KR101589742B1 - 건성 안 증후군 치료를 위한 갈렉틴의 조성물 및 용도 - Google Patents

건성 안 증후군 치료를 위한 갈렉틴의 조성물 및 용도 Download PDF

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Abstract

갈렉틴-1 단백질, 갈렉틴-3 단백질, 갈렉틴-7 단백질 및/또는 갈렉틴-8 단백질의 치료적으로 유효한 양을 상피 상처로 고통받는 포유 동물에 투여하는 것을 포함하는 포유 동물의 건성 안의 치료적 처리를 위한 방법을 제공한다. 갈렉틴-1 단백질, 갈렉틴-3 단백질, 갈렉틴-7 단백질 및/또는 갈렉틴-8 단백질, 및 적합한 담체 또는 희석제인 약학적으로 활성 약물을 포함하는 약학 및 안과 조성물 및 키트를 제공한다.
갈렉틴 단백질, 건성안 증후군, 제조 방법, 약학 조성물

Description

건성 안 증후군 치료를 위한 갈렉틴의 조성물 및 용도{COMPOSITIONS AND USES OF A GALECTIN FOR TREATMENT OF DRY EYE SYNDROME}
갈렉틴 단백질로 건성 안 증후군을 치료하기 위한 조성물, 방법 및 키트(kit)가 제공된다.
건성 안 증후군(DES)은 30 내지 45세 사이 인구의 최대 10%에 영향을 미치는 흔한 질병이고, 45세 이상 노인 인구의 경우 최대 20%로 증가한다(문헌 [Schein et al. 1997, Am J Ophthamol 124, 723-72; Brewitt] 및 [Sistani, 2001, Surv of Ophthalmol 45;S119-S202]). DES는 안 자극, 흐릿하고 흔들리는 시력을 생성하고, 시력에 위협을 주는 각막 감염 및 궤양의 위험을 증가시킨다. DES의 조직학적 영향은 결막 배상 세포의 감소된 밀도 및 안구 표면 상피에 의한 점액의 감소되고 비정상적인 생성으로 인한 안구 표면 상피의 비정상적인 증식과 분화를 포함한다(문헌 [Murillo-Lopez and Pflugfelder, 1996, Dry Eye. In: Krachmer J, Mannis M, Holland E, eds. The Cornea. Mosby, St. Louis, MO. 663-686]; [Dursun et al., 2002, Invest Ophthamol & Vis Sci 43:632-638]). 건성 안 질병(dry eye disease)은 만성적인 질병이고, 이의 증상 및 징후는 습도 및 공기 이동뿐만 아니라, 특정한 시각 활동(독서 또는 컴퓨터의 사용)의 요구와 같은 환경적인 요소에 의해 크게 영향을 받는다.
DES의 전형적인 증상은 화끈거림, 가려움, 이물감, 자상(刺傷), 건조감, 눈부심, 안구 피로 및 충혈이다. 건성 안 질병은 만성적인 질병이고, 이의 증상 및 징후는 습도 및 공기 이동뿐만 아니라, 특정한 시각 활동(독서 또는 컴퓨터의 사용)의 요구와 같은 환경적인 요소에 의해 크게 영향을 받는다(문헌 [Rheinstrom, 1999, Dry eye. In Yanoff, ed. Ophthalmology. 1st Ed. Editor. Mosley International Ltd, St Louis, MO; Foulks, 2003, The Ocular Surface, 1:20-30]).
아주 다양한 인공 눈물 제품을 이용할 수 있지만, 이 모두는 증상의 일시적 완화만을 제공한다. 현재 이 상태를 반전하는 치료약은 존재하지 않는다. 따라서, 본 기술 분야에서 건성 안 증후군을 치료하는 추가적인 약제 및 조성물에 대한 필요성이 있다. 특히, 약물, 조성물 및 치료법에 대한 필요성이 있다.
개요
본 발명은 치료를 필요로 하는 포유 동물의 건성 안을 치료하기 위한 방법을 특징으로 하고, 이는 치료적으로 유효한 양의 갈렉틴 단백질을 포유 동물에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 구체예는 포유 동물의 건성 안을 예방하기 위한 방법이고, 이는 건성 안을 예방함을 필요로 하는 포유 동물을 식별하고, 치료적으로 유효한 양의 갈렉틴 단백질을 포유 동물에 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 이 방법은 안구 상피 상처; 항히스타민제의 사전 사용, 소염제의 사전 사용; 및 엑시머 레이저 치료의 사전 사용 중 하나 이상을 갖는 포유 동물의 군으로부터 선택되는 치료 또는 예방을 필요로 하는 포유 동물을 위해 이용된다. 예를 들어, 포유 동물은 인간이다. 또한, 갈렉틴 단백질은 갈렉틴-8, 갈렉틴-7 및 갈렉틴-3으로부터 선택된다. 특정한 구체예에서, 건성 안은 지속성 증후군이다. 예를 들어, 건성 안은 상피 미란의 원인이 된다. 또한, 상피 미란은 각막 상처를 생성한다.
일반적으로, 상기 방법에서 이용되는 것으로서 갈렉틴-8 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 갈렉틴-8 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 것으로서, 용어 "실질적으로 동일"은 갈렉틴-8이 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열에 대해 60% 이상의 동일성 또는 70% 이상의 동일성, 80% 이상의 동일성 또는 90% 이상의 동일성을 갖는 것을 의미한다.
일반적으로, 상기 방법에서 이용되는 것으로서 갈렉틴-7 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 갈렉틴-7 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 갈렉틴-7은 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 60% 이상의 동일성 또는 70% 이상의 동일성, 80% 이상의 동일성 또는 90% 이상의 동일성을 가진다. 특정한 구체예에서, 갈렉틴-7 단백질은 갈렉틴-7 갈락토사이드-결합 도메인을 포함한다.
일반적으로, 상기 방법에서 이용되는 것으로서 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 60% 이상의 동일성 또는 70% 이상의 동일성, 80% 이상의 동일성 또는 90% 이상의 동일성을 가진다. 특정한 구체예에서, 갈렉틴-3 단백질은 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인을 포함한다.
본 명세서에서 본 발명의 또 다른 구체예는 건성 안의 치료에 촉진 효과를 갖는 약학 조성물로서, 약학적으로 적합한 담체 또는 희석제 및 결막 및/또는 각막 상피의 완전성(integrity)을 촉진하는 데 충분한 양의 갈렉틴-8 단백질을 포함하는 조성물이다. 본 명세서에서 본 발명의 또 다른 구체예는 건성 안의 치료에 촉진 효과를 갖는 약학 조성물로서, 약학적으로 적합한 담체 또는 희석제 및 결막 및/또는 각막 상피의 완전성을 촉진하는 데 충분한 양의 갈렉틴-7 단백질을 포함하는 조성물이다. 본 명세서에서 본 발명의 또 다른 구체예는 건성 안의 치료에 촉진 효과를 갖는 약학 조성물로서, 약학적으로 적합한 담체 또는 희석제 및 결막 및/또는 각막 상피의 완전성을 촉진하는 데 충분한 양의 갈렉틴-3 단백질을 포함하는 조성물이다. 본 명세서에서 본 발명의 또 다른 구체예는 건성 안의 치료에 촉진 효과를 갖는 약학 조성물로서, 약학적으로 적합한 담체 또는 희석제 및 결막 및/또는 각막 상피의 통합성을 촉진하는 데 충분한 양의 갈렉틴-8 단백질을 포함하는 조성물이다. 이들 약학 조성물 중 임의의 것에서, 건성 안은 재발성 상피 미란을 갖는 안구 건조증이다. 예를 들어, 안구 건조증은 각막 상처인 상처를 생성한다. 또한, 건성 안은 엑시머 레이저 각막 절제술에 의해 초래된다.
약학 조성물의 다양한 구체예에서, 갈렉틴-8 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 포함하고, 또는 갈렉틴-8 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 대안적으로, 갈렉틴-8 단백질은 갈렉틴-8 N-말단 도메인 및 갈렉틴-8 프롤린, 글리신 및 티로신-풍부 도메인을 포함한다. 대안적으로, 갈렉틴-8 단백질은 갈렉틴-8 프롤린, 글리신 및 티로신-풍부 도메인 및 갈렉틴-8 갈락토사이드-결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 갈렉틴-8 단백질은 갈렉틴-8 갈락토사이드-결합 도메인을 포함한다. 대안적으로, 갈렉틴-7 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 갈렉틴-7 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 대안적으로, 갈렉틴-7 단백질은 갈렉틴-7 갈락토사이드-결합 도메인을 포함한다. 대안적으로, 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 갈렉틴-3 단백질은 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인을 포함한다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 포유 동물의 건성 안 질병을 치료하는 방법을 추가 특징으로 하고, 이는 각막 표면 또는 결막 표면 상의 눈물 막의 확산에 영향을 미치는 치료적으로 유효한 양의 물질을 포유 동물에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 포유 동물의 건성 안 질병을 치료하는 방법을 특징으로 하고, 이는 갈렉틴-8 단백질의 발현에 영향을 미치는 치료적으로 유효한 양의 물질을 건성 안으로 고통받는 포유 동물에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 물질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열을 갖는 갈렉틴-8 단백질을 포함한다. 예를 들어, 물질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 갈렉틴-8 단백질을 포함한다.
도 1은 인간 갈렉틴-3(GenBank 수탁번호 BAA22164, 서열번호 1)의 아미노산 서열 및 조성을 도시한다.
도 2는 인간 갈렉틴-7(GenBank 수탁번호 I55469, 서열번호 2)의 아미노산 서열 및 조성을 도시한다.
도 3은 토끼 갈렉틴-3(GenBank 수탁번호 JC4300), 닭 갈렉틴-3(GenBank 수탁번호 AAB02856) 및 햄스터 갈렉틴-3(GenBank 수탁번호 CAA55479)의 아미노산 서열과 인간 갈렉틴-3(서열번호 1)의 아미노산 서열의 CLUSTAL W 배열을 도시한다. 본 도면의 첫 번째(상부) 서열은 인간 갈렉틴-3(서열번호 1)의 1번 내지 250번 아미노산이고, 본 도면의 두 번째 서열은 햄스터 갈렉틴-3의 1번 내지 245번 아미노산이고, 본 도면의 세 번째 서열은 토끼 갈렉틴-3의 1번 내지 242번 아미노산이고, 본 도면의 네 번째(하부) 서열은 닭 갈렉틴-3의 1번 내지 262번 아미노산이다.
도 4는 랫트(rat) 갈렉틴-7(GenBank 수탁번호 P97590) 및 마우스(mouse) 갈렉틴-7(GenBank 수탁번호 054974)의 아미노산 서열과 인간 갈렉틴-7(서열번호 2)의 아미노산 서열의 CLUSTAL W 배열을 도시한다. 본 도면의 첫 번째(상부) 서열은 랫트 갈렉틴-7의 1번 내지 136번 아미노산이고, 본 도면의 두 번째 서열은 마우스 갈렉틴-7의 1번 내지 136번 아미노산이고, 본 도면의 세 번째(하부) 서열은 인간 갈렉틴-7(서열번호 2)의 1번 내지 136번 아미노산이다.
도 5는 인간 갈렉틴-3(서열번호 1)의 PROSITE 스캔의 결과의 요약이다.
도 6은 인간 갈렉틴-7(서열번호 2)의 PROSITE 스캔의 결과의 요약이다.
도 7은 PFAM의 은닉 마르코브 모델(HMM)로부터 유래한 공통(consensus) 아미노산 서열(PF00337)을 갖는 인간 갈렉틴-3의 갈락토사이드-결합 도메인의 배열을 도시한다. 상부 서열이 공통 아미노산(PF00337, 서열번호 3)이고, 하부 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 117번 내지 247번에 해당한다.
도 8은 PFAM의 은닉 마르코브 모델(HMM)로부터 유래한 공통 아미노산 서열(PF00337)을 갖는 인간 갈렉틴-7의 갈락토사이드-결합 도메인의 배열을 도시한다. 상부 서열이 공통 아미노산(PF00337, 서열번호 3)이고, 하부 아미노산 서열은 서열번호 2의 아미노산 5번 내지 135번에 해당한다.
도 9는 생체 내 부분적으로 치유되도록 하였고, 그 후 파라핀 구역에서 갈렉틴-3 면역반응성을 분석하였던 2 ㎜ 찰과상 또는 엑시머 레이저 상처를 갖는 일련의 각막 사진을 포함한다. (A), (i) 정상 각막 및 (ii) 찰과상 및 (iii) 엑시머 레이저 손상 직후 각막의 헤마톡실린 및 에오신 염색. (B), (i) 정상 gal3+/+ 각막 및 (ii) 엑시머 레이저 손상 후 치유 gal3+/+ 각막의 면역조직화학염색. (iii) 정상 gal3-/- 각막 및 (iv) 엑시머 레이저 손상 후 치유 gal3-/- 각막의 면역조직화학염색. 어두운 색은 양성 면역염색을 나타낸다. WE, 상처 가장자리; LE, 이동하는 상피의 리딩 에지(leading edge); 화살, 상피; 화살상부, 백혈구/간질 세포.
도 10은 손상된 각막 상피의 치유 속도에 대한 β-락토오스(Lac) 및 수크로즈(Suc)의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 11은 엑시머 레이저 또는 알칼리 치료에 의해 손상되고, 생체 내 또는 시험관 내에서 치유되도록 한 야생형(gal-3+/+)과 갈렉틴-3 결핍(gal-3-/-) 마우스 내 손상된 각막 상피의 치유 속도를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 12는 cDNA 마이크로어레이 및 반정량(semi-quantitative) PCR에 의해 측정된, 야생형(gal-3+/+)과 갈렉틴-3 결핍(gal-3-/-) 마우스 사이에서의 갈렉틴-7의 유전자 발현 및 관리 유전자(housekeeping gene)(GAPDH는 D-글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소이고, 그리고 RPS29는 라이보솜 단백질 S29이고; ODC는 오르니틴 탈카르복실효소이다)의 선택의 차이를 도시하는 표이다.
도 13은 (A) 웨스턴 블럿(Western Blot) 분석 (B) 면역조직화학 분석 및 (C) 마우스 배아 섬유모세포의 이용에 의해 측정된, 야생형(gal-3+/+)과 갈렉틴-3 결핍(gal-3-/-) 마우스 사이에서의 갈렉틴-7의 발현의 차이를 예시한다.
도 14는 갈렉틴-3 결핍(gal-3-/-) 마우스(도 14A) 및 야생형(gal-3+/+) 마우스(도 14B)의 손상된 각막 상피의 치유 속도에 대한 외인성 갈렉틴-3의 효과를 예시하는 그래프이다.
도 15는 외인성 갈렉틴-3의 존재 하에서 야생형(gal-3+/+) 마우스의 손상된 각막 상피의 치유 속도에 대한 β-락토오스(Lac) 및 수크로즈(Suc)의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 16은 (A) 단독, β-락토오스(Lac)와 함께, 또는 수크로즈(Suc)와 함께 이용되는 경우, 야생형(gal-3+/+)의 손상된 각막 상피의 치유 속도에 대한 외인성 갈렉틴-7의 효과를 예시하는 그래프, (B) 야생형(gal-3+/+)과 갈렉틴-3 결핍(gal-3-/-) 마우스의 손상된 각막 상피의 치유 속도에 대한 외인성 갈렉틴-7의 효과를 비교하는 그래프를 포함한다.
도 17은 인간 갈렉틴-1(서열번호 6)의 아미노산 서열을 도시한다.
도 18은 인간 갈렉틴-8(서열번호 4)의 단형의 아미노산 서열을 도시한다.
도 19는 인간 갈렉틴-1(서열번호 6), 랫트 갈렉틴-1, 마우스 갈렉틴-1 및 햄스터 갈렉틴-1 각각의 아미노산 서열을 나타내고, 이들은 매우 높은 퍼센트의 동일성을 공유하여 갈렉틴-1 서열이 포유류 종 사이에서 강하게 보존된 것으로 나타났다. 진한 부분은 모든 4개의 포유류 서열 내 동일하지 않은 잔기의 위치를 나타낸다. 랫트와 인간은 90.4% 동일하고; 마우스와 인간은 88.2% 동일하고; 그리고 햄스터와 인간은 91.2% 동일하다. 본 도면은 또한 비동일한 위치에서 대다수의 잔기는 보존성 변경이고, 예를 들어, 19번 위치의 리신이 아르기닌으로, 24번 위치의 류신이 발린으로, 73번 위치의 세린이 트레오닌으로, 136번 위치의 아스파르트산이 글루탐산으로 치환된다.
도 20은 인간 갈렉틴-8(서열번호 4)의 단형(316개 아미노산) 각각의 아미노산 서열 및 마우스 갈렉틴-8, 랫트 갈렉틴-8, 닭 갈렉틴-8 및 개구리 갈렉틴-8의 단형의 해당하는 아미노산 서열을 나타내고, 인간 랫트 갈렉틴-8의 서열과 비교하 여 비인간 아미노산 서열 내 갭을 나타내기 위해 강조(underscoring)와 함께 배열하였다. 3개의 포유류 갈렉틴-8 아미노산 서열은 매우 높은 퍼센트의 동일성을 공유하고, 그리고 78.2% 동일하고, 21.8% 비동일성의 대부분은 마우스 및 랫트의 비슷한 위치의 티로신과 비교할 때 인간의 20번 위치의 페닐알라닌; 인간의 22번 위치의 글리신과 랫트의 세린; 인간의 26번 위치의 글리신과 설치류 서열의 아스파라테이트와 같은 보존된 아미노산 변경이다. 또한, 척추동물 종은 실질적인 동일성, 43.0%을 공유하여 갈렉틴-8 서열이 포유류 종 중에서 매우 동일하고, 척추동물 종 중에서 모두 강하게 보존된다.
도 21은 마우스 모델의 건성 안 증후군에 대한 갈렉틴의 투여의 효과를 보여주는 막대 그래프이고, 증후군은 시간의 함수로서 0일째에 인터루킨-1α(도에서 "IL-1"로서 표시)를 주사함으로써 유발되었다. 갈렉틴-3을 1일 및 2일째에 하루에 4번씩 그룹당 5개의 각각의 개체에 눈물 방울로 투여하였고, 눈물 방울은 75 ㎍/㎖ 또는 150 ㎍/㎖의 농도를 함유한다. 대조군 개체는 IL-1로 주사하지 않았고, 눈물 방울을 투여하지 않았다. "완충액" 군의 개체는 하루 당 4번의 담체 매개제 만의 처리를 투여하였다. 문헌 [Zoukhri, D. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 42(5):925-932]에서와 같이 눈물 동력학을 형광물질 청소에 의해 평가하였고, 여기서 낮은 수치는 더 나은 눈물 흐름을 나타낸다. 데이터는 갈렉틴을 투여하지 않은 대조군 동물과 비교할 때 갈렉틴 처리는 정상 그룹의 것으로 눈물 동력학을 복원하였음을 보여주고, 2 일째 ρ < 0.05의 통계적 유의도를 갖는 대조군과 비교하여 처리된 데이터이다.
특정한 구체예의 기술
본 출원은 다양한 특허, 과학 기사 및 기타 출판물을 언급한다. 이러한 각 아이템의 내용은 참조에 의해 편입된다. 또한, 본 명세서에서 지칭되는 모든 웹사이트의 내용(본 출원의 출원일 현재)이 참조에 의해 편입된다.
본 명세서에서는 탄수화물-결합 단백질, 갈렉틴이 각막 및 결막 표면 상에 눈물 막의 확산을 촉진시킬 수 있다는 개념을 기초로 하는 발명의 구체예가 제시된다. 갈렉틴은 갈락토오스-결합 단백질이고, 이는 점액소(mucin)의 O-연결된 올리고당류 내에서 발견되는 Galβ1-4GlcNAC 이당류에 대해 높은 친화력으로 결합한다. 많은 갈렉틴이 2가 또는 다가이기 때문에, 이는 분비 점액소의 올리고당류 쇄를 각막 및 결막의 상피 정점의 표면 상에 존재하는 막 관통 점액소(또는 기타 당단백질)를 결합시킴으로써 눈물 막 확산을 촉진할 수 있다.
본 발명은 손상된 포유류 조직 내 상처의 재상피화를 향상시키는 데 유용한 갈렉틴-8, 갈렉틴-3 및/또는 갈렉틴-7을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상피 손상으로 고통받는 포유 동물에 치료적으로 유효한 양의 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8 또는 갈렉틴-1,-3,-7 및 -8 중 임의의 것이 2개 이상의 조합을 투여하는 것을 포함하는, 포유류 조직 내 상피 손상의 치료적 치료를 위한 방법을 제공한다. 갈렉틴-1, -3, -7, -8의 조합을 투여하는 경우, 임의의 갈렉틴은 다른 갈렉틴의 투여 이전, 함께 또는 이후에 투여될 수 있다.
