCTACTGTCAAGATACAGGCTGGAGGTGCCAGAGTCGGTGACTGTGCAGGAGGGTCTGTGTGTCTCTGTGCCCTGCAGTGTCCTTTACCCCCATTACAACTGGACTGCCTCTAGCCCTGTTTATGGATCCTGGTTCAAGGAAGGGGCCGATATACCATGGGATATTCCAGTGGCCACAAACACCCCAAGTGGAAAAGTGCAAGAGGATACCCACGGTCGATTCCTCCTCCTTGGGGACCCACAGACCAACAACTGCTCCCTGAGCATCAGAGATGCCAGGAAGGGGGATTCAGGGAAGTACTACTTCCAGGTGGAGAGAGGAAGCAGGAAATGGAACTACATATATGACAAGCTCTCTGTGCATGTGACAGCCCTGACTCACATGCCCACCTTCTCCATCCCGGGGACCCTGGAGTCTGGCCACCCCAGGAACCTGACCTGCTCTGTGCCCTGGGCCTGTGAACAGGGGACGCCCCCCACGATCACCTGGATGGGGGCCTCCGTGTCCTCCCTGGACCCCACTATCACTCGCTCCTCGATGCTCAGCCTCATCCCACAGCCCCAGGACCATGGCACCAGCCTCACCTGTCAGGTGACCTTGCCTGGGGCCGGCGTGACCATGACCAGGGCTGTCCGACTCAACATATCCTATCCTCCTCAGAACTTGACCATGACTGTCTTCCAAGGAGATGGCACAGCATCCACAACCTTGAGGAATGGCTCGGCCCTTTCAGTCCTGGAGGGCCAGTCCCTGCACCTTGTCTGTGCTGTCGACAGCAATCCCCCTGCCAGGCTGAGCTGGACCTGGGGGAGCCTGACCCTGAGCCCCTCACAGTCCTCGAACCTTGGGGTGCTGGAGCTGCCTCGAGTGCATGTGAAGGATGAAGGGGAATTCACCTGCCGAGCTCAGAACCCTCTAGGCTCCCAGCACATTTCCCTGAGCCTCTCCCTGCAAAACGAGTACACAGGCAAAATGAGGCCTATATCAGGAGTGACGCTAGGGGCATTCGGGGGAGCTGGAGCCACAGCCCTGGTCTTCCTGTACTTCTGCATCATCTTCGTTGTAGTGAGGTCCTGCAGGAAGAAATCGGCAAGGCCAGCAGTGGGCGTGGGGGATACAGGCATGGAGGACGCAAACGCTGTCAGGGGCTCAGCCTCTCAGGGACCCCTGATTGAATCCCCGGCAGATGACAGCCCCCCACACCATGCTCCGCCAGCCCTGGCCACCCCCTCCCCAGAGGAAGGAGAGATCCAGTATGCATCCCTCAGCTTCCACAAAGCGAGGCCTCAGTACCCACAGGAACAGGAGGCCATCGGCTATGAGTACTCCGAGATCAACATCCCCAAGTGA
SEQ ID NO：39
MLPLLLLPLLWGGSLQEKPVYELQVQKSVTVQEGLCVLVPCSFSYPWRSWYSSPPLYVYWFRDGEIPYYAEVVATNNPDRRVKPETQGRFRLLGDVQKKNCSLSIGDARMEDTGSYFFRVERGRDVKYSYQQNKLNLEVTALIEKPDIHFLEPLESGRPTRLSCSLPGSCEAGPPLTFSWTGNALSPLDPETTRSSELTLTPRPEDHGTNLTCQVKRQGAQVTTERTVQLNVSYAPQNLAISIFFRNGTGTALRILSNGMSVPIQEGQSLFLACTVDSNPPASLSWFREGKALNPSQTSMSGTLELPNIGAREGGEFTCRVQHPLGSQHLSFILSVQRSSSSCICVTEKQQGSWPLVLTLIRGALMGAGFLLTYGLTWIYYTRCGGPQQSRAERPG
SEQ ID NO：40
ATGCTGCCCCTGCTGCTGCTGCCCCTGCTGTGGGGGGGGTCCCTGCAGGAGAAGCCAGTGTACGAGCTGCAAGTGCAGAAGTCGGTGACGGTGCAGGAGGGCCTGTGCGTCCTTGTGCCCTGCTCCTTCTCTTACCCCTGGAGATCCTGGTATTCCTCTCCCCCACTCTACGTCTACTGGTTCCGGGACGGGGAGATCCCATACTACGCTGAGGTTGTGGCCACAAACAACCCAGACAGAAGAGTGAAGCCAGAGACCCAGGGCCGATTCCGCCTCCTTGGGGATGTCCAGAAGAAGAACTGCTCCCTGAGCATCGGAGATGCCAGAATGGAGGACACGGGAAGCTATTTCTTCCGCGTGGAGAGAGGAAGGGATGTAAAATATAGCTACCAACAGAATAAGCTGAACTTGGAGGTGACAGCCCTGATAGAGAAACCCGACATCCACTTTCTGGAGCCTCTGGAGTCCGGCCGCCCCACAAGGCTGAGCTGCAGCCTTCCAGGATCCTGTGAAGCGGGACCACCTCTCACATTCTCCTGGACGGGGAATGCCCTCAGCCCCCTGGACCCCGAGACCACCCGCTCCTCGGAGCTCACCCTCACCCCCAGGCCCGAGGACCATGGCACCAACCTCACCTGTCAGGTGAAACGCCAAGGAGCTCAGGTGACCACGGAGAGAACTGTCCAGCTCAATGTCTCCTATGCTCCACAGAACCTCGCCATCAGCATCTTCTTCAGAAATGGCACAGGCACAGCCCTGCGGATCCTGAGCAATGGCATGTCGGTGCCCATCCAGGAGGGCCAGTCCCTGTTCCTCGCCTGCACAGTTGACAGCAACCCCCCTGCCTCACTGAGCTGGTTCCGGGAGGGAAAAGCCCTCAATCCTTCCCAGACCTCAATGTCTGGGACCCTGGAGCTGCCTAACATAGGAGCTAGAGAGGGAGGGGAATTCACCTGCCGGGTTCAGCATCCGCTGGGCTCCCAGCACCTGTCCTTCATCCTTTCTGTGCAGAGAAGCTCCTCTTCCTGCATATGTGTAACTGAGAAACAGCAGGGCTCCTGGCCCCTCGTCCTCACCCTGATCAGGGGGGCTCTCATGGGGGCTGGCTTCCTCCTCACCTATGGCCTCACCTGGATCTACTATACCAGGTGTGGAGGCCCCCAGCAGAGCAGGGCTGAGAGGCCTGGCTGA
SEQ ID NO：41
MEKSIWLLACLAWVLPTGSFVRTKIDTTENLLNTEVHSSPAQRWSMQVPPEVSAEAGDAAVLPCTFTHPHRHYDGPLTAIWRAGEPYAGPQVFRCAAARGSELCQTALSLHGRFRLLGNPRRNDLSLRVERLALADDRRYFCRVEFAGDVHDRYESRHGVRLHVTAAPRIVNISVLPSPAHAFRALCTAEGEPPPALAWSGPALGNSLAAVRSPREGHGHLVTAELPALTHDGRYTCTAANSLGRSEASVYLFRFHGASGASTVALLLGALGFKALLLLGVLAARAARRRPEHLDTPDTPPRSQAQESNYENLSQMNPRSPPATMCSP
SEQ ID NO：42
