CN111926071B - 一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰老中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰老中的应用。本发明以太极拳锻炼人员作为实验组，与正常年轻人和老年人进行蛋白质谱比对，筛选到FABP4蛋白，其表达在老年人血液中与年轻人相比显著上升，但在太极锻炼老年人中该趋势被显著逆转。在老龄小鼠中敲低FABP4基因表达或抑制FABP4活性显著改善认知功能、抑制衰老和相关炎症指标。提示FABP4基因具有促进衰老的作用，并可作为改善健康衰老的分子靶点，为延缓衰老提供了新靶点和新策略。

Description

一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰 老中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰老中的应用。
背景技术
世界迎来“全球老龄化”时代，而我国已进入老龄化社会并处于老龄化不断加深的阶段。预计到2020年，全国60岁以上老年人口将增加至2.55亿人左右，占总人口比重提升到17.8％左右，老龄化带来的社会负担日益加重。衰老与众多年龄相关的疾病密切相关，包括阿尔茨海默病、帕金森氏症、中风、外周神经病变、黄斑变性、白内障、老年性耳聋、II型糖尿病、骨质疏松、骨关节炎、动脉粥样硬化、前列腺增生及多种癌症等。
衰老是遗传和环境因素共同作用下机体器官功能持续衰退的复杂过程，是生命的基本特征之一。目前，关于衰老机制的理论包括：氧化应激学说、基因组稳定性下降、端粒缩短、表观遗传改变、蛋白稳态失调等，这些理论普遍支持衰老是一个程序化控制的、可被干预的生物学过程。随着人类预期寿命延长，老龄化社会来临，老年群体阿尔兹海默病、癌症、糖尿病、心脑血管疾病等的发病风险也极大增加。如果延长寿命却不能改善老年人口的生活质量，那么这种寿命的延长没有太大的意义。科学家们认为，寿命的延长应以延缓老化、保持一定的生活质量为前提。如何延缓衰老相关的功能退化、预防和治疗老年性疾病，已成为亟待解决且具有重大意义的科学问题。
近年来，很多衰老研究试图通过蛋白质组学技术从宏观上探寻衰老相关的分子标志物。 Dunston等通过比较年轻人和老年人的蛋白质组鉴定了铁转运蛋白、补体C3b和甲状腺素运载蛋白表达发生显著改变。Miura等选取长寿人群的研究发现结合珠蛋白、微球蛋白和丛生蛋白是衰老相关的蛋白因子。而Thambisetty等发现载脂蛋白ApoE的表达水平与老年人阿尔兹海默症有着密切的相关性。然而，这些研究普遍检测深度不足，对低丰度蛋白无法进行精确定量，难以反映衰老的过程对血液循环中蛋白因子的广谱调控，而且各研究发现之间缺乏重复验证。因此，需要更进一步的蛋白组学研究，特别是对低丰度蛋白进行精确定量。
如何最大限度地维持老龄人口健康，干预衰老相关疾病并延缓衰老的发生对于医疗系统、体育系统乃至整个社会都是巨大的挑战。近年来欧美学者所提倡和推广的“运动即良药”的概念，它体现了现代医学对“运动促进健康”这一观点的广泛认同。太极拳运动成为全世界健康专家的共同选择，它是我国传统体育运动项目，拥有几千年的发展历史，对促进人体健康具有重要作用。研究表明，太极拳锻炼对帕金森病、冠状动脉粥样硬化、糖尿病、纤维肌瘤、关节炎等多种人类疾病有着显著的改善作用。实践证明，老年人经常参加太极拳运动，不仅能防病健身，还可延缓衰老过程。对此，太极拳锻炼为研究衰老及衰老相关疾病的分子机制提供了绝佳的模型。
太极拳干预的临床试验研究日趋国际化，继新英格兰杂志刊出太极拳干预PD治疗之后，国外研究者对太极拳在康复与预防领域的研究也得到了迅速的发展。在疾病的康复研究中， Yeh等人在10年内先后进行了三次慢性心衰患者的太极拳康复研究；Salmoirago-Blotcher等发现，持续12周的2次/周的太极拳锻炼显著改善冠状动脉心脏疾病的恢复；Pan等进行了 120人的研究发现，3个月的太极拳锻炼显著促进非小细胞肺癌患者手术后肺呼吸功能的恢复。这些研究提示，太极拳锻炼具有明显的延缓衰老、预防衰老相关疾病的作用，是研究衰老机制理想的模型，可以弥补临床衰老领域无法进行前瞻性研究的劣势。