본 발명은 각막에 대한 손상 후 갈렉틴-3이 이동성 각막 상피 세포에서 상향 조절된다는 발견을 내포한다(실시예 1). 또한 본 발명은 각막 상피관통 엑시머 레 이저 상처 및 각막 알칼리 화상 상처의 재상피화가 야생형 마우스의 것과 비교할 때 갈렉틴-3-결핍 마우스 내에서 상당히 더 느리다는 발견을 포함한다(실시예 2). 본 발명은 다수의 손상-관련 유전자(예를 들어, 톨로이드-유사 단백질 및 갈렉틴-7)의 발현이 갈렉틴-3-결핍 마우스 내에서 비정상적이라는 발견을 더 제공한다(실시예 3). 추가적으로, 본 발명은 외인성 갈렉틴-3 및 -7이 각막 상처의 재상피화를 촉진하는 것을 증명한다(각각 실시예 4 및 5).
갈렉틴
렉틴은 구체적으로 탄수화물을 결합하고, 세포를 접합시키는 능력에 의해 정의되는 단백질이다(예를 들어, 문헌 [Sharon, Trends Biochem, Sci. 18: 221, 1993] 참조). 렉틴은 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 포함하는 아주 다양한 세포 기능에 관련되는 것으로 알려져 왔다. 렉틴은 식물, 무척추 동물 및 포유 동물 중에 널리 퍼져 있다. 동물 렉틴은 다음과 같은 4개의 뚜렷한 패밀리로 분류된다: 1) C-유형 렉틴; 2) P-유형 렉틴; 3) 갈렉틴(이전 용어 S-유형 렉틴); 및 4) 펜트락신(예를 들어, 문헌 [Baronades et al., J. Biol. Chem. 269:20807, 1994]).
상세하게 분석되었던 모든 포유류의 갈렉틴은 β-락토오스 및 해당 β-갈락토사이드를 인식한다. 모든 포유류의 갈렉틴은 작은 β-갈락토사이드에 대한 유사한 친화력을 공유하지만, 더 복잡한 당포합체에 대한 결합 특이성의 상당한 차이점을 보여준다(문헌 [Henrick et al., Glycobiology 8:45, 1998; [Sato et al., J. Biol. Chem. 267:6983, 1992]; 및 [Seetharaman et al., J. Biol. Chem. 273:13047, 1998] 참조). β-갈락토사이드 당을 결합하는 것 이외에, 갈렉틴은 적 혈구응집 활성을 보유한다. 라미닌(다수의 폴리락토스아민 쇄를 함유하는 천연 발생 당단백질)은 특정한 갈렉틴에 대한 천연 리간드인 것으로 알려져 왔다. 라미닌은 기저판(basal laminae), 모든 상피 아래 놓여 있고, 개별 근육, 지방 및 슈완(Schwann) 세포를 둘러싸는 세포외 매트릭스의 성분이다. 세포와 기저판의 상호작용은 포유류 발달 동안 다양한 세포 유형의 이동 및/또는 분화에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 갈렉틴은 막 전좌를 특정하는 전통적인 서열을 함유하지는 않으나, 세포 내로 분비되고 위치한다. β-갈락토사이드 당에 대한 이의 친화력 이외에, 갈렉틴 패밀리의 구성원은 탄수화물 인식 도메인(CRD: 탄수화물-결합 도메인으로도 지칭) 내 상당한 서열 유사성을 공유하고, 이의 해당 아미노산 잔기는 X선 결정학에 의해 측정되었다(문헌 [Lobsanov et al., J. Biol. Chem. 267:27034, 1993 및 Seetharaman et al., supra]). 갈렉틴은 세포 부착(문헌 [Cooper et al., J. Cell Biol 115:1437, 1991]), 성장 조절(문헌 [Wells et al., Cell 64:91, 1991]), 세포 이동(문헌 [Hughes, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:687, 1992]), 신생물 형질 전환(neoplastic transformation)(문헌 [Raz et al., Int. J. Cancer 46:871, 1990]) 및 면역 반응(문헌 [Offiier et al., J Neuroimmunol. 28:177, 1990])을 포함하는 아주 다양한 생물학적 기능에 연관된다. 현재 갈렉틴 패밀리의 12개의 특성화된 진핵 구성원이 있다.
갈렉틴 -3
단백질(CBP-35, Mac-2, L-34, εBP, 및 RL-29로서 종래 공지됨)의 갈렉틴-3 패밀리의 구성원은 전형적으로 약 240 내지 270개의 아미노산을 포함하고, 약 25 내지 29 kDa의 범위의 분자량을 가진다. 갈렉틴-3 단백질은 일반적으로 짧은 N-말단 도메인, 갈락토사이드-결합 영역을 포함하는 C-말단 도메인 및 7-10개의 보존 아미노산의 반복을 포함하는 개재 프롤린, 글리신 및 티로신-풍부 도메인으로 구성되어 있다(문헌 [Liu et al., Biochemistry 35:6073, 1996] 및 [Cherayil et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA, 87:7324, 1990]). 탄뎀(tandem) 반복은 콜라겐 유전자 대패밀리에서 발견되는 것과 유사하다. 반복의 수는 갈렉틴-3 단백질 사이에서 변화하고, 그리고 상이한 종으로부터의 갈렉틴-3 단백질 사이의 크기 차이를 설명한다. 갈렉틴-3의 N-말단 도메인은 단백질이 당포합체 리간드를 함유하는 표면에 대한 결합 시에 다중체화(multimerization)를 겪도록 한다.
갈렉틴-3은 다양한 염증 세포(예를 들어, 활성 대식세포, 호염기 세포 및 비만 세포)에서, 그리고 다양한 조직의 상피 및 섬유모세포에서 발현된다(문헌 [Perillo et al., J. Mol. Med. 76:402, 1998]). 이는 세포 표면상, 세포외 매트릭스(ECM) 내, 세포질에서, 그리고 세포 핵에서 발견된다. 세포 표면상 또는 ECM에서, 갈렉틴-3은 많은 ECM 및 세포 표면 분자에서 발견되는 폴리락토스아민을 함유하는 상보성(complementary) 당포합체에 결합함으로써 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 중재하는 것으로 생각된다. 갈렉틴-3은 라미닌에 결합함으로써 세포-매트릭스 부착을 억제하는 것으로 생각된다. 세포 핵에서, 갈렉틴-3은 널리 공지된 세포 부착 분자(예를 들어, α6β1 및 α4β7 인테그린, 문헌 [Warlfield et al., Invasion Metastasis 17:101, 1997] 및 [Matarrese et al., Int. J. Cancer 85:545, 2000]) 및 시토킨(예를 들어, IL-1, 문헌 [Jeng et al., Immunol. Lett. 42: 113, 1994])의 발현에 영향을 미침으로써 세포-매트릭스 상호작용에 간접적으로 영향을 미칠 수 있다. 갈렉틴-3 발현은 신장과 같은 선택된 기관 내에서 발달적으로 조절되고, 손상 후 폐포(pulmonary alveolar) 상피 세포 및 간세포 내 이의 발현 수준은 상향-조절된다. 갈렉틴-3은 증식 동안 특정한 세포 유형의 핵 내에서 농축되는 것으로 알려져 왔다. 갈렉틴-3의 발현은 특정한 종양 내에서 상승하고, 이는 갈렉틴-3이 전이에서 역할을 수행하는 것을 암시한다. 물론, 약한 전이성 세포주 내 갈렉틴-3의 과잉발현은 전이 잠재력의 상당한 증가를 초래하였다(문헌 [Raz et al., supra]).
인간 갈렉틴-3은 250개의 아미노산 길이이고, 대략 26.1 kDa의 분자량을 가진다(서열번호 1, 도 1). 도 1, 3, 5, 및 7에서 예시한 바와 같이, 인간 갈렉틴-3은 다음의 도메인, 서명 서열, 또는 다른 구조적 특징(PS 및 PF 접두어 식별 번호에 관한 일반적인 정보에 대해서는 문헌 [Sonnhammer et al., Protein 28:405, 1997]을 참조)을 함유한다: 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 1번 내지 14번에 위치하는 N-말단 도메인; 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 15번 내지 116번에 위치하는 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인; 서열번호 1의 대략 아미노산 잔기 117번 내지 247번에 위치하는 갈락토사이드-결합 도메인; 서열번호 1의 대략 아미노산 181번 내지 200번에 위치하는 갈랍틴 서명 서열(PROSITE No. PS00309); 서열번호 1의 대략 아미노산 4번 내지 7번에 위치하는 하나의 잠재적 N-글리코실화 부위(PROSITE No. PS00001); 서열번호 1의 대략 아미노산 137번 내지 139번 및 194번 내지 196번에 위치하는 2개의 잠재적 단백질 키나제 C 인산화 부위(PROSITE No. PS00005); 서열번호 1의 대략 아미노산 6번 내지 9번 및 175번 내지 178번에 위치하는 2개의 잠재적 카세인 키나제 II 인산화 부위(PROSITE No. PS00006); 및 서열번호 1의 대략 아미노산 24번 내지 29번, 27번 내지 32번, 34번 내지 39번, 43번 내지 48번, 52번 내지 57번, 61번 내지 66번, 65번 내지 70번, 및 68번 내지 73번에 위치하는 8개의 잠재적인 미리스토일화(myristoylation) 부위(PROSITE No. PS00008).
본 명세서에서 정의한 것으로서, "갈렉틴-3 단백질"은 갈렉틴-3 "N-말단 도메인", 갈렉틴-3 "프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인", 및/또는 갈렉틴-3 "갈락토사이드-결합 도메인"을 포함할 수 있다. 이들 도메인은 다음과 같이 더 정의된다.
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 갈렉틴-3 "N-말단 도메인"은 서열번호 1의 아미노산 1번 내지 14번과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는 약 10-20개 아미노산, 바람직하게는 약 14개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. N-말단 도메인은 N-글리코실화 부위(PROSITE No. PS00001) 및/또는 카세인 키나제 II 인산화 부위(PROSITE No. PS00006)를 포함할 수 있다. PROSITE N-글리코실화 부위는 공통 서열: N-{P}-[ST]-{P}를 가지고, PROSITE 카세인 키나제 II 인산화 부위는 공통 서열: [ST]-X(2)-[DE]를 가진다. 본 명세서에서 기술된 상기 공통 서열 및 다른 모체(motif) 또는 서명 서열에서, 아미노산에 대한 표준 IUPAC 한 문자 코드가 이용된다. 패턴 내 각 요소는 대시(-)에 의해 구분되고; 꺾쇠 괄호([])는 그 위치에서 허용되는 특정 잔기를 나타내고; X는 임의의 잔 기가 이 위치에서 허용됨을 표시하고; 그리고 소괄호(()) 내 숫자는 수반하는 아미노산으로 표현되는 잔기의 수를 표시한다. 특정한 구체예에서, N-말단 도메인은 서열번호 1의 아미노산 L7 및 L11을 포함한다. 도 3에 도시한 바와 같이, 이들 아미노산은 갈렉틴-3의 몇몇의 포유류 종 상에 걸쳐 보존되고 따라서 촉매적 및/또는 구조적 역할을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 갈렉틴-3 "프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인"은 서열번호 1의 아미노산 15번 내지 116번과 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%의 동일성을 공유하는, 약 60 내지 140개 아미노산, 더 바람직하게는 약 80 내지 120개 아미노산, 또는 약 90 내지 110개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인은 또한 공통 서열: G-{EDRKHPFYW}-X(2)-[STAGCN]-{P}을 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 N-미리스토일화 부위(PROSITE No. PS00008)를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인은 서열번호 1의 다음의 아미노산 및 영역을 갖는다: G21, P23, G27, N28, P30, G32, G34, P37, Y41-P46, G53, Y55-G57, P61, G62, G66, P72, G73, G77, Y79-G81, P83, G87, Y89, P90, G99, Y101, P102, P106, Y107, A109, L114, 및 V116. 이들 아미노산 및 영역은 갈렉틴-3의 몇몇의 포유류의 종에 걸쳐 보존되고, 촉매적 및/또는 구조적 역할을 수행할 수 있다(도 3에서 "*"로 표시한 아미노산 참조).
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 갈렉틴-3 "갈락토사이드-결합 도메인"은 150개 이상의 PFAM의 공통 서열 PF00337(서열번호 3)에 대한 서열의 정렬을 위한 비트 스코어(score)를 갖는 약 80 내지 180개 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인은 적어도 100 내지 160개의 아미노산, 더 바람직하게는 약 110 내지 150개의 아미노산, 또는 약 120 내지 140개의 아미노산을 포함하고, 150개 이상, 더 바람직하게는 175개 이상, 더 바람직하게는 200개 이상의 PFAM의 공통 서열 PF00337(서열번호 3)에 대한 서열의 정렬을 위한 비트 스코어를 갖는다.
PFAM의 공통 서열 PF00337에 대한 특정 서열의 정렬을 위한 비트 스코어를 계산하기 위해, 관심 서열을 www.sanger.ac.uk/Software/Pfam에서 입수 가능한 기본 변수를 이용하여 HMM의 PFAM 데이터베이스(예를 들어, PFAM 데이터베이스, 버전(release) 2.1)와 대조하여 조사할 수 있다. PFAM 데이터베이스의 설명은 문헌 [Sonnhammer et al., supra]에서 발견할 수 있고, HMM의 상세한 설명은 예를 들어, 문헌 [Gribskov et al., Meth. Enzymol. 183:146, 1990] 및 [Stultz et al., Protein Sci 2:305, 1993]에서 발견할 수 있다.
갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인은 1개, 바람직하게는 2개의 단백질 키나제 C 인산화 부위(PROSITE No. PS00005); 카세인 키나제 II 인산화 부위(PROSITE No. PS00006); 및/또는 갈랍틴 서명 서열(PROSITE No. PS00309)를 더 포함할 수 있다. 단백질 키나제 C 인산화 부위는 다음의 공통 서열: [ST]-X-[RK]을 가진다. 갈랍틴 서명 서열은 다음의 공통 서열: W-[GEK]-X-[EQ]-X-[KRE]-X(3,6)-[PCTF]-[LIVMF]-[NQEGSKV]-X-[GH]-X(3)-[DENKHS]-[LIVMFC]을 가진다. 특정한 구체예에서, 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인은 다음의 ID NO: 1의 아미노산 및 영역을 포함 한다: P117, Y118, L120-L122, G125, P128, R129, L131-I134, G136-V138, N141, N143, R144, L147, F149, R151, G152, D154, A156-F163, E165, R169-N174, N179-G182, E184-R186, F190-E193, G195, P197-K199, Q201-L203, E205, D207-Q220, N222, R224, L228, I231, I236, G238-I240 및 L242-S244. 이들 아미노산 및 영역은 갈렉틴-3의 몇몇의 포유류의 종 상에서 보존되고, 그리고 촉매적 및/또는 구조적 역할을 수행할 수 있다(도 3에서 "*"로 표시된 아미노산 참조).
본 발명의 특정한 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1로 표현되는 것으로서 인간 갈렉틴-3의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 용어 "실질적으로 동일"은 본 명세서에서 제1 및 2 아미노산 서열이 공통 구조적 도메인 및/또는 공통 기능 활성을 가질 수 있도록 제2 아미노산 서열 내 정렬된 아미노산 잔기에 대해 동일한, 충분한 또는 최소한의 수의 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산을 지칭하는 것으로 이용된다. 예를 들어, 서열번호 1에 대해 60% 이상, 또는 65% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 공통 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 서열을 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일하다고 칭한다. 특히, 서열번호 1의 특정 아미노산 잔기의 결실, 부가, 치환 또는 변경과 같은, 우연히 또는 의도적으로 유도된 변화를 함유하는 단백질은 본 명세서에서 제공되는 갈렉틴-3 단백질의 정의에 포함될 수 있다. 또한 본 명세서에서 정의한 것으로서, 갈렉틴-3 단백질이 소과, 개과, 고양이과, 염소 과, 양과, 돼지과, 랫트과 및 말과 종에 제한되지는 않으나 이를 포함하는 다른 포유류 종으로부터 취한 갈렉틴-3의 아미노산 서열로 표현되는 영역을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
서열 사이의 서열 동일성의 계산은 다음과 같이 수행된다. 2개의 아미노산 서열의 % 동일성을 측정하기 위해, 서열이 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭이 최적 배열을 위해 제1 및 제2 아미노산 서열의 하나 또는 모두에 도입될 수 있다). 다음으로, 해당하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치의 아미노산 잔기를 비교한다. 제1 서열 내 위치가 제2 서열 내 해당하는 위치에서와 같이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 단백질은 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 % 동일성은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 개수의 함수이고, 이는 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 각 갭의 길이를 감안한다.
서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 % 동일성의 측정은 수학적인 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 기본 변수를 이용하는 정렬 소프트웨어 프로그램을 이용하여 측정된다. 적합한 프로그램은 예를 들어, 문헌 [Thompson et al., Nuc. Acid Research 22:4673, 1994(www.ebi.ac.uk/clustalw)]의 CLUSTAL W, [Tatusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett. 174:247, 1999(www.ncbi.nhn.nlm.gov/blast/bl2seq/bl2.html)]의 BL2SEQ, [Notredame and Higgins, Nuc. Acids Research 24:1515, 1996(igs-server.cnrs-mrs.fr/~cnotred)]의 SAGA, 및 [Morgenstern et al., Bioinformatics 14:290, 1998(bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/dialign)]의 DIALIGN을 포함한다.
갈렉틴 -7
단백질의 갈렉틴-7 패밀리의 구성원은 전형적으로 약 130 내지 140개의 아미노산을 포함하는 단량체로서 존재하고, 약 15 내지 16 kDa의 범위의 분자량을 가진다(예를 들어, 문헌 [Magnaldo et al, Develop. Biol. 168:259, 1995] 및 [Madsen et al., J. Biol. Chem. 270:5823, 1995 참조]). 갈렉틴-7의 발현은 상피 성층화(stratification)의 개시와 연관되어 연관되어 왔다(문헌 [Timmons et al., Int. J. Dev. Biol. 43:229, 1999]). 갈렉틴-7은 세포-매트릭스 및 세포-세포 상호작용에서 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 갈렉틴-7은 세포-세포 접촉 면적(예를 들어, 인간 표피의 상층 내)에서 발견된다; 이의 발현은 비부착(anchorage independent) 각질 내에서 가파르게 하향조절되고, 이는 악성 각질 세포주에는 존재하지 않는다. 갈렉틴-7은 정상 각질의 유지를 위해 요구될 수 있다(문헌 [Madsen et al., supra] 참조).
인간 갈렉틴-7은 136개의 아미노산을 포함하고, 대략 15.1 kDa의 분자량을 갖는다(서열번호 2, 도 2). 도 2, 4, 6, 및 8에서 예시한 바와 같이, 인간 갈렉틴-7은 다음의 도메인, 서명 서열, 또는 다른 구조적 특징을 함유한다: 서열번호 2의 대략 아미노산 잔기 5번 내지 135번에 위치하는 갈락토사이드-결합 도메인; 서열번호 2의 대략 아미노산 70번 내지 89번에 위치하는 갈랍틴 서명 서열(PROSITE No. PS00309); 서열번호 2의 대략 아미노산 29번 내지 32번에 위치하는 하나의 N-글리 코실화 부위(PROSITE No. PS00001); 서열번호 2의 대략 아미노산 132번 내지 134번에 위치하는 하나의 단백질 키나제 C 인산화 부위(PROSITE No. PS00005); 서열번호 2의 대략 아미노산 9번 내지 12번에 위치하는 하나의 카세인 키나제 II 인산화 부위(PROSITE No. PS00006); 및 서열번호 2의 대략 아미노산 13번 내지 18번 및 44번 내지 49번에 위치하는 2개의 미리스토일화 부위(PROSITE No. PS00008).
본 명세서에서 정의한 것으로서, "갈렉틴-7 단백질"은 갈렉틴-7 "갈락토사이드-결합 도메인"을 포함한다. 이 도메인은 다음과 같이 더 정의된다.
