CN115444839A

CN115444839A - 伏立诺司他在制备治疗视网膜感光细胞退行性病变的药物中的应用

Info

Publication number: CN115444839A
Application number: CN202210912413.1A
Authority: CN
Inventors: 彭广华; 赵萌
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2022-07-30
Filing date: 2022-07-30
Publication date: 2022-12-09

Abstract

本发明涉及伏立诺司他在制备治疗视网膜感光细胞退行病变的药物中的应用，旨在解决对于遗传性视网膜感光细胞退行性疾病尚缺乏有效的治疗药物和方法的技术问题。基于典型性动物模型明确了视网膜感光细胞退行性变性的全过程，确认了视网膜感光细胞退行性变性过程中组蛋白H3K27ac水平出现显著性改变，组蛋白乙酰转移酶CBP/p300活性升高，组蛋白去乙酰化酶HDAC6表达升高；并基于视网膜感光细胞退行性病变过程中组蛋白乙酰化修饰的分子机制而设计和发掘精准治疗药物及方案：以SAHA特异性抑制组蛋白去乙酰化酶HDAC6的表达，提高H3K27ac乙酰化水平，促进Hdc基因的表达，Hdc的表达升高，视网膜感光细胞退行性病变的视网膜功能得到部分恢复。

Description

伏立诺司他在制备治疗视网膜感光细胞退行性病变的药物中的应用

技术领域

本发明涉及眼科药物技术领域，具体涉及一种伏立诺司他在制备治疗视网膜感光细胞退行性病变的药物中的应用。

背景技术

视网膜是视觉形成的重要组织之一，位于眼球壁最内层，主要由神经节细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、感光细胞、视网膜色素上皮细胞和胶质细胞等组成。这些细胞呈层级排列，由内到外分别分布于神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层、外核层、外节层和色素上皮层。视网膜感光细胞主要包括视杆细胞和视锥细胞，视杆细胞主要负责暗视，其主要光色素基础是Rhodopsin；视锥细胞主要负责明视其主要光色素基础是L-opsin、M-opsin和S-opsin，它们分别负责接收红光、绿光和蓝光。视网膜感光细胞接收到光信号之后会把光信号转换成化学信号传递给双极细胞，双极细胞再把化学信号转化成电信号传递给神经节细胞，神经节细胞最后把视觉信号传递给大脑中的视觉中枢形成视觉。

遗传性视网膜感光细胞退行性疾病主要由凋亡引起的视网膜感光细胞进行性死亡的眼部疾病，其包括静止性夜盲和进行性的视网膜感光细胞变性，其细胞学基础是首发视杆细胞死亡，继发视锥细胞死亡，最后视网膜色素上皮细胞变性。患者首先出现的症状是夜盲，随后是中心视力丧失，最终失明。遗传性视网膜感光细胞退行性疾病作为一种失明性疾病，严重影响着患者的生活质量；遗传性视网膜感光细胞退行性疾病的发病率约为1/4000。目前，临床上对于遗传性视网膜感光细胞退行性疾病，尚缺乏有效的治疗药物和方法。

公开于该背景技术部分的信息仅用于加深对本公开的背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本申请基于典型性动物模型（rd10小鼠）视网膜感光细胞退行性变性具体发病过程、视网膜感光细胞变性过程中组蛋白乙酰化修饰的改变及伏立诺司他干预组蛋白乙酰化对视网膜形态、功能和分子表达影响的研究，结果显示视网膜感光细胞退行性病变过程中组蛋白H3K27ac水平与正常组相比出现显著性改变，组蛋白乙酰转移酶CBP/p300活性升高，组蛋白去乙酰化酶HDAC6表达升高；进一步的研究发现，在视网膜感光细胞退行性变性过程启动前，给予伏立诺司他（Vorinostat，SAHA）治疗，可改善视网膜视觉功能和组织学形态，其机制在于 SAHA特异性抑制了组蛋白去乙酰化酶HDAC6的表达，提高了H3K27ac乙酰化水平，促进了Hdc基因的表达，结果表明组蛋白乙酰化可作为视网膜感光细胞退行性病变干预与治疗潜在的精确的表观遗传修饰的分子靶点。

根据本公开的一个方面，将伏立诺司他应用于制备治疗视网膜感光细胞退行性病变的药物中。

根据本公开的另一个方面，将伏立诺司他应用于制备上调Hdc基因表达的制剂中。

在本公开的一些实施例中，所述伏立诺司他的施用方式为：于视网膜感光细胞变性过程启动前注射45～55mg/kg（体重）。

在本公开的一些实施例中，由所述伏立诺司他或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体组成临床上可接受的药物或制剂。

在本公开的一些实施例中，所述载体为药学领域的常规稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香剂、甜味剂中的至少一种。

在本公开的一些实施例中，所述临床上可接受的制剂为片剂、粉剂、粒剂、胶囊、擦剂、滴眼液、眼膏、凝胶、口服液及注射用药中的任意一种。

本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下任一技术效果或优点：

1. 基于典型性动物模型明确了视网膜感光细胞退行性变性的全过程，确认了组蛋白乙酰化修饰在视网膜感光细胞退行性变性过程中的分子调控作用：视网膜感光细胞变性过程中组蛋白H3K27ac水平出现显著性改变，组蛋白乙酰转移酶CBP/p300活性升高，组蛋白去乙酰化酶HDAC6表达升高。

2. 基于视网膜感光细胞退行性病变过程中组蛋白乙酰化修饰的分子机制而设计和发掘了精准化治疗药物及方案：以SAHA特异性抑制组蛋白去乙酰化酶HDAC6的表达，提高H3K27ac乙酰化水平，促进Hdc基因的表达，Hdc的表达升高，视网膜感光细胞退行性病变的程度明显减轻，视网膜功能得到部分恢复。

附图说明

图1为本申请一实施例中 rd10和WT小鼠出生后不同时间点Dark-adapted 0.01ERG的b波变化：A为WT小鼠b波图；B为rd10小鼠b波图；C为WT小鼠和rd10小鼠b波的统计分析图。

图2为本申请一实施例中rd10和WT小鼠出生后不同时间点Dark-adapted 3.0 ERG的b波变化：A为WT小鼠b波图；B为rd10小鼠b波图；C为WT小鼠和rd10小鼠b波的统计分析图。

图3为本申请一实施例中rd10小鼠和WT小鼠出生后在不同时间点Light-adapted3.0 ERG的a波变化：A为WT小鼠a波图；B为rd10小鼠a波图；C为WT小鼠和rd10小鼠b波的统计分析图。

图4为本申请一实施例中WT小鼠出生后不同时间点视网膜HE染色切片图：A为视网膜组织全周图；B为视网膜各层组织的展示；C为WT小鼠视网膜全周图；D为WT小鼠出生不同时间点视网膜全周18点位外核层厚度与第18天对比统计分析图。

