CN113577045A - 四氢姜黄素在制备预防和/或治疗高原认知障碍的药物中的用途 - Google Patents

四氢姜黄素在制备预防和/或治疗高原认知障碍的药物中的用途 Download PDF

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戴瑛
尤晓舟
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Abstract

本发明提供了四氢姜黄素或其药学上可接受的盐在制备治疗高原认知障碍的药物中的用途。本发明四氢姜黄素可作为急进高原前后的补充剂，以预防或治疗高原认知障碍的发生。

Description

四氢姜黄素在制备预防和/或治疗高原认知障碍的药物中的 用途
技术领域
本发明涉及高原病防治药物研究技术领域,具体涉及四氢姜黄素在预防和 /或治疗高原认知障碍的药物中的用途。
背景技术
低氧是高原环境的主要特征，大脑是对缺氧最敏感的器官。当人员从平 原地区快速进入高原地区时，随着海拔迅速升高，含氧量下降，大脑得不到 充足的氧气造成脑组织损伤，继而引起学习、记忆、辨识能力等认知功能受 损，引发一系列神经精神改变，包括头疼、失眠、注意力下降，对外界反应 的灵敏度以及行为异常等，严重者会出现睡眠呼吸功能障碍，甚至出现烦躁、 惊厥、昏迷或共济失调等症状，更会诱发多种致死率极高的高原病，如高原 脑水肿、高原肺水肿。
研究显示，急性高原缺氧严重影响人的思维能力，干扰脑力作业效能， 其发病机制并非基于急性高原反应(AMS)，而是由于低氧引发的脑功能异 常而引起。也有研究报道，高原环境对暴露个体的认知功能会产生明显影响， 海拔越高认知功能受损越严重，而且不同认知功能的变化趋势不同。当个体 上升到海拔>5000米时，身体和视觉错觉也被观测出来，认知的所有功能(复 杂任务功能)都会减少，当上升到海拔>7000米时，认知损伤更明显。对认知 影响除了海拔高度外，暴露时间也是重要原因之一，研究表明，长期暴露于 高原中认知损伤更为严重。因此，高原暴露对于急进高原人群和常驻高原人 群均存在神经损伤作用。
进入高原人群正在逐年攀升，其中包括旅游者、登山爱好者、筑路人员、 戍边军人等，高海拔急性缺氧暴露极大威胁了进驻高原地区人员的身体健康， 干扰脑力作业效能，如何防治高原环境下认知能力障碍成为亟待解决的问题 之一。目前对高原认知障碍的防护措施包括①阶梯型上升海拔，提高机体对 低氧的耐受能力；②提高低氧预适应能力，即增强细胞缺氧诱导因子-1 (HIF-1)等转录因子活性，影响其通路下游蛋白质的表达，提高抗缺氧能力； ③耐低氧训练，通过爬山、跑步等运动增强心肺功能，提高缺氧适应能力； ④吸氧、下降海拔高度，积极后送等，有利于改善认知障碍等低氧所致症候； ⑤药物防护等。其中提高缺氧适应能力、吸氧等这些防护措施大多受到时间 空间以及设备的限制，时效性差。而针对短期快速高原活动如军事活动、地 质灾害救援等，方便快捷的药物防护就凸显其应用优势。现针对改善急性高 原缺氧所致认知功能障碍的有效防护药物仍然是空白，原因是急性高原缺氧 所致认知功能损伤的发生机制还有待进一步阐明。虽然一些激素类药物和神 经兴奋类药物如胆碱、槲皮素、二氢杨梅素以及中药人参、红景天等，可以 一定程度上改善高原低氧引起的认知功能障碍，但存在不同程度的副作用， 且中药服用不便，资源有限，无法作为常规药物使用。因此，急需开发一种 见效快、疗效显著、毒副作用小的预防和/或改善高原低氧致认知障碍的药物。
四氢姜黄素(Tetrahydrocurcumin,THC)作为姜黄素(Curcumin)在体内代 谢过程中产生的最为活跃的代谢产物，具有抗炎、抗氧化、改善记忆、降脂 等药理活性。前期研究发现其具有一定的神经保护作用，但高原认知障碍的 身体变化因素复杂，保护脑神经并不能达到预防或改善该疾病的发生发展， 因此目前还没有关于四氢姜黄素对高原低氧致认知障碍的保护作用的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种四氢姜黄素或其药学上可接受的盐 在制备预防和/或治疗高原认知障碍的药物中的用途。
进一步地，所述药物是预防和/或治疗急性高原认知障碍的药物。
进一步地，所述药物是缓解氧化应激反应的药物。
进一步地，所述药物是减轻神经炎症反应的药物。
进一步地，所述药物是改善受损神经功能的药物。
进一步地，所述药物是改善脑水肿的药物。
更进一步地，所述药物是减少自由基和/或神经递质堆积的药物。
更进一步地，所述药物是激活神经元，上调血脑屏障中紧密连接蛋白 occludin表达，和/或下调HIF-1α,上调GLUT1的药物。
本发明还提供了一种四氢姜黄素或其食品上可接受的盐在制备调节机体 功能的食品中的用途。
进一步地，所述食品是耐缺氧的食品。
本发明还提供了一种治疗高原认知障碍的组合物，它是以四氢姜黄素或 其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制 备而成的制剂。
进一步地，所述制剂为口服制剂、外用制剂或注射剂。
本发明利用动物低压氧舱7000m暴露24h的模型成功模拟小鼠急性高 海拔暴露后认知障碍模型，通过该模型研究发现：四氢姜黄素的预补充可以 有效改善脑水肿的发生及认知的损伤，其作用机制与其强大的抗氧化功能、 保护血脑屏障功能，降低神经毒性、对神经元的激活作用、下调HIF-1α、上 调GLUT1的作用机制相关，由此得出四氢姜黄素可作为急进高原前后的补 充剂，以预防或治疗高原认知障碍的发生。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段， 在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、 替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步 的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。 凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1动物实验性低压氧舱
