TW202204394A - 腺病毒之免疫測定方法及免疫測定器具 - Google Patents

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桑原三和
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Abstract

本發明之目的在於提供一種能夠快速、簡便且高靈敏度地檢測及測定受檢試樣中所含之腺病毒之單株抗體、使用其之腺病毒之免疫測定方法及免疫測定器具。 本發明提供一種與具有序列編號1所示之胺基酸序列之第21～944位之序列的多肽發生抗原抗體反應之單株抗體或其抗原結合性片段、使用其之免疫測定方法及免疫測定器具。

Description

腺病毒之免疫測定方法及免疫測定器具
本發明係關於一種腺病毒之免疫測定方法及免疫測定器具、以及用於此之抗腺病毒抗體。
已知腺病毒為急性熱性咽炎、咽結膜炎、急性氣管炎、病毒性肺炎等呼吸系統疾病、急性濾泡性結膜炎、流行性角結膜炎等眼疾病、感染性胃腸炎等消化系統疾病、尿道炎等泌尿系統疾病等之病原體。目前，腺病毒分為A～G七種，存在超過80個型別。其中，1～51型係作為血清型被報告，52型之後係作為由全鹼基序列確定之基因型被報告(非專利文獻1)。人感染腺病毒後會呈現多樣之臨床症狀，特異性症狀較少，故難以根據臨床症狀來證實感染了腺病毒。又，腺病毒之感染性較高，為了防止群體感染，必須儘早證實病毒之感染。
作為快速且簡便地檢測腺病毒之方法，已開發有使用抗腺病毒抗體之免疫層析法或應用酶免疫分析(EIA，Enzyme immunoassay)之方法，但於可採集試樣量較少之眼科領域中陽性率為60%以下，從而尋求更高靈敏度之快速診斷法或可用於其之抗腺病毒單株抗體。
根據日本國立感染症研究所之發生趨勢調查，已掌握作為腺病毒相關疾病之咽結膜熱、感染性胃腸炎、流行性角結膜炎之患者之發病資訊。已知急性呼吸系統疾病、咽結膜熱係由B、C、E種之腺病毒引起，感染性胃腸炎係由A、F、G種之腺病毒引起，流行性角結膜炎係由B、D、E種之腺病毒引起(非專利文獻2)。B種之腺病毒3型及E種之腺病毒4型為流行性角結膜炎及咽結膜熱之最普通之病因，D種之腺病毒8型、19型及37型還是一些國家、尤其是東亞及東南亞地區流行性角結膜炎大爆發之原因。腺病毒8型、19型及37型為熟知之院內感染之流行病學原因。最近，由腺病毒引起之院內感染成為公共衛生領域重大社會問題，亦成為醫院之經濟及倫理問題。
現已製作、報告有多種與腺病毒反應之單株抗體。例如，報告有使用與腺病毒之特定亞型反應之單株抗體來檢測腺病毒之方法(專利文獻1及2)。 [先前技術文獻]  [非專利文獻]
非專利文獻1：Seto D, et al., J Virol 85: 5701-5702, 2011 非專利文獻2：IASR Vol. 38 p. 133-135: 2017年7月號 專利文獻1：日本專利特開2000-290298 專利文獻2：日本專利特開2000-290299
(發明所欲解決之問題)
然而，目前製作之針對腺病毒之單株抗體對腺病毒之檢測靈敏度均不充分，尋求更高靈敏度地反應之單株抗體。又，習知之抗腺病毒單株抗體由於表位之胺基酸序列不特定，故存在再現性較差之問題。 本發明之目的在於提供一種能夠快速、簡便且高靈敏度地檢測及測定受檢試樣中所含之腺病毒之單株抗體、使用其之腺病毒之免疫測定方法及免疫測定器具。 (解決問題之技術手段)
本發明者等人針對上述課題，經過努力研究，結果發現為了更高靈敏度地檢測腺病毒，有效的是使用以腺病毒所含之特定之胺基酸序列作為表位之單株抗體，從而完成本發明。
即，本發明係如下所述。 [1]一種單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有序列編號1所示之胺基酸序列之第21～944位之序列的多肽發生抗原抗體反應。 [2]如[1]記載之單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有自序列編號1所示之胺基酸序列之第21～131位、第266～412位及第448～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。 [3]如[1]或[2]記載之單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有自序列編號1之胺基酸序列之第21～115位、第266～385位及第451～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。 [4]如[1]或[2]記載之單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有自序列編號1之胺基酸序列之第21～45位、第56～115位、第266～385位、第451～485位、第526～575位、第581～615位、第656～725位、第766～795位、第801～830位、第851～875位及第886～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。 [5]一種腺病毒之免疫測定方法，其包括利用如[1]至[4]中任一項記載之單株抗體或其抗原結合性片段與檢體中之腺病毒之抗原抗體反應來對腺病毒進行免疫測定。 [6]如[5]記載之方法，其中，上述免疫測定方法為三明治法，上述單株抗體或其抗原結合性片段用於標記或固相之至少任一者。 [7]一種腺病毒之免疫測定器具，其包含如[1]至[4]中任一項記載之單株抗體或其抗原結合性片段。 (對照先前技術之功效)