图5为本申请一实施例中rd10小鼠出生后不同时间点视网膜HE染色结果：A为rd10小鼠视网膜全周图；B为rd10小鼠在出生后不同时间点视网膜全周18点位外核层厚度与第18天相比统计分析图；C为WT小鼠与rd10小鼠视网膜外核层厚度在各个时间点的统计图。

图6为本申请一实施例中不同时间点WT与rd10小鼠视网膜厚度改变：A为WT小鼠与rd10小鼠出生不同时间点OCT检测视网膜厚度图；B为WT与rd10小鼠出生不同时间点视网膜总厚度统计柱状图。

图7为本申请一实施例中rd10小鼠不同时间点视网膜感光细胞凋亡过程：A为rd10小鼠不同时间点视网膜感光细胞TUNEL染色图，细胞核用蓝色荧光（DAPI）标记，反应凋亡细胞用绿色荧光标记，白色箭头表示凋亡细胞；B为rd10小鼠不同时间点视网膜感光细胞凋亡比例统计图。

图8为本申请一实施例中WT小鼠与rd10小鼠视网膜视紫红质蛋白的表达变化：A为WT小鼠与rd10小鼠出生不同时间点视网膜视紫红质(Rhodopsin,Rho)和内参GAPDH蛋白表达的Western Blot条带图；B为WT小鼠与rd10小鼠出生不同时间点视紫红质与内参蛋白GAPDH标准化后相对表达量的柱状图。

图9为本申请一实施例中 WT和rd10小鼠不同时间点视网膜切片GS免疫荧光染色结果：A为WT小鼠出生第18天GS染色；B为rd10小鼠出生第18天GS染色；C为WT出生第25天GS染色；D为rd10小鼠出生第25天GS染色；E为WT出生第32天GS染色；F为rd10小鼠出生第32天GS染色。

图10为本申请一实施例中WT和rd10小鼠出生后不同时间点在旷场中活动变化：A为WT小鼠和rd10小鼠在旷场区域活动的轨迹图与密度图；B为WT小鼠和rd10小鼠出生后不同时间点在旷场中央区域所占时间比例的统计柱状图；C为WT小鼠和rd10小鼠出生不同时间点在旷场总的活动距离的统计柱状图。

图11为本申请一实施例中WT和rd10小鼠不同时间点在黑白箱中活动变化规律：A为WT和rd10小鼠出生不同时间点在黑白箱区域活动的轨迹图与密度图；B为WT和rd10小鼠出生后不同时间点去白箱次数的统计柱状图；C为WT和rd10小鼠出生后不同时间点在白箱与黑箱所在时间比值的统计柱状图。

图12 为本申请一实施例中组蛋白H3赖氨酸位点乙酰化表达水平变化：A为H3K9ac、H3K18ac与H3K27ac表达水平的Western Blot灰度图；B为WT与rd10小鼠在不同时间的H3K9ac表达的统计柱状图；C为WT与rd10小鼠在不同时间点H3K18ac表达的统计柱状图；D为WT与rd10小鼠在不同时间点H3K27ac表达的统计柱状图，第25天两组差异*P<0.05；E为WT与rd10小鼠在不同时间点H3表达的统计柱状图。

图13为本申请一实施例中组蛋白去乙酰化酶与乙酰转移酶的蛋白表达变化：A为WT与rd10小鼠在不同时间点组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的蛋白表达水平的Western Blot灰度图；B为WT与rd10小鼠在不同时间点组蛋白乙酰转移酶p300和CBP的蛋白表达水平的Western Blot灰度图；C为HDAC1蛋白表达的统计柱状图；D为HDAC2蛋白表达的统计柱状图；E为HDAC3蛋白表达的统计柱状图；F为HDAC6蛋白表达的统计柱状图，第18天时，两组之间蛋白表达差异*P<0.05；G. CBP蛋白表达的统计柱状图，组内与第18天相比****P<0.0001；H. P300蛋白表达的统计柱状图，组内与第18天相比** P<0.01。

图14为本申请一实施例中免疫沉淀样品Western Blot检测H3K27ac目的条带的富集：A-1、A-2、A-3代表WT组的3个生物重复样本，B-1、B-2、B-3代表rd10组的3个生物学重复样本。

图15为本申请一实施例中各组样本的Reads在参考基因组上的分布柱状图。

图16为本申请一实施例中Reads在基因上下游的的分布图以及Reads在基因起始位点的分布图。

图17为本申请一实施例中各个样本间Input组与IP组相关性热图：WT和rd10小鼠两组各3个样本的IP组与Input组相关性程度。

图18为本申请一实施例中WT组与rd10组差异Peak的基本信息：A为两组差异Peak数量；B为两组差异Peak的长度；C为两组差异Peak注释后所在的基因区域（A组代表WT组，B组代表rd10组）。

图19为本申请一实施例中差异Peak富集分析：A为差异Peak注释到的基因的GO分析；B为差异Peak注释到的基因的KEGG分析图。

图20为本申请一实施例中各组样本之间的生物学重复相关性分析：A为Normal组即WT组与rd10组各3个生物学重复样本相关性热图；B为WT组与rd10组各3个生物学重复样本主成分分析聚类图。

图21为本申请一实施例中Normal组与rd10组差异基因的火山图和条目柱状图。A为差异表达基因的热图，B为上下调基因数量。

图22为本申请一实施例中ChIP-seq与RNA-seq差异基因关联分析四象限图：第一象限代表ChIP-seq和RNA-seq都高表达的基因，第二象限代表ChIP-seq低表达而RNA-seq高表达的基因，第三象限代表ChIP-seq和RNA-seq都低表达的基因，第四象限代表ChIP-seq高表达而RNA-seq低表达的基因。

图23为本申请一实施例中ChIP-seq与RNA-seq联合分析差异基因GO富集分析图：A为同时上调基因GO富集分析；B为同时下调基因GO富集分析。

图24为本申请一实施例中Wnt5b、C4b、Hdc、Syne2、Ppara、Casz1、Rgs9和Rgs20基因在两组小鼠视网膜中的表达：A为Wnt5b基因，t检验**P<0.01；B为C4b基因，t检验***P<0.001；C为Hdc基因，t检验**P<0.01；D为Syne2基因，t检验P>0.05；E为Ppara基因，t检验**P<0.01；F为Casz1基因，t检验P>0.05；G为Rgs9基因，t检验*P<0.05；H为Rgs20基因，t检验*P<0.05。

图25为本申请一实施例中H3K27ac与Hdc的直接结合：A. WT与rd10小鼠IP组与Input组H3K27ac在Hdc基因上的Peak分布；B. WT与rd10小鼠H3K27ac的ChIP-qPCR结果统计柱状图，首先以Input作为背景对各组Hdc进行处理，之后与IgG组进行比较。双因素方差分析对比组内IP组与IgG组基因表达量的差异以及组间Hdc表达量的差异，组内Hdc与IgG的差异****P<0.0001，组间Hdc表达差异#### P<0.0001。

