TW202136779A - 免疫測定方法及免疫測定器具 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種感度較高之抗體及使用該抗體之檢查試劑。
本發明係一種免疫測定方法，其係藉由使用將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化之載體之免疫測定方法來檢測測定對象者，且藉由使用如下載體來提昇檢測感度並檢測測定對象，該載體係向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加二糖類及糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化。
Description
本發明係關於一種免疫測定方法及免疫測定器具。
目前市場上出售有使用各種抗體之檢查試劑。然而，例如於利用先前之RS(Respiratory Syncytial，呼吸道融合)病毒檢查試劑進行RS病毒檢測之情形時，感度不足(專利文獻1)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
專利文獻1：日本專利第6454274號說明書
[發明所欲解決之問題]
鑒於上述現狀，本發明之目的在於提供一種感度較高之免疫測定方法及使用該免疫測定方法之檢查試劑。
[解決問題之技術手段]
本發明人等發現，藉由在將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化時添加二糖類及糖醇類，可提高檢測感度，從而完成本發明。
即，本發明如下。
[1]一種免疫測定方法，其係藉由使用將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化之載體之免疫測定方法來檢測測定對象者，且藉由使用如下載體來提昇檢測感度並檢測測定對象，該載體係向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加二糖類及糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化。
[2]如[1]之方法，其中向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加1～4%(w/v)之二糖類及0.5～4%(w/v)之糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定於載體。
[3]如[1]或[2]之方法，其中二糖類為海藻糖或麥芽糖。
[4]如[1]至[3]中任一項之方法，其中糖醇類為甘露醇或山梨糖醇。
[5]如[1]至[4]中任一項之方法，其係免疫層析法。
[6]如[1]至[5]中任一項之方法，其中抗體或其抗原結合性片段為抗RS病毒N蛋白質抗體或其抗原結合性片段。
[7]一種檢測用試劑，其係將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化者，且於包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之檢測區域包含二糖類及糖醇類，且檢測感度得到提昇。
[8]如[7]之檢測用試劑，其中二糖類為海藻糖或麥芽糖。
[9]如[7]或[8]之檢測用試劑，其中糖醇類為甘露醇或山梨糖醇。
[10]如[7]至[9]中任一項之檢測用試劑，其係免疫層析法試劑。
[11]如[7]至[10]中任一項之檢測用試劑，其中抗體或其抗原結合性片段為抗RS病毒N蛋白質抗體或其抗原結合性片段。
[12]一種檢測用試劑之製造方法，該檢測用試劑係檢測感度得到提昇，且將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化者，該製造方法係向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加二糖類及糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化。
[13]如[12]之製造方法，其中向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加1～4%(w/v)之二糖類及0.5～4%(w/v)之糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定於載體。