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 갈렉틴-7 "갈락토사이드-결합 도메인"은 80개 이상의 PFAM의 공통 서열 PF00337(서열번호 3)에 대한 서열의 정렬을 위한 비트 스코어를 갖는 약 80 내지 180개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 갈렉틴-7 갈락토사이드-결합 도메인은 약 100 내지 160개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 약 110 내지 150개의 아미노산, 또는 약 120 내지 140개의 아미노산을 포함하고, PFAM의 공통 서열 PF00337(서열번호 3)에 대한 80개 이상, 더 바람직하게는 100개 이상, 더 바람직하게는 120개 이상의 서열의 정렬을 위한 비트 스코어를 갖는다. 갈렉틴-7 갈락토사이드-결합 도메인은 1개의 N-글리코실화 부위(PROSITE No. PS00001); 1개의 단백질 키나제 C 인산화 부위 (PROSITE No. PS00005); 1개의 카세인 키나제 II 인산화 부위(PROSITE No. PS00006); 1 또는 2개의 미리스토일화 부위(PROSITE No. PS00008); 및/또는 갈랍틴 서명 서열(PROSITE No. PS00309)을 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 갈렉틴-7 갈락토사이드-결합 도메인은 서열번호 2의 다음의 아미노산 및 영역을 포함한다: M1, S2, H6, K7, L10, P11, G13, R15, G17-V19, R21-G24, V26, P27, A30, R32-Q43, D46-N63, K65, Q67, G68, W70-G76, G78, P80-L90, I92, G97-K99, V101, G103, D104, Y107, H109, F110, H112, R113, P115, V119, R120, V122-L130, S132, I135, 및 F136. 이들 아미노산 및 영역은 갈렉틴-7의 몇몇의 포유류 종에 걸쳐 보존되고, 촉매적 및/또는 구조적 역할을 수행할 수 있다(도 4에서 "*"로 표시한 아미노산 참조).
본 발명의 특정한 갈렉틴-7 단백질은 서열번호 2로 표현되는 것으로서 인간 갈렉틴-7의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 갈렉틴-7 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 특히, 서열번호 2의 특정 아미노산 잔기의 결실, 부가, 치환 또는 변경과 같은, 우연히 또는 의도적으로 유도된 변화를 함유하는 단백질은 본 명세서에서 제공되는 갈렉틴-7의 정의에 포함될 수 있다. 또한 본 명세서에서 정의한 것으로서, 갈렉틴-7 단백질이 소과, 개과, 고양이과, 염소과, 양과, 돼지과, 랫트과 및 말과 종에 제한되지는 않으나 이를 포함하는 다른 포유류 종으로부터 취한 갈렉틴-7의 아미노산 서열로 표현되는 영역을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
갈렉틴 -8
갈렉틴-8은 예를 들어, 간, 심장, 근육, 신장, 비장, 후지(後肢) 및 뇌에 존재하는 광범위하게 발현되는 단백질이고, 인간 및 랫트 갈렉틴-8 유전자의 서열 및 단백질은 입수 가능하다(예를 들어, 문헌 [Hadari, et al., Trends in Glycosci and Glycotechnol. 9: 103-112, 1997] 참조). 고 친수성 특성 및 점액소의 O-연결된 올리고당류 내에서 발견되는 Galβ1-4GlcNAC 이당류에 결합하기 위한 기능은 이 단백질이 건성 안 증후군을 치료하기 위한 이상적인 약물이 되도록 한다.
인간 갈렉틴-8을 위한 아미노산 서열의 2가지 형태가 공지되어 있고, 316개의 아미노산 형태(수탁번호 O00214, 1997.11.1 생성) 및 359개의 아미노산 형태(수탁번호 Q8TEV1, 2002.6.1 생성)이다. 이들 서열은 상당한 길이만큼 유사하거나 또는 동일하지만, 전체적으로 길이 변형에 불과하지 않고, 상이한 부분을 갖는다. 한 문자 아미노산 코드를 이용하는 316개 형태 아미노산 서열을 이하 보여준다(서열번호 4):
MLSLNNLQNI IYNPVDPYYG TIPDQLDPGT LIVICGHVPS DADRFQVDLQ NGSSVKPRAD 60
VAFHFNPRFK RAGCIVCNTL INEKWGREEI TYDTPFKREK SFEIVIMV1K DKFQVAVNGK 120
HTLLYGHRIG PEKIDTLGIY GKVNIHSIGF SFSSDLQSTQ ASSLELTEIS RENVPKSGTP 180
QLSLPFAARL NTPMGPGRTV VVKGEVNANA KSFNVDLLAG KSKDIALHLN PRLNIKAFVR 240
NSFLQESWGE EERNITSFPF SPGMYFEMII YCDVREFKVA VNGVHSLEYK HRFKELSSID 300
TLEINGDIHL LEVRSW 316
더 긴 형태의 아미노산 서열을 이하 보여준다(서열번호 5):
MMLSLNNLQN IIYSPVIPYV GTIPDQLDPG TLIVICGHVP SDADRFQVDL QNGSSVKPRA 60
DVAFHFNPRF KRAGCIVCNT LINEKWGREE ITYDTPFKRE KSFEIVIMV1 KDKFQVAVNG 120
KHTLLYGHRI GPEKIDTLGI YGKVNIHSIG FSFSSDLQST QASSLELTEI SRENVPKSGT 180
PQLPSNRGGD ISKIAPRTVY TKSKDSTVNH TLTCTKIPPT NYVSKILPFA ARLNTPMGPG 240
GTVVVKGEVN ANAKSFNVDL LAGKSKHIAL HLNPRLNIKA FVRNSFLQES WGEEERNITS 300
FPFSPGMYFE MIIYCDVREF KVAVNGVHSL EYKHRFKELS SIDTLEINGD IHLLEVRSW 359
본 명세서에서 정의한 것으로서, "갈렉틴-8 단백질"은 갈렉틴-8 "N-말단 도메인", 갈렉틴-8 "프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인", 및/또는 갈렉틴-8 "갈락토사이드-결합 도메인"을 포함할 수 있다. 이 도메인은 다음과 같이 더 정의된다.
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 갈렉틴-8 "N-말단 도메인"은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 1번 내지 14번과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100% 동일성을 공유하는 약 10-20개의 아미노산, 바람직하게는 약 14개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. N-말단 도메인은 N-글리코실화 부위(PROSITE No. PS00001) 및/또는 카세인 키나제 II 인산화 부위(PROSITE No. PS00006)를 포함할 수 있다. PROSITE N-글리코실화 부위는 공통 서열: N-{P}-[ST]-{P}를 가지고, PROSITE 카세인 키나제 II 인산화 부위는 공통 서열: [ST]-X(2)-[DE]을 가진다. 상기 공통 서열, 및 다른 모체 또는 서명 서열.
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 갈렉틴-8 "프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인"은 서열번호 4 및 5의 각각의 아미노산 15번 내지 116번과 약 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 이상, 또는 100% 동일성을 공유하는, 약 60개 내지 140개의 아미노산, 더 바람직하게는 약 80개 내지 120개의 아미노산, 또는 약 90개 내지 110개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인은 또한 공통 서열: G-{EDRKHPFYW}-X(2)-[STAGCN]-{P}를 갖는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 N-미리스토일화 부위(PROSITE No. PS00008)를 포함할 수 있다. 특정한 구체예에서, 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인은 서열번호 4의 다음의 아 미노산 및 영역: G20, P23, P28, G29, G36, P39, 및 당업자에게 명백한 것으로서 다른 이러한 잔기를 포함한다. 이들 아미노산 및 영역은 갈렉틴-8의 몇몇의 포유류 종에 걸쳐서 보존되고, 촉매적 및/또는 구조적 역할을 수행할 수 있다. 특정한 구체예에서, 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인은 서열번호 5의 다음의 아미노산 및 영역: G21, P24, P29, G30, G37, P40 및 당업자에게 명백한 것으로서 다른 이러한 잔기를 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 갈렉틴-4 "갈락토사이드-결합 도메인"은 150개 이상의 PFAM의 공통 서열 PF00337(서열번호 3)에 대한 서열의 정렬을 위한 비트 스코어를 갖는 약 80개 내지 180개의 아미노산의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인은 적어도 약 100개 내지 160개의 아미노산, 더 바람직하게는 약 110개 내지 150개의 아미노산, 또는 약 120개 내지 140개의 아미노산을 포함하고, 150개 이상, 더 바람직하게는 175개 이상, 더 바람직하게는 200개 이상의 PFAM의 공통 서열 PF00337(서열번호 3)에 대한 서열의 정렬을 위한 비트 스코어를 갖는다.
PFAM의 공통 서열 PF00337에 대한 특정 서열의 정렬을 위한 비트 스코어를 계산하기 위해, 관심 서열을 www.sanger.ac.uk/Software/Pfam에서 입수 가능한 기본 변수를 이용하여 HMM의 PFAM 데이터베이스(예를 들어, PFAM 데이터베이스, 버전 2.1)와 대조하여 조사할 수 있다. PFAM 데이터베이스의 설명은 문헌 [Sonnhammer et al., supra]에서 발견할 수 있고, HMM의 상세한 설명은 예를 들어, 문헌 [Gribskov et al., Meth. Enzymol. 183:146, 1990] 및 [Stultz et al., Protein Sci 2:305, 1993]에서 발견할 수 있다.
갈렉틴-8 갈락토사이드-결합 도메인은 1개의, 바람직하게는 2개의 단백질 키나제 C 인산화 부위(PROSITE No. PS00005); 카세인 키나제 II 인산화 부위(PROSITE No. PS00006); 및/또는 갈랍틴 서명 서열(PROSITE No. PS00309)을 더 포함할 수 있다. 단백질 키나제 C 인산화 부위는 다음DML 공통 서열: [ST]-X-[RK]을 가진다. 갈랍틴 서명 서열은 다음의 공통 서열: W-[GEK]-X-[EQ]-X-[KRE]-X(3,6)-[PCTF]-[LIVMF]-[NQEGSKV]-X-[GH]-X(3)-[DENKHS]-[LIVMFC]을 가진다. 특정한 구체예에서, 갈렉틴-8 갈락토사이드-결합 도메인은 다음의 서열번호 4의 아미노산 및 영역: L123-L124, G126, P131, R128, L140-I146, 및 상기 설명한 것에 유사한 다른 부위를 포함한다. 이들 아미노산 및 영역은 갈렉틴-8의 몇몇의 포유류 종에 걸쳐서 보존되고, 촉매적 및/또는 구조적 역할을 수행할 수 있다(도 3에서 "*"로 표시한 아미노산 참조).
본 발명의 특정한 갈렉틴-8 단백질은 서열번호 4 및 5로 표현되는 인간 갈렉틴-8의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 다른 갈렉틴-8 단백질은 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열에 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 용어 "실질적으로 동일"은 본 명세서에서 제1 및 2 아미노산 서열이 공통 구조적 도메인 및/또는 공통 기능 활성을 가질 수 있도록 제2 아미노산 서열 내 정렬된 아미노산 잔기에 대해 동일한, 충분한 또는 최소한의 수의 아미노산 잔기를 함유하는 제1 아미노산을 지칭하는 것으로 이용된다. 예를 들어, 서열번호 4 또는 5에 대해 약 60% 이상, 또는 65% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더 바람직하게는 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 공통 구조적 도메인을 함유하는 아미노산 서열을 서열번호 4 또는 5의 아미노산 서열에 실질적으로 동일하다고 칭한다. 특히, 서열번호 4 또는 5의 특정 아미노산 잔기의 결실, 부가, 치환 또는 변경과 같은, 우연히 또는 의도적으로 유도된 변화를 함유하는 단백질은 본 명세서에서 제공되는 갈렉틴-8의 정의에 포함될 수 있다. 또한 본 명세서에서 정의한 것으로서, 갈렉틴-8 단백질이 소과, 개과, 고양이과, 염소과, 양과, 돼지과, 랫트과 및 말과 종에 제한되지는 않으나 이를 포함하는 다른 포유류 종으로부터 취한 갈렉틴-8의 아미노산 서열로 표현되는 영역을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
건성 안 증후군은 안과학의 "흔한 감기"로 고려되고, 안과 의사에게 제시되는 환자의 두 번째로 가장 흔한 불평이다. 거의 1500만 명의 미국인들이 건성 안으로 고통받는다. 이 질병은 눈물 막의 구조 또는 기능의 결핍에 의해 초래된다. 눈물 막은 동적 구조를 가지고, 이의 생성 및 전환은 안구 표면의 건강을 유지하는 데 필수적이다. 눈물 막은 3개의 층으로 구성되어 있다: 점액소(mucin)(최내부), 수성(중앙부) 및 지질(최상부) 층. 이들 층 중 임의의 것의 이 층의 기능 장애는 건성 안 질병의 원인이 될 수 있다. 눈물 막은 최내부 층에 존재하는 점액소 분자를 통해 상피 세포의 표면에 연결된다. 점액소 층은 각막 위의 눈물 막의 균일한 확산을 촉진하고, 적절한 안구 표면 습윤을 위한 필수적인 요소이다. 점액소 분자가 눈에 고착되지 않으면, 상피 손상은 정상적인 수성 눈물 생성으로도 발생할 수 있다. 눈물 막의 결함 있는 확산은 안구 표면 또는 눈물 막을 방해하고, 건성 안 질병을 초래할 수 있다. 내부 점액소 층은 결막 배상 세포에 의해, 그리고 결막 및 각막 상피 세포에 의해 생성된다. 안구 점액소는 막 스패닝(예를 들어, MUCI 및 MUCU), 또는 겔 형성/분비(예를 들어, MUC5AC)일 수 있다.
점액소는 이의 질량의 반 이상을 O-연결된 탄수화물로서 갖는 매우 거대한 당단백질이다. 풍부한 O-연결된 탄수화물 측쇄는 점액소의 매우 친수성인 특성애 관계된다. 이 친수성 성질은 수성 층이 눈 위에서 균일하게 확산하도록 하는 것으로 생각된다.
본 발명은 건성 안 증후군(DES)의 치료를 위한 갈렉틴의 치료적인 용도에 기초한다. 임의의 특정 메커니즘에 의해 제한됨 없이, 이 용도는 갈렉틴의 탄수화물-결합 성질에 기초한다. 국소적으로 적용되는 안약 용액 내 갈렉틴은 분비 점액소를 결막 및 각막 상피의 표면상에 존재하는 막관통 점액소 또는 다른 당단백질에 결합시킴으로써 눈물 막 확산을 촉진할 수 있다.
본 명세서 내 실시예에서, 건성 안의 3개의 상이한 랫트과의 모델에서의 국소적으로 적용된 갈렉틴 용액의 효과를 측정할 것이다. 한 모델에서, Pflugfelder 실험실(문헌 [Dursun et al., 2002, Invest Ophthamol & Vis Sci. 43:632-638]; [Pflugfelder et al., 2003, The Ocular Surface,1:31-36])에 의해 보고된 방법에 따라, 정상 마우스의 꼬리에 스코폴라민 패치를 도포함으로써 눈물 부족 현상을 유발한다. 제2 모델은 눈물샘 염증성 병변을 발달시키는 MRL/lpr 자가면역성 마우스, 쇼그렌 증후군을 위해 제안된 모델을 활용한다(문헌 [Jabs et al., 1991, Invest Ophthamol Vis Sci. 32:371-380]; [Jabs et al., 1997, Curr Eye Res. 16:909- 916]). 제3 모델은 IL-1α의 주사를 이용하여 쇼그렌 증후군과 균등한 동물 모델을 생성한다(문헌 [Zoukhri, D. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 42(5): 925-932] 참조).
하기 변수에 대한 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, 및 갈렉틴-8의 단독 또는 조합으로 다양한 농도의 효과를 측정하기 위해, 운반체로 처리한 대조군 동물과 비교하여, 측정은 눈물 생성, 눈물 청소 및 각막 형광물질 염색의 생체 내 분석법, 생체 내 분석법 후 격리된 눈물샘에 관한 생화학 분석법 및 안구 표면에 관한 조직 병리학법을 포함한다. 또한, 스코폴로민 치료 이전 갈렉틴 용액으로의 예비치료의 효과를 검사하고, 이는 β-락토오스, 갈렉틴 억제제와 갈렉틴의 조합된 치료의 가능한 효과이다.
본 명세서 내 실시예로부터 얻은 데이터는 갈렉틴이 모델의 건성 안 증후군과 연관된 측정 가능한 변수에 대해 통계적으로 유의적인 효과를 생성함을 보여준다. 위약(placebo)-치료 동물과 비교할 때, 갈렉틴-치료 동물의 눈 각막의 각막 형광물질 염색의 감소는 갈렉틴이 인간 DES에 대한 우수한 치료 가능성을 가지는 강한 증거를 제공한다. 두 동물 모델이 DES의 구별되는 형태를 대표하기 때문에, 어느 모델에서의 양성 결과는 갈렉틴이 DES 치료에서 수행할 수 있는 역할을 측정하는 것을 도울 수 있고, 그리고 최대의 유리한 효과에 대해 요구되는 갈렉틴의 최적의 농도, 효과의 지속성 및 각막과 내인성 점액소에 대한 갈렉틴의 결합 특성을 측정하는 추가적인 동물 실험을 포함하는 임상시험의 초점을 안내할 것이다. 더 나아가, 독성 연구를 수행하여 안전한 안 복용 범위를 설정하고, 임상시험에 대한 승인 을 받기 전 FDA 요구조건을 이행한다.
눈물의 최내부층은 결막의 배상 세포로부터 그리고 각막과 결막의 상피 세포에 의해 생성된 점액소로 이루어진다. 점액소는 분비 점액으로서 배출 및 존재할 수 있고, 또는 막관통 점액소로서 상피에 부착되어 남아 있을 수 있다. 이 분자는 풍부한 O-연결된 탄수화물 측쇄를 갖는 당단백질이다. 측쇄는 점액소의 매우 친수성 특성에 관계되고, 이는 수성 층이 눈 위에서 균일하게 확산하도록 한다. 눈물샘에 의해 생성된 수성 층은 눈물 막의 약 90%를 이루고 있다. 이는 용해된 염, 글루코오스, 리소자임, 눈물-특이적 프리알부민, 락토페린, 분비 면역글로불린 A 및 다른 단백질과 물로 대부분 구성된다. 외부 지질 층은 증발을 지체시키고, 검판선으로부터 생성된 피지 물질로 구성되어 있다. 눈깜박임은 이 층을 눈물 막 위에 확산시킨다(문헌 [Rheinstrom SD, 1999, Dry eye. In Yanoff, ed. Ophthalmology. 1st Ed. Editor. Mosley International Ltd, St Louis, MO]).
국립 안 연구소(The National Eye Institue)는 2개의 주요 카테고리: 수성 층 결핍 및 증발 결핍으로 건성 안 상태를 분류하고 있다. 그러나, 임상 증상은 흔히 2개의 발병 경로의 혼합이다(감소된 눈물 생성은 흔히 과도한 증발의 결손된 지질 층 확산의 원인이 되고, 검판선 질병은 하이포분비성 건성 안과 매우 흔히 연관되어 있다). 쇼그렌 증후군 건성 안 및 비-쇼그렌 증후군 건성 안으로의 수성 눈물 결핍 그룹의 하위범주화는 2개의 그룹 사이의 질병의 고통의 차이를 인식하고, 쇼그렌 증후군의 염증성 발현을 강조한다(문헌 [Foulks, 2003, The Ocular Surface. 1:20-30]).
수성 층 결핍은 건성 안의 가장 흔한 원인이고, 보통 눈물샘으로부터 감소된 눈물 분비에 의해 초래되지만, 눈물 증발의 증가도 관련될 수 있다. 감소된 분비의 원인은 쇼그렌 증후군, 노인성 분비 저하, 눈물샘 절제, 비타민 A 결핍, 사르코이드증 또는 림프종의 면역성 눈물샘 손상, 감각 또는 운동 반사 손실, 결막의 흉터 형성 상태 및 콘택트 렌즈 착용을 포함한다(문헌 [Rolando and Zierhut, Surv Ophthalmol. 45:S203-S210, 2001]). 느린 눈물 회전과 함께, 증가한 전해질 농도, 성장 인자의 손실, 또는 연관염증성 지향 시토킨의 존재와 같은 수성 층의 조성의 변화 또한 안구 표면 손상과 연관된다.
배상 세포 결핍 및 이에 따라 감소된 점액소 수준이 많은 형태의 건성 안을 동반한다. 특히 특정한 장애는 배상 세포 손실을 촉진할 수 있다. 이는 비타민 A 결핍(비타민 A는 안구 표면에서 배상 세포와 점액의 유지에 필수적임) 및 스티븐-존슨(Stevens-Johnson) 증후군, 트라코마, 유천포창(pemphigoid) 및 화학적 화상과 같은 흉터성 결막 장애를 포함한다. 국소 약제 및 방부제 또한 안구 표면 및 배상 세포를 손상시킬 수 있다(문헌 [Rheinstrom SD, 1999, Dry eye. In Yanoff, ed. Ophthalmology. 1st Ed. Editor. Mosley International Ltd, St Louis, MO]; [Abelson et al, 2003, Rev Ophthalmol 10:1]).
