CN117653606A - 一种间充质干细胞外泌体冻干保护剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于外泌体冻干保护技术领域，公开了一种间充质干细胞外泌体冻干保护剂，由0.1～0.2v/v％神经酰胺、赖氨酸和0.8～1.5v/v％甘油组成，其中，外泌体冻干保护剂和外泌体混合后，赖氨酸的终浓度为50～80mM；该冻干保护剂能维持外泌体形貌完整性，避免外泌体聚集，且能很好的维持外泌体的生物学功能，可以用于外泌体冻干技术上，具有广泛的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于外泌体冻干保护技术领域，更具体的，涉及一种间充质干细胞外泌体冻干保护剂及其应用。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。如今随着大量对其生物来源、其物质构成及运输、细胞间信号的传导以及在体液中的分布的研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。
外泌体的储存具有非常重要的意义，如果没有合格的储存技术，就无法实现长期储存，已有现有研究发现-80℃是长期储存的最佳温度，在此温度下可以有效抑制生物活性蛋白(包括外泌体)的损失，但在该储存条件下，外泌体的性质仍然会存在一定程度的改变，且这种温度下很难实现外泌体的稳定运输和储存。冻干通常用于保存生物活性化合物，现在已被用于外泌体的储存，现有报道的外泌体冻干保护剂有海藻糖、甘露醇等多种糖类、醇类物质，以及其他物质的组合，但多种研究发现对于具体种类的外泌体，所使用的外泌体冻干保护剂多有不同，且已知的外泌体冻干保护剂还不能较好的保护外泌体的形貌完整性，对外泌体的生物学功能影响也较大。
源自于间充质干细胞内分泌的外泌体，富含一百多种胞外基质蛋白，mRNA信使核糖核酸和多重生长因子。在临床上，干细胞外泌体主要治疗烧伤、烫伤、皮肤溃疡，再生健康皮肤；在护肤方面，主要是对外伤受损、衰老中毒皮肤进行修复，全面调理皮肤、改善肤质，令肌肤恢复年轻、健康的状态。间充质干细胞外泌体是目前研究皮肤学领域的研究热点。然而现有技术目前还缺乏针对间充质干细胞的外泌体的冻干保护剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供一种针对间充质干细胞外泌体的冻干保护剂。
本发明的第二个目的是提供上述冻干保护剂的应用。
本发明的第三个目的是提供一种间充质干细胞外泌体冻干制剂。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种间充质干细胞外泌体冻干保护剂，由0.1～0.2v/v％神经酰胺、赖氨酸和0.8～1.5v/v％甘油组成，其中，外泌体冻干保护剂和外泌体混合后，赖氨酸的终浓度为50～80mM。
优选的，所述的间充质干细胞外泌体冻干保护剂，由0.18v/v％神经酰胺、赖氨酸和1.3v/v％甘油组成，其中，外泌体冻干保护剂和外泌体混合后，赖氨酸的终浓度为70mM。
本发明还保护上述冻干保护剂在制备外泌体冻干制剂中的应用。
本发明还保护上述冻干保护剂在改善外泌体形貌中的应用。
优选的，所述改善外泌体形貌是指提高外泌体分散程度和/或降低外泌体膜融合。
本发明还保护一种间充质干细胞外泌体冻干制剂，含有上述间充质干细胞外泌体冻干保护剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种间充质干细胞外泌体冻干保护剂，由0.1～0.2v/v％神经酰胺、赖氨酸和0.8～1.5v/v％甘油组成，其中，外泌体冻干保护剂和外泌体混合后，赖氨酸的终浓度为50～80mM；该冻干保护剂能维持外泌体形貌完整性，避免外泌体聚集，且能很好的维持外泌体的生物学功能，可以用于外泌体冻干技术上，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为外泌体电镜照片；左侧标尺为200nm，右侧标尺为600nm；
图2为外泌体粒径分析图；
图3为外泌体的创面修复实验图片。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
一、间充质干细胞外泌体的制备
操作如下：
(1)收集长至80％融合的108个间充质干细胞上清，离心3000g，收集上层清液；
(2)取(1)中的上层清液，离心3000g以去除细胞碎片，收集上层清液；
(3)取(2)中的上层清液，离心10000g以去除蛋白质，收集上层清液，后0.22μm滤膜过滤上层清液；
(4)取(3)过滤后的上层清液超速离心100000g，1.5h，弃去上层清液，用PBS重悬沉淀，收集重悬液；
(5)取(4)中的重悬液检测外泌体含量充质干细胞外泌体，电镜如图1，NTA粒径分析如图2，利用BCA法测定外泌体蛋白含量为0.28mg/ml。
二、外泌体与冻干保护剂的混合