图2脑组织含水量及体重变化(A.脑干湿比，B.体重降低百分比，*P<0.05， **P<0.01，n＝8)
图3行为认知变化(A.Y-迷宫有效交替率，B.转棒仪跌落潜伏期，*P<0.05， **P<0.01，n＝8)
图4脑组织匀浆中炎症因子变化(A.IL-1β水平，B.TNF-α水平，*P<0.05， **P<0.01，n＝8)
图5小鼠脑组织海马区、皮层病理观察(HE*50，n＝3)
图6蛋白组学技术线路图
图7差异表达蛋白定量火山图(蓝色为下调蛋白，红色为上调蛋白)
图8小鼠脑海马组织差异蛋白GO功能注释统计图(红色、蓝色、绿色依次 为生物过程、细胞组分、分子功能)
图9 KEGG相关信号通路图
图10高原暴露后的脑水肿改善情况(A.occludin免疫荧光图，B.脑组织干 湿比,C.occludin，与N组比较*P<0.05，**P<0.01，与HH组相比#P<0.05， ##P<0.01，与HH+THC相比，&P<0.05，&&P<0.01)
图11高原暴露后的小鼠认知障碍改善情况(A.旷场总活动距离，B.旷场中 心活动时间，C.Y迷宫有效自发率，D.转棒仪坠落潜伏期，E，旷场活动路 线，与N组比较，*P<0.05，**P<0.01，与HH组#P<0.05，##P<0.01与 HH+THC，&P<0.05，&&P<0.01)
图12 HE染色后的海马CA1、CA3、皮质，透射电镜观察线粒体变化红色箭 头为线粒体
图13神经递质水平(A谷氨酸水平，B去甲肾上腺素水平，与N组比较 *P<0.05，**P<0.01，与HH组#P<0.05，##P<0.01与HH+THC组相比， &P<0.05，&&P<0.01)
图14小脑组织中MDA含量和SOD活性GSH-Px检测(与N组比较 *P<0.05，**P<0.01，与HH组#P<0.05，##P<0.01，与HH+THC相比， &P<0.05，&&P<0.01)
图15 THC对急性高海拔暴露小鼠脑内CA1区和皮层区ROS的抑制 (与N组比较*P<0.05，**P<0.01，与HH组#P<0.05，##P<0.01，与 HH+THC相比，&P<0.05，&&P<0.01)
图16 THC对HH小鼠海马区神经元的激活
图17小鼠脑组织中occludin、HIF-1α、GLUT1、GLUT3蛋白表达水平变 化(与N组比较*P<0.05，**P<0.01，与HH组比较#P<0.05，##P<0.01与， HH+THC相比，&P<0.05，&&P<0.01
具体实施方式
实施例1 急性高原暴露认知障碍小鼠模型复制
1.实验材料和仪器
1.1药品与试剂
Figure BDA0003248931060000041
1.2主要仪器及设备
Figure BDA0003248931060000042
Figure BDA0003248931060000051
2.实验方法
2.1实验动物及处理
健康C57BL/6雄性小鼠，8周龄，质量20-22g，购自空军军医大学实验 动物中心[SCXK(陕)2019-001]。小鼠均适应性喂养3天后开始实验，动 物室内12h昼夜循环光照恒温并提供干净的水源和啮齿类动物饲料。本实验 一切操作均符合陕西中医药大学及空军军医大学动物实验道德伦理委员会的 规范。
将实验小鼠48只随机分为4组，分别是：①常氧组：正常对照组(N组)； ②急性高原暴露6000m-24h组；③急性高原暴露7000m-24h组：④急性高 原暴露8000m-24h组，每组12只，放置于动物低压氧舱内(塔望科技，型 号MOG-KZ)，如图1所示。常氧组小鼠被置于低压氧舱外，常氧舱外不做 任何处理，并于24h后麻醉断头取脑；急性高原暴露组小鼠置于模拟6000m、 7000m、8000m设置海拔高度中24h后麻醉断头取脑。各组小鼠中4只用 于病理学观察，8只用于相关指标检测，脑组织冲洗后用滤纸吸干表面放入多 聚甲醛或液氮中。
2.2体重记录
各组小鼠进入低压低氧模拟舱前记录一次体重，模拟结束后记录一次体 重，体重降低比率＝(进舱前体重-出舱后体重)/出舱前体重*100％，绘制小 鼠体重差异柱状图以便分析。
2.3认知行为测评
2.3.1转棒仪检测肢体协调能力
为了检测不同高海拔急性暴露对小鼠共济失调能力的影响，使用转棒测 试评估小鼠运动协调能力，转棒的直径为7cm，且表面材质光滑，避免小鼠 抓握转棒，转棒距离台面高度为12cm。首先对所有组小鼠进行转棒训练，将 转棒仪的旋转模式设置为匀速模式，使小鼠熟悉这一运动，每只小鼠在急性 高原暴露模拟前三天每天训练3次。模拟结束后立即进行检测，检测时参数 设置为5min内加速至40rPm/min，仪器自动记录5min内小鼠们从转棒上掉 落的潜伏期，当小鼠抓住转棒跟随旋转3圈也视为结束。每轮结束后用酒精 擦拭转棒。每只小鼠的测试重复3次取掉落潜伏期的平均值视为最终结果。
2.3.2 Y-迷宫
为了评估空间记忆功能，在HH暴露后进行了Y-迷宫测试。每只老鼠都 被放置在一个Y形迷宫的臂膀中，并可以在8分钟的过程中探索迷宫。我们 记录了进入三个臂的顺序和总数，自发交替的百分比作为实际交替与可能交 替的比值计算如下：有效交替率(％)＝[(正确交替数量)/(总进入数－2)]/100。