환자의 불쾌감 평가 이외에, 진단 기술이 DES의 심각성 및 원인을 측정하는 데 유용한 것으로 증명되었다. 눈물-막 불안정도는 형광물질 용액이 도포되는 눈물 파괴 시간(TBUT)의 비침습식 측정을 이용하여 평가할 수 있고, 생체현미경적으로 관찰되는 눈물 막의 최초 파괴에 대한 시간을 측정한다. 눈물 생성은 고전식 또는 개량식 셔머(Schirmer) 테스트를 이용하여 추정할 수 있다. 형광물질 또는 유사한 염료를 이용하는 안구 표면 염색의 정도는 안구 표면의 변화의 심각성을 진단하는 데 일상적으로 이용된다. 이 염료는 점액소 단백질 보호가 박탈되거나 또는 상피 세포막이 노출된 상피 표면을 염색한다. 표준 등급 시스템이 손상의 심각성을 정량하도록 발달해 왔다. 이 테스트는 또한 조사를 위한 건성 안 치료의 치료적 효과를 평가하기 위한 임상시험에서 일상적으로 이용된다(문헌 [Foulks, 2003, The Ocular Surface, 1:20-30]).
인공 눈물은 현재 건성 안 치료의 중추이다. 광범위한 상업적 제품이 입수 가능하지만, 이들 모두는 징후의 일시적 완화만을 제공한다. 현재 상태를 반전시키기 위한 치료법은 존재하지 않는다. 식염수에 셀룰로오스 에스테르(메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스) 또는 폴리비닐 알코올과 같은 고 분자량 중합체를 첨가하는 것이 인공 눈물을 생성하는 데 이용될 수 있다. 다른 인공 눈물 제제들이 눈물의 점액소 성분을 모방하기 위한 시도로 제조되어 왔다. 연구는 인공 눈물에서 이용되는 방부제가 일부 독성을 생성할 수 있음을 보여 주었고, 그 결과, 방부제 없는 인공 눈물의 단위 복용 바이엘이 입수 가능하게 되었다(문헌 [Rheinstrom SD, 1999, Dry eye. In Yanoff, ed. Ophthalmology. 1st Ed. Editor. Mosley International Ltd, St Louis, MO; Abelson, 2003, Rev Ophthalmol 10:1]).
질병의 병태생리학의 이해가 진전되면서, 많은 상이한 양상의 치료법이 소개되었고, 이는 눈물의 지질층의 장애 및 질병의 근본적인 면역 또는 호르몬 원인을 표적으로 하는 것을 포함한다(문헌 [Brewitt et al, 2001, Surv of Ophthalmol 45:S119-S202]). 조사적 치료법은 15(S)-HETE(하이드록시-에이코사테트라엔산)(문헌 [Gamache et al., 2000, Cornea 19:6:S88]) 및 합성 P2Y2 수용체 작용제(문헌 [Jumblatt et al., 1998, Exp Eye Res 67:341-346])와 같은 국소 분비촉진제(secretagogue) 뿐만 아니라 시클로스포린 A 및 코르티코스테로이드와 같은 항염증제(문헌 [Pflugfelder, 2003, The Ocular Surface, 1:31-36])의 이용을 포함한다.
점액소는 건강한 안구 눈물 막 생리학에서 역할을 갖는 것으로 공지되어 있다. 점액소는 단백질 골격 및 고 탄수화물 함량을 갖는 고-분자량 당단백질이다. 점액 층에 기여하는 것 이외에, 점액소 자체는 당질층, 세포 부착에 기여하도록 돕는 스카폴드-유사 구조물을 형성한다. 이는 또한 안구 표면 손상에 대항하는 방어물이다. 점액소는 또한 눈물 막이 친수성이 되도록 작용한다. 이는 눈물 막을 안정화시키고 이의 표면 장력을 감소시켜, 수성 층이 눈의 표면 위에 균일하게 확산하도록 한다. 이 층이 없으면, 눈물은 표면에 점착되지 않고, 이를 손상되기 쉽게 한다(문헌 [Abelson et al., 2003, Rev Ophthalmol 10:1]).
점액소의 2개의 주요한 유형이 체내에서 생성된다: 막 스패닝 점액소 및 분비된 점액소. 막-스패닝 점액소(MUC1, MUC2 및 MUC4)은 세포의 지질 이중층에 매립된다. 각막 및 결막 비-배상 세포에 의해 발현된 막-스패닝 점액소는 안구 표면에 걸쳐 배상 세포에 의해 생성된 분비된 점액소(MUC5AC, MUC7)가 확산되도록 돕는 것으로 생각된다. 점액소의 2개의 유형은 함께 작용하여 실용적인 눈물 막을 형성한다(문헌 [Danjo et al., 1998, Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 2602-2609]; [Watanabe 2002, Cornea 21:S17-S22]).
결막 점액소의 결핍은 건조한-눈 장애의 특정한 유형에서 역할을 수행한다. 가능한 원인은 배상 세포의 감소된 밀도, 점액소 분포 또는 특성의 변화 및 낮은 점액 mRNA 발현을 포함한다(문헌 [Gipson et al., 2000, Prog Retinal Eye Res,16:1:81-98]; [Gilbard, 2000, "Dry-eye disorders", In: Albert M et al., eds. Principals and Practice of Ophthalmology: 2nd Edition, Philadelphia: W.B. Saunders Company: 982-1001]). 비타민 A 결핍, 국소 투약, 방부제를 함유하는 방울의 과도한 복용 및 흉터성 결막 장애가 배상 세포 및 안구 표면을 모두 손상시킬 수 있다(문헌 [Danjo et al., 1998, Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 2602-2609]; [Abelson et al., 2003, Rev Ophthalmol 10:1]).
안구 표면 상에서 발견되는 막관통 점액소는 또한 건성 안을 갖는 환자에서 변경된다. 연구자들은 건성-안 환자에게서 생성된 MUC1와 같은 막관통 점액소가 정상 환자의 점액소와 같이 글리코실화되지 않음을 제안하였다. 변경된 구조는 안구 표면상에서 이의 기능을 잠재적으로 변화시키고, 그리고 건성 안의 발전을 더 진전시킬 수 있다(문헌 [Danjo et al., 1998, Invest Ophthalmol Vis Sci 39: 2602-2609]).
눈물 막 부족에서 갈렉틴의 역할
갈렉틴은 각막 및 결막 표면 상에 눈물 막의 확산을 촉진시키는 이상적인 후보자로서 작용하는 가능성을 가질 수 있는 탄수화물-결합 단백질이다. 이 단백질은 점액소, 구체적으로 이의 O-연결된 탄수화물 측쇄에 높은 친화력으로 결합된다. 임의의 특별한 작용 이론 또는 메커니즘에 구속됨 없이, 갈렉틴은 각막과 결막의 표면상 막관통 점액소(또는 다른 당단백질)에 분비 점액소를 결합함으로써 눈물 막 확산을 촉진할 수 있다. 점액소-결핍 눈에서, 외인성 갈렉틴은 점액소 결합을 연장하거나 향상시킬 수 있다. 더 나아가, 갈렉틴은 심지어 점액소-결핍 환경에서도, 각막 표면에 탄수화물-결합 단백질을 결합함으로써 눈물 막의 더 균일한 확산을 촉진하는 데 그 자체로 작용할 수 있다.
점액소와 갈렉틴 사이의 상호 작용은 비-안구 조직에서 입증되어 왔다. 갈렉틴은 다양한 점액소에 대한 강한 결합 친화력을 가지고 점액소 발현과 생산을 조정하는 것으로 알려져 왔다. 갈렉틴-3이 결합하여 농도-의존 방식으로 인간 결장암 세포로부터 유래한 점액소의 발현을 조정한다(문헌 [Bresalier et al, 1996, Cancer Res 56: 4354-4357]; [Dudas et al., 2002, Gastroenterology 118: 1553]). 난소 종양 세포에서, 점액소-유사 당단백질 CA125이 갈렉틴-1에 결합한다(문헌 [Seelenmeyer et al., 2002, J. Cell Sci,116:1305-1318]).
갈렉틴은 많은 세포 표면 및 ECM 당단백질 상에서 발견되는 β-갈락토사이드-함유 글라이칸에 대한 친화력을 특징으로 하는 넓게 분포한 탄수화물 결합 단백질의 패밀리를 구성한다. 포유 동물에서, 현재 이의 탄수화물-인식 도메인(CRD)의 구 조적 유사성에 의해 정의되는 갈렉틴 패밀리(갈렉틴-1 내지 -14)의 14개의 구성원이 있다. 갈렉틴은 가용성 단백질이다. 세포내적으로, 이는 세포질 내에 주로 존재하고, 갈렉틴-1 및 -3은 증식 세포의 핵에서 검출되어 왔다. 세포외적으로, 이는 세포 표면 상 및 ECM에서 발견되어 왔다. 특정한 성장 인자(예를 들어, bFGF) 및 시토킨(예를 들어, IL-1)과 같이, 갈렉틴은 표준적인 신호 서열 또는 막관통 도메인을 함유하지 않고, 잘 이해되지 않은 비표준적인 경로를 통해 세포로부터 분비된다. 갈렉틴-1, -3, -8 및 -9과 같은 몇몇의 갈렉틴은 광범위한 조직 분포를 가지지만, 갈렉틴-4, -5 및 -6과 같은 다른 것들은 조직 특이성을 보여준다. 갈렉틴-1 및 -3은 2개의 가장 광범위하게 연구된 갈렉틴이다. 세포외적으로, 두 렉틴 모두는 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴 및 인테그린의 구별되는 이성구조(isoform) 상의 올리고당류에 결합함으로써 세포-세포 및 세포-매트릭스 부착에서 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 대부분의 갈렉틴은 2개의 CRD를 가지거나 또는 동종이합체로서 존재하고, 기능적으로 2가이다. 2가 성질은 렉틴이 한편으로는 분비 점액소 당단백질의 올리고당 쇄와 그리고 다른 한편으로는 각막 정점의 표면 상 막관통 점액소의 올리고당류 또는 다른 당단백질과 상호 작용하도록 하여, 안구 표면 상에 눈물 막 확산을 촉진할 수 있다. 몇몇의 연구는 갈렉틴-3이 마우스 및 인간 각막 상피에서 발현됨을 보여주었다. 외인성 갈렉틴-3 및 -7은 마우스 동물 모델의 각막 상처의 재상피화를 자극하고, 그리고 각막 상피 세포 이동에서 역할을 수행할 수 있다(문헌 [Cao et al. 2002, J Biol Chem. 277:42299-4230]; [2003, Arch Ophthalmol, 121:82-86]).
각막 상처 치유의 2개의 상이한 모델을 이용하는 본 명세서 내의 실시예를 위한 예비적인 연구에서, 상처의 재상피화는 야생형(gal3+/+) 마우스와 비교하여 갈렉틴-3-결핍(gal3-/-) 마우스 내에서 상당히 느린 것으로 사전에 발견되었다. 대조적으로, 갈렉틴-1-결핍과 야생형 마우스 사이의 각막 상피 상처 봉합 속도의 차이는 없었다. 외인성 갈렉틴-3 및 갈렉틴-7은 농도-의존 방식으로 각막 알칼리-화상 상처의 재상피화를 가속화하였다. 이 효과는 무관계성 이당류, 수크로즈에 의해서가 아니라 경쟁적 당, β-락토오스에 의해 억제되었다(문헌 [Cao et al., 2002, J Biol Chem. 277:42299-4230; 2003, Arch Ophthalmol, 121:82-86]).
물질 및 방법
다음의 물질 및 방법이 본 명세서 내 실시예를 통해 이용된다.
갈렉틴 -1, -3, -7 및 -8의 치료적 농도를 갖는 인공 눈물 용액
전형적인 인공 눈물 용액을 본 명세서에서 동물 연구를 위한 갈렉틴 농도로 배합하였다. 용액을 완충, pH 중성 및 등장(等張)시키고, 그리고 CMC 또는 HMPC와 같은 증점제를 포함하여 점도를 증가시킨다. 갈렉틴을 제외한 모든 성분을 갖는 동일한 대조군 용액 또한 제조할 것이다. 용액은 방부제가 상피 손상을 악화시킬 수 있기 때문에 무방부제이다. 그러므로, 새로운 용액을 각 실시예를 위해 제조할 것이고, 그리고 복용 사이에는 냉장보관한다. 상이한 제제는 다음을 포함한다: 인공 눈물 대조군 용액; 각각의 갈렉틴 -1, -3, -7, 또는 -8, 또는 쌍(pairwise) 조합 10 ㎍/㎖를 함유하는 인공 눈물 용액; 및 각각의 갈렉틴 -1, -3, -7, 또는 -8, 또는 쌍 조합 20 ㎍/㎖를 함유하는 인공 눈물 용액; 및 0.1 M β-락토오스, 갈렉틴 억제제로서 작용하는 경쟁적 이당류를 더 함유하는 상기 각각.
DES 의 동물 모델로서 정상 마우스의 스코폴라민 -유발된 눈물 불충분
스코폴라민은 무스카린성 콜린성 수용체를 표적으로 하는 항-콜린성제이다. 경피 스코폴라민(scop) 패치는 흔히 항-구토 목적 및 인간의 멀미를 치료하는 데 이용된다. 간행된 연구에서(문헌 [Dursun et al., 2002, Invest Ophthamol & Vis Sci. 43:632-638]), 이 방식의 스코폴라민 처리는 대조군에서 발견된 것의 20% 미만으로의 현저하고 통계학적으로 유의적인 눈물 생성 감소의 원인이 된다. 눈물 형광물질 청소 및 각막 카복시형광물질 흡수가 모두 대략 3배 증가하였다. 송풍 후드 내에 동물을 위치시키는 것을 더 가함으로써, 이들 변수는 더욱 더 극적으로 증가하였다. 추가적으로, scop + 송풍기 마우스 내 결막 배상 세포 밀도는 대조군과 비교할 때 90% 이상 감소하였다. 경피 패치 전달 시스템이 제어되고 지속적인 약물 전달을 허용하기 때문에, 눈물 생성의 감소가 24시간을 넘는 동안 지속되고, 이는 몇 시간의 지속성을 가지는 국소 아트로핀 치료에 대비된다. 새로운 스코폴라민 패치의 재도포는 효과를 더 연장할 수 있다.
마우스의 C57BL/6 균주(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)가 이 실시예에서 이용된다. 마우스의 나이는 6 내지 8주이고, 그리고 성별은 혼합되어 있다. 마취시키지 않은 마우스를 손으로 잡고, 전기 면도기를 이용하여 동물의 중간꼬리의 1인치 부분을 면도하였다. 경피 scop 패치(Novartis, Summit, NJ)를 4 조 각으로 자르고, 1/4 구역 하나를 털 뽑힌 중간꼬리에 도포한다. 48시간 후 패치를 재도포하여 안정된 약물 전달을 유지시킨다. 동물을 실험의 각 날마다 하루에 3번씩 1시간 동안 송풍 후드 내에 놓아둔다.
MRL / lpr 자가면역성 마우스
마우스의 MRL/Mp-lpr/lpr(MRL/lpr) 변종(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)이 이 실험에서 이용된다. 이 마우스는 컨제닉(congenic) 아변종이고, 16 주령 이내에 눈물샘 염증성 병변을 유도하는 자가면역성 질환을 발달시킨다. 병인론 및 조직학적 평가에 기초하여, 이 마우스는 인간 쇼그렌 증후군을 위한 모델로서 제안되었다(문헌 [Jabs et al., 1991, Invest Ophthamol Vis Sci. 32:371-380; 2001, Curr Eye Res. 16:909-916]). 본 명세서 내 실시예의 마우스는 16주령 이상이고, 성별이 혼합되어 있다.
동물의 눈물 생성, 눈물 청소 및 각막 염색의 측정
수성 눈물 생성은 페놀 레드 함침 면사(Z1-quick, Oasis, Glendora, CA)를 이용하여 측정한다. 핀셋을 이용하여 실을 집고, 1분 동안 외안각 내 안구 표면에 도포할 것이다. 면사 상 눈금을 이용하여, 수성 눈물 생성이 젖은 실의 밀리미터로 측정된다.
눈물 파괴 시간(TBUT)은 안구 표면에 방울 형태로 도포되는 1% 나트륨 형광물질 2 ㎕(Alcon, Fort Worth, TX)를 이용하여 측정한다. 눈물 막을 슬릿-램프 생체현미경을 이용하여 검사하였고, 그리고 필름이 확산하는 시간의 길이를 기록할 것이다.
형광물질 염색은 TBUT 측정 후 안구 표면에 방울 형태로 1% 나트륨 형광물질 2 ㎕를 도포함으로써 즉시 수행된다. 도포 후 5분, 각막 형광 염색을 슬릿-램프 생체현미경을 이용하여 평가할 것이다. 형광물질 염색은 각막 표면 손상을 평가하기 위해 임상에서 흔히 이용된다. 정상 각막 표면이 아니라, 건성 안을 갖는 동물의 각막 표면이 형광물질로 염색될 것으로 기대된다. 형광 염색의 정도는 임상의 건성 안 연구에서 이용되는 것과 유사한 표준화 F1 등급 규모를 이용하여 작성될 것이다.
균등 치료
치료 및 측정 스케줄이 각각의 단기간(갈렉틴 치료 후 2시간) 및 장기간(갈렉틴 치료 후 ~14 시간) 효과를 평가할 수 있도록 설계된다. 4x/day 치료 스케줄 이후 갈렉틴이 장기간 이익을 제공함이 예상된다. 각막에 이로운 효과를 생성하는 데 필요한 치료 스케줄, 측정 스케줄, 또는 복용량의 수정은 본 명세서의 실시예의 균등의 범위 이내이다. 예를 들어, 반응이 10 ㎕/㎖ 갈렉틴 치료가 아닌 20 ㎕/㎖ 갈렉틴 치료로 나타난다면, 추가적인 예는 더 많은 복용량(50 ㎍/㎖)을 포함한다.
갈렉틴 -1, -3, 갈렉틴 -7, 및 갈렉틴 -8의 제조
이 발명의 갈렉틴을 임의의 입수 가능한 공급원으로부터 얻을 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 이는 이에 제한되지는 않으나, 천연 공급원으로부터 단리된 단백질, 재조합적으로 생성된 단백질 또는 합성적으로 생성된 단백질, 예를 들어, 고체 상 과정에 의해 생성된 단백질을 포함한다. 본 발명에 따라서, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 또는 갈렉틴-8을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 적절한 숙주 세포 내 에서 이 발명의 갈렉틴의 발현을 유도하는 재조합 DNA 분자 내에서 이용할 수 있다. 문헌 [Cherayil et al., supra, Madsen et al., supra] 및 [Hadri et al., supra]는 각각 인간 갈렉틴-1, -3, -7 및 -8의 클로닝을 상세하게 기술한다. 생물학적으로 활성인 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 또는 갈렉틴-8을 발현하기 위해, 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, 갈렉틴-8을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 균등물이 적절한 발현 벡터, 즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입된다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 갈렉틴-1-암호화, 갈렉틴-3-암호화, 갈렉틴-7-암호화 또는 갈렉틴-8-암호화 서열을 함유하는 발현 벡터 및 적절한 전사 또는 번역 대조군을 구성하는 데 이용될 수 있다. 이 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내 재조합 또는 유전자 재조합을 포함한다. 결실, 부가, 또는 치환의 도입은 종래 기술의 임의의 공지 기술, 예를 들어, PCR 기초 돌연변이 유발을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, 1989] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1989]에 기술되어 있다. 다양한 발현 벡터/숙주 계가 갈렉틴-1-암호화, 갈렉틴-3-암호화, 갈렉틴-7-암호화 또는 갈렉틴-8-암호화 서열을 함유하고 발현하는 데 이용될 수 있다. 이는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질 전환된 박테리아; 이스트 발현 벡터로 형질 전환된 이스트; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 계; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜 리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크병 바이러스, TMV)로 형질 감염 또는 세균성 발현 벡터(예를 들어, Ti, pBR322, 또는 pET25b 플라스미드)로 형질 전환된 식물 세포 계; 또는 동물 세포 계와 같은 미생물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 본 발명의 갈렉틴은 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 또는 갈렉틴-8 아미노산 서열의 전체 또는 부분을 합성하는 화학적 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 합성은 다양한 고체-상 기술을 이용하여 수행될 수 있고(문헌 [Roberge et al., Science 269:202, 1995]), 그리고 자동 합성은 예를 들어, 431A 펩티드 합성기(Foster City, CA의 Applied Biosystems로부터 입수 가능)를 이용하여, 제조업자에 의해 제공된 설명서에 따라 달성될 수 있다.