[14]如[12]或[13]之製造方法，其中二糖類為海藻糖或麥芽糖。
[15]如[12]至[14]中任一項之製造方法，其中糖醇類為甘露醇或山梨糖醇。
[16]如[12]至[15]中任一項之製造方法，其中檢測用試劑為免疫層析法試劑。
[17]如[12]至[16]中任一項之製造方法，其中抗體或其抗原結合性片段為抗RS病毒N蛋白質抗體或其抗原結合性片段。
本說明書包括作為本申請案之優先權之基礎的日本專利申請編號2019-224865號之公開內容。
[發明之效果]
本發明之方法係於免疫測定中使用如下載體，因此感度較高，該載體係向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加二糖類及糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化。又，藉由本發明，提供一種用於本發明之新穎之檢測方法之免疫測定器具。
本發明係一種檢測測定對象之免疫測定方法，係將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定於載體，利用經固定化之載體捕捉測定對象之蛋白質，並檢測所捕捉之測定對象之蛋白質。
藉由本發明之方法所檢測之測定對象可列舉：流行性感冒病毒抗原、腺病毒抗原、RS病毒抗原、HA(Hepatitis A，甲型肝炎)抗原、HBc(Hepatitis B core，乙型肝炎核心)抗原、HCV(Hepatitis C Virus，丙型肝炎病毒)抗原、HIV(Human Immunodeficiency Virus，人類免疫缺陷病毒)抗原、EBV(Epstein-Barr Virus，EB病毒)抗原、NLV(Norwalk-Like Virus，諾瓦克樣病毒)抗原等病毒抗原；砂眼披衣菌抗原、溶血性鏈球菌抗原、百日咳菌抗原、幽門螺桿菌抗原、鉤端螺旋體抗原、梅毒螺旋體抗原、弓蟲抗原、疏螺旋體屬抗原、炭疽菌抗原、MRSA(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)抗原等細菌抗原；黴漿菌脂質抗原、人類絨毛膜激性腺素等肽激素；類固醇激素等類固醇；腎上腺素或嗎啡等生理活性胺類；維生素B類等維生素類；前列腺素類、四環素等抗生物質；細菌等所產生之毒素、各種腫瘤標記、農藥、抗大腸桿菌抗體、抗沙門氏菌抗體、抗葡萄球菌抗體、抗曲狀桿菌抗體、抗產氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體、抗腸炎弧菌抗體、抗志賀樣毒素抗體、抗人轉鐵蛋白抗體、抗人血白蛋白抗體、抗人類免疫球蛋白抗體、抗微球蛋白抗體、抗CRP(C-Reactive Protein，C反應蛋白)抗體、抗肌鈣蛋白抗體、抗HCG(Human Chorionic Gonadotropin，人絨毛膜促性腺激素)抗體、抗砂眼披衣菌抗體、抗鏈球菌溶血素O抗體、抗幽門螺桿菌抗體、抗β-葡聚糖抗體、抗HBe(Hepatitis B e，乙型肝炎e)抗體、抗HBs(Hepatitis B surface，乙型肝炎表面)抗體、抗腺病毒抗體、抗HIV抗體、抗輪狀病毒抗體、抗流行性感冒病毒抗體、抗小病毒抗體、抗RS病毒抗體、抗RF(Rheumatoid Factor，類風濕因子)抗體、與源自病原微生物之核酸成分互補之核苷酸等，但並不限於該等。
以下，以測定對象係RS病毒為例進行說明。
於測定對象例如為RS病毒之情形時，使用抗RS病毒抗體作為抗體或其抗原結合性片段。
本發明中，抗RS病毒抗體係特異性地識別RS病毒之抗體，具體而言，將RS病毒之蛋白質作為抗原特異性地識別並結合。作為RS病毒之蛋白質，可列舉與細胞融合相關之F蛋白質、N蛋白質等。N蛋白質亦被稱為核蛋白質，包含391個胺基酸殘基。N蛋白質係被稱為核蛋白衣之核糖核蛋白質複合體之構成成分，圍繞RS病毒之基因組RNA形成螺旋結構。較佳為使用針對抗RS病毒抗體N蛋白質之抗體。
本發明藉由在將抗RS病毒抗體固定於載體時添加二糖類及糖醇類，可提高RS病毒之檢測感度。
作為二糖類，可列舉海藻糖、麥芽糖。
作為糖醇類，可列舉甘露醇、山梨糖醇。