2.4脑含水量测定
脑含水量主要是通过干湿重比值来检测，行为学测试结束后迅速麻醉采 用脱颈椎法处死小鼠取脑，用生理盐水轻轻冲洗脑组织表面的血迹后，滤纸 轻轻吸干表面液体，迅速在精密电子天平上称重记为脑组织湿重，然后置于 70℃电热恒温烘箱中烘烤。72h后称重达恒重后记为脑组织干重。最后按照 Elliot公式计算脑组织湿重百分比值，WBC％＝(湿重－干重)/湿重×100％。
2.5脑组织HE染色观察
4％多聚甲醛溶液将分离出的用于HE染色的脑组织浸泡完全。固定充分 后，将大脑切成2mm左右的冠状切片，将其放置于固定盒中。然后用石蜡进 行包埋，再次进行切片，最后用苏木精-伊红染料染色，在光学显微镜下观察 脑组织病理学的变化。
2.6 ELISA法测小鼠脑组织炎性因子
取各组脑组织，用冷盐水冲洗后研磨成匀浆，然后在4℃下离心30min， 加入9倍体积的预冷PBS获得10％的上清液。根据生产厂家的说明书，用商 用定量ELISA试剂盒测定肿瘤坏死因子-β和IL-1β水平。
3.数据处理
所有实验数据均使用GraPhPad-8进行数据分析和绘图。使用One-way Analysisof Variance(ANOVA)比较多组间差异，t检验比较两组间差异，P< 0.05认定为有统计学差异。
4.结果
4.1急性高原暴露对小鼠的生存状态影响
在实验过程中以及达到预定缺氧时间后，常氧组小鼠精神状态正常，运 动活跃饮水进食正常，毛发顺滑。而进入低压氧舱内的小鼠普遍表现为眼睛 眯起，食欲不振、活动范围降低、长时间群聚卧姿、排便减少、呼吸不畅、 极个别表现出呼吸困难、呼吸频明显加快。模拟结束后各高原暴露组小鼠均 表现出运动意愿不强烈，毛发混乱湿润的状态，此外，常氧组、6000m未出 现小鼠死亡，但是在7000m组和8000m组中出现小鼠死亡。
4.2急性高原暴露对小鼠脑组织含水量(BWC)及体重变化影响
BWC的实验结果如图2A.所示，与正常组(N组)相比，6000m、7000 m和8000m组小鼠BWC均显著升高(P<0.01)。7000m组、8000m组 BWC显著高于6000m组(P<0.05，P<0.01)，但是8000m组与7000m 组脑含水量程度无显著性差异。表1、图2B.中小鼠体重随着海拔的增加而下 降，与6000m组相较，7000m、8000m组体重显著降低(P<0.05，P<0.01)， 而7000m组相较8000m组无显著性差异。
表1急性高原暴露小鼠体重变化(
Figure BDA0003248931060000071
n＝12)
Figure BDA0003248931060000072
4.3急性高原暴露对小鼠行为认知学的影响
Y迷宫用来评价小鼠的空间学习记忆能力，如图3A，与N组相比，6000 m、7000m和8000m组小鼠工作记忆能力显著下降，说明急性高原暴露对小 鼠的记忆认知能力产生损害，且海拔越高损伤程度越重。转棒仪用来评价小 鼠是否共济失调，如图3B，与N组相比，6000m、7000m和8000m组小 鼠从杆上掉落的潜伏期均显著下降(P<0.01)，说明急性不同高原暴露条件 对于小鼠的平衡能力存在明显损伤，且8000m海拔的暴露对平衡能力损伤最为严重。
4.4小鼠脑组织炎症因子浓度测定
小鼠大脑匀浆中炎症因子浓度如图4A.4B所示，与N组相比，各组IL-1β、 TNF-α水平均显著增高(P<0.01)，但6000m、7000m、8000m组间IL-1β 表达水平平均无显著性差异(P>0.05)，而7000m较6000m显著性增加 (P<0.01)，较8000m组显著性降低(P<0.05)。提示炎症因子的表达有 随海拔上升而增加的趋势。
4.5急性高原露对小鼠脑组织病理学的影响
组织病理学结果如图5所示，N组小鼠脑组织中各细胞界限十分清晰， 海马结构完整且排列整齐。6000m、7000m和8000m组小鼠脑组织中细胞 均出现界限混乱，排列稀松，海马结构被破坏，细胞周围间隙扩大、核固缩 且浓染、皮质中有明显的炎性细胞浸润和脑水肿。并且随着海拔的上升，正 常神经细胞数量降低，细胞损伤加重。
5、讨论
建立复现性好、评价体系健全的急性高原病动物模型是急性高海拔暴露 疾病的研究基础。目前大多数高原疾病实验性模型均选用小型实验动物低压 氧仓进行模拟高原环境，其原因在于设备操作简单，成本低，常用于在低压 低氧模拟期间不需要对实验动物进行处置的实方案中。而大型的高原环境氧 舱适用于较长时间的模拟高空环境，并且可以在模拟期间操作人员进入舱内 进行操作，但是操作人员进入前舱内海拔需要降低至3000m-4000m的较适 宜海拔，对实验环境及经济水平要求较高。因此本实验通过小型低压低氧舱 建造高原急性暴露模型，观察不同急性高海拔暴露后对小鼠脑组织的影响， 复制了相对稳定的认知行为障碍的模型。在实验过程中发现，正常组小鼠表 现正常，饮水摄食并未异常，但是急性高海拔暴露各组小鼠体重均有所下降， 其中急性高原8000m暴露组的体重降低最为显著，这可能是由于小鼠处于高 原应激状态，导致食欲降低，不摄食、不饮水。并且发现小鼠在舱内有毛发 湿润的现象，可能存在代谢加快的状态。我们的结果表明6000m暴露组小鼠 脑干湿比、炎症因子等比较正常组有轻微的增加，行为学实验中协调能力较 常氧组没有显著性差异，工作认知能力较7000m组8000m组降低，且无死 亡个例。7000m和8000m组的各项损伤均较为严重，其中脑含水量较常氧 组、6000m组均显著增加，工作能力、协调能力损伤较6000m组更为严重， 这是由于认知能力的损伤程度与海拔高度呈正相关。小鼠表现出强烈的抑郁， 精神萎靡的状况。我们猜测，小鼠的这种表现可能是急性高原暴露的主要症 状头痛，也是高山病诊断标准中最主要的症状。高原头痛High-altitude headache，HAH)发生于高原暴露(大于2500m)后24h内。且头痛的发 生机制与低氧低压暴露后脑静脉容积增加、脑脊液积累、脑部出现水肿有关， 与6000m、7000m、8000m组脑水肿的显著增加表现一致。此外，7000m、 8000m组小鼠均出现不同程度的死亡现象，这可能是HACE末期致死的表 现。