将上述制备得到的外泌体2ml与保护剂混合，得到待冻干外泌体混合液。其中，保护剂由神经酰胺、赖氨酸和甘油组成，具体每个实施例和对比例的待冻干外泌体混合液中保护剂的组成如表1所示。
表1
| 项目 | 神经酰胺(v/v％) | 赖氨酸(mM) | 甘油(v/v％) |
| 实施例1 | 0.1 | 50 | 0.8 |
| 实施例2 | 0.14 | 60 | 1.0 |
| 实施例3 | 0.18 | 70 | 1.3 |
| 实施例4 | 0.2 | 80 | 1.5 |
| 空白对照组 | - | - | - |
| 对比例1 | 0.18 | 40 | 1.3 |
| 对比例2 | 0.18 | 100 | 1.3 |
| 对比例3 | - | 70 | 1.3 |
| 对比例4 | 0.18 | 70 | - |
三、冻干程序
将待冻干外泌体混合液放入液氮中-80℃快速冷冻过夜，使用冷冻干燥机进行真空冻干，冻干条件：冷阱温度-50～-55℃，真空压力5～10Pa，处理24h。
冻干结束后呈粉末状，且4℃密封储存。
四、冻干保护剂对外泌体的影响
4.1、外泌体形貌
将冻干后的外泌体进行复溶：加入提前预冷的PBS溶液涡旋即可，并观察复溶后的外泌体形貌。
表2
表2列出了每个组外泌体形貌的变化，从表2可以看出，在不加冻干保护剂的情况下，空白对照组的外泌体大量聚集，分散度差，外泌体膜结构被破坏，且产生大量膜融合；对比例1中赖氨酸的量较少，对比例2中赖氨酸的量较多，从对比例1和对比例2的结果可以看出，一定浓度下的赖氨酸在保护外泌体形貌的完整性上起主要作用；对比例3缺少神经酰胺，神经酰胺主要和赖氨酸搭配，辅助赖氨酸进一步降低外泌体的聚集和膜融合现象；甘油在本发明的冻干保护剂中起到防止晶格生成的功效，从而避免外泌体膜结构大量破损，对比例4缺少甘油，因此，相比较于外泌体聚集，外泌体的膜结构融合的现象更为明显。
4.2、外泌体生物学功能
A、抗炎作用
1、试验动物：雄性SPF6周龄小鼠。
2、试验设计：选用健康且皮肤完好的小鼠40只，分为10组，常规麻醉后，剔除腹部被毛，去毛面积2cm×2cm，分别取表1中各组复溶后的外泌体，涂覆于去毛皮肤表面。24h后温水洗净涂覆外泌体的部位皮肤，并将上述实验中涂抹过外泌体的小鼠皮肤取下，进行匀浆，用于免疫炎症因子的检测，其检测具体根据现有试剂盒进行操作，结果如表3。
表3
从表3可以看出，在不加冻干保护剂的情况下，空白对照组的炎症因子数值较高；对比例1中赖氨酸的量较少，对比例2中赖氨酸的量较多，从对比例1和对比例2的结果可以看出，一定浓度下的赖氨酸能进一步降低炎症反应；对比例3缺少神经酰胺，其炎症因子数值较高，也侧面说明了，神经酰胺的添加起到了降低炎症反应的作用；对比例4缺少甘油，对炎症因子的影响要小于对比例3。
因此，本发明冻干保护剂在保护外泌体形貌完整的基础上，还能够进一步降低炎症反应，和炎症因子的含量，也辅助起到了抗炎作用。
B、创面修复
考察实施例复溶后的外泌体的创面修复能力，使用化学药剂对小鼠进行刺激创伤，DNFB(二硝基氟苯)是一种常用于实验室研究中诱导皮肤过敏反应的化合物，它可以导致皮肤化学损伤。使用BALB/c小鼠，将小鼠随机分成DNFB阳性对照(Model)，DNFB+外泌体(Gel)、对照组(Normal)，每组六只。给小鼠提供标准饮食和水，保持它们在常规饲养条件下，使其适应实验环境。将DNFB用卡波姆制备成使用合适剂量(0.25～0.5％)的凝膏制剂，并在实验开始的第1，4，7，10天分别用DNFB涂抹小鼠背部进行1次化学刺激，外泌体组则在第5天后每天进行2次给药。
结果显示，在第7天，Gel组的皮损面积明显比阳性对照组，在第15天，Gel组创面基本完全愈合，而阳性对照组还有明显的较大面积的创面；由此可以看出涂抹了本发明实施例3的复溶后的外泌体仍然有显著的创面愈合的功效，表现出稳定的生物功能。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.间充质干细胞外泌体冻干保护剂，其特征在于，由0.1～0.2v/v％神经酰胺、赖氨酸和0.8～1.5v/v％甘油组成，其中，外泌体冻干保护剂和外泌体混合后，赖氨酸的终浓度为50～80mM。
2.根据权利要求1所述的间充质干细胞外泌体冻干保护剂，其特征在于，由0.18v/v％神经酰胺、赖氨酸和1.3v/v％甘油组成，其中，外泌体冻干保护剂和外泌体混合后，赖氨酸的终浓度为70mM。
3.权利要求1或2所述冻干保护剂在制备外泌体冻干制剂中的应用。
4.权利要求1或2所述冻干保护剂在改善外泌体形貌中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述改善外泌体形貌是指提高外泌体分散程度和/或降低外泌体膜融合。
6.一种间充质干细胞外泌体冻干制剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述间充质干细胞外泌体冻干保护剂。
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