脂质是许多生物过程的重要组成部分，对许多常见疾病的发病机制至关重要。脂肪酸结合蛋白(FABPs)是一类小分子，高度保守的胞质蛋白，可结合长链脂肪酸和其他疏水性配体，可调节脂质通量、转运、信号和代谢。细胞内和细胞外与蛋白质的相互作用使脂质的功能和多样性成为可能。FABPs最初被描述为细胞内蛋白质，可以影响细胞内的脂质通量、代谢和信号。随着这种蛋白质家族的功能得到进一步阐明，很明显，它们在局部和系统中都是新陈代谢和炎症过程的重要中介，因此是潜在的治疗目标。FABPs是参与分泌、吸血和细胞内脂肪酸输送到亚细胞细胞器(如线粒体和过氧化物体)的脂质载体，与葡萄糖代谢和脂质氧化有关。
脂肪酸结合蛋白4(Fatty acid binding protein FABP4；也称为Adipocyte-FABP，A-FABP，和aP2)，含132个氨基酸，分子质量为14719Da。FABP4是在脂肪细胞中发现的脂肪酸结合蛋白，是脂肪细胞中的脂质转运蛋白；呈β桶状结构(beta-barrel structure)，内部容纳疏水性配体，天然存在的长链脂肪酸和合成的疏水配体可以被接受到其中。通过结合长链脂肪酸和视黄酸，将长链脂肪酸和视黄酸提供给细胞核中的同源受体。FABP4充当内源脂肪酸从细胞表面到脂肪酸存储和代谢各个部位的转运蛋白。
FABP4由脂肪细胞分泌，其在肥胖人群中的水平较高。在人类中，高循环FABP4水平与肥胖、代谢疾病和心脏功能障碍有关。FABP4调节代谢和炎症途径，在小鼠模型中，抑制FABP4可以改善2型糖尿病、动脉粥样硬化、和免疫代谢疾病。FABP4的基因缺陷和小分子介导抑制可以有效改善小鼠模型中的葡萄糖平衡，减少动脉粥样硬化。FABP4的循环形式在系统代谢中具有关键的荷尔蒙功能，它在脂肪细胞和巨噬细胞中高度表达，并且与胰岛素抵抗、代谢综合征和动脉粥样硬化的发展有关。此外，这种蛋白质作为细胞质穿梭蛋白，用于核受体PPAR的配体活化，以激活其下游转录靶点，参与细胞分化、凋亡和抗炎反应。FABP4抑制剂BMS309403是选择性靶向FABP4抑制剂。其Ki值小于2nM。BMS309403是一种芳香族联苯偶氮化合物，可与脂肪酸竞争高特异性的A-FABP结合口袋。BMS309403已显示出可降低THP-1巨噬细胞的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)分泌。BMS309403可以有效预防严重的动脉粥样硬化和2型糖尿病。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物，所述分子标志物为 FABP4基因和/或FABP4基因的表达产物。
如上述的一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物在制备用于检测和/或治疗动物衰老指标或衰老相关疾病的试剂和/或试剂盒中的应用。
进一步地，所述衰老指标包括动物体重、胰岛细胞病变中的至少一种。
如上述的一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物在制备用于检测和/或治疗动物认知功能的试剂和/或试剂盒中的应用。
进一步地，所述认知功能包括动物学习和/或记忆能力。
如上述的一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物在制备用于检测和/或治疗动物炎症情况的试剂和/或试剂盒中的应用。
如上述的一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物在制备用于检测和/或治疗动物肝功能的试剂和/或试剂盒中的应用。
进一步地，所述试剂和/或试剂盒包含FABP4的抑制剂。
进一步地，所述FABP4的抑制剂为FABP4基因的siRNA、FABP4基因的RNA干扰载体、FABP4的抗体及其他能够抑制FABP4表达的抑制剂中的任一种。
如上述的一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物在制备用于筛选与衰老相关的诊断和 /或治疗药物的细胞模型和/或动物模型中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
1.本发明发现FABP4基因的新功能，即FABP4基因能够加速衰老相关疾病的作用。