ATGGAAAAGTCCATCTGGCTGCTGGCCTGCTTGGCGTGGGTTCTCCCGACAGGCTCATTTGTGAGAACTAAAATAGATACTACGGAGAACTTGCTCAACACAGAGGTGCACAGCTCGCCAGCGCAGCGCTGGTCCATGCAGGTGCCACCCGAGGTGAGCGCGGAGGCAGGCGACGCGGCAGTGCTGCCCTGCACCTTCACGCACCCGCACCGCCACTACGACGGGCCGCTGACGGCCATCTGGCGCGCGGGCGAGCCCTATGCGGGCCCGCAGGTGTTCCGCTGCGCTGCGGCGCGGGGCAGCGAGCTCTGCCAGACGGCGCTGAGCCTGCACGGCCGCTTCCGGCTGCTGGGCAACCCGCGCCGCAACGACCTCTCGCTGCGCGTCGAGCGCCTCGCCCTGGCTGACGACCGCCGCTACTTCTGCCGCGTCGAGTTCGCCGGCGACGTCCATGACCGCTACGAGAGCCGCCACGGCGTCCGGCTGCACGTGACAGCCGCGCCGCGGATCGTCAACATCTCGGTGCTGCCCAGTCCGGCTCACGCCTTCCGCGCGCTCTGCACTGCCGAAGGGGAGCCGCCGCCCGCCCTCGCCTGGTCCGGCCCGGCCCTGGGCAACAGCTTGGCAGCCGTGCGGAGCCCGCGTGAGGGTCACGGCCACCTAGTGACCGCCGAACTGCCCGCACTGACCCATGACGGCCGCTACACGTGTACGGCCGCCAACAGCCTGGGCCGCTCCGAGGCCAGCGTCTACCTGTTCCGCTTCCATGGCGCCAGCGGGGCCTCGACGGTCGCCCTCCTGCTCGGCGCTCTCGGCTTCAAGGCGCTGCTGCTGCTCGGGGTCCTGGCCGCCCGCGCTGCCCGCCGCCGCCCAGAGCATCTGGACACCCCGGACACCCCACCACGGTCCCAGGCCCAGGAGTCCAATTATGAAAATTTGAGCCAGATGAACCCCCGGAGCCCACCAGCCACCATGTGCTCACCGTGA
SEQ ID NO：43
QSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYF
SEQ ID NO：44
LTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVT
SEQ ID NO：45
CAGACCAGCAAGCTGCTGACCATGCAGAGCAGCGTGACCGTGCAGGAGGGCCTGTGCGTGCATGTGCCCTGCAGCTTCAGCTACCCCAGCCACGGCTGGATCTACCCCGGTCCCGTAGTGCACGGCTACTGGTTCAGGGAGGGCGCCAACACCGACCAGGACGCTCCCGTGGCAACCAACAACCCCGCCAGGGCCGTGTGGGAGGAGACCAGGGACAGGTTCCACCTGCTGGGCGACCCCCACACCAAGAACTGCACCCTGAGCATCAGGGACGCCAGGAGGAGCGACGCCGGCAGGTACTTCTTCAGGATGGAGAAGGGGTCTATCAAGTGGAACTACAAGCACCACCGGCTGAGCGTGAATGTGACCGCCCTGACCCACCGGCCCAATATCCTCATCCCCGGCACCCTGGAGAGCGGCTGCCCCCAGAATCTTACCTGCAGCGTACCCTGGGCCTGCGAGCAGGGCACCCCTCCAATGATCAGCTGGATCGGCACCAGCGTGAGCCCCCTGGACCCTAGTACCACCAGGAGCAGCGTGCTGACCCTGATCCCCCAGCCCCAGGACCACGGAACCAGCCTGACCTGCCAGGTGACCTTCCCCGGAGCCAGCGTAACCACCAACAAGACCGTGCACCTGAACGTGAGCTACCCACCCCAAAACCTGACCATGACCGTGTTCCAGGGCGACGGCACGGTGAGCACCGTACTGGGCAACGGCAGCTCTCTGAGCCTGCCCGAGGGCCAGAGCTTGCGGCTGGTCTGCGCCGTGGATGCTGTGGACAGCAACCCTCCCGCCAGGCTGAGCCTGAGCTGGAGGGGCCTGACCCTGTGCCCCAGCCAGCCCAGCAATCCCGGCGTGCTGGAGCTGCCCTGGGTTCACCTGAGGGACGCTGCCGAGTTCACATGTAGGGCCCAGAACCCCCTGGGCTCTCAGCAGGTGTACCTGAACGTGTCTCTTCAGAGTAAGGCCACCAGCGGCGTGACCCAAGGAGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTTGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAG
SEQ ID NO：46
CAGAAGTCCAACAGAAAGGACTACAGCCTGACCATGCAGAGCAGCGTGACAGTGCAAGAGGGGATGTGCGTCCACGTCCGGTGCAGCTTTAGCTACCCTGTGGACAGCCAGACCGACAGCGATCCTGTGCACGGCTACTGGTTCAGAGCCGGCAACGACATCTCTTGGAAAGCCCCAGTGGCCACCAACAATCCTGCCTGGGCTGTGCAAGAAGAGACACGGGACAGATTCCATCTGCTGGGCGACCCTCAGACCAAGAACTGCACACTGAGCATCCGGGACGCCAGAATGTCTGACGCCGGCAGATACTTCTTCCGGATGGAAAAGGGCAACATCAAGTGGAACTATAAGTACGACCAGCTGAGCGTGAACGTGACAGCCCTGACACACAGACCCAACATTCTGATCCCCGGCACACTGGAAAGCGGCTGCTTCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCTTGGGCCTGCGAGCAGGGAACACCTCCTATGATCAGCTGGATGGGAACCAGCGTGTCCCCTCTGCACCCTAGCACCACAAGATCCAGCGTGCTGACACTGATCCCTCAGCCTCAGCACCACGGCACAAGCCTGACCTGTCAAGTTACACTTCCTGGCGCTGGCGTGACCACCAACAGAACAATCCAGCTCAACGTGTCCTATCCTCCTCAGAACCTGACCGTGACCGTGTTCCAAGGCGAGGGCACAGCTTCTACAGCCCTGGGCAATAGCAGCAGCCTGTCTGTGCTGGAAGGCCAGTCTCTGAGACTCGTGTGCGCCGTGGATAGCAACCCTCCTGCTAGACTGAGCTGGACTTGGCGGAGCCTGACACTGTACCCTAGCCAGCCTAGCAATCCCCTGGTGCTGGAACTGCAAGTGCACCTGGGAGATGAGGGCGAGTTCACCTGTAGAGCCCAGAATAGCCTGGGCAGCCAGCACGTGTCCCTGAACCTGTCTCTGCAGCAAGAGTACACCGGCAAGATGAGGCCTGTGTCTGGCGTTCTGCTGGGAGCCGTGGGAGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTTGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAG
SEQ ID NO：47
CAGAAGTCCAACAGAAAGGACTACAGCCTGACCATGCAGAGCAGCGTGACAGTGCAAGAGGGGATGTGCGTCCACGTCCGGTGCAGCTTTAGCTACCCTGTGGACAGCCAGACCGACAGCGATCCTGTGCACGGCTACTGGTTCAGAGCCGGCAACGACATCTCTTGGAAAGCCCCAGTGGCCACCAACAATCCTGCCTGGGCTGTGCAAGAAGAGACACGGGACAGATTCCATCTGCTGGGCGACCCTCAGACCAAGAACTGCACACTGAGCATCCGGGACGCCAGAATGTCTGACGCCGGCAGATACTTCTTCCGGATGGAAAAGGGCAACATCAAGTGGAACTATAAGTACGACCAGCTGAGCGTGAACGTGACAGCCCTGACACACAGACCCAACATTCTGATCCCCGGCACACTGGAAAGCGGCTGCTTCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCTTGGGCCTGCGAGCAGGGAACACCTCCTATGATCAGCTGGATGGGAACCAGCGTGTCCCCTCTGCACCCTAGCACCACAAGATCCAGCGTGCTGACACTGATCCCTCAGCCTCAGCACCACGGCACAAGCCTGACCTGTCAAGTTACACTTCCTGGCGCTGGCGTGACCACCAACAGAACAATCCAGCTCAACGTGTCCTATCCTGGTGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGAGGCGGATCTCAGAAGTCCAACAGAAAGGACTACAGCCTGACCATGCAGAGCAGCGTGACAGTGCAAGAGGGGATGTGCGTCCACGTCCGGTGCAGCTTTAGCTACCCTGTGGACAGCCAGACCGACAGCGATCCTGTGCACGGCTACTGGTTCAGAGCCGGCAACGACATCTCTTGGAAAGCCCCAGTGGCCACCAACAATCCTGCCTGGGCTGTGCAAGAAGAGACACGGGACAGATTCCATCTGCTGGGCGACCCTCAGACCAAGAACTGCACACTGAGCATCCGGGACGCCAGAATGTCTGACGCCGGCAGATACTTCTTCCGGATGGAAAAGGGCAACATCAAGTGGAACTATAAGTACGACCAGCTGAGCGTGAACGTGACAGCCCTGACACACAGACCCAACATTCTGATCCCCGGCACACTGGAAAGCGGCTGCTTCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCTTGGGCCTGCGAGCAGGGAACACCTCCTATGATCAGCTGGATGGGAACCAGCGTGTCCCCTCTGCACCCTAGCACCACAAGATCCAGCGTGCTGACACTGATCCCTCAGCCTCAGCACCACGGCACAAGCCTGACCTGTCAAGTTACACTTCCTGGCGCTGGCGTGACCACCAACAGAACAATCCAGCTCAACGTGTCCTATCCTGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAG
SEQ ID NO：48
CAGAAGTCCAACAGAAAGGACTACAGCCTGACCATGCAGAGCAGCGTGACAGTGCAAGAGGGGATGTGCGTCCACGTCCGGTGCAGCTTTAGCTACCCTGTGGACAGCCAGACCGACAGCGATCCTGTGCACGGCTACTGGTTCAGAGCCGGCAACGACATCTCTTGGAAAGCCCCAGTGGCCACCAACAATCCTGCCTGGGCTGTGCAAGAAGAGACACGGGACAGATTCCATCTGCTGGGCGACCCTCAGACCAAGAACTGCACACTGAGCATCCGGGACGCCAGAATGTCTGACGCCGGCAGATACTTCTTCCGGATGGAAAAGGGCAACATCAAGTGGAACTATAAGTACGACCAGCTGAGCGTGAACGTGACAGCCCTGACACACAGACCCAACATTCTGATCCCCGGCACACTGGAAAGCGGCTGCTTCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCTTGGGCCTGCGAGCAGGGAACACCTCCTATGATCAGCTGGATGGGAACCAGCGTGTCCCCTCTGCACCCTAGCACCACAAGATCCAGCGTGCTGACACTGATCCCTCAGCCTCAGCACCACGGCACAAGCCTGACCTGTCAAGTTACACTTCCTGGCGCTGGCGTGACCACCAACAGAACAATCCAGCTCAACGTGTCCTATCCTCCTCAGAACCTGACCGTGACCGTGTTCCAAGGCGAGGGCACAGCTTCTACAGCCCTGGGCAATAGCAGCAGCCTGTCTGTGCTGGAAGGCCAGTCTCTGAGACTCGTGTGCGCCGTGGATAGCAACCCTCCTGCTAGACTGAGCTGGACTTGGCGGAGCCTGACACTGTACCCTAGCCAGCCTAGCAATCCCCTGGTGCTGGAACTGCAAGTGCACCTGGGAGATGAGGGCGAGTTCACCTGTAGAGCCCAGAATAGCCTGGGCAGCCAGCACGTGTCCCTGAACCTGTCTCTGCAGCAAGAGTACACCGGCAAGATGAGGCCTGTGTCTGGCGTTCTGCTGGGAGCCGTGGGAGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAGGGTGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGCGGAGGCGGATCTCAGAAGTCCAACAGAAAGGACTACAGCCTGACCATGCAGAGCAGCGTGACAGTGCAAGAGGGGATGTGCGTCCACGTCCGGTGCAGCTTTAGCTACCCTGTGGACAGCCAGACCGACAGCGATCCTGTGCACGGCTACTGGTTCAGAGCCGGCAACGACATCTCTTGGAAAGCCCCAGTGGCCACCAACAATCCTGCCTGGGCTGTGCAAGAAGAGACACGGGACAGATTCCATCTGCTGGGCGACCCTCAGACCAAGAACTGCACACTGAGCATCCGGGACGCCAGAATGTCTGACGCCGGCAGATACTTCTTCCGGATGGAAAAGGGCAACATCAAGTGGAACTATAAGTACGACCAGCTGAGCGTGAACGTGACAGCCCTGACACACAGACCCAACATTCTGATCCCCGGCACACTGGAAAGCGGCTGCTTCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCTTGGGCCTGCGAGCAGGGAACACCTCCTATGATCAGCTGGATGGGAACCAGCGTGTCCCCTCTGCACCCTAGCACCACAAGATCCAGCGTGCTGACACTGATCCCTCAGCCTCAGCACCACGGCACAAGCCTGACCTGTCAAGTTACACTTCCTGGCGCTGGCGTGACCACCAACAGAACAATCCAGCTCAACGTGTCCTATCCTCCTCAGAACCTGACCGTGACCGTGTTCCAAGGCGAGGGCACAGCTTCTACAGCCCTGGGCAATAGCAGCAGCCTGTCTGTGCTGGAAGGCCAGTCTCTGAGACTCGTGTGCGCCGTGGATAGCAACCCTCCTGCTAGACTGAGCTGGACTTGGCGGAGCCTGACACTGTACCCTAGCCAGCCTAGCAATCCCCTGGTGCTGGAACTGCAAGTGCACCTGGGAGATGAGGGCGAGTTCACCTGTAGAGCCCAGAATAGCCTGGGCAGCCAGCACGTGTCCCTGAACCTGTCTCTGCAGCAAGAGTACACCGGCAAGATGAGGCCTGTGTCTGGCGTTCTGCTGGGAGCCGTGGGA
SEQ ID NO：49
QKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO：50