약학 조성물
본 발명의 한 측면에서, 약학 조성물을 제공하고, 이 조성물은 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7, 및/또는 갈렉틴-8을 포함하고, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 특정한 구체예에서, 이 조성물은 선택적으로 하나 이상의 추가적인 치료제를 더 포함한다. 특정한 구체예에서, 추가적인 치료제 또는 치료제들은 성장 인자, 항염증제, 혈관 수축제, 콜라겐분해효소 억제제, 국소 스테로이드, 매트릭스 금속단백분해효소 억제제, 아스코르베이트, 안지오텐신 II, 안지오텐신 III, 칼레티큘린, 테트라사이클린, 섬유결합소, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 전환 성장 인자(TGF), 각질세포 성장 인자(KGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 뉴레큘린(neu) 발생 인자(NDF), 간세포 성장 인자(HGF), 비오틴과 같은 비타민 B 및 히 알루론산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 이용되는 것으로서, 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 희석제 또는 다른 액체 매개제, 분산제 또는 현탁 보조제(suspension aid), 표면 활성제, 등장제, 농후제 또는 유화제, 방부제, 고체 바인더, 윤활제 등을 포함하고, 이는 원하는 특정 복용 형태에 적합하다. 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences Ed. by Gennaro, Mack Publishing, Easton, PA, 1995]은 약학 조성물을 배합하는 데 이용되는 다양한 담체 및 이의 제조에 관한 공지 기술을 개시한다. 약학적으로 허용 가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 몇몇의 예는 글루코오스 및 수크로즈와 같은 당; 옥수수 녹말 및 감자 녹말과 같은 녹말; 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 분말화된 트라가칸스; 맥아; 젤라틴; 운모; 코코아 버터 및 좌약 왁스과 같은 부형제; 땅콩기름, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브오일, 옥수수오일, 및 콩기름과 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; 알긴산; 발열인자-없는 물; 등장성 식염수; 링거(Ringer) 용액; 에틸 알코올, 및 인산 완충액 뿐만 아니라 나트륨 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 다른 비독성 융화성 윤활제를 포함하고, 뿐만 아니라 배합기의 공정에 따라 착색제, 이형제, 코팅제, 감미료, 착향료 및 방향제, 방부제를 포함하나, 이에 제한되지는 않고, 그리고 항산화제 또한 조성물 내에 존재할 수 있다.
치료적으로 유효한 복용량
본 발명의 치료 방법에 따른 또 다른 측면에서, 본 명세서에서 기술되는 바와 같은 약학 조성물에 눈을 접촉시킴으로써 건성 안을 치료하는 것을 제공한다. 따라서, 본 발명은 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 및/또는 갈렉틴-8을 포함하는 활성제를 포함하는 약학 조성물의 치료적으로 유효한 양을 원하는 결과를 달성하는 데 필요한 양으로, 그리고 시간 동안 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 건성 안의 치료 방법을 제공한다. 각막 및 결막 표면상에 눈물 막의 확산을 촉진하는 치료 수단으로서, 또는 건성 안과 연관되는 합병증을 최소화하는 예방 수단으로서 발명의 제약을 투여하는 단계를 내포함을 이해할 것이다(예를 들어, 항히스타민제로 염증 상태의 치료 또는 수술의 동안 및/또는 후 상처 세척 용액으로서). 본 발명의 특정한 구체예에서, 약학 조성물의 "치료적으로 유효한 양"은 건성 안을 촉진하는 데 유효한 양이다. 본 발명의 방법에 따른 조성물은 눈을 치료하는 데 효과적인 투여의 임의의 양 및 임의의 경로를 이용하여 투여될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 이용되는 것으로서, 표현 "건성 안 치료를 촉진하는 데 유효한 양"은 눈물 막을 촉진하기 위해 충분한 양의 조성물을 지칭한다. 정확한 복용량은 치료받는 환자를 고려하여 개별 내과 의사에 의해 선택된다. 복용량 및 투여는 활성제(들)의 충분한 수준을 제공하도록 또는 원하는 효과를 유지하도록 조정된다. 고려할 수 있는 추가적인 인자는 질병 상태의 심각성, 예를 들어, 건성 안의 정도, 병력; 환자의 나이, 몸무게 및 성별; 식단, 투여의 시간 및 빈도; 약물 조합; 반응 민감성; 및 치료에 대한 내성/반응을 포함한다. 장기간 활성 약학 조성물은 특별한 조성물 의 반감기 및 제거 속도에 따라 하루에 몇 번, 매일, 3 내지 4일, 매주 또는 매 2주마다 한번 씩 투여될 수 있다.
본 발명의 활성제는 바람직하게는 투여의 용이성 및 복용의 획일성을 위한 복용 단위 형태로 배합된다. 본 명세서에서 이용되는 것으로서 표현 "복용 단위 형태"는 치료될 환자에 적합한 물리적으로 분리된 단위의 활성제를 지칭한다. 그러나, 본 발명의 조성물의 전체 하루 사용량은 건강한 의학적 판단의 범위 내의 내과 의사의 참석에 의해 결정될 것임을 이해할 것이다. 임의의 활성제의 경우, 치료적으로 유효한 복용량은 세포 배양 분석법으로 또는 동물 모델, 보통 마우스, 토끼, 개, 또는 돼지로 초기에 추정할 수 있다. 동물 모델은 또한 투여의 바람직한 농도 범위 및 경로를 얻는 데 이용된다. 눈에 대한 직접적인 도포는 투여의 경로로서 계획되지만, 이러한 정보는 인간 내 투여를 위한 유용한 복용량 및 추가적인 경로를 측정하는 데 이용될 수 있다. 치료적으로 유효한 복용량은 징후 또는 상태를 개선하는 활성제의 양을 지칭한다. 활성제의 치료적 효능 및 독성은 세포 배양 또는 실험 동물로 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있고, 예를 들어, ED50(복용량은 집단의 50% 내에서 치료적으로 유효함) 및 LD50(복용량은 집단의 50%에게 치사량임)이다. 치료 효과에 대한 독성의 복용비가 치료 지수이고, 그리고 비, LD50/ED50로서 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 보여주는 약학 조성물이 바람직하다. 세포 배양 분석법 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에 대한 복용량의 범위를 배합하는 데 이용된다.
약학 조성물의 투여
원하는 복용량으로 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체와의 배합 후, 이 발명의 약학 조성물은 눈으로(분말, 연고, 또는 점적약제에 의한 것으로서), 즉, 눈에 직접적으로 도포되는 것과 같이 국소적으로 인간과 다른 포유류에 투여될 수 있다. 치료되는 상태의 심각성에 따라, 경구적, 좌약, 비경구적, 수조내, 질내, 복막내, 협면으로(buccally), 또는 비음성적(nasally)과 같은 대안적이고 추가적인 경로가 계획된다.
안구 투여를 위한 액체 복용 형태는 완충제 및 가용화제, 물과 같은 바람직한 희석제, 티모졸(thymosol)과 같은 방부제 및 폴리에틸렌 글리콜, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 히알루론산 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨 또는 타마린드 검과 같은 용액을 조정하기 위한 1개 이상의 생체고분자 또는 중합체를 포함한다.
경구 투여를 위한 액체 복용 형태는 약학적으로 허용 가능한 유제, 미세유제, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 활성제 이외에, 액체 복용 형태는 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 에틸 알코올, 아이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 다이메틸포름아마이드, 오일(특히, 목화씨, 땅콩, 옥수수, 병원균, 올리브, 피마자(castor) 및 참기름), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸르릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르와 같은 유화제 및 이의 혼합물과 같은 본 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 비활성 희석제를 함유할 수 있다. 비활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현수제, 감미료, 착향료 및 방향제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
발명의 약학 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 복용 형태는 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제, 또는 패치를 포함한다. 활성제는 무균 상태 하에서 약학적으로 허용 가능한 담체 및 요구될 수 있는 것으로서 임의의 필요한 방부제 또는 완충제와 혼합된다. 예를 들어, 안구 또는 피부 감염은 수성 점적약제, 미스트(mist), 유제 또는 크림으로 치료될 수 있다. 투여는 치료적일 수 있고 또는 예방적일 수 있다. 예방 제제는 잠재적 상처의 부위에, 또는 접촉 렌즈, 접촉 렌즈 세척 및 헹굼 용액, 접촉 렌즈 보관 또는 수송을 위한 용기, 접촉 렌즈 취급을 위한 기구, 안점적약제, 수술용 세척 용액, 귀 점적약제, 눈 패치, 및 크림, 로션, 마스카라, 아이라이너 및 아이섀도우를 포함하는 눈 주위용 화장품과 같은 상처의 원인에 존재할 수 있거나 도포될 수 있다. 본 발명은 개시된 조성물(예를 들어, 거즈 붕대 또는 스트립)을 함유하는 안과 기구, 수술 기구, 청력 기구 또는 제품 및 이러한 기구 또는 제품을 제조하거나 이용하는 방법을 포함한다. 이 기구는 개시된 조성물로 코팅, 함침하거나, 그에 결합하거나 그렇지 않으면 처리될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림, 및 젤은 이 발명의 활성제 이외에, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 녹말, 트라가칸스, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 운모, 산화 아연, 또는 이의 혼합물과 같은 부형제를 함유할 수 있다.
분말 및 스프레이는 이 발명의 약물 이외에, 운모, 규산, 수산화 알루미늄, 규산 칼슘, 폴리아마이드 분말 또는 이 물질의 혼합물과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 스프레이는 클로로플루오로탄화수소와 같은 관용적인 추진제를 추가적으로 함유할 수 있다.
경피 패치는 신체에 대한 활성 성분의 제어된 전달의 제공의 추가된 이점을 가진다. 이러한 복용 형태는 적절한 매질 내에서 화합물을 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 흡수 강화제가 또한 피부 전체에 걸쳐 화합물의 유체를 증가시키는 데 이용될 수 있다. 속도는 속도 제어 막을 제공함으로써 또는 중합체 매트릭스 또는 겔 내에서 화합물을 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
주사 가능한 제제, 예를 들어, 무균 주사 가능한 수성 또는 유질 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현수제를 이용하는 공지된 기술에 따라 배합될 수 있다. 무균 주사 가능한 제제는 또한 비독성 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매, 예를 들어, 1,3-부탄다이올 내 용액으로 무균 주사 가능한 용액, 현탁액 또는 유제일 수 있다. 사용될 수 있는 허용 가능한 매개제 및 용매는 물, 링거 용액, U.S.P. 및 등장성 염화 나트륨 용액이다. 또한, 무균, 불휘발성 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함하는 임의의 온화한 불휘발성 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사의 제조에서 이용된다. 주사 가능한 배합은 예를 들어, 세균-보유 필터를 통한 여과함으로써, 또는 이용 전 무균성 물 또는 다른 무균성 주사 가능한 매질에 용해 또는 분산될 수 있는 무균성 고체 조성물의 형태로 무균제를 통합함으로써 무균화될 수 있다. 활성제의 효과를 연장하기 위해, 서브피부 또는 근육 내 주사로부터 약물의 흡수를 느리게 하는 것이 종종 바람직하다. 비경구적으로 투여된 활성제의 지연된 흡수는 오일 매개제 내에서 약물을 용해 또는 현탁함으로써 달성될 수 있다. 주사 가능한 저장 형태는 폴리락티드-폴리글리코라이드와 같은 생분해 가능한 중합체 내에서 약물의 마이크로캡슐(microencapsule) 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 활성제 대 중합체의 비 및 사용된 특별한 중합체의 본성에 따라, 활성제 박리의 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해 가능한 중합체의 예는 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(무수물)이다. 저장 주사 가능한 제제는 또한 리포좀 또는 신체 조직과 융화할 수 있는 미세유제 내에서 약물을 포획함으로써 제조된다.
좌약 또는 질 투여를 위한 조성물은 바람직하게는 이 발명의 활성제(들)와 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌약 또는 주위 온도에서는 고체이나 체온에서는 액체여서 직장 또는 질강에서 녹고, 활성제(들)를 박리하는 좌약 왁스이다. 경구 투여를 위한 고체 복용 형태는 캡슐, 정, 알약, 분말 및 과립을 포함한다. 이러한 고체 복용 형태에서, 활성제는 1개 이상의 시트르산 나트륨 또는 제2 인산 칼슘과 같은 비활성, 약학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체 및/또는 a) 녹말, 수크로즈, 글루코오스, 만니톨 및 규산과 같은 필러 또는 증량제, b) 예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피폴리디논, 수크로즈 및 아카시아와 같은 결합제, c) 글리세롤과 같은 보습제(humectant), d) 한천(agar-agar), 탄산 칼슘, 감자 또는 타피오카 녹말, 알긴산, 특정한 실리케이트 및 탄산 나트륨과 같은 붕해 제, e) 파라핀과 같은 용해 지연제, f) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제, g) 예를 들어, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제, h) 카올린 및 벤토나이트 점토와 같은 흡수제, 및 i) 운모, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 및 이의 혼합물과 같은 윤활제와 혼합된다.
유사한 유형의 고체 조성물은 유당으로서 이러한 부형제뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 이용하는 연-충전 및 강-충전 젤라틴 캡슐 내 충전제로서 사용될 수 있다. 정, 당의정(糖衣錠), 캡슐, 알약 및 과립의 고체 복용 형태는 장용 코팅, 박리 제어 코팅 및 약학 제제 기술에서 널리 공지된 다른 코팅과 같은 코팅 및 껍질로 제조될 수 있다. 이러한 고체 복용 형태에서, 활성제(들)는 수크로즈 또는 녹말과 같은 1개 이상의 비활성 희석제로 혼합될 수 있다. 이러한 복용 형태는 또한 보통의 관행대로 비활성 희석제 이외에 추가적인 물질, 예를 들어, 제형 윤활제 및 마그네슘 스테아레이트 및 미세결정 셀룰로오스와 같은 기타 제형 보조제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정 및 알약의 경우에서, 복용 형태는 또한 완충제를 포함할 수 있다. 이는 선택적으로 조영제를 함유할 수 있고, 그리고 또한 선택적으로 지연된 방식으로, 창자관의 특정한 부분 내에서 활성제(들) 만을 또는 우선적으로 박리하는 조성물의 일부일 수 있다. 이용될 수 있는 삽입 조성물의 예는 중합체성 물질 및 왁스를 포함한다.
약학 조성물의 용도
상기 논의되고, 실시예에서 더 상세하게 기술된 바와 같이, 갈렉틴-3, 갈렉 틴-7 및 갈렉틴-8은 막관통 점액소(또는 다른 당단백질)에 분비 점액소의 올리고당 쇄를 결합함에 의해 눈물 막 확산의 촉진제로서 유용하다. 일반적으로, 이 갈렉틴은 건성 안의 치유를 자극하는 데 임상적으로 유용할 것으로 신뢰된다.
일반적으로, 본 명세서에서 이들 갈렉틴은 피부 상피; 각막 상피; 위장관의 벽; 폐 상피; 및 신장 세관, 혈관, 자궁, 질, 요도, 또는 호흡관의 내부 표면을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 상피 조직과 연관된 치유를 자극하는 데 임상적으로 유용한 것으로 보여진다. 본 발명은 다양한 구체예에서 수술 상처, 절제 상처, 수포, 궤양, 병변, 찰과상, 미란, 열상, 종기, 베임(cut), 욕창(sore), 및 열 노출 또는 화학물질로 인한 화상을 포함하는 다양한 상피 상처 유형의 치료를 포함한다. 이들 상처는 정상 개체 또는 당뇨병, 각막 영양 장애, 요독증, 영양실조, 비타민 결핍, 비만, 감염, 면역억제 및 스테로이드, 방사선 치료법, 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 항종양제 및 대사길항제에 의한 전신 치료와 연관된 합병증과 같은 비정상 상처 치유를 유도하는 상태 하에 있는 개체 내에 있을 수 있다.
본 명세서에서 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 예를 들어, 진피 손실 후 진피 재확립을 촉진하는 데 유용하다. 대안적으로, 본 명세서에서 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 및/또는 갈렉틴-8은 상처 층에 대한 피부 이식편의 부착을 증가시키고, 상처 층으로부터 재상피화를 자극하는 것으로 보여진다. 적합한 피부 이식편은 이에 제한되지는 않으나, 자가이식, 인공 피부, 동종이식편(allograft), 자가식피편, 자가표피이식편, 무혈관(avacular) 이식편, 블레어-브라운(Blair-Brown) 이식편, 골 이식편, 배태조직 이식편, 피부(cutis) 이식편, 지연 이식편, 식피 이 식편, 표피 이식편, 근막 이식편, 전층피부이식편, 이종 이식, 종조직이식(xenograft), 동종 이식편, 증식성 이식편, 표층 이식편, 망상 이식편, 점막 이식편, 올리에르-티르쉬(Ollier-Thiersch) 이식편, 오멘팔(omenpal) 이식편, 첩부 이식편, 경상 이식편, 전층(penetrating) 이식편, 부분층 피부 이식, 및 중간층 피부 이식편을 포함한다.
본 명세서에서 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 수포가 진피-표피 연접부에서 형성되는 포진 피부염을 치료하는 데 유용하다. 본 명세서에서 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 그 병변의 재상피화를 가속화함으로써 수포성 표피박리증, 흔하고 개방되고 고통스러운 수포의 원인이 되는 하부 진피에 대한 표피의 부착에서의 결함을 치료하는 데 유용하다. 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 표피 내 세포-세포 부착의 손실을 포함하는 천포창 질환, 또는 진피-표피 연접부에서의 세포-세포 부착의 손실을 포함하는 유천포창 질환을 치료하는 데 또한 유용하다. 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 이에 제한되지는 않으나 당뇨병성 궤양, 진피 궤양, 욕창성 궤양, 동맥성 궤양, 및 정맥 정체 궤양을 포함하는 다양한 궤양을 치료하는 데 이용된다.
본 발명은 각막 조직 치유의 촉진을 위한 방법을 포함한다. 이는 각막 궤양, 열, 방사선, 소수포증(小水泡症), 각막 찰과상 또는 열상, 근시를 교정하기 위한 굴절교정 수술, 이물질 및 무균 각막 침윤물에 의해 발생하는 각막 상피 결함; 산 또는 알칼리(예를 들어, 불화수소산, 포름산, 무수 암모니아, 시멘트, 및 페놀) 또는 백린, 금속 원소, 질산염, 탄화수소 및 타르와 같은 기타 화학적 약물에 대한 노출에 의한 화학적 화상; 향신경성 각막병증, 당뇨병성 각막병증 및 티제슨(Thygeson) 표층 점상 각막병증과 같은 각막병증; 바이러스성 각막염(예를 들어, 메타헤르페스 또는 헤르페스 각막염) 및 세균성 각막염과 같은 각막염; 및 격자 이영양증, 상피 기저 막 이영양증(EBMD) 및 푸크(Fuch) 내피 이영양증과 같은 각막 영양 장애의 치료를 포함한다.
갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 본 명세서 내 방법에 의해 위장성 궤양을 치료하고, 점막 벽 치유를 돕고, 그리고 샘 점막층과 십이지장 점막 벽을 더 빠르게 재생하는 데 유용하다. 크론(Crohn) 질환 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 창자 질환은 작은 또는 큰 창자, 각각의 점막층 표면의 파괴의 원인이 되는 질환이다. 따라서 갈렉틴-1, -3, -7 및 갈렉틴-8은 점막층 표면의 재포장을 촉진하여 더 빠른 치유를 돕고 염증성 창자 질환의 진행을 예방 또는 약화시키는 데 이용될 수 있다. 갈렉틴-1, -3, -7 및 갈렉틴-8은 점액소를 결합하고, 상피 정점의 표면에 대해 이의 부착을 용이하게 하는 것으로 기대되고, 따라서 소화되는 해로운 물질로부터 또는 수술 후에 위장관을 보호하는 데 이용될 수 있다. 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 세균성 감염, 바이러스성 감염, 방사선 치료법, 화학요법 또는 기타 치료의 결과인 장(gut) 독성의 부작용을 감소시키는 데 이용될 수 있다. 갈렉틴-8, -3 및/또는 갈렉틴-7은 예를 들어, 점막염, 식도염, 또는 위염(예를 들어, 구강, 식도, 창자, 대장, 직장 및 항문 궤양에 연관된 병변을 치유하기 위함)을 예방 또는 약화시키는 데 예방적으로 또는 치료적으로 이용될 수 있다.
갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 요로상피 치유를 촉진하는 데 유용하 다. 요로상피 세포를 포함하는 조직 층은 심장도관술, 수술, 또는 세균성 감염(예를 들어, 임질과 같은 성전염성 질환을 초래하는 약물에 의한 감염)을 포함하는 수많은 메커니즘에 의해 손상될 수 있다. 본 발명은 또한 갈렉틴-8, -3 및/또는 갈렉틴-7의 유효량의 투여를 포함하는 여성 생식로 내 조직 치유의 촉진을 위한 방법을 포함한다. 여성 생식로 내 조직 손상은 칸디다, 트리코모나스, 가드네렐라, 임질, 클라미디아, 미코플라스마 감염 및 다른 성 전이 질환을 포함하는 광범위한 상태에 의해 초래될 수 있다.
갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 본 명세서 내 방법에 의해 신장 상피 세포의 복구를 촉진하는 데 유용하고, 따라서 급성 및 만성 신부전 및 말기 신장 질환과 같은 신장 질환 및 병리를 완화 또는 치료하는 데 유용할 수 있다. 갈렉틴-1, -3, 7 및/또는 갈렉틴-8은 방법에 의해 유방 조직의 복구를 촉진하는 데 유용하고, 따라서 수술, 외상, 또는 암에 의한 유방 조직 손상의 치유를 촉진하는 데 이용될 수 있다. 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 본 명세서 내 방법에 의해 외상, 수술 또는 화학물질에 의한 뇌 조직 손상을 치유 및 완화를 촉진하는 데 유용하다.
갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 다양한 병리학적 상태에 의해 초래된 폐에 대한 손상을 감소 또는 예방하기 위해 예방적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 폐포 및 세기관지 상피의 복구를 촉진하는 데 이용되어 급성 또는 만성 폐 손상을 예방, 약화 또는 치료할 수 있다. 폐포의 진행성 손실의 원인이 되는 폐기종 및 흡입 손상, 즉, 세기관지 상피 및 폐포의 괴사를 초래하는 연기 흡입 및 화상으로 인한 폐기종이 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8을 이용하여 유효하게 치료될 수 있고, 화학요법, 방사선 치료, 폐암, 천식, 탄진폐증 및 다른 폐 손상 상태에 기인한 손상도 그러하다.
본 발명에 의해 포섭되는 치료 방법이 인간의 상처를 치료하는 데 제한되지 않고, 이에 제한되지는 않으나 소과, 개과, 고양이과, 염소과, 양과, 돼지과, 랫트과 및 말과 종를 포함하는 임의의 포유류의 상처를 치료하는 데 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 주어진 종의 상처를 치료하는 경우, 요구되지는 않으나, 이용되는 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8은 종 내에서 천연적으로 발생하는 것과 같은 갈렉틴-1, -3, -7 및/또는 갈렉틴-8의 아미노산 서열에 대해 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하다.
이들 실시예 내 기술된 모든 동물 치료는 시력 연구 시 동물 이용에서의 시력안과학 연구 협회(Vision and Ophthalmology Resolution on the Use of Animals in Vision Research) 및 실험동물의 관리와 사용에 관한 NIH 지침(NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)의 규정을 준수하였다.
실시예 1 - 손상 후 이동성 각막 상피에서 갈렉틴 -3의 상향 조절
갈렉틴-3의 발현 수준이 손상 후 치유 각막의 상피에서 변화하는지 여부를 측정하기 위해, 2 mm의 엑시머 레이저 절제 및 찰과상을 갖는 마우스 각막이 생체 내에서 부분적으로 치유되도록 하였고, 그리고 랫트 항-인간 갈렉틴-3 mAb M3/38(American Type Culture Collection, Rockville, MD)으로 면역 염색을 진행하였다. 각막 상피는 원형-중층 편평 상피이다. 마우스 내에서, 이는 전체 각막 두께 의 20-25%를 이루고 있고, 5 내지 6개 층의 세포로 구성되어 있다. 상피 기저 막에 대한 후부는 각막 간질이고, 이는 마우스 내에서 전체 각막 두께의 70-80%를 나타낸다. 찰과상는 상피를 제거하고 각막 간질을 그대로 남겨둔다. 대조적으로, 통상적으로 근시의 교정에 이용되는, 엑시머 레이저 치료는 상피뿐만 아니라 전방 각막 간질을 제거한다.
스위스 웹스터 마우스(Taconic Laboratory Animal Services, Germantown, NY)를 1.25%의 아베르틴(avertin)(0.2 ㎖/10 kg 몸무게)의 근육내 주사로 마취하였다. 아베르틴은 2,2,2 트라이브로모에탄올 2.5 g, 2-메틸-2-부탄올(Aldrich, Milwaukee, WI) 5 ㎖ 및 증류수 195 ㎖를 혼합하여 제조하였다. 국소 마취제로서 프로파라카인(Proparacaine) 점안액(Alcon Labs, Fort Worth, TX으로부터 입수 가능한 ALCAINETM)을 각막에 도포하였다. 상피통과 엑시머 레이저 절제를 APEX PLUSTM 엑시머 레이저(Summit Technology of Waltham, MA)를 이용하여 제1 그룹 마우스의 오른쪽 눈 상에 수행하였다(2 mm 광학부; 42 내지 44 ㎛ 절제 깊이, PTK 모드). 2 mm의 찰과상을 Alger 붓(Alger Equipment Company of Lago Vista, TX)을 이용하여 제2 그룹의 마우스의 오른쪽 눈 상에 생성하였다.
수술 후, 모든 동물은 진통제로서 부프레노핀(Reckit & Colman Pharmaceuticals, Richmond, VA로부터 입수 가능한 BUPRENEXTM, 0.3 mg/㎖의 0.2 ㎖)의 근육 내 주사를 받았다. 항생제 연고(Pharmaderm, Melville, NY로부터 입수 가능한 VETROPOLYCINTM)를 도포하였고, 16 내지 18시간 동안 각막이 부분적으로 생 체 내 치유되도록 하였다. 치유 기간의 종료시, 동물을 상기 기술한 바와 같이 마취하였고, 경추 탈골에 의해 희생시켰다. 그리고 나서 파라핀 왁스 내에 매립하기 전에 눈을 2시간 동안 포르말린 내에서 고정하였다. 조직 절편(5 ㎛ 두께)을 안구 축에 평행한 위치에서 절단하였다. 절편을 자일린으로의 처리에 의해 탈파라핀화하였고, 등급화(graded) 에탄올 용액 (100%, 70%, 및 30%)으로 재수화하였다. 면역염색을 위해, 조직 절편을 내인성 과산화효소 활성 및 비특이적 결합, 각각을 차단하기 위해 3% H2O2(37℃, 10 분) 및 2.5% 정상 산양 혈청으로 순차적으로 배양하였다. 후속적으로 절편을 mAb M3/38(비희석된 하이브리도마 유체, 1시간), 1시간 동안 바이오틴(biotin)화 항-랫트 IgG(1:200, Vector Labs, Burlingame, CA), 20시간 동안 아비딘 D 및 바이오틴과산화효소의 새롭게 제조된 복합체(Vector Labs) 및 다이아미노벤지딘(DAB) - H2O2 시약(Kirkegaard & Perry Labs, Gaithersburg, MD)으로 배양하였다. 음성 대조군을 위해, 절편을 무관계성 mAb 또는 배지만으로 처리하였다.
도 9에 도시한 바와 같이, 정상(도 9 A 및 B) 및 치유(도 9 C 및 D) 각막의 파라핀 절편의 면역조직화학적 염색은 각막 상처 치유의 두 모델 모두에서, 정상 상피와 비교할 때 이동성 상피의 리딩 에지가 mAb M3/38로 더 강하게 염색되었음을 나타내었고, 기저 및 중간 세포 층 내에서 특히 그러하다. 치유 뿐만 아니라 정상 각막 상피 모두에서, 면역염색은 세포-매트릭스 부착의 부위에서 더 강했다. 정상 각막의 간질 세포는 mAb M3/38과 반응하지 않았지만, 치유 각막 아래 전방 간질 내 세포는 갈렉틴-3을 강하게 발현시키고, 특히 이동성 상피 아래 영역 내에서 그러하 다.
비필수 아미노산, L-글루타민, 항생제 및 0.4% 우 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 무혈청 이글(Eagle) 최소 필수 배지 내에서 16 내지 18시간 동안 기관 배양에서 치유되도록 두는 경우 각막 상피 내 갈렉틴-3 면역반응력은 유사하였다. 그러나, 생체 외에서 치유되도록 하였던 각막의 전방 간질은 갈렉틴-3을 발현하는 세포가 부족하고, 이는 생체 내에서 치유되도록 하였던 각막의 간질에서 발견되는 갈렉틴-3 양성 세포가 거의 백혈구이고 각막세포가 아님을 암시한다.
갈렉틴-3의 탄수화물 인식 도메인이 손상 후 각막 상피 시트 이동에서 역할을 수행하는지 여부를 결정하기 위해, 2 mm 엑시머 레이저 및 찰과상을 갖는 각막을 이당류 β-락토오스 및 수크로즈의 존재 및 비존재로 기관 배양 내에서 치유되도록 하였다. β-락토오스는 갈락토오스를 함유하고 갈렉틴을 결합하지만, 수크로즈는 갈락토오스가 부족하고 갈렉틴을 결합하지 않는다. 이 실험에서, 각막 상처의 재상피화의 속도는 β-락토오스의 존재 하에서 상당히 느렸지만, 수크로즈는 영향을 미치지 않는다. 도 10에서 도시한 바와 같이, 상이한 그룹(2 이상의 실험의 평균 ± SEM) 중에서 mm2/h로서 표현된 치유 속도는 다음과 같았다: 배지 단독, 0.088 ± 0.003 (N=29); 배지 + β-락토오스, 0.063 ± 0.003 (N=19); 배지 + 수크로즈 0.084 ± 0.004 (N=1O).
실시예 2 - 야생형 및 갈렉틴 -3 결핍 마우스의 각막 상피 상처 봉합
각막 상처의 재상피화가 갈렉틴-3 결핍 마우스 내에서 손상되는지 여부를 결 정하기 위해, 각막 상처 치유의 4개의 상이한 모델을 이용하였다. 갈렉틴-3 결핍 마우스(gal-3-/-)를 문헌 [Hsu et al., Am. J. Pathol. 156:1073, 2000]에서 기술된 바와 같이 갈렉틴-3 유전자의 표적화 방해로 발생시켰다. 구체적으로, CRD에 대해 코딩하는 영역을 네오마이신 저항 유전자로 방해하였다. 이는 0.5 kb 인트론 4-엑손 5 분절을 항생제 저항 유전자(네오)로 치환하는 것을 포함한다. 갈렉틴-3 유전자가 비활성화된 서던 블럿 뿐만 아니라 웨스턴 블럿 분석함으로써 확인하였다.
간단하게는, 엑시머 레이저 절제(실시예 1에서 기술) 또는 알칼리-화상 상처를 갖는 각막을 생체 내 또는 시험관 내에서 부분적으로 치유하도록 하였다(실시예 1에서 기술). 알칼리 손상의 경우, 2 mm 여과 디스크(Whatman 50, Whatman International, Maidstone, UK)를 원형절제기를 이용하여 제조하였고, 0.5 N NaOH 내에 침지하고, 30초 동안 제2 그룹의 마우스의 오른쪽 눈의 각막 표면상에 두었다. 그리고 나서 과량의 PBS로 눈을 린스하였다. 치유 기간의 종료시, 상처 면적을 메틸렌 블루로 염색함으로써 가시화시켰다. 염색된 상처를 표준 거리에서 사진 촬영하고, 상처 면적의 외곽선을 염색된 상처의 투시된 이미지로부터 종이 위에 그렸다. 이 외곽선을 SIGMASCANTM 소프트웨아(SPSS Science of Chicago, IL)을 이용하여 디지털화하고 정량화하였다. 상처 치유의 상이한 모델의 gal-3+/+ 마우스의 상처 봉합 속도의 분석은 gal-3+/+ 마우스에서 ㎟/h로서 표현되는 상처 봉합 속도가 알칼리-화상으로 손상된 것과 비교할 때 엑시머 레이저로 손상된 각막에서 더 느림을 밝 혔다. 또한, 이용된 손상 방법에 관계없이, 상처 봉합 속도는 기관 배양의 것과 비교할 때 생체 내 치유되도록 한 각막에서 더 빨랐다. 도 11에서 도시한 바와 같이, gal-3+/+ 그룹 중 상처 봉합 속도는 다음과 같았다: 엑시머 레이저/시험관 내 그룹의 경우 0.076 ± 0.003 ㎟/h, 엑시머 레이저/생체 외 그룹의 경우 0.050 ± 0.003 ㎟/h, 알칼리-화상/생체 내 그룹의 경우 0.182 ± 0.003 ㎟/h, 및 알칼리-화상/시험관 내 그룹의 경우 0.106 ± 0.005 ㎟/h. 각 그룹은 2개 이상의 실험의 평균 ± SEM(각 그룹 내 N=9 이상)을 나타낸다. gal-3-/- 그룹과 gal-3+/+ 그룹의 상처 봉합 속도의 비교는 각막이 엑시머 레이저 또는 알칼리 처리에 의해 손상되었는지 여부 및 각막이 생체 내 또는 시험관 내에서 치유되도록 하였는지 여부와 관계없이, ㎟/h로 표현되는 각막 상피 상처 봉합 속도가 gal-3+/+ 마우스의 것과 비교할 때 gal-3-/- 마우스에서 상당히 느림을 밝혔다. 상이한 gal-3-/- 그룹의 상처 봉합 속도는 엑시머 레이저/시험관 내 그룹의 경우 0.060 ± 0.004 ㎟/h, 엑시머 레이저/생체 외 그룹의 경우 0.036 ± 0.005 ㎟/h, 알칼리-화상/생체 내 그룹의 경우 0.150 ± 0.008 ㎟, 및 알칼리-화상/시험관 내 그룹의 경우 0.081 ± 0.004 ㎟/h였다. 또, 모든 값은 2개 이상의 실험의 평균 ± SEM(각 그룹에서 N=8 이상)이다.
실시예 3 - 손상 후 갈렉틴 -3 결핍 마우스의 이동성 각막 상피에서의 유전자 발현 패턴
각막 상피 상처의 재상피화가 gal-3-/- 마우스 내에서 불안한 이유를 이해하 고자 하는 시도에서, 치유 gal-3+/+ 및 gal-3-/- 각막의 유전자 발현 패턴을 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 비교하였고, 결과를 반정량 RT-PCR에 의해 더 확인하였다.
상피통과 엑시머 레이저 절제(2 mm 직경)를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 30 gal+/+ 및 30 gal-/- 마우스의 오른쪽 눈 위에 생성하였다. 각막이 20 내지 24시간 동안 생체 내에서 부분적으로 치유되도록 하였다. 치유 기간의 종료시, 동물을 희생시켰고, 각막을 절개하였고, 즉시 액체 질소 내에 위치시켰고, SMARTTM cDNA 기술을 이용하는 유전자 발현의 분석을 위해 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA로 배송하였다. 간단하게는, 전체 RNA는 ATLASTM Pure Total RNA Labeling System에서 제공된 시약을 이용하여 단리하였다. 30 gal-3+/+ 및 30 gal-3-/- 각막으로부터의 RNA의 수율은 각각 3.5 ㎍ 및 2.6 ㎍였다. gal-3+/+ 및 gal-3-/- 마우스의 각막의 RNA 제제의 A260:A280 비는 각각 1.48 및 1.37이었다. 리보솜 RNA 28S:18S 비는 두 제제 모두에 대해 1.8이었다. 이는 RNA 제제의 양이 만족스러움을 보장하였다. 프로브 제조를 위해, 최초 가닥 cDNA는 RNA, 개질 올리고(dT) 프라이머(CDS 프라이머), POWERSCRIPTTM 역전사효소, 및 SMARTTM II 올리고뉴클레오티드의 175 ng을 이용하여 합성하였다. 대조군은 역전사효소가 없는 시료의 배양을 포함하였다. cDNA를 장거리(LD)-PCR에 의해 증폭하였다. 증폭 주기의 최적의 수를 결정하기 위해, 반응 생 성물의 분취량을 15, 18, 21 및 24 주기에서 채취하였고, 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 최적의 주기 수, 즉, 23을 이용하는 증폭된 이중 가닥 cDNA의 수율이 1 내지 1.6 ㎍였다. 증폭된 cDNA(500 ng)를 ATLASTM 마이크로어레이(Clontech)를 위한 SMARTTM cDNA 프로브 합성에 대한 설명서에 기술된 바와 같이 Klenow 효소 및 33P-αATP를 이용하여 방사성 표지하였다. 표지한 프로브를 NUCLEOSPINTM 여과기에서 여과함으로써 정제하였고, 마우스 1.2k-I ATLASTM 나일론 cDNA 마이크로어레이(Clontech)에 혼성화하였다. 이는 ~1200개의 마우스 유전자로 이루어지는 광폭 스펙트럼어레이이다. 혼성화 후, 막을 포스포이미저(phosphorimager) 스크린에 노출하였고, 결과는 ATLAS IMAGETM 2.0 소프트웨어(Clontech)에 의해 분석되었다. 데이터는 반정량 RT-PCR에 의해 증명하였다.
RT-PCR을 위해, 전체 RNA 및 최초 가닥 cDNA을 이미 기술한 과정을 이용하여 치유 gals+/+ 및 gal-3-/- 각막으로부터 제조하였다. PCR 증폭을 cDNA 14 ng, Clontech로부터 구입한 유전자-특이적 관용 프라이머 및 ADVANTAGETM 2 PCR 키트(Clontech)의 다른 시약을 이용하여 50 ㎕ 부피로 수행하였다. 이용된 어닐링 온도는 68℃였고, 반응을 다양한 주기 수의 PCR 증폭으로 처리하였다. 관리 유전자의 분석을 위해, 증폭된 생성물의 5 ㎕ 분취량을 5주기마다 채취하였지만(18주기에서 시작), 상이하게 발현되는 유전자의 분석을 위해, 반응 증폭된 생성물을 2주기마다 채취한다(28번째 주기에서 시작). 다양한 주기에서 채취된 증폭된 생성물을 1.5% 아가로스/브롬화 에티디움 겔 내에서 전기 영동에 의해 분석하였다(도 12).
이 실험은 gal-3+/+ 마우스의 치유 각막과 비교할 때, gal-3-/- 마우스의 치유 각막이 갈렉틴-7, 다른 갈락토오스-결합 단백질, 및 톨로이드-유사 단백질 (TLL), 금속단백분해효소에 대한 mRNA 전사의 현저히 감소된 수준을 함유하는 것을 보여주었다. 전체적으로, 치유 gal-3+/+ 각막과 비교할 때, 치유 gal-3-/- 각막은 약 12배 적은 갈렉틴-7(도 12) 및 14배 적은 TL1 유전자 전사(데이터는 미도시)를 함유하였다. 다양한 관리 유전자의 mRNA 전사의 발현 수준은 마이크로어레이 기술(도 12), 및 반정량적 RT-PCR(도 12, GAPDH는 D-글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소이고; RPS29는 리보솜 단백질 S29이고; ODC는 오르니틴 탈카복실화제임)에 의해 검출된 바와 같이 치유 gal-3+/+ 및 gal-3-/- 모두에서 유사하였다.
갈렉틴-7 단백질의 발현 수준이 gal-3-/- 마우스의 치유 각막에서도 감소되는 지 여부를 결정하기 위해, 치유 gal-3+/+ 및 gal-3-/- 각막의 세제(detergent) 추출물을 이용하는 웨스턴 블럿 분석(도 13A) 및 gal-3+/+ 및 gal-3-/- 마우스의 각막으로부터 유래한 파라핀 절편을 이용하는 항-갈렉틴-7 다클론 항체로의 면역조직화학적 연구(도 13B)를 수행하였다. 면역반응력은 강함(+++), 중간(++), 약함(+) 또는 음성 (-)으로서 등급이 매겨졌다. 상당히 적은 갈렉틴-7 면역반응력을 치유 gal-3+/+ 각막의 것과 비교하여 치유 gal-3-/- 각막의 이동성 상피에서 검출하였다: gal-3+/+:+++ 36/42, ++ 5/42; + 이하 1/42; gal-3-/-:+++ 3/42, ++ 26/42, + 이하 13/42. 또한, 세포 배양에서 성장한 gal-3-/- 마우스 배아 섬유모세포(MEF)는 gal-3+/+ MEF 배양과 비교할 때 감소된 수준의 갈렉틴-7을 발현시켰다(도 13C).
실시예 4 - 외인성 갈렉틴 -3은 야생형 및 갈렉틴 -3 결핍 마우스의 각막 상처의 재상피화를 자극
각막 상피 상처 봉합 속도가 gal-3-/- 마우스에서 요동한다는 것을 증명한 뒤에(실시예 2), 외인성 갈렉틴-3이 기관 배양에서 치유성 각막의 재상피화를 자극할지 여부를 결정하는 것이 관심의 대상이었다. 이 연구에서, 각막알칼리-화상 상처를 갖는 gal-3+/+ 및 gal-3-/- 마우스의 각막을 다양한 양의 재조합 갈렉틴-3의 존재 및 비존재에서 무혈청 배지 내에서 배양하였다.
