CN112852718A - 一种牛胎盘外泌体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种牛胎盘外泌体的制备方法。本发明结合胎盘的结构特点通过冻融、两次特定的超声、过滤等物理学方法有效地去除了牛胎盘组织中其他杂质成分，最终获得了富含外泌体的无菌产物。该方法对牛胎盘外泌体的提取率高，工艺稳定性好。实验表明，本发明制得的牛胎盘外泌体具有良好的完整性和生物学活性，在一定的浓度范围内，具有促进人皮肤成纤维细胞增殖的功效。

Description

一种牛胎盘外泌体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种牛胎盘外泌体的制备方法。

背景技术

近年来动物胎盘的研究不断增多，许多动物胎盘如牛、羊、鹿、驴等的生理活性被不断发现。动物胎盘提取物是来源于动物胎盘的一类复合活性成分，含有丰富的氨基酸、蛋白质、卵磷脂、多糖体、维生素、矿物元素等，具有增强记忆、抗应激、调节内分泌、增强免疫力、延缓衰老等功效，根据目前相关研究报道，胎盘提取物具有促进末梢血液循环、促进细胞及组织呼吸、去除自由基、保湿、免疫赋活及美颜等多种生物学作用。目前，已有多种利用胎盘提取有效活性物质的专利。这些专利获取胎盘提取物的方法主要以下3种：(1)直接提取法：胎盘组织经匀浆后加提取液提取，或胎盘匀浆后反复冻融法提取，提取液离心、冻干即可。(2)超临界CO2萃取法：胎盘组织冻干、粉碎、超临界萃取后，萃取物匀浆、离心，冻干离心液。(3)酶辅助提取法：胎盘经1-2种蛋白酶适度酶解后，离心、冻干离心液。这些胎盘提取物的制备方法及产品存在以下缺点：(1)获得的胎盘提取物以大分子蛋白为主，人体吸收效率低；(2)缺乏提取液精制工艺，产品成分复杂，品质低；(3)提取方法简单粗放，提取效率低，原料利用率低。因此，如何有效地获得动物胎盘中的生物活性成分并充分发挥其功效，具有重要的科学及产业化意义。

外泌体(Exosome)是由细胞内囊泡结构释放到细胞外的一种膜性囊泡，直径约30-150nm，细胞在正常的生理状况下都会分泌外泌体，由于质膜和多泡体之间融合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡被脂质双层分为内部和外部，由于其含有膜脂质、膜蛋白、遗传物质和细胞质成分，间接地反映出细胞的性质和状态。同时，外泌体样囊泡通过与其他细胞和组织的结合，并将膜成分、mRNA、miRNA、蛋白质(生长激素、细胞因子等)等转移至受体细胞，而作为介导细胞-细胞之间通讯的胞外运输蛋白。

动物外泌体广泛存在于活体动物体内，动物外泌体选择性包裹脂质、蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，可以透皮吸收，被靶细胞摄取，可以明确减轻组织损伤程度、促进损伤组织形态学及功能学的修复，它可能还具有潜在的调节机体免疫、调控细胞生长分化等生物学功能。因此，建立动物胎盘外泌体，尤其是牛胎盘外泌体的制备工艺，可以为安全、稳定且有效的基于动物外泌体的化妆品新原料研发及产业化奠定基础。

然而，目前的制备工艺主要以制备胎盘提取物为主，制备工艺简单粗放，提取效率低，原料利用率低，工艺稳定性差，缺乏提取液精制工艺，产品成分复杂，品质低。同时缺乏统一的质量控标准及质量控制指标，最终导致无法形成安全、稳定且质量可靠的产品。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种牛胎盘外泌体的制备方法。该方法对牛胎盘外泌体的提取率高，工艺稳定性好，且制备的牛胎盘外泌体具有良好的完整性和生物学活性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供一种牛胎盘外泌体的制备方法，包括：

取牛胎盘匀浆，匀浆液冻融；

将解冻后的匀浆液进行第一轮超声处理，过滤，滤液-80℃冷冻保存；

滤液4℃解冻，离心，取上清液进行第二轮超声处理，经滤网多级过滤，获得牛胎盘细胞外泌体；

所述第二轮超声为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二超声的功率为100～700w，超声累计的总时间为30～60min。

本发明中，所述冻融为-80℃冻存12-24h后室温溶解。所述冻融的次数为1-5次。一些具体实施例中具体为3次。

一些实施方案中，所述第一轮超声的功率为990w，时间为30min。

一些实施方案中，经过第一轮超声之后的匀浆液依次经过20目、80目的筛网进行过滤。

一些具体实施例中，所述第二超声为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，超声累计的总时间为30min或60min，超声功率为500w或700w。

本发明中，所述多级过滤为四级过滤。一些实施方案中，所述四级过滤为依次过孔径为5μm、1μm、0.45μm和0.22μm的滤网。

本发明中，所述离心为差速离心。一些实施方案中，所述差速离心具体为：300g离心30min，取上清3000g离心30min，取上清10000g离心30min。

本发明牛胎盘外泌体的制备方法，包括：取牛胎盘匀浆，匀浆液冻融；将解冻后的匀浆液进行第一轮超声处理，过滤，滤液-80℃冷冻保存；滤液4℃解冻，离心，取上清液进行第二轮超声处理，经滤网多级过滤，获得牛胎盘细胞外泌体；所述第二轮超声为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二轮超声的功率为100～700w，超声累计的总时间为30～60min。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1)本发明完全采用物理提取的方法并保持提取整个提取过程的低温环境，避免了目前其他制备工艺引入的酶类、有机溶剂或高温等影响终产品质量和活性的不利因素；