在病理学观察中，常氧组中，小鼠的皮层及海马体结构正常，细胞排列 整齐，细胞间隙正常，而急性高海拔暴露各组组中皮质与海马体均出现不同 程度的损伤，包括皮层中神经元和胶质细胞的锥细胞浓缩，间隙扩大出现水 肿。有研究表明，海拔6100m中暴露24小时内，海马CA1和CA3区、纹 状体及皮质形态学上都有显著的改变，发现致密混乱的圆点(神经细胞)和 少数空泡现象，即出现了病理上的形态改变。此外，Wyllie也报道了低压低 氧下海马CA1、CA2神经元细胞的凋亡的特征，细胞出现皱缩、染色质凝聚。 由于储存信息是海马神经元细胞最主要的功能，因此，海马神经元细胞的坏 死可能是造成高原暴露认知功能障碍的直接原因。7000m组与8000m组细 胞间隙较常氧与6000m组更大，水肿更加明显，海马区均出现神经元皱缩， 可见7000m和8000m高海拔急性暴露对小鼠的脑组织损伤严重，这也是 7000m组与8000m组行为学损伤更严重的直接原因。此前就有huang等人 通过C57BL/6雄性小鼠安置在一个减压室(速度为50m/s)升至海拔6000m。 发现脑含水量在早期(24小时内)升高，BBB通透性较高，脑组织结构明 显变宽，皮质血管扩张，部分神经元出现萎缩，核呈暗色固缩，造成神经元 结构损伤，降低了小鼠在水迷宫中的认知表现。Zhou等人发现在24h急性 高海拔6000m暴露后，炎症反应加速了脑水肿的发生和发展，这与BBB通 透性增加、小胶质细胞激活和水通道AQP-4表达增强有关，最终导致小鼠神 经元受损，认知功能和协调能力运动功能受损。
6、小结
良好的动物模型应该为操作简单、模拟性强、可重复性强等优点。本发 明通过使用C57BL/6小鼠在小动物低压低氧舱高原急性暴露成功复制了认知 行为障碍小鼠模型。并发现急性7000m和8000m高原急性暴露24h对脑 部结构及功能损伤较大，并出现脑水肿的现象。行为学测试损伤也较6000m 组严重。但由于8000m海拔暴露后小鼠状态十分虚弱且出现大量死亡，所以 本次实选择8min内上升至7000m海拔维持24h的造模条件进行下一步实验。
实施例2 蛋白质组学初步探讨急性高海拔暴露小鼠脑组织可能变化的蛋 白及信号通路
1.实验试剂与仪器
1.1药品与试剂
Figure BDA0003248931060000091
Figure BDA0003248931060000101
1.2实验仪器
Figure BDA0003248931060000102
2.实验方法
2.1技术路线图
具体见图6所示。
2.2小鼠脑组织蛋白制备及酶解
自80℃冰箱内取出常氧组(N)、7000m高原暴露组样品(n＝3)，称 量适量组织样品，并移入研钵(已经液氮预冷)内，将液氮加入，彻底研磨， 使其呈粉末状。向每组样品内皆逐一添加粉末4倍量的裂解缓冲液(1％的磷 酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂，还有8M尿素构成)，接着超声裂解处理。之 后于12000g转速、4℃温度下行离心处理，计时10min，将细胞碎片清除 掉，把上清移入另一离心管，借助BCA试剂盒来检测蛋白浓度。提取各样品 等量蛋白，实施酶解反应，于56℃温度中，通过二硫三醇(5mM)进行还 原，计时0.5h，于室温中，通过碘乙酰胺(llmM)，实施15min烷基化处 理。
将TEAB(lOOmM)放到尿素(浓度＜2M)内，以此完成对蛋白质样品 的稀释。最后，添加胰蛋白酶(为蛋白质量的1/50)实施首次经夜消化处理， 添加蛋白质量1/100的胰蛋白酶实施第2次的4h消化处理。
2.3 TMT标记
待结束胰蛋白酶消化，开始经由StrataXC18SPE柱实施脱盐操作，接着 真空干燥。肽于TEAB(0.5M)内重组，同时基于TMT试剂盒说明书所示 操作完成加工处理。即将TMT试剂置于乙腊内，解冻和重组处理。接着于室 温中对肽混合物行120min孵育处理，同时依次为真空离心混合处理、脱盐 操作与干燥处理。
2.4 HPLC分级
通过碱性反相HPLC完成肽段的分级，所用色谱柱 (Agilent300ExtendC18)的参数设定如下：粒径5um、长250mm、内径4.6mm。 在肽段分面梯度方面，乙腈的浓度是8％至32％，酸碱度是9，60个组分分 离的用时为1h，接着合并60个肽段成6个，对这6个组分开展真空冷冻干 燥处理，备用。
2.5串联质谱耦合液相色谱法(LC-MS/MS)
将胰蛋白酶肽溶于0.1％甲酸(溶剂A)中，直接负载到自制的反相分析 柱(15厘米长，75μm I.D)。梯度由6％增加到23％的溶剂B(0.1％甲酸在 98％乙腈中)超过26分钟，23％增加到35％在8分钟，爬升到80％在3分 钟，然后保持在80％的最后3分钟，所有的恒定流量为400nL/min在 EASY-nLC1000UPLC系统。这些肽被置于NSI源中，然后在QExactiveTMPlus(Thermo)中进行串联质谱(MS/MS)，并在线耦合到UPLC。 电喷雾电压为2.0kV。全扫描的m/z扫描范围为350～1800，于OrbitraP内检 出完整的肽，达70,000分辨率，之后将肽当做MS/MS设置NCE为28，同 时于OrbitraP内检出片段，达17,500分辨率。1类数据依赖的过程，于1次 MS扫描间交替出现，再实施20遍MS/MS扫描。