재조합 전장 인간 갈렉틴-3을 대장균(Escherichia coli)에서 생성하였고, 기존에 기술한 바와 같이 정제하였다(Yang et al., Biochemistry 37:4086, 1998). 알칼리-화상 상처(2 mm 직경)를 실시예 2에서 기술한 바와 같이 알칼리-침지 필터 디스크를 이용하여 마취된 마우스의 양쪽 눈 상에 생성하였다. 손상 후, 동물을 희생시켰고, 눈을 절개하였고, 외인성 갈렉틴-3의 존재 또는 비존재로 18 내지 20시간 동안 배양하였다. 동물의 왼쪽 눈은 대조군으로서 작용하였고, 무혈청 배지 만에서 배양하였다. 오른쪽 눈을 다음을 포함하는 다양한 테스트 시약을 함유하는 무혈청 배지 내에서 배양하였다: (i) 갈렉틴-3(5 내지 20 ㎍/㎖), (ii) 갈렉틴-3(10 ㎍/㎖) + 0.1 M β-락토오스, (iii) 갈렉틴-3(10 ㎍/㎖) + 0.1 M 수크로즈, (iv) 0.1 M β-락토오스, 또는 (v) 0.1 M 수크로즈. 치유 기간의 종료시, 남아있는 상처 면적을 염색하였고, 사진 촬영하고, SIGMASCANTM 소프트웨어(SPSS Science, Chicago, IL)를 이용하여 실시예 2에서 기술한 바와 같이 정량화하였다. 각 그룹은 최소한 3개의 눈을 함유하였고 모든 실험을 두 번 이상 수행하였다.
외인성 갈렉틴-3은 gal-3-/- 마우스에서 각막 상처의 재상피화의 속도에 영향이 없었으나(도 14A), 10 ㎍/㎖ 및 20 ㎍/㎖ 농도(0 및 5 ㎍/㎖: 0.090 ± 0.010 ㎟/h; 10 ㎍/㎖: 0.129 ± 0.010 ㎟/h; 20 ㎍/㎖: 0.154 ± 0.004 ㎟/h; 2개 이상의 실험의 평균 ± SEM, N=7 이상)에서 gal-3+/+ 마우스 내에서 농도-의존 방식으로 상처 봉합의 속도를 자극하였다. 도 15에 도시한 바와 같이, gal-3+/+ 마우스 내 각막 상피 상처 봉합 시 갈렉틴-3의 자극 효과는 수크로즈가 아니라 β-락토오스에 의해 특이적으로 억제되었다(10 ㎍/㎖ 갈렉틴-3: 0.127 ± 0.010 ㎟/h; 10 ㎍/㎖ 갈렉틴-3 + 0.1 M β-락토오스: 0.103 ± 0.014 ㎟/h; 10 ㎍/㎖ 갈렉틴-3 + 0.1 M 수크로즈: 0.130 ± 0.003 ㎟/h. 모든 수치는 2개 이상의 실험의 평균 ± SEM, N=7 이상으로 나타낸다).
실시예 5 - 외인성 갈렉틴 -7은 야생형 및 갈렉틴 -3 결핍 마우스에서 각막 상처의 재상피화를 자극
별개의 연구에서, cDNA 마이크로어레이를 이용하는 gal-3+/+ 마우스의 정상 및 치유 각막의 유전자 발현 패턴의 비교(즉, 실시예 3에서와 같이)는 치유 각막 내에서, 갈렉틴-7의 발현이 두드러지게 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. gal-3-/- 마우스의 치유 각막에서 갈렉틴-7 발현이 하향 조절된다는 것을 보여 주는 실시예 3에서 기술된 연구와 함께, 이 발견은 외인성 갈렉틴-7이 기관 배양에서 치유 각막의 재상피화를 자극하는 지 여부를 결정하는 실험의 설계를 유도한다. 이 연구에서, 알칼리-화상 상처를 갖는 gal-3-/- 마우스의 각막을 재조합 갈렉틴-7의 다양한 양의 존재 및 비존재로 무혈청 배지 내에서 배양하였다.
재조합 전장 인간 갈렉틴-7을 대장균 내에서 cDNA(American Type Culture Collection, Manassas, VA로부터 EST 클론으로서 입수 가능)를 pET25b 플라스미드(Novagen, Madison, WI로부터 입수가능) 내로 클로닝함으로써 생산하였다. 알칼리-화상 상처(2 mm 직경)을 실시예 2에서 기술한 바와 같이 알칼리-침지 필터 여과 디스크를 이용하여 마취된 동물의 양쪽 눈 상에 생성하였다. 손상 후, 동물을 희생시켰고, 눈을 절개하였고, 18 내지 20시간 동안 외인성 갈렉틴-7의 존재 또는 비존재로 배양하였다. 동물의 왼쪽 눈은 대조군으로서 작용하고, 무혈청 배지만에서 배양하였다. 오른쪽 눈을 다음의 다양한 테스트 시약을 함유하는 무혈청 배지 내에서 배양하였다: (i) 갈렉틴-7(20 ㎍/㎖), (ii) 갈렉틴-7(20 ㎍/㎖) + 0.1 M β-락토오스, 또는 (iii) 갈렉틴-7(20 ㎍/㎖) + 0.1 M 수크로즈. 치유 기간의 종료시, 남아있는 상처 면적을 염색하였고, 사진 촬영하고, 실시예 2에서 기술한 바와 같이 SIGMASCANTM 소프트웨어(SPSS Science, Chicago, IL)를 이용하여 정량화하였다. 각 그룹은 최소한 6개의 눈을 함유하였고 모든 실험을 두 번 이상 수행하였다.
도 16에 도시한 바와 같이, 외인성 갈렉틴-7은 상처 봉합의 속도를 자극하였다(배지 단독: 0.036 ± 0.006 ㎟/h; 20 ㎍/㎖ 갈렉틴-7: 0.072 ± 0.004 ㎟/h; 2개 이상의 실험의 평균 ± SEM, N=1O 이상). 도 16에 도시한 바와 같이, 각막 상피 상처 봉합에 대한 갈렉틴-7의 자극 효과는 수크로즈가 아니라 β-락토오스에 의해 특이적으로 억제되었다(20 ㎍/㎖ 갈렉틴-7: 0.072 ± 0.004 ㎟/h; 20 ㎍/㎖ 갈렉틴-7 + 0.1 M β-락토오스: 0.050 ± 0.004 ㎟/h; 20 ㎍/㎖ 갈렉틴-7 + 0.1 M 수크로즈: 0.079 ± 0.007 ㎟/h. 모든 값은 2개 이상의 실험의 평균 ± SEM, N=9 이상을 나타낸다). 도 16에 도시한 바와 같이, 외인성 갈렉틴-7을 gal-3-/- 마우스 대신에 gal-3+/+ 마우스의 손상된 각막에 첨가하는 경우 상처 봉합의 속도가 더 향상된다(0.094 ± 0.003 gal-3+/+ ㎟/h).
실시예 6 - 야생형 및 갈렉틴 -3 결핍 마우스의 피부 상피 상처 봉합
Gal-3+/+ 및 gal-3-/- 마우스를 1.25% 아베르틴(0.2 ㎖/10 g 몸무게)의 복강내 주사로 마취한다. 레이저 치료 전, 면도칼을 이용하여 등쪽 영역으로부터 털을 제거한다. 6 밀리미터 경피 등쪽 피부 상처가 엑시머 레이저(Summit Technology of Waltham, MA)를 이용하여 만들어진다. 수술 후, 항생제 연고를 상처 표면에 도포하고, 부프레노핀(2 mg/kg 몸무게)이 수술 후 고통을 최소화하기 위해 피하 제공된 다. 상처가 생체 내에서 부분적으로 치유되도록 하고, 수술 후 24, 48, 및 72시간 검사한다. 치유 기간의 종료시, 마우스를 다시 1.25% 아베르틴(0.2 ㎖/10 g 몸무게)을 복강내 주사로 마취하고, 상처 면적을 사진 촬영하고 시그마 스캔 소프트웨어를 이용하여 정량화한다. 2개 그룹의 동물(즉, gal-3+/+ 및 gal-3-/- 마우스) 사이의 상처 봉합 속도를 비교한다. 그리고 나서 동물을 이산화탄소 흡입 또는 펜토바르비탈의 과다복용에 의해 희생시킨다.
실시예 7 - 피부 상처의 재상피화에 대한 외인성 갈렉틴 -3의 효과
동물(마우스: 57BL/6 및 129 혼합된 유전적 배경; 수령: 6 내지 8 주; 성별: 혼성)을 1.25% Avertin(0.2 ㎖/ 10 g 몸무게)을 복강내 주사로 마취한다. 레이저 치료 전에, 면도칼을 이용하여 등쪽 영역으로부터 털을 제거한다. 두 개의 6 mm 경피 등쪽 피부 상처(한 쪽에 1개씩)가 엑시머 레이저(Summit Technology of Waltham, MA)를 이용하여 만들어진다. 수술 후, 항생제 연고를 상처 표면에 도포하고, 부프레노핀(2 mg/kg 몸무게)이 수술 후 고통을 최소화하기 위해 피하 제공된다. 그리고 나서 상처가 생체 내에서 부분적으로 치유되도록 한다. 4-6 시간마다, 갈렉틴-3을 함유하는 연고를 오른쪽 상처에 도포하고, 대조군으로서 작용하는 것으로 담체 만을 왼쪽 상처에 도포한다. 치유 기간(24 내지 48시간)의 종료시, 1.25% 아베르틴(0.2 ㎖/10 g 몸무게)을 복강내 주사로 동물을 마취하고, 상처 면적을 사진 촬영하고, 시그마 스캔 소프트웨어를 이용하여 정량화한다. 두 동물 그룹(갈렉틴-3 처리군 및 대조군) 사이의 상처 봉합 속도를 비교한다. 그리고 나서 동물을 이산화탄소 흡입 또는 펜토바르비탈의 과다복용에 의해 희생시킨다.
실시예 8 - 피부 상처의 재상피화에 대한 외인성 갈렉틴 -7의 효과
동물(마우스: 57BL/6 및 129 혼합된 유전적 배경; 나이: 6 내지 8 주; 성별: 혼성)을 1.25% 아베르틴(0.2 ㎖/10 g 몸무게)의 복강내 주사로 마취한다. 레이저 치료 전에, 면도칼을 이용하여 등쪽 영역으로부터 털을 제거한다. 두 개의 6 mm 경피 등쪽 피부 상처(한쪽에 1개씩)가 엑시머 레이저(Summit Technology of Waltham, MA)를 이용하여 만들어진다. 수술 후, 항생제 연고를 상처 표면에 도포하고, 부프레노핀(2 mg/kg 몸무게)이 수술 후 고통을 최소화하기 위해 피하 제공된다. 그리고 나서 상처를 생체 내에서 부분적으로 치유되도록 둔다. 4-6시간마다, 갈렉틴-7을 함유하는 연고를 오른쪽 상처에 도포하고, 대조군으로서 작용하는 것으로서 담체 만을 왼쪽 상처에 도포한다. 치유 기간(24 내지 48시간)의 종료시, 동물을 1.25% 아베르틴(0.2 ㎖/10 g 몸무게)을 복강내 주사로 마취하고, 상처 면적을 사진 촬영하고, 시그마 스캔 소프트웨어를 이용하여 정량화한다. 두 동물 그룹(갈렉틴-7 처리군 및 대조군) 사이의 상처 봉합 속도를 비교한다. 그리고 나서 동물을 이산화탄소 흡입 또는 펜토바르비탈의 과다복용에 의해 희생시켰다.
실시예 9 - 알비노 토끼의 건성 안에 대한 외인성 갈렉틴 -8 또는 갈렉틴 -1의 효과
동물(토끼: 알비노; 수령: 6 내지 8주; 성별: 혼성)을 1.25% 아베르틴(0.2 ㎖/10 g 몸무게)의 복강내 주사로 마취하였다. 각 토끼는 1.0% 황산 아트로핀 (문헌 [Burgalassi, S., et ah, Ophthalm Res 31: 229-235, 1997])의 매일 반복되는 점적주입에 의해 건성 안을 가지도록 유발한다. 각 동물의 건성 안 질병의 평가는 셔머 I 테스트 및 형광물질 염색 후 각막 검사에 의해 평가되었다.
4-6 시간마다, 갈렉틴-8의 용액을 함유하는 점안제를 각 동물의 오른쪽 눈에 도포하고, 그리고 대조군으로서 작용하는 담체만을 왼쪽 눈에 도포한다. 치유 기간(24 내지 48시간)의 종료시, 동물을 1.25% 아베르틴(0.2 ㎖/10 g 몸무게)의 복강내 주사로 마취하고, 눈 주위를 사진 촬영하고, 시그마 스캔 소프트웨어를 이용하여 정량화한다. 눈의 표면 및 건성 안의 증상을 2개의 그룹의 눈(갈렉틴-8 처리한 오른쪽 눈 및 대조군 왼쪽 눈) 사이에서 평가하고, 이들 표면을 비교한다. 그리고 나서 동물을 이산화탄소 흡입 또는 펜토바르비탈의 과다복용에 의해 희생시키고, 표준 독성학적 기준에 의해 분석하였다.
인간 및 다른 척추동물(도 20)의 다양한 갈렉틴-8 단백질(도 18 및 서열번호 4 및 5)의 아미노산 서열은 실질적으로 동일하고, 특히 다른 포유류 종의 것이 그러하다. 유사하게 인간 및 다른 포유 동물의 다양한 갈렉틴-1 단백질(도 19 및 서열번호 6)의 아미노산 서열이 실질적으로 동일하다. 보존성 및 덜 보존적 변경이 관찰되는 위치는 건성 안 증후군 및 다른 안구 증상을 치료할 수 있는 다른 기능성 갈렉틴-8 및/또는 -1 단백질을 얻기 위해 잔기가 변할 수 있는 위치를 나타낸다.
실시예 10 - 스코폴라민 모델: DES 를 위한 갈렉틴 처리 및 스코폴라민 처리 전 갈렉틴 용액으로의 예비 처리의 효과
용액의 ㎖당 갈렉틴-1, 갈렉틴-3, 갈렉틴-7 및 갈렉틴-8 중 1 또는 2개의 0, 10 또는 20 ㎍를 함유하는 인공 눈물 용액을 이하 기술되는 치료 스케줄에 따라 투 여할 것이다. 각 동물의 한쪽 눈이 각 시점에서 10 ㎕ 방울 부피를 이용하여 처리된다. 스코폴라민 패치 모델 동물의 그룹에서, 갈렉틴 용액 10 ㎍/㎖를 한쪽 눈에 매일 4번씩 도포하였고, 스코폴라민 패치의 도포 후 즉시 시작한다. 각 마우스의 처리 그룹을 이용한다. 처리 그룹 및 눈은 무작위화 및 암호화하여 맹검(maslced) 방식으로 측정되었다. 각 동물의 한쪽 눈은 치료 용액을 받고, 그리고 다른 쪽은 대조군 점안제를 받는다. 측정을 각 시점에서 좌우 양측으로 수행한다.
실시예 11 - 스코폴라민 모델: β-락토오스, 갈렉틴 억제제와 투여된 갈렉틴 의 조합된 처리
갈렉틴의 효과가 경쟁적 이당류에 의해 억제될 수 있는지 여부를 측정하기 위해, 0.1 M β-락토오스와 조합한 갈렉틴 용액 1O㎍/㎖을 제외하고는 실시예 1과 동일한 과정을 수행하였다.
스코폴라민 모델을 위한 처리 스케줄
1일 - 기저라인 측정(눈물 생성, TBUT, 형광 염색) 스코폴라민 도포
2일 - 예비 처리 측정, 스코폴라민 도포 후 24시간(2일째, 시간 0)
측정 후 0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
1-2, 4-5, 8-9시간 사이에 송풍 후드 노출 처리
3일 - 시간 0에서 새로운 스코폴라민 패치 도포
0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
최초 처리 후 2시간에서 측정(3일, 시간 2시간)
1-2, 4-5, 8-9시간 사이에 송풍 후드 노출 처리
4일 - 측정(4일, 시간 0)
0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
1-2, 4-5, 8-9시간 사이에 송풍 후드 노출 처리
5일 - 시간 0에서 새로운 스코폴라민 패치 도포
0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
1-2, 4-5, 8-9시간 사이에 송풍 후드 노출 처리
6일 - 측정(6일, 시간 0)
실시예 12 - DES 에서 갈렉틴 - 1, -3, -7 및 -8의 역할: 마우스의 자가면역성 MRL/lpr 변종
처리 그룹 및 눈은 무작위화 및 암호화하여 맹검 방식으로 측정될 것이다. 각 동물의 한 눈은 처리 또는 대조군 점적약제를 받는다. 측정을 각 시점에서 좌우 양측으로 수행하였다.
처리 스케줄
1일 - 기저라인 측정(눈물 생성, TBUT, 형광물질 염색)
시간 0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
2일 - 0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
최초 처리 후 측정(2일, 시간 2시간)
3일 - 측정 (3일, 시간 0)
측정 후 시간 0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
4일 - 시간 0, 4, 8 및 12 시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
최초 처리 후 2시간에서 측정(4일, 시간 2시간)
5일 - 시간 0, 4, 8 및 12시간에서 갈렉틴 또는 대조군 처리
6일 - 측정(6일, 시간 0)
실시예 13 - 건성 안 증후군을 갖는 개체의 갈렉틴 -3에 의한 처리
건성 안 증후군에서 갈렉틴의 효과를 측정하기 위해, 각 그룹 내 5개 동물을 갖는 4개의 그룹의 마우스를 이용하는 인터루킨-1을 이용하는 동물 모델계를 사용하였고, 다음과 같이 처리하였다. 3개의 그룹에서, 쇼그렌 증후군의 랫트과 모델에 대해 확립된 표준 과정에 따라, 개체에 0일에 인터루킨-1(IL-1)을 주사하였다(문헌 [Zoukhri, D. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci 42(5): 925-932]). 대조군 개체는 주사를 받지 않고, 안 점적약제로서 추가 처리받지 않았다. IL-1 수령자는 1일부터 시작하여 갈렉틴-3을 함유하는 눈물 점적약제를 하루에 4번씩 75 ㎍/㎖ 또는 150 ㎍/㎖으로 투여함으로써 처리된다. 개체의 한 그룹은 하루에 4번씩 완충액만(갈렉틴 제외)으로 유사하게 투여되었다. 건성 안의 정도를 기술한 바와 같이 각 개체에서 형광물질 청소에 의해 평가하였다(문헌 [Zoukhri et al.]).
도 21은 1일까지의 처리 동안의 초기에서, 형광물질 청소에 의해 측정된 눈물 분비는 대조군 개체와 비교하여 갈렉틴-3 75 ㎍/㎖ 또는 150 ㎍/㎖으로 처리한 개체 내에서 개선되었고, 그리고 2일까지 증후군이 갈렉틴-처리 개체에서 전체적으로 치료되었음을 보여준다. 사실 2일에 다소 더 나은 눈물 청소가 75 ㎍/㎖의 더 적은 복용량에서 관찰되었고, 그리고 최적의 복용량은 이 양보다 더 적을 수 있다. 도 21에서 2일에 처리된 개체에 대한 막대 위 *는 이 데이터가 건성 안을 갖고 완 충액 운반체(vehicle)만을 투여한 대조군 개체의 데이터와 비교하여 p < 0.05의 수치에서 통계적으로 유의적임을 표시한다. 결론적으로, 갈렉틴-3은 건성 안을 치료할 수 있었고, 치료의 1 내지 2일 이내에 이 상태를 개선할 수 있었다. 포유 동물들 사이에서의 매우 높은 수준의 갈렉틴 동일성을 고려하면, 그리고 갈렉틴 패밀리의 상이한 구성원들 사이에서의 갈렉틴 기능적 및 특이적 아미노산 서열 공통 동일성의 존재를 고려하면, 갈렉틴-1, -3, -7 및 -8 중 임의의 것, 또는 이들 갈렉틴의 조합이 건성 안 및 관련 증후군을 치료하는 데 유사하게 효과적일 것으로 예상된다.
