CN113388578A

CN113388578A - 一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法

Info

Publication number: CN113388578A
Application number: CN202110945560.4A
Authority: CN
Inventors: 任峰; 王志爽; 李迺昶; 廖小平
Original assignee: Stm Tianjin Cell Engineering Technology Co ltd
Current assignee: Stm Tianjin Cell Engineering Technology Co ltd
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2021-09-14

Abstract

本发明提供一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法，该方法包括：提取脐带间充质干细胞，并利用脐带带间充质干细胞制备干细胞培养液，在制得的干细胞培养液中提取外泌体。本发明的培养基包含人参皂苷、人血清白蛋白和无血清基础，其中人参皂苷中的人参皂苷Rg1可以在一定浓度范围内促进MSC的增殖，人血清白蛋白能够为细胞提供氮源等有效营养成分，利用此培养方案可以增加MSC增殖能力进而提高了外泌体浓度，且在分离外泌体时，利用0.22μm的过滤器过滤离心后的上清液，可以将细胞碎片及大于200nm的囊泡全部去除，在不造成外泌体的丢失和外泌体形态改变的情况下，得到更纯度更高的外泌体。

Description

一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法

技术领域

本发明属于外泌体制备领域，尤其涉及一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法。

背景技术

干细胞可通过分泌一些生物活性因子，如；生长因子、外泌体等，调控创伤局部炎症反应、免疫反应、血管新生和抗凋亡等间接作用修复病变缺损的组织器官。外泌体的产生，其是细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成的细胞外纳米级小囊泡，它们可以携带信号到身体上距离较远的部分，进而进行细胞与靶细胞之间的信息交流，脐带干细胞分离于新生儿出生后的废弃组织-脐带，因其来源较为广泛易获取、无伦理性争议、免疫原性低下、对供者无伤害等优势而被广泛应用于组织工程与再生医学的研究领域之中，被认为是最为理想的组织工程种子细胞之一。

然而在移植于患者的受损处时，单次移植量所需有效蛋白数量很高，而传统细胞培养扩增模式无法在短期内获得如此巨大的外泌体，成为应用中较为棘手的问题。

因此，本申请提出一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法，改变传统细胞培养扩增模式，有利于间充质干细胞细胞增殖，提高外泌体的分泌效果。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法，该方法包括：

步骤1：用含5%的青霉素-链霉素的PBS缓冲液浸泡新鲜脐带，反复冲洗3-5遍，直至无血液及其他杂质，将整条脐带剪成 3-4cm 的小段，并将脐带内的动脉和静脉间的胶质慢慢撕下，放置在滴有少量 PBS 的培养皿上，接着将分离出来的胶质剪碎，直至肉眼不可见组织块，剪碎的过程中保持湿润状态，且剪碎过程中不可加过多PBS缓冲液；

步骤2：接着向培养皿中加入0.1%的Ⅰ型胶原酶，将组织放入孵箱，消化9-12小时，将消化好的悬液混匀后，用 PBS缓冲液稀释至不粘稠，在离心机2000rpm的转速下离心10min，并收集沉淀，将收集的沉淀加 PBS缓冲液混匀，在离心机1500rpm的转速下离心5min，接着在离心液内加入1%的青霉素-链霉素，混匀后用70μm 滤网过滤，台盼蓝计数后按照 5×105/mL接种于培养皿中，待细胞贴壁后 48h 进行半量培养液换液，待原代细胞达到90%融合后，部分细胞按照 1:3 的比例进行胰蛋白酶传代；

步骤3：使用包含人参皂苷、人血清白蛋白和无血清基础的培养基传代培养至 P3于 10cm 培养皿中，待细胞增殖融合至 80%，按照 1:5 进行传代，待P4 细胞融合至对数生长期时，弃培养基，利用PBS 缓冲液漂洗两次，接着在5个培养皿中均分别加入6ml培养基，24h 后收取培养基于离心管中，该培养基即为干细胞培养液，计数5个培养皿中的细胞总数；