2.6数据库搜索
所得到的MS/MS数据使用Maxquant搜索引擎(vl.5.2.8)进行处理)。 借助连接反向诱饵数据库的人单螺旋数据库，来搜集串联质谱。切割酶选择 胰蛋白酶/P，切割缺失个数允许值为4个。首次搜索时，设置前驱体离子的 质量耐受性为20PPm，主要搜索是调整成5PPm，关于碎片离子的质量耐受 性，则设置成0.02Da。固定修饰是Cys上的梭甲基，可变修饰则为Met上 的乙酰化与氧化。调节FDR，使其在1％以下，将修饰肽的最低分数设置＞ 40。
2.7生物信息学分析
GO注释中，蛋白质存在分子功能、细胞间隔与生物过程之分。针对各 类别，借助双尾Fisher精准测试，对差异表达蛋白(DEG)对各鉴定蛋白的 富集展开检测。GO具备显著性的标准为：校正后P值在0.05以下。富集通 路分析：借助数据库KEGG，经由双尾Fisher精准测试，对富集通路展开鉴 定，从而测试DEG对各鉴定蛋白的富集。通路具备显著性的标准为：校正后P值在0.05以下。在KEGG网站中，此类通路进行了等级类别的划分。浓 缩的蛋白质域分析：针对各类别的蛋白质Jnterpro网的存在数据库研究测试 差异表达。校正P值＜0.05的蛋白被认为具有显著性。
3.统计学方法
统计分析蛋白质组学数据由PROGENERATION相同SPOT软件自动执 行。使用GraPhPad-8进行数据分析。One-way Analysis of Variance(ANOVA) 比较多组间差异，t检验比较两组间差异，P<0.05认定为有统计学差异。
4.结果
4.1小鼠脑组织差异蛋白鉴定
采用HPLC-MS/MS TMT标记法对N组与7000m组脑组织进行定量蛋白质 组学分析，鉴定出5909个蛋白质，其中5715个含有定量信息。对所有差异 表达的蛋白质进行蛋白质功能注释、功能分类、功能富集和基于功能富集的 聚类分析，变化比值>1.2或<0.83发现上调蛋白42个，下调蛋白43个蛋白 (P<0.05)，见表2和图7。
表2 差异表达蛋白总表
Figure BDA0003248931060000121
Figure BDA0003248931060000131
Figure BDA0003248931060000141
4.2小鼠脑组织差蛋白GO功能注释
差异蛋白GO功能注释结果显示：生物进程(BP Biological Process)主 要涉及单有机体过程、细胞过程和生物调节等12个方面；差异蛋白的细胞组 成(CCCellularComPonent)涉及8个方面，主要包括细胞、细胞部分和细胞 器等；所涉及的分子功能(MF Molecular Function)主要包括7个方面。见图 8。
4.3小鼠脑组织差异蛋白KEGG富集分析结果
差异蛋白KEGG富集分析结果显示：显著富集的信号通路有10条(P< 0.05)见表3和图9，重要相关蛋白12个见表4。
表3 显著性KEGG通路
Figure BDA0003248931060000151
表4 KEGG通路中相关蛋白详解
Figure BDA0003248931060000152
Figure BDA0003248931060000161
5.讨论
越来越多的人因为各种需求急进高原地区，伴随而来的是各种高原病， 其中就包括高认知行为障碍，因此初步探究蛋白质组学低压低氧中的变化， 以揭示新的病理生理机制，确定新的生物标志物和/或潜在的治疗目标对高原 开发十分有意义。有报道比较了蛋白质组在3、6、12和24之后分别进行低 压低氧，以了解低氧调节的早期蛋白质和通路。这是第一个全面的蛋白质组 研究报告蛋白质组水平的变化，在海马和皮层响应低压缺氧发现88和73低 氧应答蛋白。发现Got 1等糖酵解酶显著上调。
葡萄糖转运家族中的重要成员Slc2a1(GLUT1)在脑内代谢中扮演着重 要角色。缺血缺氧时会应激性增加，以适应低氧环境下的能量匮乏，以确保 脑内神经细胞的葡萄糖供应。通过本次定量蛋白质组学生物信息学分析研究， 我们发现，在急性高原暴露后，多个通路存在异常，初步判断可能和P17809 Slc2a1(GLUT1)参与多个信号通路相关，包括map05166 Human T-cell leukemia virus 1infection人t细胞白血病病毒1感染、map05211 Renal cell carcinoma 肾细胞癌、map 05230 Central carbon metabolism incancer癌症的中心CP碳代 谢、map 04066 HIF-1 signaling Pathway HIF-1信号通路和map 04919 Thyroid hormone signaling Pathway甲状腺激素信号通路。变化差异较大的通路蛋白可 能是急性高原认知障碍的生物标记物，或生物体的应激保护因子，除Slc2a1(GLUT1)外，还有Fxn、MaP2k2、H2-D1、Mug1、Ndufa1、Polr2e、Sdc等。 其中Fxn(编码frataxin的基因)的内含子内gaa x ttc三胞胎的扩增导致转录 沉默，从而形成了神经退行性疾病共济失调的分子基础。自噬失调可能在神 经退行性疾病的发病机制中起着核心作用，而MAP2K2在神经元自噬中起到 重要作用。Ndufa 1突变会导致线粒体疾病，并在年长的人群中诱发神经性退 行疾病如帕金森、阿兹海默症。
6.小结
GLUT1在急性高原暴露后显著增加，其涉及通路除HIF-1 signaling Pathway外还包括多种信号通路。由此可见，Slc2a1(GLUT1)可能是防治急 性高原暴露认知障碍的重要靶点。
实施例3 四氢姜黄素对急性高原暴露小鼠认知障碍的保护作用及机制
1.试剂与仪器
1.1实验药品试剂
Figure BDA0003248931060000171
Figure BDA0003248931060000181
1.2主要仪器及设备
Figure BDA0003248931060000182
Figure BDA0003248931060000191
2.实验方法
2.1分组及造模
将48只小鼠被随机分为4组，常氧组(N组，等体积生理盐水灌 胃)急性高海拔暴露模型组(HH组，等体积生理盐水灌胃)，四氢 姜黄40mg/kg组(THC组，40mg/kg四氢姜黄素灌胃)，S(salidroside) 组(红景天口服液组2mL/kg灌胃)，每组12只，暴露前三天连续 灌胃给药。第三天灌胃结束30min后放入小动物低压低氧舱内，8min 内升至7000m海拔，暴露24h，后立即检测行为学，随后麻醉取脑存 于-80°冰箱待测。
2.2认知行为能力测试
2.2.1转棒仪测定
同实施例1的2.5.1
2.2.2 Y-迷宫测定
同实施例1的2.5.2
2.2.3旷场试验
小鼠被放置在方形露天场室的中心(40×40×40厘米，长度×宽度 和高度)，光滑的蓝色地板和蓝色的墙壁，并允许自由探索5分钟。 地板被分成九个正方形。老鼠的行为是用位于房间上方的数码相机记 录的。使用迷宫视频成像软件(Stoelting公司，WoodDale，IL，美国)， 计算在中心的时间和运动总距离。每个试验之间用70％乙醇擦拭干净。
2.3脑含水量
同实施例1的2.6
2.4神经递质水平
测量与神经递质合成和分泌变化相关的行为和认知功能障碍。脑组织在1： 9 PBS(PH＝7.4)中研磨。匀浆在5000×g下离心10min，4℃，取上清液进 行测定。谷氨酸和去甲肾上腺素(NE)水平在脑组织中被量化的高灵敏度酶 联免疫吸附试验与商业上可用的试剂盒遵循制造商的指示。用微板阅读器在 450nm处用光学密度测量吸光度。
2.5组织学检查
HE染色同例1，同时用透射电子显微镜观察到了神经元和星形胶质细胞 中线粒体的超微结构形态。海马体完全浸入显微镜固定液，用分级乙醇脱水， 嵌入，超薄切片，染色。通过TEM可以观察到海马体内细胞内质网和线粒体 的超微结构。最后，在电子显微镜下拍照。
2.6氧化应激水平
脑组织在冰上研磨后取上清液检测氧化应激参数。3500r/min，4℃离心， 10min，取上清液测定相关指标。测定脑组织中丙二醛(MDA)的产量以及 超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性。在532处 测定MDA含量；在550和412nm处分别测定SOD、GSH-Px含量。
2.7免疫荧光
用荧光染料2，7-二氯荧光素二乙酸酯测定细胞内活性氧(ROS)。简单 地说，用1XPBS洗涤，然后在100μL10μM DCFH-DA在1X PBS中孵育 30分钟，在37℃下分别在485和530nm处检测荧光信号进行观察样品用 PBS在柠檬酸钠抗原缓冲液中冲洗三次，在3％牛血清白蛋白溶液 (Sigma-Aldrich)中浸泡30min，在PBS中稀释一夜。采用兔抗阻塞素 (BiossBS-1495R；1：200)和小鼠抗神经元核心抗原(NeuN)单克隆抗体 (Chemicon，1：100)抗体，鼠抗星形胶质细胞抗原GFAP单克隆抗体样品 (Chemicon，1：100)与二次抗体在黑暗中孵育50min。添加山羊抗兔Alexa488 共轭抗体(1：400，Servicebio)和山羊抗兔CY3标记抗体(1：300，Servicebio) 二级抗体。最后用4`，6-二氨基-2-苯基环吲哚(Sigma-Aldrich)在26℃的黑 暗中染色10min，在倒置荧光显微镜共聚焦激光扫描显微镜下观察。
2.8 Western blotting
基于蛋白质组学的结果，用Western blotting验证脑组织中HIF-1α的表达。 冷冻的脑组织在含有蛋白酶抑制剂的冰冷的RIPA缓冲液中被分解。在 10,000×下离心10分钟收集溶解蛋白，获得上清液。使用BCA蛋白质检测试 剂盒测定蛋白质浓度。通过10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的溶物， 电泳转移到聚二氟乙烯膜上，并用以下主要抗体检测：兔多克隆occludin(1： 1000)、兔克隆HIF-1α、兔克隆GLUT1、GULT3(1：500)。使用和抗β肌 动蛋白(1：1000)作为内部Ns。将PVDF膜与对应的二抗室温孵育2h。随 后用1×TBST缓冲液洗涤4×10min，显色发光，记录结果。条带强度使用 ImageJ进行量化。实验结果使用目的条带灰度值/β-actin灰度值表示。
3.统计学分析
所有实验数据均使用GraPhPad-8进行数据分析和绘图。使用One-way Analysisof Variance(ANOVA)比较多组间差异，t检验比较两组间差异，P< 0.05认定为有统计学差异。
4.结果
4.1 THC改善急性高原暴露后的脑水肿
小鼠大脑含水量测定结果如图10所示。与N组相比，HH组、THC组 小鼠脑含水量都有增加趋势(P<0.05)，此外，与HH组相比，THC组脑含 水量增加均具有显著性差异(P<0.05)。与N组相比，Occludin的表达量 显著降低(P<0.01)，而THC组Occludin的表达量较HH组显著升高(P< 0.05)。THC组与S组对于急性高原暴露导致的脑水肿增加及occludin下降治疗效果并无明显差异。
4.2 THC改善急性高原暴露认知障碍