CAGAAGTCCAACAGAAAGGACTACAGCCTGACCATGCAGAGCAGCGTGACAGTGCAAGAGGGGATGTGCGTCCACGTCCGGTGCAGCTTTAGCTACCCTGTGGACAGCCAGACCGACAGCGATCCTGTGCACGGCTACTGGTTCAGAGCCGGCAACGACATCTCTTGGAAAGCCCCAGTGGCCACCAACAATCCTGCCTGGGCTGTGCAAGAAGAGACACGGGACAGATTCCATCTGCTGGGCGACCCTCAGACCAAGAACTGCACACTGAGCATCCGGGACGCCAGAATGTCTGACGCCGGCAGATACTTCTTCCGGATGGAAAAGGGCAACATCAAGTGGAACTATAAGTACGACCAGCTGAGCGTGAACGTGACAGCCCTGACACACAGACCCAACATTCTGATCCCCGGCACACTGGAAAGCGGCTGCTTCCAGAATCTGACCTGCTCTGTGCCTTGGGCCTGCGAGCAGGGAACACCTCCTATGATCAGCTGGATGGGAACCAGCGTGTCCCCTCTGCACCCTAGCACCACAAGATCCAGCGTGCTGACACTGATCCCTCAGCCTCAGCACCACGGCACAAGCCTGACCTGTCAAGTTACACTTCCTGGCGCTGGCGTGACCACCAACAGAACAATCCAGCTCAACGTGTCCTATCCTCCTCAGAACCTGACCGTGACCGTGTTCCAAGGCGAGGGCACAGCTTCTACAGCCCTGGGCAATAGCAGCAGCCTGTCTGTGCTGGAAGGCCAGTCTCTGAGACTCGTGTGCGCCGTGGATAGCAACCCTCCTGCTAGACTGAGCTGGACTTGGCGGAGCCTGACACTGTACCCTAGCCAGCCTAGCAATCCCCTGGTGCTGGAACTGCAAGTGCACCTGGGAGATGAGGGCGAGTTCACCTGTAGAGCCCAGAATAGCCTGGGCAGCCAGCACGTGTCCCTGAACCTGTCTCTGCAGCAAGAGTACACCGGCAAGATGAGGCCTGTGTCTGGCGTTCTGCTGGGAGCCGTGGGAGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAG
SEQ ID NO：51
LQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVT
SEQ ID NO：52
LQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTI
SEQ ID NO：53
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SEQ ID NO：54
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCCACAGGCGTGCACAGCGATCCCAATTTCTGGCTGCAAGTGCAAGAGTCCGTGACCGTGCAAGAGGGCCTGTGTGTGCTGGTGCCCTGCACCTTCTTTCACCCCATTCCTTACTACGACAAGAACAGCCCTGTGCACGGCTACTGGTTTAGAGAGGGCGCCATCATCAGCAGAGATAGCCCTGTGGCCACCAACAAGCTGGACCAAGAGGTGCAAGAAGAGACACAGGGCAGATTCAGACTGCTGGGCGACCCCAGCAGAAACAACTGCAGCCTGTCTATCGTGGACGCCAGGCGGAGAGACAACGGCAGCTACTTCTTCCGGATGGAACGGGGCAGCACCAAGTACAGCTACAAGAGCCCTCAGCTGTCCGTGCACGTGACCGACCTGACACACAGACCCAAGATTCTGATCCCCGGCACACTGGAACCTGGCCACAGCAAGAATCTGACCTGCTCCGTGTCCTGGGCCTGCGAACAGGGAACCCCTCCTATCTTTAGCTGGCTGAGCGCCGCTCCTACATCTCTGGGCCCTAGAACAACACACAGCAGCGTGCTGATCATCACCCCTAGACCTCAGGACCACGGCACCAACCTGACCTGCCAAGTGAAATTTGCTGGCGCTGGCGTGACCACCGAGAGAACCATCCAGCTGAACGTGACCTACGTGCCACAGAACCCTACCACCGGCATCTTTCCAGGCGACGGCTCTGGCAAGCAAGAAACAAGAGCTGGCGTGGTGCACGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTTGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAGTA
SEQ ID NO：55
MGWSCIILFLVATATGVHSDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGGGGSGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO：56
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCCACAGGCGTGCACAGCGATCCCAATTTCTGGCTGCAAGTGCAAGAGTCCGTGACCGTGCAAGAGGGCCTGTGTGTGCTGGTGCCCTGCACCTTCTTTCACCCCATTCCTTACTACGACAAGAACAGCCCTGTGCACGGCTACTGGTTTAGAGAGGGCGCCATCATCAGCAGAGATAGCCCTGTGGCCACCAACAAGCTGGACCAAGAGGTGCAAGAAGAGACACAGGGCAGATTCAGACTGCTGGGCGACCCCAGCAGAAACAACTGCAGCCTGTCTATCGTGGACGCCAGGCGGAGAGACAACGGCAGCTACTTCTTCCGGATGGAACGGGGCAGCACCAAGTACAGCTACAAGAGCCCTCAGCTGTCCGTGCACGTGACCGACCTGACACACAGACCCAAGATTCTGATCCCCGGCACACTGGAACCTGGCCACAGCAAGAATCTGACCTGCTCCGTGTCCTGGGCCTGCGAACAGGGAACCCCTCCTATCTTTAGCTGGCTGAGCGCCGCTCCTACATCTCTGGGCCCTAGAACAACACACAGCAGCGTGCTGATCATCACCCCTAGACCTCAGGACCACGGCACCAACCTGACCTGCCAAGTGAAATTTGCTGGCGCTGGCGTGACCACCGAGAGAACCATCCAGCTGAACGTGACCTACGTGCCACAGAACCCTACCACCGGCATCTTTCCAGGCGACGGCTCTGGCAAGCAAGAAACAAGAGCTGGCGTGGTGCACGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTTGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAGTAG
SEQ ID NO：57
MGWSCIILFLVATATGVHSDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO：58
ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCCACAGGCGTGCACAGCGATCCCAATTTCTGGCTGCAAGTGCAAGAGTCCGTGACCGTGCAAGAGGGCCTGTGTGTGCTGGTGCCCTGCACCTTCTTTCACCCCATTCCTTACTACGACAAGAACAGCCCTGTGCACGGCTACTGGTTTAGAGAGGGCGCCATCATCAGCAGAGATAGCCCTGTGGCCACCAACAAGCTGGACCAAGAGGTGCAAGAAGAGACACAGGGCAGATTCAGACTGCTGGGCGACCCCAGCAGAAACAACTGCAGCCTGTCTATCGTGGACGCCAGGCGGAGAGACAACGGCAGCTACTTCTTCCGGATGGAACGGGGCAGCACCAAGTACAGCTACAAGAGCCCTCAGCTGTCCGTGCACGTGACCGACCTGACACACAGACCCAAGATTCTGATCCCCGGCACACTGGAACCTGGCCACAGCAAGAATCTGACCTGCTCCGTGTCCTGGGCCTGCGAACAGGGAACCCCTCCTATCTTTAGCTGGCTGAGCGCCGCTCCTACATCTCTGGGCCCTAGAACAACACACAGCAGCGTGCTGATCATCACCCCTAGACCTCAGGACCACGGCACCAACCTGACCTGCCAAGTGAAATTTGCTGGCGCTGGCGTGACCACCGAGAGAACCATCCAGCTGAACGTGACCTACGTGCCACAGAACCCTACCACCGGCATCTTTCCAGGCGACGGCTCTGGCAAGCAAGAAACAAGAGCTGGCGTGGTGCACGAACCTCGAGGGCCTACCATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAGTGCCCCGCTCCTAATCTGCTCGGAGGCCCCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAAGATCAAGGACGTGCTGATGATCTCTCTGAGCCCCATCGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCGAGGACGATCCCGATGTGCAGATCAGTTGGTTCGTGAACAACGTGGAAGTGCACACAGCCCAGACACAGACCCACAGAGAGGACTACAACAGCACCCTGAGAGTGGTGTCTGCCCTGCCTATCCAGCACCAGGATTGGATGAGCGGCAAAGAATTCAAGTGCAAAGTGAACAACAAGGACCTGCCTGCTCCTATCGAGCGGACCATCTCTAAGCCTAAGGGCTCTGTTAGAGCCCCTCAGGTGTACGTGCTGCCTCCTCCAGAGGAAGAGATGACCAAGAAACAAGTGACCCTGACCTGCATGGTCACCGACTTCATGCCCGAGGACATCTACGTGGAATGGACCAACAACGGCAAGACCGAGCTGAACTACAAGAACACCGAGCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTACTTCATGTACTCCAAGCTGCGCGTGGAAAAGAAGAACTGGGTCGAGCGGAACAGCTACAGCTGCTCTGTGGTGCACGAGGGCCTGCACAATCACCACACCACCAAGAGCTTCAGCCGTACGCCTGGAAAGGGAGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGTGGCTATATCCCCGAGGCTCCTAGAGATGGCCAGGCCTATGTTCGGAAGGATGGCGAATGGGTGCTGCTGAGCACCTTCCTTTAG
SEQ ID NO：59
MGWSCIILFLVATATGVHSDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGGGGSGGGGSGGGGSDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO：60
MGWSCIILFLVATATGVHSDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGGGGSDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVH
SEQ ID NO：61
MGWSCIILFLVATATGVHSQKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGGGGGSGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO：62
MGWSCIILFLVATATGVHSQKSNRKDYSLTMQSSVTVQEGMCVHVRCSFSYPVDSQTDSDPVHGYWFRAGNDISWKAPVATNNPAWAVQEETRDRFHLLGDPQTKNCTLSIRDARMSDAGRYFFRMEKGNIKWNYKYDQLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCFQNLTCSVPWACEQGTPPMISWMGTSVSPLHPSTTRSSVLTLIPQPQHHGTSLTCQVTLPGAGVTTNRTIQLNVSYPPQNLTVTVFQGEGTASTALGNSSSLSVLEGQSLRLVCAVDSNPPARLSWTWRSLTLYPSQPSNPLVLELQVHLGDEGEFTCRAQNSLGSQHVSLNLSLQQEYTGKMRPVSGVLLGAVGEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO：63
MGWSCIILFLVATATGVHSQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGGGGGSGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO：64
MGWSCIILFLVATATGVHSQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGKGGGGSGGGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO：65
QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVH
SEQ ID NO：66
QTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGCPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLCPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQG
SEQ ID NO：67
MGWSCIILFLVATATGVHSQTSKLLTMQSSVTVQEGLCVHVPCSFSYPSHGWIYPGPVVHGYWFREGANTDQDAPVATNNPARAVWEETRDRFHLLGDPHTKNCTLSIRDARRSDAGRYFFRMEKGSIKWNYKHHRLSVNVTALTHRPNILIPGTLESGSPQNLTCSVPWACEQGTPPMISWIGTSVSPLDPSTTRSSVLTLIPQPQDHGTSLTCQVTFPGASVTTNKTVHLNVSYPPQNLTMTVFQGDGTVSTVLGNGSSLSLPEGQSLRLVCAVDAVDSNPPARLSLSWRGLTLYPSQPSNPGVLELPWVHLRDAAEFTCRAQNPLGSQQVYLNVSLQSKATSGVTQGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
SEQ ID NO：68
atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtacactcccagaccagcaagctgctgaccatgcagagcagcgtgaccgtgcaggagggcctgtgcgtgcatgtgccctgcagcttcagctaccccagccacggctggatctaccccggtcccgtagtgcacggctactggttcagggagggcgccaacaccgaccaggacgctcccgtggcaaccaacaaccccgccagggccgtgtgggaggagaccagggacaggttccacctgctgggcgacccccacaccaagaactgcaccctgagcatcagggacgccaggaggagcgacgccggcaggtacttcttcaggatggagaaggggtctatcaagtggaactacaagcaccaccggctgagcgtgaatgtgaccgccctgacccaccggcccaatatcctcatccccggcaccctggagagcggcagcccccagaatcttacctgcagcgtaccctgggcctgcgagcagggcacccctccaatgatcagctggatcggcaccagcgtgagccccctggaccctagtaccaccaggagcagcgtgctgaccctgatcccccagccccaggaccacggaaccagcctgacctgccaggtgaccttccccggagccagcgtaaccaccaacaagaccgtgcacctgaacgtgagctacccaccccaaaacctgaccatgaccgtgttccagggcgacggcacggtgagcaccgtactgggcaacggcagctctctgagcctgcccgagggccagagcttgcggctggtctgcgccgtggatgctgtggacagcaaccctcccgccaggctgagcctgagctggaggggcctgaccctgtaccccagccagcccagcaatcccggcgtgctggagctgccctgggttcacctgagggacgctgccgagttcacatgtagggcccagaaccccctgggctctcagcaggtgtacctgaacgtgtctcttcagagtaaggccaccagcggcgtgacccaaggaggctatatccccgaggctcctagagatggccaggcctatgttcggaaggatggcgaatgggtgctgctgagcaccttccttgaacctcgagggcctaccatcaagccctgtcctccatgcaagtgccccgctcctaatctgctcggaggccccagcgtgttcatcttcccacctaagatcaaggacgtgctgatgatctctctgagccccatcgtgacctgcgtggtggtggatgtgtccgaggacgatcccgatgtgcagatcagttggttcgtgaacaacgtggaagtgcacacagcccagacacagacccacagagaggactacaacagcaccctgagagtggtgtctgccctgcctatccagcaccaggattggatgagcggcaaagaattcaagtgcaaagtgaacaacaaggacctgcctgctcctatcgagcggaccatctctaagcctaagggctctgttagagcccctcaggtgtacgtgctgcctcctccagaggaagagatgaccaagaaacaagtgaccctgacctgcatggtcaccgacttcatgcccgaggacatctacgtggaatggaccaacaacggcaagaccgagctgaactacaagaacaccgagcctgtgctggacagcgacggcagctacttcatgtactccaagctgcgcgtggaaaagaagaactgggtcgagcggaacagctacagctgctctgtggtgcacgagggcctgcacaatcaccacaccaccaagagcttcagccgtacgcctggaaagtag
SEQ ID NO：69
GGGGSGGGGS
SEQ ID NO：70
GGP
SEQ ID NO：71
GGGGS
SEQ ID NO：72
GGGGS

Claims (91)

1.一种分离的多肽，其包含：
a)凝集素结构域；
b)三聚化结构域；和
c)二聚化结构域。
2.权利要求1所述的多肽，其中所述凝集素结构域、三聚化结构域和二聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。
3.权利要求1所述的多肽，其中所述凝集素结构域、二聚化结构域和三聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。
4.前述权利要求中任一项所述的多肽，其还包含连接物。
5.权利要求2所述的多肽，其还在所述凝集素结构域与三聚化结构域之间包含连接物。
6.权利要求3所述的多肽，其还在所述二聚化结构域与三聚化结构域之间包含连接物。
7.一种分离的多肽，其包含：
a)第一凝集素结构域；
b)第二凝集素结构域；和
c)二聚化结构域。
8.权利要求7所述的多肽，其中所述第一凝集素结构域和第二凝集素结构域是一致的。
9.权利要求7或8所述的多肽，其中所述第一凝集素结构域、第二凝集素结构域和二聚化结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。
10.权利要求7或8所述的多肽，其中所述第一凝集素结构域、二聚化结构域和第二凝集素结构域以N-至C-端的方向共价连接在一起。
11.权利要求1-10中的任一项所述的多肽，其中所述凝集素结构域包含Siglec唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域或其变体。
12.权利要求11所述的多肽，其中所述凝集素结构域包含Siglec细胞外结构域或其变体。
13.权利要求11或12所述的多肽，其中所述Siglec是哺乳动物的Siglec。
14.权利要求13所述的多肽，其中所述Siglec是人类、猴、狗、大鼠或小鼠Siglec。
15.权利要求14所述的多肽，其中所述Siglec是人类Siglec。
16.权利要求15所述的多肽，其中所述Siglec选自Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14和Siglec-15。
17.权利要求16所述的多肽，其中所述Siglec选自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10和Siglec-11。
18.权利要求17所述的多肽，其中所述Siglec选自Siglec-3、Siglec-7和Siglec-9。
19.权利要求18所述的多肽，其中所述Siglec选自Siglec-7和Siglec-9。
20.权利要求19所述的多肽，其中所述凝集素结构域包含SEQ ID NO：1,SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：51。
21.权利要求20所述的多肽，其中所述凝集素结构域包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
22.权利要求20所述的多肽，其中所述凝集素结构域包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：65或SEQ ID NO：66。
23.权利要求22所述的多肽，其中所述凝集素结构域包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。
24.权利要求14所述的多肽，其中所述Siglec是小鼠Siglec。
25.权利要求24所述的多肽，其中所述Siglec选自SigE、SigF、SigG和SigF。
26.权利要求1-8中的任一项所述的多肽，其中所述凝集素结构域包含C型凝集素结构域。
27.权利要求26所述的多肽，其中所述C型凝集素选自CLEC1A、CLEC1B、CLEC2A、CLEC2B、CD69(CLEC2C)、CLEC2D、CLEC2L、CLEC3A、CLEC3B、CLEC4A、CLEC4C、CLEC4D、CLEC4E、CLEC4F、CLEC4G、ASGR1(CLEC4H1)、ASGR2(CLEC4H2)、FCER2(CLEC4J)、CD207(CLEC4K)、CD209(CLEC4L)、CLEC4M、CLEC5A、CLEC6A、CLEC7A、OLR1(CLEC8A)、CLEC9A、CLEC10A、CLEC11A、CLEC12A、CLEC12B、CD302(CLEC13A)、LY75(CLEC13B)、PLA2R1(CLEC13C)、MRC1(CLEC13D)、MRC2(CLEC13E)、CLEC14A、CLEC16A、CLEC17A、KLRA1、KLRB1(CLEC5B)、KLRC1、KLRC2、KLRC3、KLRC4、KLRD1、KLRF1(CLEC5C)、KLRG1(CLEC15A)、KLRG2(CLEC15B)和KLRK1。
28.权利要求27所述的多肽，其中所述C型凝集素选自CLEC4A、CLEC12A和CLEC12B。
29.权利要求1-6或11-28中的任一项所述的多肽，其中所述三聚化结构域是天然三聚化结构域或合成三聚化结构域。
30.权利要求29所述的多肽，其中所述三聚化结构域选自T4噬菌体纤维蛋白(foldon)、网格蛋白、热休克因子1、胶原蛋白、血细胞凝集素、GCN4、基于GCN4的异亮氨酸拉链和卷曲螺旋肽三聚化结构域。
31.权利要求30所述的多肽，其中所述三聚化结构域选自基于GCN4的异亮氨酸拉链和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域。
32.权利要求31所述的多肽，其中所述三聚化结构域是T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域。
33.权利要求3所述的多肽，其中所述三聚化结构域包含SEQ ID NO：5。
34.权利要求1-33中的任一项所述的多肽，其中所述二聚化结构域是天然二聚化结构域或合成二聚化结构域。
35.权利要求34所述多肽，其中所述二聚化结构域选自免疫球蛋白Fc结构域、基于亮氨酸拉链的、基于卷曲螺旋的和基于螺旋的二聚化结构域。