向用於固相化之抗RS病毒抗體溶液中添加二糖類及糖醇類即可。抗RS病毒抗體溶液係使抗體溶解於磷酸緩衝液、磷酸緩衝生理鹽水(PBS)等緩衝液中製作而成。此時之抗體濃度為數十pg/mL～數g/mL。二糖類之濃度為0.5～10%(w/v)，較佳為1～5%(w/v)，進而較佳為1～4%(w/v)，尤佳為1～3%(w/v)。糖醇之濃度為0.2～10%(w/v)，較佳為0.5～5%(w/v)，進而較佳為0.5～4%(w/v)，尤佳為0.5～3%(w/v)。將該等溶液以例如線上塗佈於載體並使其乾燥即可。
藉由向抗體溶液中添加二糖類及糖醇進行固定化，相較於不添加二糖類及糖醇之情形，RS病毒抗原之檢測感度會提昇1.5倍以上，較佳為提昇1.75倍以上，進而較佳為提昇2倍以上。
本發明中以抗RS病毒抗體為基礎，僅分離抗原結合部位之抗原結合性片段亦可用於本發明之方法。即，使用藉由公知之方法製作之Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、dsFv、雙功能抗體(diabody)、微型抗體(minibody)等具有特異抗原結合性之片段(抗原結合性片段)之情形時，該等片段亦包括在單株抗體內，包括在本發明之範圍內。又，單株抗體之類別並不限定於IgG(Immunoglobulin G，免疫球蛋白G)，亦可為IgM(Immunoglobulin M，免疫球蛋白M)或IgY(Immunoglobulin Y，免疫球蛋白Y)。
用於本發明之方法之單株抗體可藉由以下方式獲得，即，使用公知之免疫學方法，使包含目標抗原之複合體或萃取物、或者抗原或其等之部分肽對被免疫動物進行免疫，並使用被免疫動物之細胞製作融合瘤。用於免疫之肽之長度並無特別限定，較佳為使用5個胺基酸以上之肽，更佳為使用10個胺基酸以上之肽作為免疫原。免疫原既可由培養液獲得，亦可藉由以下方式獲得，即，將編碼任意抗原之DNA嵌入質粒載體，並將其導入至宿主細胞而使其表現。成為免疫原之任意抗原或其部分肽亦可作為如下例示之蛋白質與融合蛋白質表現，於純化後或未純化之狀態下作為免疫原使用。製作融合蛋白質時可利用業者通常用作「蛋白質表現、純化標籤」之麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白質(MBP)、硫氧化還原蛋白(TRX)、Nus標籤、S標籤、HSV標籤、FRAG標籤、多組胺酸標籤等。與該等之融合蛋白質較佳為使用消化酵素來將任意抗原或其部分肽部分與其以外之標籤部分切斷，於經分離純化後作為免疫原使用。
製備來自已免疫之動物之單株抗體可藉由眾所周知之科勒等人之方法(Kohler etal., Nature, vol, 256, p495 - 497 (1975))而容易地進行。即，自已免疫之動物回收脾細胞或淋巴細胞等抗體產生細胞，根據慣例使其與小鼠骨髓瘤細胞融合而製作融合瘤，並藉由限制稀釋法等對所獲得之融合瘤進行選殖，於所選殖之各融合瘤所產生之單株抗體之中，選擇與用於動物之免疫之抗原發生抗原抗體反應之單株抗體。
來自腹水或培養上清液之單株抗體之純化可使用公知之免疫球蛋白純化法。例如可列舉：利用使用硫酸銨或硫酸鈉之鹽析所進行之分離法、PEG(Polyethylene Glycol，聚乙二醇)分離法、乙醇分離法、DEAE(diethylaminoethanol，二乙胺基乙醇)離子交換層析法、凝膠過濾法等。又，亦可根據免疫動物種及單株抗體之類別，藉由使用結合有蛋白A、蛋白G、蛋白L中之任一者之載體之親和層析法進行純化。
本發明之免疫測定方法係藉由利用以上述方式所製作之單株抗體或其抗原結合性片段(以下，至實施例之前之記述中，除根據上下文明顯並非如此之情形外，「抗體」均意為「抗體或其抗原結合性片段」)與檢體中之抗原的抗原抗體反應之免疫測定來進行測定。作為用於此之免疫測定法，可使用競爭法、凝聚法、西方墨點法、免疫染色法、三明治法等業者眾所周知之任一方法。再者，本發明中，「測定」包括定量、半定量、檢測中之任一者。
作為免疫測定，較佳為三明治法。三明治法中，以2個抗體夾著抗原之形式形成複合體，並檢測該複合體。三明治法本身於免疫測定之領域中眾所周知，例如可藉由免疫層析法或ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析法)法進行。該等三明治法本身均眾所周知，本發明之方法除使用將上述N蛋白質作為抗原識別之單株抗體以外，可藉由眾所周知之三明治法進行。