在急性暴露24小时后，小鼠接受旷场试验，以评估其一般运动能力。如 图11。THC组较N组总行程距离(A)中心区域时间(B)显著性降低(P< 0.05，P<0.01)，但相较于HH组显著降(P<0.05，P<0.01)，表明THC预 处理影响了一般的运动和情绪活动。Y-迷宫试验表明，暴露于HH会降低有 效自发率(C)，说明小鼠空间工作记忆受损(P<0.01)。但THC预处理较HH组增强了空间学习能力(P<0.05)。转棒仪常为身体协调能力的试验， 与N组相比，暴露于缺氧高海拔条件会导致全身协调能力出现明显的缺陷， 这表现在从HH组与THC组从加速的转棒仪上跌落的潜伏期降低(P<0.01)， 但是THC组与HH组的坠落潜伏期无显著性差异。但是S组较HH组、THC 组跌落潜伏期显著增加(P<0.01)。这些结果提示THC对急性高原暴露小鼠的认知障碍有有益的影响，但未能改善协调能力的下降。
4.3 THC对急性高原暴露的脑组织结构影响
经H&E染色结果显示，如图12，400×放大倍数下，N组在脑细胞排列正 常，皮质神经元和脑毛细血管结构正常，椎体细胞形态正常，排列整齐。在 HH组中，皮质血管周围间隙增大，发生充血，而含有神经元和小胶质细胞 的间隙扩张，锥略缩小。这些结果表明，脑水肿的产生，海马CA1区细胞不 规则，无组织。海马CA3区可见大量萎缩的椎体细胞，细胞核呈黑色染色。 THC组比HH组更能缓解皮质血管的充血和细胞空洞，充血减少提示水肿程 度减轻，CA1区细胞排列较紧密。在CA1区没有萎缩的椎体细胞，但在CA3 区观察到一些。
此外，我们通过TEM观察到暴露的海马神经元的线粒体变化如图12。在 N组，线粒体的形状主要为管状；在HH组，一些线粒体膨胀、肿胀，显示 内部嵴结构丧失。与HH组中的线粒体相比，THC和S组肿胀的线粒体数量 减少，嵴结构损伤降低。
4.4 THC调节神经递质水平
图13显示了HH组较N组去甲肾上腺素NE和谷氨酸GLU在大脑匀浆中 显著升高(P<0.01)。与HH组相比，THC预处理降低了脑组织中去甲肾上 腺素和谷氨酸的水平(P<0.01)，降低了神经毒性。并且抗NE递质水平变 化能力高于S组(P<0.05，P<0.01)。
4.5 THC拮抗急性高原暴露诱导的小鼠脑组织氧化应激
脑匀浆中SOD、MDA和GSH-Px的活性水平。如图14所示，HH组脑 组织上清液中SOD和MDA水平明显低于N组(P<0.01，P<0.01)，THC处 理小鼠SOD水平较HH组显著升高(P<0.05)，MDA水平显著下降(P<0.01) 提示THC促进适应低氧环境的效应。与N组相比，HH组后GSH-Px活性降 低(P<0.01)，与HH组相比，THC处理组后GSH-Px活性增加(P<0.01)。 表明THC提高了小鼠的抗氧化能力，以保护其免受HH所致脑损伤。各组S 组与THC组相比均无显著性差异。用DHE荧光染料测定细胞内ROS的积累 (图15)。与N组相比，HH组的ROS水平在皮质和CA1中显著上调(P<0.01， P<0.01)，而THC组的ROS水平与HH组相比略有下降(P<0.05，P<0.01)。
4.6 THC提高急性高原暴露中海马区神经元活性
根据免疫荧光染色图16，HH组神经元标志物Neun较N组明显降低，与 HH组相比，THC组Neun上调且明显于S组。
4.7结合蛋白质组学进行目标蛋白验证
如图17根据蛋白质组学结果测定GLUT-1、GLUT-3和HIF-1α的GLUT 的表达水平。在整个实验中观察到HH组GLUT-1和HIF-1α的表达较N组 显著上调(P<0.05，P<0.01)HIF-1α在THC的作用下下调(P<0.05)； THC组GLUT-1则较HH组更增加了(P<0.05)。然而，本次实验结果显 示HH或THC处理对小鼠大脑中GLUT-3表达水平影响不显著。
5.讨论
本部分初步探究了THC保护急性高原暴露所致认知障碍的作用机制。本 研究中行为测试表明，THC改善了HH暴露小鼠的Y-迷宫工作记忆能力和旷 场中一般运动能力，但是对协调能力并没有显著改善。红景天对于小鼠协调 能力的改善可能与它提高高原运动能力及抗疲劳性有关，也可能是红景天对 于其他神经递质的作用。如李洋洋等发现受试者服用红景天后，再次暴露于 低压缺氧环境时，受试者体内的多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺皮质激素含 量下调，肾上腺素含量升高，提高了机体在高海拔缺氧条件下的劳动能力。
氧化应激损伤作为高原暴露中必不可少的损伤机制，预先补充THC提高 了HH暴露后的抗氧化应激能力，增强了海马区自由基的清除，保护了海马 区的神经功能。急性高海拔缺氧可诱导机体大脑神经递质和激素水平的改变。 谷氨酸是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质，负责记忆巩固和认知等多 种功能。低血压低氧暴露和过度刺激谷氨酸转运蛋白会导致中枢神经系统功 能障碍和兴奋性毒性。肾上腺素能调节失调是由于缺氧的而导致的认知功能 障碍的一个重要原因。NE参与大脑的认知、运动和自主神经功能，特别是在 学习和记忆巩固中。它是反映中枢神经系统健康的一个重要标志。NE的增加 会导致脑血管收缩而血流量降低，过量会导致头痛、呕吐。在我们的研究中， THC逆转了由HH引起的神经递质水平的增加，并减轻了神经毒性的发生， 这与本研究的结果一致。