36.权利要求35所述的多肽，其中所述二聚化结构域是免疫球蛋白Fc结构域。
37.权利要求36所述的多肽，其中所述免疫球蛋白Fc结构域是小鼠或人类免疫球蛋白Fc结构域。
38.权利要求37所述的多肽，其中所述免疫球蛋白Fc结构域是小鼠IgG2a免疫球蛋白Fc结构域。
39.权利要求38所述的多肽，其中所述免疫球蛋白Fc结构域包含SEQ ID NO：6。
40.权利要求4-6或11-39中的任一项所述的多肽，其中所述连接物包含SEQ ID NO：69。
41.权利要求1-4或9-38中的任一项所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：67。
42.权利要求41所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8。
43.权利要求5-40中的任一项所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60。
44.权利要求43所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：12。
45.一种多聚体蛋白，其包含权利要求1-44中的任一项所述的多肽。
46.权利要求45所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白是二聚体、三聚体、六聚体或十二聚体。
47.权利要求46所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白是六聚体。
48.一种多聚体蛋白，其包含六个分开的如权利要求1-6或11-44中的任一项所述的多肽，所述多肽复合产生六聚体蛋白。
49.一种多聚体蛋白，其包含两个分开的权利要求5-42中的任一项所述的多肽，所述多肽通过每个多肽的每个二聚化结构域二聚化，产生二聚体蛋白。
50.权利要求45-49中的任一项所述的多聚体蛋白，其中当通过表面等离子体共振或生物层干涉量度法测量时，所述多聚体蛋白以0.01nM至100nM的KD结合糖类配体。
51.权利要求50所述的多聚体蛋白，其中所述KD是10nM或更低。
52.权利要求51所述的多聚体蛋白，其中所述KD是1nM或更低。
53.权利要求45-52中的任一项所述的多聚体蛋白，其中所述糖类配体是Siglec配体。
54.权利要求53所述的多聚体蛋白，其中所述Siglec配体选自Siglec-1、Siglec-2、Siglec-3、Siglec-4、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10、Siglec-11、Siglec-12、Siglec-14和Siglec-15配体。
55.权利要求54所述的多聚体蛋白，其中所述Siglec配体选自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10和Siglec-11配体。
56.权利要求55所述的多聚体蛋白，其中所述Siglec配体选自Siglec-3、Siglec-7和Siglec-9配体。
57.权利要求56所述的多聚体蛋白，其中所述Siglec配体选自Siglec-7和Siglec-9配体。
58.权利要求53-57中的任一项所述的多聚体蛋白，其中所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸、唾液酸化路易斯X、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc。
59.权利要求58所述的多聚体蛋白，其中所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸和唾液酸化路易斯X。
60.一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7 C2-组结构域、第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
61.一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7 C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三Siglec-7 C2-组结构域和第四Siglec-7 C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
62.一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7 C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：
a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；
d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；并且
e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
63.一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-7唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-7 C2-组结构域、第二Siglec-7 C2-组结构域、Fc结构域和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：
a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；
d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；并且
e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
64.一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9 C2-组结构域、第一连接物、第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
65.一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9 C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第三Siglec-9 C2-组结构域和第四Siglec-9 C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
66.一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9 C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域和Fc结构域，并且其中：
a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；
d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；并且
e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
67.一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-9唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-9 C2-组结构域、第二Siglec-9 C2-组结构域、Fc结构域和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：
a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；
d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；和
e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