步骤4：预冷超速离心机至温度为 4℃ ，放入干细胞培养液离心10min，除去细胞碎片，将离心后上清液移植至超速离心管中，用 PBS缓冲液补满超速离心管，接着继续将超速离心管内的上清液在温度为4℃条件下离心 20min,离心后利用0.22μm的过滤器过滤离心后的上清液，将过滤好的上清液置于另一超速离心管中，在温度为4℃的条件下离心90min，接着弃上清液，利用无菌滤纸吸净管壁液体，管底即为外泌体，加入相应保存液体，-80℃保存待用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的培养基包含人参皂苷、人血清白蛋白和无血清基础，其中人参皂苷中的人参皂苷Rg1可以在一定浓度范围内促进MSC的增殖，人血清白蛋白能够为细胞提供氮源等有效营养成分，利用此培养方案可以增加MSC增殖能力进而提高了外泌体浓度。

2、本发明有利于间充质干细胞的细胞增殖，提高外泌体的分泌效果，且在分离外泌体时，利用0.22μm 的过滤器过滤离心后的上清液，可以将细胞碎片及大于200nm 的囊泡全部去除，在不造成外泌体的丢失和外泌体形态改变的情况下，得到更纯度更高的外泌体。

附图说明

图1是本发明的外泌体在不同培养基中细胞扩增的对比结果示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步描述：

实施例：

本发明提供一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法，该方法包括：

（1）提取脐带间充质干细胞：

用含5%的青霉素-链霉素的PBS缓冲液浸泡新鲜脐带，反复冲洗3-5遍，直至无血液及其他杂质，所述PBS缓冲液是由0.2gKCl溶液、8g NaCl溶液、0.24g KH₂PO₄溶液, 3.63gNa₂HPO₄·12H₂O溶于1LddH₂O，并经高压灭菌制得的，将整条脐带剪成 3-4cm 的小段，沿脐带切断处可肉眼观察到其中包含三条血管，其中两条动脉在静脉两侧，将其中一条动脉剥离开脐带外膜，将动脉撕下，可见动脉与静脉间的粘稠状物质，将此胶质一点点撕下，放置在滴有少量 PBS缓冲液的培养皿上，接着用同样的方法分离另一动脉与静脉间的胶质，最后将静脉剥离出来，分离最后留在外膜上的胶质，接着将分离出来的胶质剪碎，直至肉眼不可见组织块，剪碎的过程中保持湿润状态，且剪碎过程中不可加过多PBS缓冲液；

接着向培养皿中加入0.1%的Ⅰ型胶原酶，其中0.1%Ⅰ型胶原酶的制备是将0.1%的Ⅰ型胶原酶溶于100ml的DMEM 培养基，并通过0.22μm过滤器过滤除菌得到的，将组织放入孵箱，消化9-12小时，将消化好的悬液混匀后，用 PBS缓冲液稀释至不粘稠，即每1ml的悬液加入20ml的PBS缓冲液进行稀释，在离心机2000rpm的转速下离心10min，并收集沉淀，将收集的沉淀加 PBS缓冲液混匀，在离心机1500rpm的转速下离心5min，接着在离心液内加入1%的青霉素-链霉素，混匀后用70μm 滤网过滤，台盼蓝计数后按照 5×105/mL接种于培养皿中，待细胞贴壁后 48h 进行半量培养液换液，待原代细胞达到 90%融合后，部分细胞按照 1:3的比例进行胰蛋白酶传代；

（2）干细胞培养液的制备：

使用包含人参皂苷、人血清白蛋白和无血清基础的培养基传代培养至 P3于 10cm培养皿中，其中人参皂苷添加浓度在1-5mg/ml，人血清白蛋白添加体积浓度在2-4wt%，待细胞增殖融合至 80%，按照 1:5 进行传代，待P4 细胞融合至对数生长期时，弃培养基，利用PBS 缓冲液漂洗两次，接着在5个培养皿中均分别加入6ml培养基，24h 后收取培养基于离心管中，该培养基即为干细胞培养液，计数5个培养皿中的细胞总数；