图26为本申请一实施例中不同给药浓度和注射时间点SAHA干预治疗组与非治疗组视网膜形态对比：A. 25mg/kg浓度(体重)注射第14天到第29天，检测视网膜形态变化图；B为两组小鼠视网膜外核层厚度统计图（P>0.05）；C为50mg/kg(体重)注射第9天至第29天，视网膜形态变化图；D为两组小鼠视网膜外核层厚度统计图（P>0.05）；E为50mg/kg(体重)注射第14天到25天，视网膜形态变化图；F为两组组小鼠视网膜外核层厚度统计图（P>0.05）；G为50mg/kg(体重)第14天到第29天，视网膜形态变化图；H为rd组小鼠与rd+SAHA组小鼠视网膜外核层厚度统计图（P<0.0001）。

图27为本申请一实施例中SAHA干预治疗后视网膜感光细胞形态与视网膜厚度变化：A为rd10小鼠与SAHA干预治疗rd10小鼠视网膜HE染色全周图与视网膜组织切片图；B为两组视网膜全周图视神经左右两侧各9个点位视网膜外核层厚度统计图，两组之间各个点位比较利用非配对t检验；C为rd10小鼠与SAHA干预治疗小鼠视网膜 OCT厚度图；D为两组小鼠视网膜总厚度统计图（P<0.05）。

图28为本申请一实施例中SAHA治疗后视网膜视杆细胞功能改变：A为非治疗组rd10小鼠与SAHA干预治疗小鼠暗视0.01 ERG波形图；B为两组小鼠暗视3.0 ERG波形图；C为非治疗组rd10小鼠与SAHA干预治疗小鼠暗视0.01 ERG的b波振幅统计图（P<0.05）；D为两组小鼠暗视3.0 ERG的b波振幅统计图（P<0.05）。

图29为本申请一实施例中SAHA干预治疗后视网膜感光细胞凋亡改变：A为rd10小鼠与SAHA干预治疗小鼠TUNEL和DAPI荧光染色图；B为两组小鼠视网膜外核层TUNEL阳性细胞统计图（P<0.01）；C为两组小鼠视网膜Rhodopsin和Caspase3的Weatern Blot灰度图；D为两组小鼠视网膜Rhodopsin/GAPDH统计图（P<0.01）；E为两组小鼠视网膜Caspase3/GAPDH统计图（P<0.05）。

图30为本申请一实施例中rd10小鼠未治疗组与SAHA治疗组视网膜切片GS免疫荧光染色。

图31为本申请一实施例中SAHA干预治疗对rd10视网膜内组蛋白去乙酰化酶和组蛋白H3K27ac表达的影响：A为rd10小鼠与SAHA治疗小鼠HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC6和组蛋白H3K27a灰度图；B为两组小鼠视网膜HDAC1/GAPDH统计图（P>0.05）；C为两组小鼠视网膜HDAC2/GAPDH统计图（P>0.05）；D为两组小鼠视网膜HDAC3/GAPDH统计图（P>0.05）；E为两组小鼠视网膜HDAC6/GAPDH统计图（P<0.05）；F为两组小鼠视网膜H3K27ac/GAPDH统计图（P<0.01）。结果提示，SAHA通过特异性抑制组蛋白去乙酰化酶HDAC6的表达提高了组蛋白H3K27位点的乙酰化水平。

图32为本申请一实施例中SAHA干预治疗组H3K27ac与Hdc的直接结合：A为SAHA干预治疗组rd10小鼠与非治疗组视网膜内Hdc基因表达水平的统计图（P<0.01）；B为SAHA干预治疗组rd10小鼠视网膜内H3K27ac免疫沉淀Hdc基因与IgG的qPCR统计图（P<0.01）。

具体实施方式

以下实施例中所述涉及的主要实验材料及实验方法：

1. 实验动物

Pde6b^rd10基因突变小鼠（rd10）购自美国Jackson Laboratory，野生型（WT）小鼠C57BL/6J小鼠购自北京维通利华，饲养条件为SPF级标准动物房，温度20-24℃，湿度40-60%，保持明暗交替12/12h，食水充足。所有动物实验过程及动物处死方式经郑州大学生命科学动物伦理审查委员会批准（伦理号ZZUIRB2021-076），符合动物伦理要求，严格按照规定进行试验。

2. 视网膜电图（ERG）

眼电生理诊断系统RETI-scan21（德国罗兰电生理设备公司），具有检测不同类型动物的各类视网膜电图、视网膜相干断层扫描准确检测视网膜的厚度（OCT）、检测不同动物眼底病变的全方位的摄像和视网膜血管荧光造影检测视网膜血管性疾病的特征。

各组实验组小鼠提前6小时进行暗适应，异氟烷诱导麻醉后，小鼠双眼滴加复方托吡卡胺滴眼液进行散瞳。将针形电极按顺序插在小鼠尾巴根部和两侧面颊处并用胶布固定，将两个环形电极分别放置在小鼠角膜处，检查电极阻抗，待电极的阻抗小于5。观察小鼠生物波稳定之后，开始检测，按顺序：暗视0.1，暗视3.0，暗视Ops3.0，暗视10.0，明视3.0和明视3.0 fliker。

3. 视网膜组织石蜡切片制作和HE染色：

不同时间点实验组rd10小鼠和对照组C57BL/6J小鼠异氟烷气体麻醉后，取出眼球置放眼球固定液内48小时。将固定好的眼球沿着角膜巩膜缘剪掉角膜，除去晶体和虹膜。将视杯放入全自动脱水机中，依次经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸蜡，包埋、4μm厚切片、烤片、脱蜡、HE染色和中性树脂封片，显微镜下40倍镜中在距离视神经200μm处拍照，用仪器自带软件对视网膜外核层厚度进行测量。

4. 视网膜相干断层扫描（OCT）

待测小鼠异氟烷诱导麻醉，在小鼠结膜囊内点复方托吡卡胺滴眼液散瞳2-3分钟，进行OCT拍照保存，将视网膜分层，以视神经为中心，分别在上下左右四个方向选择距离视神经相同的位置进行图像处理，并测量视网膜总厚度。

5. Western Blot检测

实验组和对照组小鼠麻醉后取出眼球，快速获取视网膜，按照RIPA蛋白提取试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒提供的方法获得视网膜蛋白，检测实验组与对照组视网膜蛋白的浓度，将各样本均配置成相同浓度（1μg/μL），加热10分钟使蛋白变性。各样本蛋白样本加10μL（10μg）进行SDS-PAGE电泳、蛋白转膜、封闭、抗原抗体结合反应、ECL化学发光反应、曝光和储存拍照。

6. TUNEL染色

石蜡切片脱蜡，每个视网膜上滴加20μL不含DNase的蛋白酶K（20μg/mL），室温条件下孵育30min，用PBS洗3遍，每遍5min。将TdT酶和荧光标记液按1：9配制TUNEL工作液，在每个视网膜上滴加20μL，将处理过的石蜡切片放在保湿盒中，一起放入烘箱避光孵育60min，再用PBS洗3遍，每遍5min，每个视网膜组织切片滴加15μL DAPI进行染色，室温下避光孵育3min，PBS洗3遍，每遍5min，然后放纯水中浸泡10min，用滤纸吸取石蜡切片中的多余水分，每个视网膜组织滴加一滴抗荧光淬灭剂封片，在盖玻片四角滴指甲油固定，荧光显微镜下拍照。