68.一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-3 C2-组结构域、第一连接物、第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第二Siglec-3 C2-组结构域和Fc结构域，并且其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
69.一种包含两个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含第一Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、第一Siglec-3 C2-组结构域、Fc结构域、第二Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域和第二Siglec-3 C2-组结构域，其中所述两个多肽在它们的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
70.一种包含6个多肽的多聚体蛋白，其中每个多肽以N-端至C-端的方向包含Siglec-3唾液酸结合性V-组免疫球蛋白样结构域、Siglec-3 C2-组结构域、Fc结构域和T4噬菌体纤维蛋白(foldon)三聚化结构域，并且其中：
a)所述第一、第二和第三多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
b)所述第四、第五和第六多肽在它们相应的三聚化结构域处三聚化；
c)所述第一和第二多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；
d)所述第三和第四多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)；并且
e)所述第五和第六多肽在它们相应的Fc结构域处二聚化(例如共价连接)。
71.权利要求45-70中的任一项所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白已用唾液酸酶处理。
72.权利要求71所述的多聚体蛋白，其中所述多聚体蛋白的唾液酸含量低于尚未用所述唾液酸酶处理的相似或在其他方面一致的多聚体蛋白的唾液酸含量的50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。
73.一种药物组合物，其包含权利要求45-72中的任一项所述的多聚体蛋白。
74.一种在需要的对象中治疗Siglec介导的障碍的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的权利要求45-72中的任一项所述的多聚体蛋白或权利要求73所述的药物组合物，从而在所述对象中治疗所述障碍。
75.一种检测样品中的糖类的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与权利要求45-72中的任一项所述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述糖类的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-糖类复合物；并且
(b)如果有的话，检测所述在步骤(a)中产生的复合物的存在。
76.一种在癌症对象中检测糖类的方法，所述方法包括：
(a)将来自于所述对象的样品与权利要求45-72中的任一项所述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述糖类的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-糖类复合物；并且
(b)如果有的话，检测所述在步骤(a)中产生的复合物的存在。
77.权利要求75或76所述的方法，其中所述糖类是Siglec配体。
78.一种鉴定可能对使用Siglec抑制剂的治疗有响应的癌症对象的方法，所述方法包括：
(a)将来自于所述对象的样品与权利要求45-72中的任一项所述的多聚体蛋白在一定条件下相接触，所述条件在所述样品中存在所述Siglec配体的情况下允许所述多聚体蛋白形成多聚体蛋白-Siglec配体复合物；并且
(b)如果有的话，检测所述在步骤(a)中产生的复合物的存在，
其中复合物的存在表明所述对象将对使用Siglec抑制剂的治疗有响应。
79.一种在需要的对象中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述对象给药有效量的Siglec抑制剂，从而在所述对象中治疗所述癌症，其中所述癌症已通过权利要求76所述的方法被鉴定为包含表达一种或多种Siglec配体的癌细胞。
80.权利要求77-79中的任一项所述的方法，其中所述Siglec配体选自Siglec-3、Siglec-5、Siglec-6、Siglec-7、Siglec-8、Siglec-9、Siglec-10和Siglec-11配体。
81.权利要求80所述的方法，其中所述Siglec配体选自Siglec-3、Siglec-7和Siglec-9配体。
82.权利要求81所述的方法，其中所述Siglec配体选自Siglec-7和Siglec-9配体。
83.权利要求80-82中的任一项所述的方法，其中所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸、唾液酸化路易斯X、NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-3GalNAc、NeuGcα2-3Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-3Galβ1-3GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-6GalNAc、Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAc、NeuGcα2-6Galβ1-4Glc、NeuGcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuGcα2-6GalNAc、NeuAcα2-8NeuAcα2-3Galβ1-4Glc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc、NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc、NeuAcα2-6Galβ1-4GlcNAc6S、NeuAcα2-3Galβ1-4GalNAc、NeuAcα2-8NeuAc、NeuAcα2-3GalβSβ1-4GlcNAcα2-3Fuc和NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAc6Sα2-3Fuc。
84.权利要求83所述的方法，其中所述Siglec配体选自α2,3-连接的唾液酸、α2,6-连接的唾液酸和唾液酸化路易斯X。
85.权利要求78-84中的任一项所述的方法，其中所述Siglec抑制剂是抗Siglec抗体。
86.权利要求85所述的方法，其中所述抗Siglec抗体选自抗Siglec-3抗体、抗Siglec-5抗体、抗Siglec-6抗体、抗Siglec-7抗体、抗Siglec-8抗体、抗Siglec-9抗体、抗Siglec-10抗体和抗Siglec-11抗体。
87.权利要求86所述的方法，其中所述抗Siglec抗体选自抗Siglec-3抗体、抗Siglec-7抗体和抗Siglec-9抗体。
88.权利要求87所述的抗体，其中所述抗Siglec抗体选自抗Siglec-7抗体和抗Siglec-9抗体。
89.权利要求75-88中的任一项所述的方法，其中所述样品选自组织样品、体液样品或细胞样品。
90.权利要求76-89中的任一项所述的方法，其中所述癌症是上皮癌。
91.权利要求90所述的方法，其中所述上皮癌选自子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、外阴癌、子宫癌、输卵管癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、泌尿系统癌症、膀胱癌、头颈癌、口腔癌和肝癌。
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