三明治法中使用識別抗原之1種或2種以上之抗體(固定於固相之抗體及標記抗體)。於使用2種以上之抗體之情形時，該等2種抗體中之至少任一者係將上述N蛋白質作為抗原識別之單株抗體。又，亦可以2個相同之抗體夾著抗原而形成複合體。
於以三明治法作為檢測原理之免疫測定中，作為抗體被固定化之固相，只要是能夠藉由公知之技術將抗體固定者則皆可使用，例如可任意選擇具有毛細管作用之多孔性薄膜(membrane)、粒子狀物質、試驗管、樹脂平板等公知者。又，作為標記抗體之物質，可使用酵素、放射性同位素、螢光物質、發光物質、有色粒子、膠體粒子等。於利用上述各種材料所進行之免疫測定法中，尤其是自臨床檢查之簡便性及迅速性之方面考慮，較佳為作為使用薄膜之側流式之免疫測定法之免疫層析法。
本發明中，本發明人等亦提供一種免疫測定器具，其藉由在將抗RS病毒抗體固定化時添加二糖類及糖醇類，可進行能夠提高RS病毒之檢測感度之側流式之免疫測定。本發明所提供之免疫測定器具包括：具有捕捉測定對象物(抗原)之抗體(抗體1)經固定化之檢測區域的載體、具有可移動之標記抗體(抗體2)之標記物區域、滴加檢體之樣品墊、吸收被展開之檢體液之吸收帶、及用以將該等構件貼合為一體之背襯片，且抗體1及抗體2中之至少一者係將本發明之N蛋白質作為抗原識別之單株抗體。亦將該免疫測定器具稱為免疫層析試驗片。
載體係具有將用以捕捉被檢測物質(抗原)之抗體固定化之性能的材料，且具有不妨礙液體於水平方向通行之性能。較佳為具有毛細管作用之多孔性薄膜，係可藉由吸收而輸送液體及分散於液體中之成分之材料。形成載體之材質並無特別限定，例如可列舉：纖維素、硝化纖維素、乙酸纖維素、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃纖維、尼龍、聚酮等。其中更佳為使用硝化纖維素而製成薄膜者。將使抗體固定化後之薄膜稱為抗體固定化薄膜。
標記物區域包含含有標記抗體之多孔性基材，基材之材質可使用通常使用之玻璃纖維或不織布等。為了含浸大量標記抗體，該基材較佳為厚度0.3 mm～0.6 mm左右之墊狀。亦將含浸標記抗體並乾燥後之多孔性基材稱為乾燥墊。
標記抗體之標記多數情況下使用：如鹼性磷酸酶或辣根過氧化酶之類之酵素、如金膠體之類之金屬膠體、氧化矽粒子、纖維素粒子、著色聚苯乙烯粒子及著色乳膠粒子等。於使用金屬膠體粒子、著色聚苯乙烯粒子或著色乳膠粒子等著色粒子之情形時，由於因該等標記試劑凝聚而產生著色，故而測定該著色。將使抗體固定化後之粒子稱為抗體固定化粒子。抗體之固定化量並無特別限定，於標記區域存在數ng至數十μg即可。
檢測區域係指捕捉被檢測物質(抗原)之抗體經固定化之載體之部分區域。檢測區域設置至少1個將用以捕捉抗原之抗體固定化之區域。檢測區域包含於載體即可，將抗體固定於載體上即可。如上所述，於將抗RS病毒抗體固定於檢測區域時，向抗RS病毒抗體溶液中添加二糖類及糖醇類。抗體之固定化量並無特別限定，於檢測區域固定數ng至數十μg即可。本發明之檢測區域以能夠檢測之方式包含二糖類及糖醇。
樣品墊係用以滴加檢體之部位，為多孔性材料。樣品墊係位於免疫測定器具之最上游之部位。該材料可使用通常使用之濾紙、玻璃纖維、不織布等。為了將大量檢體用於免疫測定，較佳為厚度0.3 mm～1 mm左右之墊狀。檢體中亦包含使檢體於其他溶液中懸浮所獲得之試樣等使用檢體所製備之試樣。
吸收帶係用以吸收供給至載體且於檢測區域未參與反應之成分之構件。該材料可使用包含普通天然高分子化合物、合成高分子化合物等之保水性較高之濾紙、海綿等，為了促進檢體之展開，較佳為吸水性較高者。
背襯片係用以將上述所有材料，即載體、樣品墊、標記物區域、吸收帶等以部分重疊之方式貼附並固定之構件。只要是將該等材料以最適合之間隔配置並固定者即可，背襯片並非必須品，但自製造上或使用上之便利性之方面考慮，通常以使用背襯片為佳。
本發明之免疫測定器具中可進而存在對照顯示區域(構件)。對照顯示區域係顯示已正確地實施試驗之部位。例如，對照顯示區域位於檢測區域之下游，檢體試樣通過檢測區域，到達對照顯示區域時藉由著色等而發出訊號。對照顯示區域中，可使與結合有標記載體之抗體相結合之物質預先固相化，亦可使檢體到達時顏色發生變化之pH指示劑等試劑預先固相化。於結合有標記載體之抗體為小鼠單株抗體之情形時，使用抗小鼠IgG抗體即可。