（3）外泌体的制备：

预冷超速离心机至温度为 4℃ ，放入干细胞培养液离心10min，除去细胞碎片，将离心后上清液移植至超速离心管中，用 PBS缓冲液补满超速离心管，接着继续将超速离心管内的上清液在温度为4℃条件下离心 20min,离心后利用0.22μm的过滤器过滤离心后的上清液，将过滤好的上清液置于另一超速离心管中，在温度为4℃的条件下离心90min，接着弃上清液，利用无菌滤纸吸净管壁液体，管底即为外泌体，加入相应保存液体，-80℃保存待用。

对比例1：

设置一组空白组和三组对照组进行对比，其中：

空白组的外泌体培养基：DMEM基础培养基+5%的 FBS缓冲液；

对照组1的外泌体培养基：DMEM基础培养基+5%的FBS缓冲液+ 1mg/ml人参皂苷+2wt%白蛋白；

对照组2的外泌体培养基：DMEM基础培养基+5%的FBS缓冲液+ 3mg/ml人参皂苷+3wt%白蛋白；

对照组3的外泌体培养基：DMEM基础培养基+5%的FBS缓冲液+ 5mg/ml人参皂苷+4wt%白蛋白；

如附图1所示，结果显示，相同培养条件下，对照组的细胞扩增率、外泌体蛋白浓度及效应蛋白所占比例均优于传空白组，其中对照组3中的实施效果最优，此培养方案可以提高外泌体浓度，本发明提供的培养基成分明确、安全性高、扩增能力强，扩增方法简单高效，有利于规模化生产。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“同轴”、“底部”、“一端”、“顶部”、“中部”、“另一端”、“上”、“一侧”、“顶部”、“内”、“前部”、“中央”、“两端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，由此，限定有“第一”、“第二”、“第三”、“第四”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及等同物限定。

Claims

1.一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法，其特征在于，该方法包括：

步骤2：接着向培养皿中加入0.1%的Ⅰ型胶原酶，将组织放入孵箱，消化9-12小时，将消化好的悬液混匀后，用 PBS缓冲液稀释至不粘稠，在离心机2000rpm的转速下离心10min，并收集沉淀，将收集的沉淀加 PBS缓冲液混匀，在离心机1500rpm的转速下离心5min，接着在离心液内加入1%的青霉素-链霉素，混匀后用70μm 滤网过滤，台盼蓝计数后按照 5×10⁵/mL接种于培养皿中，待细胞贴壁后 48h 进行半量培养液换液，待原代细胞达到 90%融合后，部分细胞按照 1:3 的比例进行胰蛋白酶传代；

步骤3：使用包含人参皂苷、人血清白蛋白和无血清基础的培养基传代培养至 P3于10cm 培养皿中，其中培养基中的人参皂苷添加浓度在1-5mg/ml，人血清白蛋白添加体积浓度在2-4wt%，待细胞增殖融合至 80%，按照 1:5 进行传代，待P4 细胞融合至对数生长期时，弃培养基，利用PBS 缓冲液漂洗两次，接着在5个培养皿中均分别加入6ml培养基，24h后收取培养基于离心管中，该培养基即为干细胞培养液，计数5个培养皿中的细胞总数；

2.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液是由0.2gKCl溶液、8g NaCl溶液、0.24g KH₂PO₄溶液, 3.63g Na₂HPO₄·12H₂O溶于1LddH₂O，并经高压灭菌制得的。

3.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法，其特征在于，所述步骤2中向培养皿中加入0.1%Ⅰ型胶原酶，其中0.1%Ⅰ型胶原酶的制备是将0.1%的Ⅰ型胶原酶溶于100ml的DMEM 培养基，并通过0.22μm过滤器过滤除菌得到的。

4.如权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞中的外泌体的制备方法的构建方法，其特征在于，所述步骤2中将消化好的悬液混匀后，用 PBS缓冲液稀释至不粘稠，是每1ml的悬液加入20ml的PBS缓冲液进行稀释。