결론
본 명세서에서 갈렉틴-3 및 갈렉틴-7이 각막 상처의 재상피화에서 역할을 수행하는 것이 증명된다. 실시예 1에서, 면역조직화학적 연구는 손상 후, 갈렉틴-3이 각막 상피 세포-기질(matrix) 부착의 부위, 세포-기질 상호작용 그리고 그에 따른 세포 이동에 영향을 미치기 위한 이상적인 위치에서 고 밀도로 위치함을 보여주었다. 실시예 2에서, 각막 상처의 재상피화는 야생형 마우스의 것과 비교할 때 갈렉틴-3 결핍 마우스에서 상당히 느려지는 것을 보여주었다. 실시예 3에서, 손상 후, 갈렉틴-7의 발현 수준이 야생형 마우스와 비교할 때 갈렉틴-3 결핍 마우스에서 상당히 감소되는 것을 보여주었다. 실시예 4 및 5에서, 외인성 재조합 갈렉틴-3 및 갈렉틴-7이 gal3+/+ 마우스의 각막 상처의 재상피화를 자극하는 것으로 보여주었다. 실시예 6-8은 상처의 재상피화에 대한 갈렉틴의 효과를 측정하는 방법을 제공한다. 실시예 9-12는 건성 안 질병에 대한 갈렉틴의 효과를 측정하는 방법을 제공한다. 실시예 13은 갈렉틴-3에 의한 건성 안의 빠르고 효과적인 치료를 보여준다. 실시예 1에서 각막 상피 상처 봉합의 속도에 대한 갈렉틴-3의 자극 효과가 관련 갈락토사이드 화학 구조를 갖는 경쟁적 이당류(β-락토오스)에 의해 무효화되나, 무관계성 화학적으로 비관령성 이당류(수크로즈)에 의해서는 영향이 없음이 더 증명되었다. 이 결과는 탄수화물 인식 도메인(CRD)이 각막에 대한 외인성 갈렉틴의 유익한 효과에 직접적으로 관련됨을 보여준다.
갈렉틴-1, -3, -7 및 갈렉틴-8이 건성 안 증후군의 치료에 영향을 줄 수 있는 메커니즘에 관한 임의의 특정 이론에 구속됨 없이, 다음의 시사점들이 제시된다.
이미 언급한 바와 같이, 갈렉틴-3은 많은 ECM 및 섬유결합소, 라미닌, 및 인테그린의 특정한 이성구조와 같은 세포 표면 분자 내에서 발견되는 폴리락토스아민 쇄를 함유하는 상보성 당포합체에 결합함으로써 세포-세포 및 세포-기질 상호작용을 중재하는 것으로 생각된다(문헌 [Liu, Clin. Immunol. 97:79, 2000 and Perillo, supra]). 그러나, 외인성 갈렉틴-3이 gal3-/- 마우스의 상처의 재상피화를 가속화시키지 않는 것으로 본 명세서에서 제시한 발견(실시예 4 참조)은 세포내 갈렉틴-3이 가장 가능성이 높게는 특이적 세포 표면 및/또는 ECM 수용체의 발현에 영향을 미침으로써, 이는 다시 세포-기질 상호작용 및 세포 이동에 영향을 미침으로써, 상처 치유의 과정에 상당히 기여하는 것을 시사한다. 이 아이디어는 갈렉틴-3 을 거의 또는 전혀 발현하지 않는 모 세포주와 비교할 때 갈렉틴-3이 유방 암종 세포주 내에서 안정하게 과다발현되어, α4β7 및 α6βl 인테그린의 상승된 수준 및 라미닌, 섬유결합소, 및 비트로넥틴을 포함하는 다양한 ECM 분자로의 향상된 부착의 원인이 되었다는 간행된 연구와 일관성이 있다(문헌 [Warfield, supra and Mattarese, supra]). 또 다른 연구(문헌 [Dudas et al., Gastroenterology 118:1553, 2000])에서, 갈렉틴-3으로 형질 감염된 결장암 암종 세포주는 특이적 점액소, MUC2, 렉틴 그 자체의 주요 리간드의 증가된 수준을 발현하였다(Bresalier et al., Cancer Research 56:4354, 1996). gal3+/+ 마우스의 상처의 재상피화의 속도에 대한 외인성 갈렉틴-3의 자극 효과가 락토오스 억제 가능하다는 사실은 세포 내 갈렉틴-3이 사실 세표 표면으로서 작용하는 단백질 또는 렉틴 그 자체의 ECM 수용체의 글리코실화를 조절할 수 있다는 흥미로운 가능성을 상승시킨다. 세포내 갈렉틴-3이 복잡한 생물학적 과정에 영향을 미치는 핵 기질 상에 작용할 잠재력을 갖는 것은 특정한 조건 하에서, 렉틴이 핵에서 리보핵단백질 복합체와 연관된 것으로 발견될 수 있고, pre-mRNA 스플라이싱 인자로서 작용할 수 있다는 발견에 의해서도 시사된다(문헌 [Dagher et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 92:1213, 1995]). 또한, 문헌 [Wang et al.]은 전립선 선암 세포에서, 갈렉틴-3은 핵 기질과 연관되고, 단일 가닥 DNA 및 RNA 모두와 결합함을 증명하였다(문헌 [Wang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 217:292, 1995]).
마우스 cDNA 마이크로어레이를 이용하는 치유 gal3+/+ 및 gal3-/- 마우스의 각 막의 유전자 발현 패턴의 분석은 야생형 마우스의 것과 비교할 때 gal3-/- 마우스의 치유 각막이 현저하게 감소된 수준의 갈렉틴-7을 발현함을 보여주었다(실시예 3 및 5 참조). 갈렉틴-7은 1994년에 처음 보고되었고(문헌 [Barondes, supra]), 그리고 갈렉틴-3과 같이 잘 특성화되지는 않았다. 갈렉틴-3과는 다르게, 갈렉틴-7은 현저한 정도의 조직 특이성을 보여준다. 성체 동물에서, 이의 발현은 층화(stratified)되어 있거나 층화될 것으로 예정된 상피에 제한된다(문헌 [Timmons et al., supra]). 이 단백질은 세포-기질 및 세포-세포 상호작용 및 세포자멸사에 관련되는 것으로 생각된다(문헌 [Leonidas, Biochemistry 37:13930, 1998] 및 [Bernerd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11329, 1999]). 일반적으로, 역 상관관계가 갈렉틴-7 발현과 각질 증식 사이에 존재하고, 그리고 갈렉틴-7 발현은 SV40 형질 전환된 각질뿐만 아니라 표피 종양으로부터 유래된 세포주에서 무효화된다. 외인성 갈렉틴-3이 gal3-/- 각막의 상처의 재상피화를 자극하지 않고, 치유 gal3+/+ 각막이 갈렉틴-7의 감소된 수준을 함유한다는 본 명세서에서 기술된 발견은 갈렉틴-3이 적어도 부분적으로, 갈렉틴-7을 조정함으로써 상처의 재상피화에 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 사실, 갈렉틴-3과 다르게, 갈렉틴-7이 락토오스-억제 가능한 방식으로 gal3-/- 각막의 상처의 재상피화를 가속함이 발견되었다. 또한, gal3-/- 마우스의 마우스 배아 섬유모세포는 갈렉틴-7의 감소된 수준을 발현하였다.
관련된 메커니즘에 관계없이, 갈렉틴-3 및 갈렉틴-7 모두가 각막 상처의 재상피화를 자극한다는 발견은 상피 상처 및 특히, 비-치유 상피 상처의 치료에 대해 광범위한 함축 사항을 가지는 것이다. 현재, 각막의 지속적인 상피 결함의 치료는 주요한 임상적인 문제이다. 더욱이, 이식 후 상처, 노인의 만성적 상처, 욕창 궤양, 및 피부의 정맥 정체 궤양의 효과적인 치료에 대한 요구가 계속되고 있다. 세포 증식을 자극하는 것으로 공지된 다수의 성장 인자(예를 들어, EGF, TGF, FGF, KGF, HGF)가 각막에서의 유용성뿐 아니라 피부 상피 상처 치유에 대해 테스트되었지만 전체적으로 실망스러운 결과였다(문헌 [Eaglstein, Surg. Clin. North Am. 77:689, 1997]; [Singer and Clark, N. Engl. J. Med. 341:738, 1999]; [Zieske and Gipson, pp. 364-372 in "Principle and Practice of Ophthalmology" Ed. by D. M. Albert] 및 [F. A. Jakobiec, W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000]; [Schultz et al., Eye 8:184, 1994]; [Kandarakiset al., Am. J. Ophthalmol. 98:411, 1984]; 및 [Singh and Foster, Am. J. Ophthalmol. 103:802, 1987]). 상처의 재상피화의 가속의 정도는 현재 연구의 갈렉틴으로 관찰된 것보다 성장 인자를 이용하는 이들 연구의 대부분에서 훨씬 적었다. 또한, EGF와 같은 성장 인자로 처리한 각막의 상피는 과다증식성으로서(문헌 [Singh and Foster, Cornea 8:45, 1989]), 명백하게 비바람직한 상태이다. 이 점에 있어서, 갈렉틴-3 및 갈렉틴-7의 임상적 잠재성이 성장 인자의 것보다 더 매력적일 수 있고, 이는 렉틴은 상피 세포 내에서 세포 유사분열을 유도하는 것으로 나타나지 않았기 때문이다. 최근 몇십 년에 걸쳐서, 근시 교정을 위한 각막 프로파일을 수정하는 엑시머 레이저 각막절제술의 가능성이 실현되었다. 수천의 이러한 과정이 매주 수행되어 근시의 개인들에게 안경 및 콘택트 렌즈로부터 자유를 제공한다. 세계 성인 인구의 25-30%가 근시라는 사실의 관점에서, 미국에서만 거의 50만 번의 과정이 매년 수행될 것으로 추정되어 왔다. 몇몇의 경우에서는, 엑시머 레이저 수술 후, 상피 치유의 지연이 있다. 이러한 지연은 매우 바람직하지 않은데, 그 이유는 수술후 연무, 감염성 각막염 및 궤양화의 발달의 위험을 각막에 초래하기 때문이다. 또한, 갈렉틴-기반 치료는 이러한 경우에서 상처의 재상피화를 촉진하는 것을 도와줄 수 있다.
다른 구체예
본 발명의 다른 구체예는 명세서의 고찰 또는 본 명세서에서 개시된 발명의 실행으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 명세서 및 실시예는 오직 예로서 고려되어야 할 것이고, 발명의 진정한 범위는 다음의 청구범위에 의해 나타나는 것임을 의도한다.
SEQUENCE LISTING <110> Tufts University <120> Compositions and uses of a galectin for treatment of dry eye syndrome <130> 34724-051 <140> PCT application <141> April 13, 2006 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 250 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Asp Asn Phe Ser Leu His Asp Ala Leu Ser Gly Ser Gly Asn 1 5 10 15 Pro Asn Pro Gln Gly Trp Pro Gly Ala Trp Gly Asn Gln Pro Ala Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Tyr Pro Gly Ala Ser Tyr Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Gln 35 40 45 Ala Pro Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Gln Ala Pro Pro Gly Ala Tyr His 50 55 60 Gly Ala Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Ala Pro Ala Pro Gly Val Tyr Pro 65 70 75 80 Gly Pro Pro Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Pro Ser Ser Gly Gln Pro Ser 85 90 95 Ala Pro Gly Ala Tyr Pro Ala Thr Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gly 100 105 110 Pro Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro 115 120 125 Arg Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg 130 135 140 Ile Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn 145 150 155 160 Pro Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Cys Asn Thr Lys 165 170 175 Leu Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe 180 185 190 Glu Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His 195 200 205 Phe Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg 210 215 220 Val Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile 225 230 235 240 Asp Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile 245 250 <210> 2 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Asn Val Pro His Lys Ser Ser Leu Pro Glu Gly Ile Arg Pro 1 5 10 15 Gly Thr Val Leu Arg Ile Arg Gly Leu Val Pro Pro Asn Ala Ser Arg 20 25 30 Phe His Val Asn Leu Leu Cys Gly Glu Glu Gln Gly Ser Asp Ala Ala 35 40 45 Leu His Phe Asn Pro Arg Leu Asp Thr Ser Glu Val Val Phe Asn Ser 50 55 60 Lys Glu Gln Gly Ser Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gly Pro Gly Val Pro 65 70 75 80 Phe Gln Arg Gly Gln Pro Phe Glu Val Leu Ile Ile Ala Ser Asp Asp 85 90 95 Gly Phe Lys Ala Val Val Gly Asp Ala Gln Tyr His His Phe Arg His 100 105 110 Arg Leu Pro Leu Ala Arg Val Arg Leu Val Glu Val Gly Gly Asp Val 115 120 125 Gln Leu Asp Ser Val Arg Ile Phe 130 135 <210> 3 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Gly Leu Val Ala Leu Asn Leu Gly Leu Lys Pro Gly Lys Thr Leu 1 5 10 15 Thr Val Lys Gly Thr Val Ala Pro Lys Asn Ala Lys Arg Phe Ala Val 20 25 30 Asn Leu Gly Lys Gly Ser Lys Glu Glu Asn Asp Leu Val Leu His Phe 35 40 45 Asn Pro Arg Phe Asn Glu Ala His Gly Asp Gln Asn Thr Val Val Cys 50 55 60 Asn Ser Lys Glu Asn Gly Asp Asn Glu Trp Gly Thr Glu Gln Arg Glu 65 70 75 80 Ala Ala Phe Pro Phe Gln Ala Gly Gln Pro Phe Glu Ile Ser Ile Ser 85 90 95 Val Glu Glu Asp Lys Phe Lys Val Lys Val Asn Asp Gly His Glu Phe 100 105 110 Glu Phe Pro His Arg Leu Lys Leu Glu Ala Val Gln Tyr Leu Gly Ile 115 120 125 Lys Gly Asp Ile Lys Leu Thr Ser Ile Lys Phe 130 135 <210> 4 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Asn Pro Val 1 5 10 15 Ile Pro Phe Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu 20 25 30 Ile Val Ile Arg Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val 35 40 45 Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Met Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe 50 55 60 His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro 85 90 95 Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp 100 105 110 Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His 115 120 125 Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val 130 135 140 Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Leu Gln Ser Thr 145 150 155 160 Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Asn Val Pro 165 170 175 Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu Arg Leu Pro Phe Ala Ala Arg Leu Asn 180 185 190 Thr Pro Met Gly Pro Gly Arg Thr Val Val Val Lys Gly Glu Val Asn 195 200 205 Ala Asn Ala Lys Ser Phe Asn Val Asp Leu Leu Ala Gly Lys Ser Lys 210 215 220 Asp Ile Ala Leu His Leu Asn Pro Arg Leu Asn Ile Lys Ala Phe Val 225 230 235 240 Arg Asn Ser Phe Leu Gln Glu Ser Trp Gly Glu Glu Glu Arg Asn Ile 245 250 255 Thr Ser Phe Pro Phe Ser Pro Gly Met Tyr Phe Glu Met Ile Ile Tyr 260 265 270 Cys Asp Val Arg Glu Phe Lys Val Ala Val Asn Gly Val His Ser Leu 275 280 285 Glu Tyr Lys His Arg Phe Lys Glu Leu Ser Ser Ile Asp Thr Leu Glu 290 295 300 Ile Asn Gly Asp Ile His Leu Leu Glu Val Arg Ser Trp 305 310 315 <210> 5 <211> 359 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Met Leu Ser Leu Asn Asn Leu Gln Asn Ile Ile Tyr Ser Pro Val 1 5 10 15 Ile Pro Tyr Val Gly Thr Ile Pro Asp Gln Leu Asp Pro Gly Thr Leu 20 25 30 Ile Val Ile Cys Gly His Val Pro Ser Asp Ala Asp Arg Phe Gln Val 35 40 45 Asp Leu Gln Asn Gly Ser Ser Val Lys Pro Arg Ala Asp Val Ala Phe 50 55 60 His Phe Asn Pro Arg Phe Lys Arg Ala Gly Cys Ile Val Cys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Ile Asn Glu Lys Trp Gly Arg Glu Glu Ile Thr Tyr Asp Thr Pro 85 90 95 Phe Lys Arg Glu Lys Ser Phe Glu Ile Val Ile Met Val Leu Lys Asp 100 105 110 Lys Phe Gln Val Ala Val Asn Gly Lys His Thr Leu Leu Tyr Gly His 115 120 125 Arg Ile Gly Pro Glu Lys Ile Asp Thr Leu Gly Ile Tyr Gly Lys Val 130 135 140 Asn Ile His Ser Ile Gly Phe Ser Phe Ser Ser Asp Leu Gln Ser Thr 145 150 155 160 Gln Ala Ser Ser Leu Glu Leu Thr Glu Ile Ser Arg Glu Asn Val Pro 165 170 175 Lys Ser Gly Thr Pro Gln Leu Pro Ser Asn Arg Gly Gly Asp Ile Ser 180 185 190 Lys Ile Ala Pro Arg Thr Val Tyr Thr Lys Ser Lys Asp Ser Thr Val 195 200 205 Asn His Thr Leu Thr Cys Thr Lys Ile Pro Pro Thr Asn Tyr Val Ser 210 215 220 Lys Ile Leu Pro Phe Ala Ala Arg Leu Asn Thr Pro Met Gly Pro Gly 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Val Lys Gly Glu Val Asn Ala Asn Ala Lys Ser Phe 245 250 255 Asn Val Asp Leu Leu Ala Gly Lys Ser Lys His Ile Ala Leu His Leu 260 265 270 Asn Pro Arg Leu Asn Ile Lys Ala Phe Val Arg Asn Ser Phe Leu Gln 275 280 285 Glu Ser Trp Gly Glu Glu Glu Arg Asn Ile Thr Ser Phe Pro Phe Ser 290 295 300 Pro Gly Met Tyr Phe Glu Met Ile Ile Tyr Cys Asp Val Arg Glu Phe 305 310 315 320 Lys Val Ala Val Asn Gly Val His Ser Leu Glu Tyr Lys His Arg Phe 325 330 335 Lys Glu Leu Ser Ser Ile Asp Thr Leu Glu Ile Asn Gly Asp Ile His 340 345 350 Leu Leu Glu Val Arg Ser Trp 355 <210> 6 <211> 135 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Cys Gly Leu Val Ala Ser Asn Leu Asn Leu Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Cys Leu Arg Val Arg Gly Glu Val Ala Pro Asp Ala Lys Ser Phe Val 20 25 30 Leu Asn Leu Gly Lys Asp Ser Asn Asn Leu Cys Leu His Phe Asn Pro 35 40 45 Arg Phe Asn Ala His Gly Asp Ala Asn Thr Ile Val Cys Asn Ser Lys 50 55 60 Asp Gly Gly Ala Trp Gly Thr Glu Gln Arg Glu Ala Val Phe Pro Phe 65 70 75 80 Gln Pro Gly Ser Val Ala Glu Val Cys Ile Thr Phe Asp Gln Ala Asn 85 90 95 Leu Thr Val Lys Leu Pro Asp Gly Tyr Glu Phe Lys Phe Pro Asn Arg 100 105 110 Leu Asn Leu Glu Ala Ile Asn Tyr Met Ala Ala Asp Gly Asp Phe Lys 115 120 125 Ile Lys Cys Val Ala Phe Asp 130 135

Claims (57)

  1. 갈렉틴-3 단백질을 포함하는 건성 안 증후군의 치료 또는 예방용 약학 조성물로서, 상기 갈렉틴-3 단백질은 피험체의 각막 및 결막에 존재하는 점액소 또는 기타 당단백질에 결합하여 눈물 막을 효과적으로 안정화시키고 눈물 막의 확산을 촉진하는 것인 약학 조성물.
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  6. 제1항에 있어서, 건성 안이 지속성 증후군인 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 건성 안이 상피 미란을 초래하는 것인 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상피 미란이 각막 상처를 생성하는 것인 약학 조성물.
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  13. 제1항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질이 갈렉틴-3 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인 및 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인을 포함하는 것인 약학 조성물.
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  19. 제1항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  20. 제1항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열의 정렬된 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기의 충분하거나 최소한의 수를 포함하는 아미노산 서열을 포함하여 이들이 공통 구조적 도메인 및/또는 공통 기능 활성을 가질 수 있도록 하는 것인 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 것인 약학 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질이 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인을 포함하는 것인 약학 조성물.
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  27. 건성 안 증후군의 치료에 촉진 효과를 갖는 약학 조성물로서, 상기 조성물이 약학적으로 적합한 담체 또는 희석제와, 분비 점액소를 결막 및 각막의 표면상의 막관통 점액소(또는 기타 당단백질)에 결합시키고/결합시키거나 각막 표면 탄수화물-결합 단백질에 결합시킴으로써 눈물 막 동역학 및 균일성을 회복시키고 결막 및/또는 각막 상피의 완전성(integrity)을 촉진하고 눈물 막 확산을 촉진시키는 양의 갈렉틴-3 단백질을 포함하는 약학 조성물.
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  44. 제27항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질이 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인을 포함하는 약학 조성물.
  45. 제27항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질이 갈렉틴-3 N-말단 도메인 및 갈렉틴-3 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인을 포함하는 약학 조성물.
  46. 제27항에 있어서, 갈렉틴-3 단백질이 갈렉틴-3 프롤린, 글리신, 및 티로신-풍부 도메인 및 갈렉틴-3 갈락토사이드-결합 도메인을 포함하는 약학 조성물.
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