2.基于FABP4在加速衰老相关疾病中的功能，为衰老疾病的药物提供靶标。
3.FABP4的抑制剂可用于制备保护肝功能和治疗衰老相关疾病的药物。
本发明紧扣国家健康工程战略规划，以老年对照和太极拳锻炼人群的横截面研究为基础，结合动物实验研究衰老的分子机制，尤其是衰老过程中影响代谢的调控机制。从分子水平探索衰老的新机制，为临床预防和治疗衰老提供新的分子靶点，它不仅为太极拳预防衰老提供科学证据，对于人类携手应对衰老和衰老相关疾病的共同威胁和挑战具有重大意义。
本发明在前期研究过程中分析了太极拳习练习3年以上的老年人，以及同龄对照老年人和对照年轻人，体检数据显示，太极拳锻炼显著改善了老年人衰退的脑血管功能、心脏收缩及舒张功能及骨密度。采用蛋白质谱分级检测方法，鉴定血液中的分泌蛋白；筛选在衰老过程中丰度改变、同时在太极拳组变化趋势逆转的蛋白分子我们通过对血浆蛋白质组学的研究，共筛选到了多个与衰老相关的显著差异表达的蛋白。其中蛋白FABP4在年轻人中显著低表达，在老年人群中显著高表达，而练习太极拳的老年人组中FABP4的表达趋于年轻人中的低表达。这些结果表明FABP4可能在逆转衰老的发生过程中发挥重要作用。
本发明以FABP4基因敲低小鼠为实验对象，通过构建衰老模型，结果表明与野生型C57 小鼠对比，FABP4基因敲低小鼠，老年鼠的认知功能有改善，衰老和炎症指标被抑制。这提示FABP4基因具有促进衰老的作用，为FABP4在研究延缓衰老的新靶点和新策略中所发挥的作用提供了理论依据和临床基础。
因此，FABP4基因可作为药物靶点，构建FABP4基因敲除和过表达的体外细胞模型或动物模型，用于筛选预防、缓解和/或治疗和衰老相关的药物；FABP4基因也可作为基因治疗中的靶基因，设计并制备预防、缓解和/或治疗衰老疾病的药物和/或生物学试剂，通过基因工程技术达到预防、缓解和/或治疗衰老疾病的目的。例如以FABP4为靶基因，设计可干扰FABP4 表达的siRNA，shRNA，和AAV-shRNA，通过化学方法合成以后，注射入人体通过RNA干扰的方法使FABP4基因沉默来治疗衰老相关疾病；此外，还可以以FABP4为靶点设计小分子化合物抑制剂，利用FABP4基因过表达的体外细胞模型或动物模型，通过筛选，发现其中能够特异性抑制FABP4的分子，从而为肝脏缺血疾病的治疗提供新的治疗性分子。
本发明涉及到FABP4对衰老的调控作用，对探索衰老相关的机制研究及药物开发将具有重大意义。
附图说明
图1是实施例2中的蛋白组学筛选结果；
图2是实施例4中对小鼠认知功能的检测结果；
图3是实施例5中对衰老和炎症指标的检测；
图4是实施例6中代谢笼实验结果；
图5是实施例7中肝脏脂肪评价结果；
图6是实施例8中FABP4抑制剂BMS309403对衰老小鼠生理指标改善结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中涉及的蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
本发明披露了一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰老中的应用，具体如下各实施例所示。本发明中涉及的实验动物：8-10周龄、体重在24g-27g，背景为雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，购自北京华阜康生物科技有限公司)、腺病毒AAV9-shNeg和腺病毒AAV9-shFabp4构建。由汉恒生物科技(上海)有限公司参照小鼠的Fabp4序列，利用pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP质粒载体，构建含shFabp4片段的真核表达质粒，其中，shFABP4的Forward primer为 rGrGrCrCrArArGrCrCrCrArArCrArUrGrArUrCrArUrCrAGT，SEQ ID NO.1，Reverse primer为 rArCrUrGrArUrGrArUrCrArUrGrUrUrGrGrGrCrUrUrGrGrCrCrArU，SEQ ID NO.2。并将质粒包装为腺相关病毒AAV9-shFabp4，而空载的pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP质粒包装为腺相关病毒AAV9-shNeg作为对照。小鼠16月龄时经尾静脉注射AAV9病毒：对照组腺病毒 AAV9-Neg和FABP4敲低组腺病毒AAV9-shFabp4，每次小鼠注射病毒剂量为5.5×1011 particles。