2)本发明不同于常规的胎盘提取物工艺，而是结合胎盘的结构特点通过冻融、超声、过滤等物理学方法逐步去除其他成分，最终获得了富含外泌体的无菌产物，并通过一系列鉴定实验及功能验证实验，证实了本发明制得的牛胎盘具有良好的完整性和生物学活性，具有显著的促进人皮肤成纤维细胞增殖的功效。本发明建立的牛胎盘外泌体的制备工艺具有良好的可靠性及稳定性。

附图说明

图1示不同超声参数对牛胎盘外泌体蛋白浓度的影响；

图2示实施例1制备的牛胎盘外泌体的粒径分析结果；

图3示实施例1制备的牛胎盘外泌体的电镜图；

图4示实施例1制备的牛胎盘外泌体的免疫印迹分析结果；

图5示实施例1制备的牛胎盘外泌体对人皮肤成纤维细胞增殖的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种牛胎盘外泌体的制备方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，牛胎盘采购自广东某知名牛奶品牌奶牛养殖场健康奶牛自然分娩的牛胎盘，经病毒及细菌检测合格后，用自来水反复冲洗后进行切块分装，于-80℃冷冻保存。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1)称取一定质量(如500g)的牛胎盘，室温解冻；

2)组织完全解冻后，用自动绞肉机将其绞碎；

3)利用组织匀浆仪进一步将组织匀浆，制备成均匀的糊状组织；

4)将匀浆物在-80℃冻存24h后室温溶解，如此反复冻融3次，充分破碎胎盘细胞；

5)将冻融后的匀浆物进行第一轮超声处理(990w,30min)，进一步破碎细胞及释放胎盘外泌体；

6)第一轮超声后的匀浆物通过不同孔径(20目、80目)的不锈钢筛网过滤，去除其中的不溶性物质，收集滤液后，于-80℃冷冻保存。

7)离心：将步骤6)获得的牛胎盘提取物滤液4℃解冻后，进行不同转速的离心力离心(300g,30min；3000g，30min；10000g，30min)，每次离心后，收集上一次离心的上清进行离心，从而充分去除滤液中的不溶性物质；

8)第二轮超声处理：将上述最后一步离心(10000g，30min)获得的上清进行第二轮超声处理。其中，第二轮超声处理为：每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二超声的功率为500w，超声累计的总时间为30min。

9)过滤：将超声处理后的产物进行多级过滤(滤网孔径为依次为5μm、1μm、0.45μm及0.22μm)后，制备获得牛胎盘外泌体。

实施例2

步骤8)中第二轮超声处理为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二超声的功率为700w，超声累计的总时间为30min。

其他步骤与实施例1相同。

实施例3

步骤8)中第二超声处理为步骤8)中第二超声处理为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二超声的功率为500w，超声累计的总时间为60min。

其他步骤与实施例1相同。

实施例4

步骤8)中第二超声处理为步骤8)中第二超声处理为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二超声的功率为700w，超声累计的总时间为60min。

其他步骤与实施例1相同。

实施例5

实验设置对比例1～4，其中，对比例1～4的制备方法中步骤8)的超声参数见表1，其他步骤与实施例1相同。

表1

3.4牛胎盘外泌体鉴定

1)蛋白浓度测试：

利用BCA法对制备的牛胎盘外泌体进行蛋白浓度检测，结果显示，本发明实施例1制备的牛胎盘外泌体的蛋白浓度为11.33±2.09(mg/ml)(组3，n＝6)(如图1所示)。

2)外泌体鉴定

本发明获得的牛胎盘提取物的粒径分析、电镜观察及免疫印迹分析，证实了本发明制备方法获得的产物主要成分是外泌体。具体检测结果见图2-4。

3.5牛胎盘外泌体功效测试

通过人皮肤成纤维细胞增殖实验表明，本发明制备的牛胎盘外泌体在25-200ug/mL的浓度范围，具有显著的促进人皮肤成纤维细胞增殖的功效(图5)。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种牛胎盘外泌体的制备方法，其特征在于，包括：

取牛胎盘匀浆，匀浆液冻融；

将解冻后的匀浆液进行第一轮超声处理，过滤，滤液-80℃冷冻保存；

滤液4℃解冻，离心，取上清液进行第二轮超声处理，经滤网多级过滤，获得牛胎盘细胞外泌体；

所述第二轮超声为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，所述第二轮超声的功率为100～700w，超声累计的总时间为30～60min。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述冻融为-80℃冻存12-24h后室温溶解；所述冻融的次数为1-5次。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一轮超声的功率为990w，时间为30min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二轮超声为每间隔8s进行一次超声，每次超声时间为8s，超声累计的总时间为30min，超声功率为500w。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多级过滤为四级过滤。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述四级过滤为依次过孔径为5μm、1μm、0.45μm和0.22μm的滤网。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述离心为差速离心。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述差速离心具体为：300g离心30min，取上清3000g离心30min，取上清10000g离心30min。

Images