免疫測定器具之大小並無特別限定，例如為縱長數cm～十數cm，橫長數mm～數cm左右。
本發明之免疫測定器具可收納於收納容器內，亦可藉由該收納容器防止例如由紫外線或空氣中之濕氣所導致之劣化。又，於使用具有污染性、感染性之檢體試樣之情形時，可藉由收納容器防止進行分析之試驗者受到污染或感染。例如使用適當大小之樹脂製盒子作為收納容器，並將本發明之器具收納於該盒子中即可。有時將收納容器及收納於其中之免疫測定器具作為一體而稱為免疫測定裝置。
包含本發明之抗RS病毒N蛋白質單株抗體之RS病毒檢測用試劑包含上述免疫測定器具。又，包含本發明之抗RS病毒N蛋白質單株抗體之RS病毒檢測用套組包含上述免疫測定器具。該套組亦可另外包含小冊子、檢體採集器具等。
於該方法中，利用毛細現象使複合體於將抗體1固定化之固相載體上展開移動，該複合體係抗體2與被檢測物質之複合體，而該抗體2能夠與經著色聚苯乙烯粒子或金膠體等適當之標記物質標記之被檢測物質(標記試劑)結合。其結果，於固相載體上形成經固定化之物質-被檢測物質-標記試劑之複合體，藉由檢測自該複合體所發出之標記試劑之訊號(於金膠體之情形時，將能夠與被檢測物質結合之物質固定化之固相載體部分會變紅)，可檢測被檢測物質。該免疫測定方法可於5～35℃下進行，較佳為於室溫下進行。
藉由本發明之方法，可檢測是否感染RS病毒，於在被檢體試樣中檢測出N蛋白質之情形時，可判斷已感染RS病毒。
於使用識別本發明之N蛋白質之抗體之情形時，可特異性地識別RS病毒，識別N蛋白質之抗體不會識別其他病毒，例如：腺病毒(Adenovirus)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)、人類腸道細胞致病性病毒(Echo virus)、單純疱疹病毒(Herpes simplex virus)、人類偏肺病毒(Human Metapneumovirus)、流行性感冒病毒(Influenza virus)、麻疹病毒(Measles virus)、腮腺炎病毒(Mumps virus)、副流行性感冒病毒(Parainfluenza virus)，不會誤檢測出該等病毒。
又，即便是於使用識別RS病毒之F蛋白質之抗體之情形時無法檢測之臨床分離株，亦可於使用識別本發明之RS病毒之N蛋白質之抗體之情形時檢測出。
作為被檢體試樣，作為檢體，使用咽部或鼻腔拭子、咽部或鼻腔清洗液、鼻腔吸出液、唾液、血清、直腸拭子、大便、大便懸濁液、尿、角膜拭子等即可。
[實施例]
以下，基於實施例更具體地對本發明進行說明。當然，本發明並不受下述實施例限定。
實施例1 抗RS病毒N蛋白質單株抗體之製作
1.RS病毒N蛋白質抗原之製備
使用使具有敏感性之哺乳類細胞感染RS病毒，培養數日後利用紫外線照射使RS病毒感染細胞之培養液不活化而成者。
2.RS病毒N蛋白質單株抗體之製作
將上述1.之RS病毒不活化抗原對BALB/c小鼠進行免疫，藉由自飼養一段時間之小鼠摘除髂骨淋巴節之「小鼠髂骨淋巴節法」(Sado Y etal., Acta Histochem. Cytochem. 39: 89 – 94 (2006))可獲得複數個產生抗RS病毒N蛋白質抗體之融合瘤細胞株。
將所取得之細胞株投予至經姥鮫烷處理之BALB/c小鼠之腹腔內，約2週後採集含抗體之腹水。自所獲得之腹水中，藉由使用蛋白A管柱之親和層析法使IgG純化，獲得複數個純化抗RS病毒N蛋白質單株抗體(以下有時稱為「抗N蛋白質抗體」)。
以下之實施例係使用所獲得之複數個抗RS病毒N蛋白質單株抗體中，考慮到反應性及特異性而選擇之抗體。
實施例2 測定RS病毒之免疫測定器具
1.抗RS病毒N蛋白質抗體之於硝化纖維素薄膜上之固定化
準備以緩衝液稀釋實施例1所製作之抗N蛋白質抗體所得之液體及抗小鼠IgG抗體，於以PET(polyethylene terephthalate，聚對苯二甲酸乙二酯)膜襯底之硝化纖維素薄膜之樣品墊側以線狀塗佈抗N蛋白質抗體，於吸收體側以線狀塗佈抗小鼠IgG抗體。之後，於熱風下使硝化纖維素薄膜充分地乾燥，獲得抗N蛋白質抗體固定化薄膜。
2.抗RS病毒N蛋白質抗體之於著色聚苯乙烯粒子上之固定化
使實施例1所製作之抗N蛋白質抗體與著色聚苯乙烯粒子共價結合，懸濁於懸浮液中，藉由超音波處理使其充分地分散，獲得抗N蛋白質抗體結合著色聚苯乙烯粒子。本說明書中，稱為抗N蛋白質抗體固定化粒子。