饲养环境：所有实验小鼠均饲养在武汉大学人民医院SPF级实验动物中心。小鼠专用饲料由中国军事医学科学院动物中心提供。饲养条件：室温在22-24℃之间，湿度在40-70％之间，明暗交替照明时间为12h，自由饮水摄食。
本发明中涉及的FABP4(人)在NCBI数据库中的编号：基因ID为2167，核苷酸序列编号NM_001442.3，蛋白序列NP_001433.1。FABP4(小鼠)在NCBI数据库中的编号：基因ID为11770，核苷酸序列编号NM_024406.3，蛋白序列NP_077717.1(构建腺病毒时采用小鼠的序列)。
实施例1 太极拳锻炼对人体各指标的改善作用
入组人员：入组22-25岁青年对照人群、60-69岁老年对照人群、60-69岁习练太极拳3 年以上人群，分别作为青年对照组、老年对照组及太极拳组。
1.脑血管功能检测
采用脑血管功能检测仪(GT-3000)对被试人群进行双侧颈总动脉血流动力学分析，利用多普勒探头采集脑血流信息，获得脑血流速度和平均血流量；利用脉动压力传感探头采集脑血管弹性相关信息，获得外周阻力、脉搏波速等相关指标。检测指标：平均流量(Qmean)，平均流速(Vmean)，最大流速(Vmax)，最小流速(Vmin)，脉搏波速(Wv)，特性阻抗(Zcv)，可扩张度(ID)，外周阻力(Rv)，动态阻力(DR)，临界压水平(Cp)，舒张压与临界压差值(Dp)等。
2.心脏功能彩超检测
采用数字化彩色超声诊断系统(SONOLINEPremier,SIEMENS)对被试人群进行心脏功能检测，经胸二维超声心动图(2DE)、及频谱多普勒显像(Doppler)对心脏的形态及舒缩功能进行测量。检测指标：升主动脉内径值(AAOD)，肺动脉内径值(MPAD)，左房内径值(LAD)，左室内径值(LVD)，右房内径值(RAD)，右室内径值(RVD)，舒张末期室间隔厚度(IVSD)，左室后壁厚度(LVPWD)，左室射血分数(LVEF)，主动脉瓣每分钟搏出量(AVSV)，二尖瓣E峰速度(MVDV：E)，二尖瓣A峰速度(MVDV：A)，肺动脉瓣每分钟搏出量(PVSV)。
3.骨密度检测
采用双能量X射线骨密度仪(Unigamma M,Ican scientific laboratories)对全部受试者正位腰椎(L1～4)骨密度(Bonemineral density，BMD)进行测定。骨骼矿物质密度是骨骼强度的一个重要指标，以克/每平方厘米(g/cm2)表示，是一个绝对值，在临床使用骨密度值时由于不同的骨密度检测仪的绝对值不同，通常使用T值判断骨密度是否正常。
Figure RE-GDA0002692600140000061
对以上各组人群的身体指标进行检测，结果见表1。通过太极拳老年组与正常老年组的对比分析，揭示了太极拳锻炼对老年人脑血管功能，心脏功能，以及骨密度衰老指标具有显著性的改善。
表1.太极拳锻炼对老年人脑血管功能，心脏收缩及舒张功能，骨密度的影响。
Figure RE-GDA0002692600140000062
Figure RE-GDA0002692600140000071
#,P值为老年组和太极老人组相比较进行计算。
实施例2 蛋白质组学筛选
将青年对照组、老年对照组及太极拳组的血浆样本按性别随机分为三个混合样，每组混合样含15个体的样本，分性别进行两次10标、36级串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT) 蛋白质谱鉴定，筛选在衰老过程中丰度改变、且太极拳组变化趋势逆转的蛋白分子标志物。
结果如图1所示：A.血清中IGF-1表达量的ELISA检测。B.血清中FABP4表达量的ELISA 检测。蛋白质谱揭示太极拳锻炼逆转老年人血循环中FABP4的升高。
实施例3 FABP4转基因小鼠的构建
自然衰老小鼠模型建立：购买8周龄C57BL/6野生型雄性小鼠，伺养到14个月时，分别进行腺病毒AAV9-shNeg和腺病毒AAV9-shFabp4注射，构建Fabp4敲减小鼠和其对照鼠。小鼠培养至20个月龄，建立自然衰老小鼠模型。在小鼠20个月时，检测相关指标。