7. 免疫荧光染色

视网膜组织石蜡切片脱蜡，将切片置于柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0）中，隔沸水加热20min进行抗原修复，冷却至室温，纯水洗2次，每次5min，PBS洗一次，免疫组化笔在视网膜组织周围划圈，每个视网膜组织滴加20μL山羊血清封闭液，室温孵育封闭45min，将一抗用封闭液按相应比例稀释，每个视网膜滴加20μL，4℃孵育过夜，从冰箱中取出，恢复至室温，PBS充分洗涤，5min×3次，滴加偶联荧光标记的二抗（1:2000）20μL，室温孵育45min，PBS充分洗涤，5min×3次，滴加10μL DAPI进行细胞核染色，室温孵育3min，PBS充分洗涤，5min×3次，纯水浸泡10min，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜下观察，拍照。

8. 小动物旷场视觉行为学检测：

采用动物旷场视觉行为学检测仪（加拿大CleverSys公司制造），为动物视觉行为学评估提供一种可靠有效的客观指标。

（1）将小鼠放在正常灯光下适应两个小时。

（2）提前2小时将小鼠放入操作间适应光线环境。

（3）然后点击上侧菜单栏里的摄像头，选择实时视频，确认。

（4）设置背景文件：调整旷场角度和光线，点击录制视频按钮，录制10秒左右后，暂停。

（5）设置观察区：进入观察区设置模式，选择多边形，对旷场的四个顶点进行标记，记下每个顶点的坐标标记，然后点击添加中心区块，创建基于正方形区域的一个中心区块。对旷场正方区域的一个边进行距离标定，选择左上角的顶点的坐标位置右键新建标定点1，选择右上角的顶点的坐标右键新建标定点2，然后右键设置距离，设置为40cm。

（6）设置动物检测与追踪：选择上方菜单栏的设置-动物监测与追踪设置，动物大小：最小10像素，最大6000像素；动物颜色：浅色背景中的深色动物；动物外观模型：低：0，高：120；动物每帧最大移动距离：720像素。

（7）设置事件规则与协议：选择上方菜单栏的设置-时间规则与协议设置。

（8）然后点击左侧菜单栏的另存为，设置第一只小鼠的视频名称，将分析前的对号选上，就可以点击视频按钮开始录制视频，将小鼠放在旷场中心区域，10分钟结束后，再另存第二只小鼠的视频，开始录制，直到所有小鼠检测完毕。

9. 小动物黑白箱视觉行为学检测：

采用小动物黑白箱视觉行为学检测仪（加拿大CleverSys公司），客观评估动物的视觉行为。

（1）提前2h将小鼠放入操作间适应光线环境。

（2）打开Topscan Version 3.0软件，根据黑白箱实验装置区域设置观察区，设置实验条件，把小鼠在黑箱中的活动和在白箱中的活动作为两个事件进行观察。

（3）命名实验动物，将小鼠眼睛背对着黑白箱中间的门放入白箱中心，迅速点击录像键进行录像，记录十分钟后自动停止，在此过程中对小鼠在黑白箱中的行为指标进行统计分析。

（4）各小鼠重复（3）的实验步骤进行后续的实验。

10. H3K27ac位点的ChIP-seq测序

（1）获取视网膜样本：显微镜下快速取出视网膜，每只小鼠的两个视网膜为一个标本，放在冻存管中，置放液氮中速冻10分钟。

（2）ChIP测序及数据分析：染色质免疫共沉淀测序技术将染色质免疫沉淀技术与测序技术联合起来，研究蛋白质与DNA的相互作用。具体方法如下：

a. 染色体免疫共沉淀：使用1%甲醛对视网膜样本进行交联10分钟，10X甘氨酸终止交联。裂解视网膜细胞使细胞内物质释放以获得细胞核，获取DNA-蛋白质组成的复合物，随后超声破碎仪超声片段化DNA（富集在 200-500bp）。各样本取100uL作为IP（免疫沉淀目标蛋白H3K27ac-DNA 复合物）和IgG（做IgG免疫沉淀的对照）样品，取10uL为Input样品，置于旋转混合仪上，4℃ 孵育过夜，同时做Protein A/G磁珠孵育过夜。第二天先将磁珠用裂解液洗涤两次，第三次重悬后，取10uL磁珠加入到IP和IgG管中，与抗体-蛋白共同孵育4h后，洗涤和洗脱沉淀复合物，65℃加热使DNA-蛋白质复合物解交联，纯化DNA，并对DNA进行质控。

b. DNA文库构建及测序：对染色体免疫沉淀下来的 DNA 进行末端修复并加上碱基 A，再加上DNA接头，使用磁珠获取DNA片段进行 PCR 扩增，获得待测序的文库，Illumina双端测序（PE）文库（～300bp），利用琼脂糖凝胶电泳对所构建的DNA文库进行DNA片段化检测。

c. 生物信息学分析：使用fastp软件对原始测序数据数据进行处理：(a)去除reads末端多余的接头序列，并筛选掉长度小于15bp的reads；(b)去除碱基质量值低于Q15的碱基所占的比例大于40%的reads；(c)去除N碱基大于5个的reads。

①Reads 分布情况：使用RSeQC软件来读取reads在基因组上的位置并对这些位置信息进行统计分析，定位区域主要包括基因编码区、转录起始位点、启动子区、基因间区、内含子区和转录终止位点。

② 样本生物学重复检测：样本间相关性是后续数据是否可靠的关键，样本间相关系数越接近于1，它们的蛋白结合模式相似度越高。

③ Peak calling：组蛋白 ChIP-seq使用 Input 组reads作为背景，使用 Epic2软件对 IP 组进行 call peak。使用bedtools软件对筛选到的peak所在基因组进行基因注释和peak分布分析。

④ 组间差异Peak分析：使用基于 edgeR 框架的 csaw 软件筛选组间差异 peak，以及差异peak注释到的基因。使用KOBAS软件对注释到的差异基因进行GO富集和KEGG富集分析。

11. RNA测序和数据分析：

（1）视网膜测序样品准备：显微镜下快速取出视网膜，置放液氮中速冻10分钟，干冰运输至武汉康测科技有限公司，RNA-seq测序及分析工作均由武汉康测科技有限公司完成，测序深度30x，单样本数据量为20G。rd10和C57BL/6J小鼠各取三个生物学重复样本。

（2）RNA-seq文库构建和测序：采用适用于Illumina®（目录号DR08402，武汉Seqhealth有限公司）的KCTM链mRNA文库制备试剂盒，使用2μg总RNA制备RNA测序文库。对应于200-500个碱基的PCR产物进行富集和定量，标本在Novaseq 6000测序仪（Illumina）上机，用PE150程序进行测序。