3.抗RS病毒N蛋白質抗體結合著色聚苯乙烯粒子之塗佈及乾燥
將特定量之上述2中製作之抗體固定化粒子塗佈於玻璃纖維不織布，利用熱風化使其充分地乾燥。本說明書中稱為標記物墊。
4.RS病毒檢查裝置之製作
使上述1中製作之抗體固定化薄膜及上述2及3所製作之標記物墊與其他構件(背襯片、吸收帶、樣品墊)貼合，並切斷為5 mm寬，製成RS病毒檢查裝置。
5.RS病毒檢查裝置之特異性及正確性之確認
向上述4所製作之RS病毒檢查裝置中，滴加50μL包含引發呼吸道感染症之病毒之檢體懸浮液(10mM Tris(pH8.0)、1%(w/v)聚氧乙烯辛基苯基醚、3%(w/v)精胺酸、3%(w/v)BSA(Bovine Serum Albumin，牛血清白蛋白))，並靜置5分鐘。
將於抗小鼠IgG抗體及抗N蛋白質抗體二者之塗佈位置目視下均確認到顯色之情形判定為+。將僅於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置目視下確認到顯色，且於抗N蛋白質抗體之塗佈位置目視下並未確認到顯色之情形判定為-。又，將於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置並未確認到顯色之情形判定為無效。
將結果示於表1。
[表1]
| 病毒名 | 測定結果 |
| RS病毒長株(A型) | + |
| RS病毒A-2株(A型) | + |
| RS病毒CH-18株(B型) | + |
| 腺病毒1型 | - |
| 腺病毒2型 | - |
| 腺病毒3型 | - |
| 腺病毒4型 | - |
| 腺病毒5型 | - |
| 腺病毒7型 | - |
| 腺病毒19型 | - |
| 柯薩奇病毒A9型 | - |
| 柯薩奇病毒B4型 | - |
| 柯薩奇病毒B5型 | - |
| 柯薩奇病毒B6型 | - |
| 人類腸道細胞致病性病毒2型 | - |
| 人類腸道細胞致病性病毒3型 | - |
| 人類腸道細胞致病性病毒4型 | - |
| 人類腸道細胞致病性病毒6型 | - |
| 人類腸道細胞致病性病毒9型 | - |
| 人類腸道細胞致病性病毒11型 | - |
| 人類腸道細胞致病性病毒30型 | - |
| 單純疱疹病毒1型 | - |
| 人類偏肺病毒 A 型 | - |
| 人類偏肺病毒 B 型 | - |
| 流行性感冒病毒A/新喀里多尼亞/20/99(H1N1) | - |
| 流行性感冒病毒A/北京/262/95(H1N1) | - |
| 流行性感冒病毒A/紐約/55/2004(H3N2) | - |
| 流行性感冒病毒A/廣島/52/2005(H3N2) | - |
| 流行性感冒病毒B/上海/361/2002(山形) | - |
| 流行性感冒病毒B/馬來西亞/2506/2004(維多利亞) | - |
| 麻疹病毒 | - |
| 腮腺炎病毒 | - |
| 副流行性感冒病毒1型 | - |
| 副流行性感冒病毒2型 | - |
| 副流行性感冒病毒3型 | - |
| 副流行性感冒病毒4型 | - |
如表1所示，使用本發明之抗RS病毒N蛋白質抗體之免疫測定器具雖然對RS病毒反應，但並不對其他呼吸道感染症之病因病毒顯現交叉反應性，因此確認其對RS病毒特異性地反應。
實施例3 使用抗RS病毒N蛋白質單株抗體之高感度RS病毒檢查裝置
確認到使用實施例2所製作之抗N蛋白質抗體之RS病毒檢查裝置相較於使用抗RS病毒F蛋白質單株抗體(抗F蛋白質抗體)製作之檢查裝置，RS病毒抗原之檢測感度較低。
於實施例2之1.中將抗N蛋白質抗體固定於硝化纖維素薄膜時，添加二糖類及糖醇類，藉此具有與使用抗F蛋白質抗體之檢查裝置同等程度之感度。
1.高感度化抗N蛋白質抗體固定化薄膜之製作
向於實施例2之1.中將抗N蛋白質抗體固定化時之緩衝液中添加2%(w/v)之海藻糖作為二糖類，進而添加1.0～2.0%(w/v)之甘露醇，將所得者以線狀塗佈於硝化纖維素薄膜之後，於熱風下使硝化纖維素薄膜充分乾燥，從而獲得高感度化抗N蛋白質抗體固定化薄膜。
2.高感度化抗N蛋白質抗體固定化薄膜之評估
使用高感度化抗N蛋白質抗體固定化薄膜，利用實施例2之4.中記載之方法製備RS病毒檢查裝置，並使用RS病毒抗原之2倍連續稀釋液，依照實施例2之5.中記載之方法進行試驗，將試驗結果示於表2。