实验分组：20个月腺病毒AAV9-shNeg转染衰老小鼠20只，20个月腺病毒AAV9-shFabp4 转染衰老小鼠20只，C57BL/6野生型8周龄年轻小鼠20只。
实施例4 对小鼠认知功能的检测
Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)实验是一种强迫实验动物游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，Morris水迷宫主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力的评价。通过检测指标Island latency，Island entries，Island time，speed 等，明确Fabp4对小鼠学习与记忆的影响。
1.获得性训练
(1)将小鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间(s)。在前几次训练中，如果这个时间超过90s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留15s。
(2)将动物移开、擦干。必要时将动物(尤其是大鼠)放在150W的白炽灯下烤5min，放回笼内。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔15～20min,连续训练5d。
2.探查训练
最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。
3.对位训练
测定动物的工作记忆(working memory)。探查训练结束后的第二天，开始维持4天的对位训练。将平台放在原先平台所在象限的对侧象限，方法与获得性训练相同。每天训练4次。每次记录找到平台的时间和游泳距离以及游泳速度。
4.对位探查训练
最后一次对位训练的第二天进行。方法与上述探查训练类似。记录动物60s内动物在目标象限(平台第二次所在区)所花时间和进入该区的次数。
结果如图2所示：A.5天小鼠寻找目标区域所需要的时间；B.进入目标区域的次数；C.第 5天小鼠寻找目标区域所需要的时间；D.在目标区域停留的时间。E.游泳速度。实验说明，敲低Fabp4能够改善认知功能。
水迷宫实验分为两个阶段，1-5天为学习，记忆能力的阶段，如图2A所示，是这5天小鼠寻找目标区域所需要的时间，衰老小鼠的学习能力和记忆能力都弱于年轻小鼠，敲除Fabp4 后轻度改善。图2的B-E反应的是第6天检测阶段的结果，相比于年轻小鼠，衰老小鼠进入目标区域的次数及在目标区域停留的时间减少，寻找目标区域的时间延长，游泳速度减慢，而敲除Fabp4对上述参数均有改善，但是只有进入目标区域的次数具有统计学意义。
实施例5 衰老和炎症指标的检测
RNA提取：向收集的心肌细胞中加入1ml的Trizol溶液，于冰上反复吹打至心肌细胞充分裂解，静置5分钟，加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15-30秒，静置2-3分钟，4℃下离心12000rpm x 15min。吸取水相层至新的EP管中，加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟，4℃下离心12000rpm x 10min。弃上清，于沉淀中加入预冷的75％乙醇1ml，重悬沉淀并充分洗涤，4℃下离心12000rpm x 5min。弃上清，晾干，加入适量DEPC水，65℃下促溶RNA。取2ul RNA行琼脂糖凝胶电泳检测RNA是否提取成功，剩余RNA不使用时于-80℃条件下保存。
实时荧光定量PCR(RT-PCR)：逆转录使用Thermo Fisher Scientific的逆转录试剂盒，逆转录为cDNA。逆转录后的cDNA用ddH2O稀释五倍，采用Thermo Fisher Scientific公司的 SYBRTM Green试剂检测mRNA水平，具体反应体系见表2。
表2实时荧光定量PCR反应体系
Figure RE-GDA0002692600140000091
反应条件：
95℃10min；95℃10sec，60℃10sec，72℃10sec，40cycles，40℃30sec，绘制溶解曲线，最终数据以2-△△Ct进行分析。