（3）生物信息学分析：

a. 原始测序数据过滤：用fastp软件进行数据质控，去掉冗余接头序列，过滤掉Q20的碱基比例大于0.08的数据；过滤掉当raeds读N的碱基多于5个时。

b. 参考数据比对：将clean data与小鼠参考基因组比对，获得比较全面的转录本信息。定位准确的百分比高于70%，而具有多个定位序列的百分比高于10%。

c. 转录组分析：转录组分析的对象主要是能够编码蛋白的DNA转录后的mRNA，对mRNA的表达量进行统计、并评估组内及组间样品基因差异表达的基因。以RPKM值来统一化计算基因表达量并对表达量进行比较分析。

d. 筛选差异表达基因：使用edgeR package分别筛选两组之间比较之后上调表达基因和下调表达基因。一般用差异倍数的log值即logFC和差异显著水平即p值进行评估筛选，以logFC的绝对值>1且p value<0.05作为标准，筛选差异表达基因。

e. GO分析和KEGG分析：对差异基因进行GO和KEGG通路分析。

12. ChIP-seq与RNA-seq数据关联分析

使用R语言的ggplot包，对ChIP-seq筛选到的差异基因与RNA-seq筛选到的基因取交集作图，并进行数据关联分析。

13. 荧光定量qPCR反应

（1）RNA抽提和逆转录合成cDNA：从rd10和WT小鼠获取视网膜，用RNA抽提试剂盒提取RNA，取1μL RNA进行浓度检测。使用反转录试剂盒（K1622）用来反转录，反转录反应体系详见表1，反转录条件见表2。

表1 逆转录反应体系

。

表2 逆转录反应条件

。

逆转录合成cDNA反应结束后，取适量cDNA进行稀释至1ng/1μL，用于下一步的荧光定量PCR反应。

（2）Real-Time qPCR引物设计和合成：在NCBI数据库检索Wnt5b、C4b、Hdc、Syne2、Ppara、Casz1、Rgs9、Rgs20及GAPDH的mRNA的编码区CDS序列，由上海生工公司进行引物设计与合成，引物序列见表3。

表3 Real-Time qPCR引物设计序列

。

（3）Real-Time qPCR反应体系（见表4）

表4 Real-Time qPCR反应体系

。

（4）反应条件（见表5）：加样后上荧光定量PCR仪进行反应，记录扩增反应中的荧光信号值。

表5 Real-Time PCR反应条件（Tm≤60℃）

。

（5）荧光定量qPCR检测结果分析：各检测样本以内参GAPDH做标准化，即用荧光定量PCR仪记录的目标基因的Ct值减去内参GAPDH的Ct值，得到ΔCt值。

14. ChIP-qPCR验证组蛋白修饰与基因的直接结合

（1）染色体免疫沉淀：采用PierceTM磁性ChIP试剂盒（货号26157，赛默飞出品），按照试剂盒提供的实验方法实施。

（2）ChIP-荧光定量PCR检测

a. ChIP-qPCR引物设计和合成：首先找到H3K37ac与Hdc的结合位点，设计引物，由上海生工公司引物合成，引物序列见表6。

表6 Hdc引物序列

。

b. Real-Time qPCR反应体系（见表7）

表7 Real-Time qPCR反应体系

。

c. 加样后上荧光定量PCR仪进行检测，记录扩增反应中的荧光信号值。

（3）荧光定量Real-Time qPCR检测结果统计：首先算出检测样本Input组的调整因子log₂10，再用Input组的平均Ct值减去log₂10，得出调整后的Input值，用调整后的Input值分别减去IP组和IgG组的平均Ct值得出各组ΔCt值，最后用公式100×10^ΔCt即为各样本中目标基因的相对表达量。

15. SAHA储存溶液/使用溶液的配置与小鼠给药方法

（1）SAHA储存溶液的配置：伏立诺他（Voristat，SAHA），CAS号149647-78-9，购自美国MedChemExpress公司，分子式为C₁₄H₂₀N₂O₃，分子量为264.32。将50mg的SAHA溶解到1mL的DMSO里，溶解至SAHA储存溶液清晰，配置成50mg/mL的储存液，每管分装100uL，放在负80度冰箱储存。

（2）SAHA使用溶液的配制：首先将100uL 50mg/mL的SAHA稀释到5mg/mL，加入400uL的PEG300混匀，再加入50uL的Tween-80混匀，最后加入450uL的生理盐水混匀，配制成SAHA使用液1000 uL。

（3）SAHA注射剂量和注射方法：测量rd10小鼠体重，注射SAHA浓度为50mg/kg(体重)，小鼠每克体重腹腔注射10uL的SAHA，从rd10小鼠出生第14天开始注射，隔天注射一次，直到第29天。

腹腔注射方法：异氟烷浸湿棉球置放小鼠鼻孔前，小鼠麻醉后，胰岛素注射器抽取药液，排尽空气。左手抓住小鼠颈背部皮肤固定，翻转使腹部向上，用75%酒精棉球消毒下腹部皮肤，右手持注射器，自腹股沟上方进针，倾斜45°角刺入皮肤、腹肌，进入腹腔时会有落空感，此时回抽无血液、尿液、肠液等即可推注药液。

（4）实验分组：rd10小鼠+溶质组（SAHA未治疗组），rd10小鼠+SAHA组（SAHA治疗组）。

16. 统计学分析

实验数据以均值 ± 标准差（Mean ± SD）表示，采用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行统计分析。利用重复测量的单因素方差分析对同一组小鼠不同时间点的参数进行比较。利用非配对t检验对两组之间同一时间点进行比较。利用双因素方差分析对不同分组小鼠的不同处理进行比较。P < 0.05认为差异具有统计学意义。

实施例一：视网膜感光细胞退行性变性模型的选择、评价及发病机制研究

基因突变小鼠是目前研究遗传性视网膜感光细胞退行性病变发病机制与开拓治疗方法的经典动物模型，其中Pde6b^rd10（rd10）小鼠是发生在编码光转导蛋白Pde6β的基因Pde6b第5外显子上的一个纯合错义突变，其发病时间、病理特点和病程过程均符合人类遗传性视网膜感光细胞退行性变性的临床特征。

1. 视网膜电图：

视网膜电图ERG波形的振幅反映视网膜感光细胞到视网膜神经节细胞的整个视觉传导回路的功能。其中暗视 0.01 ERG的b波波形振幅主要由视网膜视杆-双极细胞产生，是反映视杆细胞功能的主要指标；暗视3.0 ERG的b波波形振幅主要由On-OFF输入信号产生，主要反映视杆和视锥信号的异常。标准光适应全场背景亮度强度为30明视ERG的a波波形图主要由On和Off视锥双极细胞产生，主要反映视锥细胞的功能。