將於抗小鼠IgG抗體及抗N蛋白質抗體二者之塗佈位置目視下均確認到顯色之情形判定為+。將僅於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置目視下確認到顯色，且於抗N蛋白質抗體之塗佈位置目視下並未確認到顯色之情形判定為-。又，將於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置目視下並未確認到顯色之情形判定為無效。
[表2]
| 甘露醇添加量 | RS病毒抗原稀釋倍率 | |||
| 2 | 4 | 8 | 16 | |
| 無 | + | - | - | - |
| 1.0% | + | + | - | - |
| 2.0% | + | + | - | - |
確認到由添加二糖類及甘露醇導致感度提昇2倍。
[產業上之可利用性]
使用本發明之抗體可以高感度特異性地檢測RS病毒感染症。
本說明書所引用之所有刊行物、專利及專利申請係以直接引用之方式併入本說明書中。
Claims (17)
- 一種免疫測定方法，其係藉由使用將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化之載體之免疫測定方法來檢測測定對象者，且藉由使用如下載體來提昇檢測感度並檢測測定對象，該載體係向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加二糖類及糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化。
- 如請求項1之方法，其中向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加1～4%(w/v)之二糖類及0.5～4%(w/v)之糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定於載體。
- 如請求項1或2之方法，其中二糖類為海藻糖或麥芽糖。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中糖醇類為甘露醇或山梨糖醇。
- 如請求項1至4中任一項之方法，其係免疫層析法。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中抗體或其抗原結合性片段為抗RS病毒N蛋白質抗體或其抗原結合性片段。
- 一種檢測用試劑，其係將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化者，且於包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之檢測區域包含二糖類及糖醇類，且檢測感度得到提昇。
- 如請求項7之檢測用試劑，其中二糖類為海藻糖或麥芽糖。
- 如請求項7或8之檢測用試劑，其中糖醇類為甘露醇或山梨糖醇。
- 如請求項7至9中任一項之檢測用試劑，其係免疫層析法試劑。
- 如請求項7至10中任一項之檢測用試劑，其中抗體或其抗原結合性片段為抗RS病毒N蛋白質抗體或其抗原結合性片段。
- 一種檢測用試劑之製造方法，該檢測用試劑係檢測感度得到提昇，且將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化者，該製造方法係向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加二糖類及糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定化。
- 如請求項12之製造方法，其中向包含抗原、抗體或其抗原結合性片段之溶液中添加1～4%(w/v)之二糖類及0.5～4%(w/v)之糖醇類，而將抗原、抗體或其抗原結合性片段固定於載體。
- 如請求項12或13之製造方法，其中二糖類為海藻糖或麥芽糖。
- 如請求項12至14中任一項之製造方法，其中糖醇類為甘露醇或山梨糖醇。
- 如請求項12至15中任一項之製造方法，其中檢測用試劑為免疫層析法試劑。
- 如請求項12至16中任一項之製造方法，其中抗體或其抗原結合性片段為抗RS病毒N蛋白質抗體或其抗原結合性片段。
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