取各小组老鼠的肝脏组织提取总RNA，反转录后采用RT-PCR检测衰老相关因子p21的mRNA表达水平，以及Interleukin-6(IL-6)，和Interleukin-1beta(IL-1β))的mRNA表达水平，以18S rRNA的mRNA水平为参照。引物序列见下表:
Forward primer Reverse primer
P21 CCTGGTGATGTCCGACCTG,SEQ ID NO.3 CCATGAGCGCATCGCAATC,SEQ ID NO.4
IL-1β CCGTGGACCTTCCAGGATGA,SEQ ID NO.5 GGGAACGTCACACACCAGCA,SEQ ID NO.6
IL-6 AGTTGCCTTCTTGGGACTGA,SEQ ID NO.7 TCCACGATTTCCCAGAGAAC,SEQ ID NO.8
18S AGGGTTCGATTCCGGAGAGG,SEQ ID NO.9 CAACTTTAATATACGCTATTGG,SEQ ID NO.10
肝组织细胞衰老情况测定结果见图3所示，A.衰老指标p21。B.炎症因子指标IL-6和 IL-1β。实验结果说明，敲低Fabp4能够改善衰老指标和炎症因子水平。该部分实验检测了年轻小鼠(Young)，老年对照小鼠(Old-shNeg)和老年Fabp4敲低小鼠(Old-shFabp4)的衰老标志物p21和炎症标志物IL-6，IL-1β的mRNA表达水平。RT-PCR检测显示，三个指标FABP4敲低老年小鼠的衰老状况和炎症水平相比与对照老年小鼠均有明显改善，且与年轻小鼠相比无统计学差异，这些进一步提示FABP4与衰老相关。这些结果表明，抑制FABP4表达可以改善肝组织衰老情况。
实施例6 代谢笼实验(Metabolic cage experiment)
利用计算机对小鼠一天或数天的饮食，气体代谢，活动等情况进行实时监测，综合分析其代谢方面可能存在的异常表型。采用Oxymax/CLAMS动物代谢系统(Columbus，USA)，通过标准气体校正仪器对气体检测的精确性后，将小鼠在代谢笼中饲养，避免人为干扰，通过测定气体(氧气及二氧化碳)的改变计算小鼠的呼吸熵、产热，实时检测小鼠的摄食量改变，并通过红外线穿越次数计算小鼠实时活动情况。
检测指标包括：动物的水和食物消耗量、固体和液体排泄物质量、氧气的消耗量(VO2 consumption)，二氧化碳消耗量(CO2 consumption)、二氧化碳的产生量(CO2production)，热量生成量(Heat production)、活动度(Activity)等。
结果如图4所示，A和B.每小时耗氧量与二氧化碳产生量的变化曲线图。C和D.小鼠夜间及白天耗氧总量及二氧化碳生成总量的柱状图。E和F.小鼠24小时热量生成量及活动次数。结果表明Fabp4敲低能够增加衰老小鼠的基础代谢率。
图4中A和B是小鼠夜间及白天耗氧总量及二氧化碳生成总量的曲线图，相比于年轻小鼠，老年小鼠的耗氧量、二氧化碳产生量均明显下降，而敲除了FABP4的衰老小鼠耗氧量，二氧化碳产生量有所升高，主要集中在小鼠活动旺盛的夜间；Fabp4敲除可以显著增高小鼠夜间耗氧量，有统计学意义。图4中C-F是24小时热量生成及活动次数，敲除FABP4的衰老小鼠热量生产增加，活动次数增多，这与耗氧量的变化是一致的。
实施例7 肝脏脂肪评价
为了显示组织内的脂肪常采用油红O进行染色的方法。油红O为脂溶性染料，在脂肪内能高度溶解，可特异性的使组织内甘油三酯等中性脂肪着色。采用冰冻切片处理组织样本，并通过Hoechst33342对细胞核进行染色。肝细胞内的脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。通过红色面积区域的大小，评价肝脂肪变性程度。拍照后用ImageJ图像处理软件分析，明确衰老细胞的比例。
结果如图5所示，年轻小鼠(Young)，老年对照小鼠(Old-shNeg)和老年Fabp4敲低小鼠(Old-shFabp4)。肝组织油红O染色结果表明，年轻小鼠肝组织脂滴很少，衰老对照组肝组织间隙有大量脂滴，但还没到空泡状的程度，敲低Fabp4的部分小鼠有所较少。结果说明，Fabp4敲低能够改善衰老小鼠的脂肪程度。
实施例8 FABP4抑制剂BMS309403对衰老小鼠生理指标改善的作用