（1）暗视0.01 ERG的b波检测结果：检测WT小鼠和rd10小鼠在出生第18、25、32、39、46、53天的暗视0.01 ERG的b波并对此进行统计分析见图1A-C所示。不同时间点rd10小鼠暗视0.01 ERG的b波振幅与WT小鼠相比均具有显著差异性。结果提示：WT小鼠的视杆细胞功能在出生第32天是视杆细胞功能完善的时间点，而rd10小鼠视杆细胞的视觉功能在第18天出现损伤。

（2）暗视3.0 ERG的b波检测结果：检测WT小鼠和rd10小鼠在出生第18、25、32、39、46、53天的暗视3.0 ERG的b波并对此进行统计分析（图2 A-C）。rd10小鼠暗视3.0 ERG的b波振幅与WT小鼠相比均具有显著差异性（P < 0.0001）（图2 C）。结果提示：WT小鼠的视杆细胞和视锥细胞的功能在第32天是视网膜感光细胞功能完善的时间点，rd10小鼠感光细胞的视觉功能在第18天时严重下降。

（3）明视3.0 ERG的a波检测结果：检测WT和rd10小鼠在出生第18、25、32、39、46和53天明视3.0 ERG的a波并进行统计分析（图3 A-C）。rd10小鼠与WT小鼠相比明视3.0 ERG的a波振幅均显著下降（P < 0.0001）（图3C）。结果提示：WT小鼠的视锥细胞出生第18天时功能基本完善，rd10小鼠出生第32天开始视锥功能受损。结合暗视0.01 ERG和暗视3.0 ERG的结果显示：rd10小鼠的视杆细胞功能在出生第18天时已经严重受损，而视锥细胞的功能从出生第32天时开始损伤。

2. 视网膜组织病理切片结果：

（1）WT小鼠不同时间点视网膜HE染色结果： WT小鼠出生第18、25、32、39、46和53天HE染色6个时间点的小鼠视网膜的全周图形态和相对应的视网膜各层组织图（图4C），对WT小鼠6个时间点的视网膜全周图两侧各平均分成9个点位的外核层厚度测量，各个时间点无统计学差异（图4D）。

（2）rd10小鼠不同时间点视网膜HE染色结果：以同样的方法对rd10小鼠出生第13、16、18、25、32、39、46和53天的小鼠视网膜HE染色得到8个时间点的小鼠视网膜的全周图和相对应的视网膜各层组织图（图5 A）。随着时间的推移外核层厚度逐渐变薄（P < 0.0001），两组之间外核层厚度均具有显著差异（P<0.0001）（图5B-C）。结果显示，rd10小鼠感光细胞层厚度从16天到25天是显著下降期，第32天时外核层厚度仅剩一层。

3. 视网膜光学相干断层扫描结果

利用OCT分别对WT与rd10小鼠在出生第18、25、32、39、46和53天扫描视网膜厚度图像，对比两组间的视网膜总厚度具有明显差异（P < 0.0001），图6A-B所示。结合HE染色结果和视网膜外核层厚度检测，二者具有一致性。

4. TUNEL检测视网膜感光细胞的凋亡过程：

TUNEL染色结果显示rd10小鼠在出生第16天检测到TUNEL阳性细胞，第23天时凋亡细胞比例达到高峰，第29天时随着外核层的变薄，凋亡阳性细胞大幅减少，第32天，仅剩少量凋亡阳性细胞。以上结果提示rd10小鼠感光细胞退行性变性的一个主要方式是凋亡，凋亡发生在第16天到32天之间，第23天凋亡达最高峰（图7 A-B）。

5. Western Blot检测视杆细胞标记蛋白表达的变化：

图8A-B结果显示，rd10组小鼠出生第18、25、32、39天的视网膜中视紫红质的表达逐渐降低（P=0.0001），与对应时间点WT小鼠的视紫红质的表达相比均有显著差异（P <0.01）。视紫红质的表达变化与上述视杆细胞功能与形态的变化一致。

6. GS免疫荧光染色：

结果如图9，发现在WT小鼠出生第18、25、32天小鼠视网膜中，GS表达均一，排列致密，而在rd10小鼠出生第18、25、32天小鼠视网膜中GS表达紊乱，排列稀疏，并有向外核层迁移的趋势。

7. rd10小鼠视觉行为学的改变：

对rd10小鼠在出生第18、25、32、39、46与53天这6个时间点进行视觉行为学测试，包括旷场和黑白箱视觉行为学检测。

（1）旷场视觉行为学的变化： rd10小鼠和WT小鼠出生第18天在旷场的活动量均很小。第32天 rd10小鼠和WT小鼠在中央区域的比例具有差异性（P < 0.05），rd10组小鼠在旷场中的活动总距离从第25天开始显著增加，第39天到53天保持相对稳定（P < 0.0001），图10所示。

（2）黑白箱视觉行为学的变化：rd10小鼠去白箱的次数除了在第46天时有一个明显的增加之外（P < 0.01），rd10小鼠去白箱次数在其它时间点基本维持稳定（P < 0.01）。对两组小鼠之间不同时间点去白箱次数的统计分析发现，除了在第46天时rd10小鼠相比于WT小鼠有一个明显升高外，其它时间点两组小鼠间没有显著差异，图11所示。

8. 组蛋白H3赖氨酸位点组蛋白乙酰化水平的变化：

根据上述研究结果rd10小鼠视网膜视杆细胞凋亡峰值发生在第18天到25天之间，第39天外核层厚度仅保持在1层。选择第18、25、32、39天这四个时间点检测组蛋白赖氨酸第9、18和27三个位点的乙酰化表达水平。

图12 A显示WT与rd10两组间蛋白表达的灰度值；图12 B-C中4个时间点两组之间H3K9ac和H3K18ac表达水平无明显差异；图12 DH3K27ac在25天时rd10小鼠与WT小鼠相比显著升高。通过单因素方差分析可知WT小鼠组内4个时间点之间H3K9ac、H3K18ac与H3K27ac的表达无差异，rd10小鼠组内4个时间点之间H3K9ac、H3K18ac与H3K27ac的表达也无差异。

9. 组蛋白乙酰化调控酶的表达水平：

检测调控组蛋白乙酰化常见的组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC6和组蛋白乙酰转移酶（CBP/p300）的表达变化。图13A显示不同时间点HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的蛋白表达条带；图13B显示CBP/p300的蛋白表达条带。rd10和WT小鼠出生第18天、25、32、39天4个时间点HDAC1、HDAC2和HDAC3的灰度值进行统计分析，两组之间的表达均无差异（P >0.05）；HDAC6统计分析发现，第18天rd10与WT小鼠相比HDAC6的表达水平明显升高（P < 0.05）；rd10小鼠在第18、25和32天的CBP的表达与WT小鼠相比明显升高（P < 0.01）；rd10小鼠在第18天的p300的表达与WT小鼠相比明显升高（P < 0.01），如图13C-H所示。

10. H3K27ac的ChIP-seq结果：

(1) 染色体免疫沉淀六个样本质量评估：染色体免疫共沉淀后，分别对Input组、IP组和IgG组进行目的蛋白H3K27ac的Western Blot检测，结果如图14。WT组3只小鼠和rd10小鼠3只小鼠视网膜的IP组与Input组表达H3K27ac，而IgG组不表达H3K27ac。WT与rd10小鼠组内IP组与Input组H3K27ac的表达具有高度一致性。