本部分研究的一个关键部分是解释了THC改善急性高海拔暴露神经损伤 的潜在分子机制，这一机制可能通过抗氧化和调节HIF-1α通路信号和葡萄糖 转运来发生。HIF-1α的表达在缺氧中并不明显，当身体暴露于低氧环境中时， HIF-1α作为缺氧信号通路的关键因素被激活。THC则抑制了HIF-1α的过度 表达。虽然HIF-1α在缺氧期间改变神经元生存率中的作用是有争议的。例如， 一项研究了HIF-1α过表达对初期阶段缺氧适应和保护的影响，但在长期缺氧 的情况下，神经保护作用逐渐减弱，神经元最终导致死亡。还有报道称，大 脑中的HIF-1α通道在早期缺氧时诱导神经元死亡。这种相反的表现发生是因 为缺氧诱导后HIF-1α稳定并转运到细胞核，以调节与适应性反应相关的各种 基因的转录。它调节70多个下游靶基因，包括与血管生成、葡萄糖代谢、细 胞增殖和存活有关的基因。因此，它不同的表现与损伤程度及调控的分子机 制有关。以往研究的类似结果表明，THC下调宫颈癌细胞中HIF-1通路。红 景天对急性高海拔暴露24h的大鼠具有保护作用，具体原因可能是通过 HIF-1α/micro-RNA 210/ISCU 1/2(COX 10)信号通路调节细胞凋亡和线粒体 能量代谢，减轻HH诱导的脑损伤。此外，我们之前的研究表明，THC通过 抑制HIF-1α下游效应子VEGF和MMP-9，BBB损伤蛋白的表达来保护BBB 功能，从而减轻脑水肿。
HIF-1α下游蛋白GLUT1也被证实参与了HH诱导的大脑能量稳态平 衡，并促进缺氧后神经元的修复。据报道，HH会增加成年大鼠在BBB中的 脑毛细血管密度和葡萄糖转运效率。而THC则增强了大脑应激诱导保护的作 用。上调HIF-1下游基因(含GLUT1的表达量。在临床中，GLUT1-DS(GLUT 1基因缺陷综合症)是葡萄糖无法透过BBB，使得中枢神经元ATP代谢异常， 由此引发小头畸形、语言功能不良、癫痫发作、发作性运动不良、共济紊乱、 肌张力不良等临床症状。低氧下后GLUT基因与蛋白质水平皆大幅上调表现， 促进葡萄糖跨BBB的转运，改善能量代谢异常，提高神经元能量获取，可能 是机体对急性缺氧脑损伤的保护体现。有关研究显示，THC的前体物-姜黄素 在糖尿病性脑梗死中上调GLUT1和GLUT3的转运活性，并在L929成纤维 细胞中增加GLUT1的表达作用。李新娟等的研究结果显示，牛磺酸能够有 效保护弥漫性脑创伤大鼠的脑组织，相关机制可能为提高了GLUT1与其蛋 白的表达，由此使脑组织的ATP供应得以维持。GLUT1除了对脑内能量代 谢至关重要，对血脑屏障的完整性和功能也起着重要的作用。乙醇能够抑制 葡萄糖跨BBB的转运能力，破坏BBB紧密连接结构，从而导致BBB功能 障碍和神经性疾病综合症。可见GLUT1在血脑屏障功能及完整性中也起着 重要的作用。GLUT1基因敲除斑马鱼的胚胎中，HH组血脑屏障上紧密连接 蛋白occludin表达下调，血脑屏障的渗透性增加，出现血管源性的脑水肿。 随着缺氧时间延长，进一步增加毛细血管内压力产生更多的水肿液，从而使 脑水肿更加重，导致血流量的减少并加重了供氧量的降低，使神经细胞坏死， 所以脑水肿也是导致认知障碍的重要原因之一。
6小结
本部分实验证实THC可以保护急性高原暴露认知障碍，机制与降低脑水 肿，减低氧化应激，减少ROS和神经递质的堆积，抑制HIF1-α，增强GLUT1 表达相关。四氢姜黄素有望成为急性高海拔暴露前的补充剂从而降低急性高 原暴露诱发的认知障碍。
综上，本发明利用动物低压氧舱7000m暴露24h的模型成功模拟小鼠急 性高海拔暴露后认知障碍模型，其具体的神经损伤表现为脑水肿及认知行为 障碍。经利用新型TMT-LC-MS/MS高通量蛋白组学技术，检测相关的蛋白表 达，鉴定和筛选出常氧组与7000m暴露24h组间差异表达的蛋白组，并对 急性高原暴露的认知障碍发生机制进行了研究，结果发现四氢姜黄素的预补 充可以有效改善急性高原缺氧所致的脑水肿的发生及认知障碍，其作用机制 与其抗氧化功能、保护血脑屏障功能，降低神经毒性、对神经元的激活作用、 下调HIF-1α、上调GLUT1的作用机制相关。由此得出四氢姜黄素可作为急 进高原前后的补充剂，以预防或治疗高原认知障碍的发生。

Claims (10)

1.四氢姜黄素或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗高原认知障碍的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是预防和/或治疗急性高原认知障碍的药物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物是缓解氧化应激反应的药物。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物是减轻神经炎症反应的药物。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物是改善受损神经功能和/或脑水肿的药物。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的用途，其特征在于，所述药物是减少自由基和/或神经递质堆积的药物。
7.根据权利要求1～5任意一项所述的用途，其特征在于，所述药物是激活神经元，上调血脑屏障中紧密连接蛋白occludin表达，和/或下调HIF-1α药物。
8.四氢姜黄素或其食品上可接受的盐在制备调节机体功能的食品中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述食品是耐缺氧的食品。
10.一种治疗高原认知障碍的组合物，其特征在于，它是以四氢姜黄素或其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂；所述制剂为口服制剂、外用制剂或注射剂。
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