BMS309403(APExBIO，Boston,MA；Catalog No.B7794；Cas No.300657-03-8；分子式C31H26N2O3)为FABP4的特异性抑制剂。通过灌胃BMS309403抑制FABP4。
小鼠有3组：8周龄年轻小鼠组，衰老小鼠对照组(CMC-Na溶剂组)，衰老小鼠FABP4抑制剂组(BMS30940345)；每组各10只。
采用C57BL/6J背景的雄性小鼠灌胃15mg/kg/d，每周灌胃两次，从20周龄小鼠开始连续灌胃到22周(雄性)，22.5周(雌性)。收取脾脏样本，进行形态学检测。
结果如图6所示，分组：年轻小鼠(Young)，老年对照小鼠(Old Control)和老年Fabp4 抑制剂BMS309403(Old BMS309403)。
灌胃FABP4抑制剂BMS309403后，对小鼠的体重略有改善作用(图6A)，通过油红O进行染色的方法，可以观察到BMS309403对小鼠心脏，棕色脂肪，肝脏有显著的改善作用(图6B)。在灌胃FABP4抑制剂BMS309403后的胰岛细胞HE染色结果见图6C：显微镜下可见年轻小鼠组(Young)胰岛细胞基本正常，细胞结构整齐；而老年组(Old Control)胰岛细胞排列紊乱，其内有大小不等、形状不规则的坏死灶，坏死灶内胰岛细胞结构模糊，排列紊乱，离断，与正常胰岛细胞比较，胰岛细胞核发生典型的坏死改变，可见核固缩。这种现象在FABP4 抑制剂BMS309403组有明显的改善作用(图6C)。结果说明，FABP4抑制剂BMS309403 能够改善衰老小鼠生理指标。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种衰老以及健康衰老相关的分子标志物及其在改善健康衰老中的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
rgrgrcrcra rargrcrcrc rararcraru rgrarurcra rurcragt 48
<210> 2
<211> 54
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
rarcrurgra rurgrarurc rarurgruru rgrgrgrcru rurgrgrcrc raru 54
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctggtgatg tccgacctg 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccatgagcgc atcgcaatc 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgtggacct tccaggatga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggaacgtca cacaccagca 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agttgccttc ttgggactga 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccacgattt cccagagaac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agggttcgat tccggagagg 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caactttaat atacgctatt gg 22

Claims (2)

1.FABP4基因的抑制剂在制备用于改善雄性动物认知功能的试剂中的应用，所述认知功能为动物学习和/或记忆能力。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述FABP4的抑制剂为FABP4基因的siRNA、FABP4基因的RNA干扰载体、FABP4的抗体中的任一种。
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