（2）ChIP-seq文库构建测序及分析：

a. 质量控制：使用fastp软件对原始测序数据进行过滤处理，检查测序数据的碱基含量分布。测序质量统计表如表8所示。

表8 ChIP-seq测序数据质量统计表

Sample	Raw Q20(%)	Raw Q30(%)	Clean Q20(%)	Clean Q30(%)	Clean GC(%)
						Normal1_IP	97	90.8	97.08	93.31	44.58
Normal1_Input	96.92	90.8	97.04	90.92	43.4
						Normal2_IP	96.84	90.29	96.91	91.02	44.82
Normal2_Input	96.92	90.68	97.02	90.39	41.69
						Normal3_IP	97.08	91.03	97.16	90.84	44.31
Normal3_Input	95.25	86.68	95.39	91.14	39.42
						Rd1_IP	97.32	91.75	97.41	86.87	43.62
Rd1_Input	97.18	91.48	97.31	91.89	41.16
						Rd2_IP	97.04	90.84	97.12	91.73	44.09
Rd2_Input	97.3	91.77	97.43	90.96	41.57
						Rd3_IP	97.39	91.92	97.48	92.01	43.81
Rd3_Input	95.99	88.3	96.13	92.05	40.3

b. 参考序列比对：首先将上述过滤好的clean data与小鼠参考基因组进行比对，得到全面的转录本信息，再将Reads在参考基因组上的分布进行分析统计如图15。基因组上的分布区域主要包括转录起始位点（TTS）、5’UTR区、编码区（CDS）、3’UTR区、转录终止位点（TES）、基因间区（Intergenic）和内含子区（Intron）。对Reads在基因区域的分布作图，如图16 A-B，WT和rd10小鼠两组的IP组在基因转录起始位点有较高的富集，这和H3K27ac对基因转录的调控一致，结果说明H3K27ac位点的ChIP-seq非常成功，可用于后续Peak calling分析。图16C-D展示了各组样本在转录起始位点附近的富集。

c. 各组样本生物学重复相关性：图17所示，WT和rd10小鼠两组各3个样本的IP组与Input组相关性程度，IP组与Input组能够明显分开，WT和rd10小鼠组内的IP组都具有很高的相关性，说明两组样品免疫沉淀结果生物重复性好。

d. 组间差异Peak分析：首先各组样本内以Input作为背景，统计各组IP组Peak宽度和数量，接着分析两组间的差异Peak，两组间一共富集到1507个差异Peak（图18 A），差异Peak的长度主要富集在3000bp（图18 B），并对Peak进行注释，图18C的饼形图展示了Peak所在基因区域的分布比例。

对这些差异Peak注释到的基因进行GO富集分析如图19 A，横坐标为-log₁₀（P），纵坐标为富集到的条目，包括生物过程、分子功能和细胞组分三个方面。KEGG通路富集分析如图19B，横坐标为-log₁₀（P），纵坐标为富集到的信号通路条目。

11. RNA-seq测序结果：

（1）原始数据处理及参考基因比对：采用fastp软件对原始数据进行过滤及数据质控，将质控合格的测序数据与参考基因组进行比对，各组比对结果如表9。

表9 RNA-seq测序数据质量统计表

。

（2）样本生物学重复相关性分析：图20 A样本相关性热图展示了Normal组与rd10组各3个生物学重复之间的相关性，图20 B样本主成分分析（PCA）聚类图，横坐标代表第一主成分维数，纵坐标代表第二主成分维数。

（3）组间差异基因分析：两组间差异发达基因进行筛选汇总，筛选条件为logFC的绝对值>1且p value<0.05，logFC>1的为上调基因，logFC<-1的基因为下调基因。对上下调基因进行汇总作图如图21 A为差异表达基因的热图，图21 B为上下调基因数量。

12. ChIP-seq与RNA-seq关联分析

（1） ChIP-seq与RNA-seq差异基因关联分析：对rd10组小鼠与WT组小鼠视网膜组蛋白H3K27ac的ChIP-seq富集到的差异Peak注释到的高表达基因和低表达基因与两组RNA-seq富集到的差异高表达基因与低表达基因取交集关联分析，画出调控关系的四象限图，如图22所示，第一象限代表ChIP-seq和RNA-seq都高表达的基因，第二象限代表ChIP-seq低表达而RNA-seq高表达的基因，第三象限代表ChIP-seq和RNA-seq都低表达的基因，第四象限代表ChIP-seq高表达而RNA-seq低表达的基因。由于H3K27ac修饰对基因转录是正向促进作用，因此应关注的基因是第一象限和第三象限的基因，去除不同Peak所在同一个基因上的重复，符合条件的一共99个基因。

ChIP-seq与RNA-seq关联分析后，对同时上调和同时下调的基因进行GO富集分析和KEGG富集分析，如图23 A展示了同时上调基因的GO分析条目，23 B展示了同时下调基因的GO分析条目。

（2）差异基因的表达：从上述99个基因中选择8个与视网膜相关基因进行mRNA水平的表达验证: Wnt5b、C4b、Hdc、Syne2、Ppara、Casz1、Rgs9和Rgs20，结果如图24显示，rd10小鼠视网膜中Wnt5b和C4b基因与WT小鼠相比呈现高表达状态；rd10小鼠视网膜中 Hdc、Ppara、Rgs9和Rgs20基因与WT小鼠视网膜相比呈现低表达状态。

（3）H3K27ac与Hdc的直接结合：通过igv软件绘制H3K27ac在6个表达有差异基因上的Peak峰图发现H3K27ac的Peak峰在Hdc基因的启动子区富集，如图25 A，因此判断H3K27ac很可能参与Hdc的转录调控。利用ChIP-qPCR进行二者直接结合的验证，结果如图25B，WT和rd小鼠两组的IP组的Hdc基因与IgG阴性对照相比，都有显著富集，验证H3K27ac与Hdc的DNA直接结合，rd10的Hdc的表达量与WT组显著下降。

实施例二：伏立诺司他在干预治疗视网膜感光细胞退行性病变中的应用

1. 确定SAHA注射浓度和时间：SAHA选择25mg/kg (体重)和50mg/kg(体重)的注射剂量，在rd10小鼠出生第14天开始注射，第29天检测视网膜的变化，结果显示，25mg/kg (体重)剂量的治疗组与rd10组小鼠相比外核层厚度没有差异，干预无效果（图26A-B）；选择出生第9天开始注射SAHA，结果治疗组与非治疗组相比外核层并没有显著差异（图26 C、D）；同时检测SAHA 50mg/kg(体重)从第14天时注射，在第25天时检测视网膜形态，结果发现治疗组与非治疗组相比没有显著差异（图26 E、F）。50mg/kg (体重)的SAHA治疗组与rd10组小鼠相比外核层厚度明显增加，显示出明显的治疗效果，图26 G、H所示。综上所述，决定对rd10小鼠的干预治疗选择50mg/kg(体重)的SAHA剂量，从第14天时开始注射，在第29天时检测各项干预指标。

2. SAHA干预治疗后视网膜组织形态的改变：SAHA在小鼠出生第14天注射，第29天进行HE染色获得治疗组与非治疗组视网膜全周图和视神经右侧300um视网膜组织切片，图27A所示；对两组视网膜全周取18位点进行外核层统计，图27B所示；第29天对rd组与rd+SAHA组小鼠进行活体眼底视网膜相干断层扫描（图27 C），对两组小鼠视网膜总厚度进行统计分析，SAHA治疗组的视网膜总厚度明显高于非治疗组（P<0.05），图27 D所示。

3. SAHA干预治疗后视网膜功能的改变：ERG检测SAHA干预治疗组暗视0.01 ERG的b波振幅显著高于rd10组（P<0.05），暗视0.01 ERG的b波代表视杆细胞功能（图28A、C）。同时，SAHA干预治疗组暗视3.0 ERG的b波振幅也显著高于rd非治疗组（P<0.05），暗视3.0 ERG的b波代表视杆细胞和视锥细胞共同的功能（图28B、D）。结果显示，SAHA干预治疗rd10视网膜退行性病变的视功能明显获得改善。

4. SAHA干预治疗后视网膜感光细胞凋亡的变化：SAHA干预治疗组视网膜感光细胞凋亡阳性细胞结果显示（图29A），视网膜外核层中TUNEL阳性细胞比例与rd组小鼠相比明显下降（P<0.01），图29B所示；Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase3的表达，干预组Caspase3的表达与非治疗组相比显著下降（P<0.05），图29 C、E所示；视网膜感光细胞特异性标记蛋白Rho表达升高，（图29 C），与非治疗组相比表达量显著升高（P<0.01），图29D所示。

5. SAHA干预治疗后视网膜GS免疫荧光染色结果：从rd10小鼠视网膜退行性病变过程中GS免疫荧光染色结果视网膜感光细胞变性过程中Müller胶质细胞细胞核向外核层移动，GS排列变得紊乱并且稀疏，为了弄清楚SAHA治疗是否会改变GS的表达和形态，观察SAHA治疗组与非治疗组的GS表达变化，结果图30所示，SAHA治疗组的Müller胶质细胞中GS排列有序致密。箭头是Müller胶质细胞细胞核所在位置。

6. SAHA干预治疗后组蛋白去乙酰化酶和组蛋白H3K27ac表达变化： SAHA干预对组蛋白去乙酰化酶HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的影响，图31 A-E显示与未治疗组相比无差异性（P>0.05）。SAHA治疗组HDAC6的表达与未治疗组相比显著下降（P<0.01）；组蛋白H3K27ac表达的影响如图31 A、F所示，与非治疗组相比H3K27ac的表达显著升高（P<0.01）。结果显示，SAHA通过特异性抑制组蛋白去乙酰化酶HDAC6的表达提高组蛋白H3K27位点的乙酰化水平。

7. SAHA干预治疗后H3K27ac对Hdc的调控作用： ChIP和RNA测序数据分析结果发现，Hdc启动子区H3K27ac低表达的同时，Hdc的mRNA水平呈现低表达，二者是正向调控关系，预测H3K27ac水平的升高很可能会提高Hdc的mRNA表达水平，采用实时荧光定量PCR检测Hdc的mRNA结果如图32 A所示，SAHA干预治疗组与非治疗组相比Hdc基因的表达水平显著升高（P<0.01），结果充分验证H3K27ac对Hdc的正向调控关系。再次用ChIP-qPCR来验证在SAHA治疗组rd10小鼠视网膜中H3K27ac与Hdc的DNA的直接结合，图32 B显示Hdc在IP组与IgG组的表达差异，两组差异具有统计学意义（P<0.01），说明H3K27ac的IP组特异性结合Hdc基因。综上所述，H3K27ac与Hdc的DNA直接结合并且H3K27ac促进了Hdc基因的转录。

以上实施例综合采用视觉功能检测技术、视觉行为学方法、组织病理学技术、ChIP和RNA测序技术、分子生物学技术与药物精准干预等技术，通过分析rd10小鼠视网膜感光细胞退行性变性具体发病过程、视网膜感光细胞变性过程中组蛋白乙酰化修饰的改变及组蛋白去乙酰化酶抑制剂干预组蛋白乙酰化对视网膜形态、功能和分子表达的影响，得出以下主要结论：

（1）rd10小鼠视网膜感光细胞结构损伤发生在小鼠出生第16天之后，视杆细胞功能退化早于视锥细胞功能，视网膜感光细胞凋亡高峰期发生在出生第23天。

（2）rd10小鼠视网膜感光细胞变性过程中组蛋白H3K27ac水平与WT小鼠比出现显著性改变，组蛋白乙酰转移酶CBP/p300活性升高，组蛋白去乙酰化酶HDAC6表达升高。

（3）rd10小鼠视网膜感光细胞退行性变性过程启动前，给予组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA治疗，可改善rd10小鼠视网膜视觉功能和组织学形态。

实施例三：伏立诺司他的作用机制

研究发现SAHA能够特异性抑制I类和II类组蛋白去乙酰化酶，因此为了探索在rd10小鼠中高表达的HDAC6能否被SAHA抑制，Western Blot检测SAHA干预治疗后HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC6的蛋白表达，结果发现HDAC6的蛋白表达量下降，而HDAC1、HDAC2和HDAC3的表达与非干预治疗组无差异性。Western Blot结果验证了HDAC6的低表达会增加组蛋白H3K27位点的乙酰化水平，SAHA干预治疗组H3K27ac表达升高。综上所述， SAHA通过抑制HDAC6的表达增加H3K27位点的乙酰化水平。

通过ChIP-seq和 RNA-seq联合分析，筛选出rd10小鼠视网膜感光细胞中的差异基因Hdc，证实H3K27ac通过调控Hdc的转录改善和增加视网膜感光细胞的功能，采用HDAC6的抑制剂SAHA治疗后，Hdc的表达升高，视网膜感光细胞退行性病变的视网膜功能得到部分恢复。由此可知，受组蛋白乙酰化调控的Hdc通过促进视网膜感光细胞的神经递质传递而保护视网膜的组织学形态和视觉功能。

Claims

1.伏立诺司他在制备治疗视网膜感光细胞退行病变的药物中的应用。

2.伏立诺司他在制备上调Hdc基因表达的制剂中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述伏立诺司他的施用方式为：于视网膜感光细胞变性前注射45～55mg/kg（体重）。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，由所述伏立诺司他或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体组成临床上可接受的药物或制剂。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述载体为药学领域的常规稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、香剂、甜味剂中的至少一种。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述临床上可接受的制剂为片剂、粉剂、粒剂、胶囊、擦剂、滴眼液、眼膏、凝胶、口服液及注射用药中的任意一种。