根據本發明，可提供一種能夠快速、簡便且高靈敏度地檢測及測定受檢試樣中所含之腺病毒之單株抗體、使用其之腺病毒之免疫測定方法及免疫測定器具。
以下，對本發明之實施形態進行詳細說明。
＜單株抗體或其抗原結合性片段＞ 本發明之單株抗體或其抗原結合性片段與具有序列編號1所示之胺基酸序列之第21～944位之序列的多肽發生抗原抗體反應。序列編號1之胺基酸序列係由944個胺基酸殘基構成之3型腺病毒GB株六鄰體單體(基因銀行登記號(GenBank Accession No.)AB330084.1)之序列。藉由在利用西方墨點法之腺病毒檢測中使用本發明之單株抗體或其抗原結合性片段，可於認為是分子量100 kD附近之單體之條帶(band)、與認為是200～300 kD之三聚體之條帶處偵測抗原抗體反應之特異性訊息。但於認為是單體之100 kD附近之條帶處僅確認到非常弱之反應。
於較佳樣態中，本發明之單株抗體或其抗原結合性片段與具有自序列編號1之胺基酸序列之第21～131位、第266～412位及第448～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。再者，認為序列編號1之胺基酸序列之第132～265位及第413～447位之序列係於腺病毒之亞型間保守性較低之序列。 又，於另一較佳樣態中，本發明之單株抗體或其抗原結合性片段與具有自序列編號1之胺基酸序列之第21～115位、第266～385位及第451～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。 進而，於另一較佳樣態中，本發明之單株抗體或其抗原結合性片段與具有自序列編號1之胺基酸序列之第21～45位、第56～115位、第266～385位、第451～485位、第526～575位、第581～615位、第656～725位、第766～795位、第801～830位、第851～875位及第886～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。 藉由使用與上述範圍之胺基酸序列之多肽發生抗原抗體反應之單株抗體或其抗原結合性片段，能夠高靈敏度地檢測腺病毒。
本發明之單株抗體或其抗原結合性片段具有包含重鏈及輕鏈之基本構造，重鏈及輕鏈分別具有能夠與抗原特異性結合之可變區。VH 指重鏈之可變區，VL 指輕鏈之可變區。重鏈及輕鏈之可變區分別包含互補決定區(CDR)即CDR1、CDR2及CDR3、以及架構區(FR)之胺基酸序列。例如，可變區包含3個CDR與3或4個FR(例如FR1、FR2及FR3或FR1、FR2、FR3及FR4)。
本發明之單株抗體包括四鏈抗體(例如2條輕鏈及2條重鏈)、重組抗體或修飾抗體(例如嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、CDR移植抗體、靈長類化抗體、去免疫化抗體、同人源化(synhumanized)抗體、半抗體、雙特異性抗體)。又，單株抗體之類型不限定於IgG，亦可為IgM或IgY。
於本發明中，所謂單株抗體之抗原結合性片段係指僅將單株抗體之抗原結合部位分離而成之片段，例如可列舉藉由公知方法製作之Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)等具有特異性之抗原結合性之片段。
(單株抗體之製作方法) 本發明之單株抗體可藉由如下方式獲得：採用公知之免疫學方法，對被免疫動物用含有包含與本發明之單株抗體發生抗原抗體反應之上述特定之胺基酸序列之腺病毒的複合體或提取物、或者該腺病毒或該等之部分多肽進行免疫，使用被免疫動物之細胞製作融合瘤。用於免疫之多肽之長度並無特別限定，可使用較佳為5個胺基酸以上、更佳為10個胺基酸以上之多肽作為免疫原。
免疫原可由培養液獲得，但亦可藉由在質粒載體中插入編碼包含與本發明之單株抗體發生抗原抗體反應之上述特定之胺基酸序列之腺病毒抗原之DNA，將其導入至宿主細胞進行表現而獲得。作為免疫原之腺病毒抗原或其部分多肽亦可以與如下例示之蛋白質之融合蛋白質之形式表現，進行純化後用作免疫原、或不經純化而直接用作免疫原。製作融合蛋白質時，業者可利用一般用作「蛋白質表現、純化標籤」之麩胱甘肽S-轉移酶(GST)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧化還原蛋白(TRX)、Nus標籤、S標籤、單純疱疹病毒(HSV，Herpes Simplex Virus)標籤、FRAG標籤、多組胺酸標籤等。與該等之融合蛋白質較佳為使用消化酶將上述腺病毒抗原或其部分多肽部分與其以外之標籤部分切斷，分離純化後用作免疫原。
由已免疫動物製備單株抗體時可利用公知之柯勒(Kohler)等人之方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))而容易地進行。即，從已免疫動物回收脾細胞或淋巴球等抗體產生細胞，藉由常規方法使其與小鼠骨髓瘤細胞融合而製作融合瘤，將獲得之融合瘤藉由有限稀釋法等進行選殖，於選殖之各融合瘤產生之單株抗體之中，選擇與用於動物免疫之抗原發生抗原抗體反應之單株抗體。
從腹水或培養上清液中純化單株抗體時可採用公知之免疫球蛋白純化法。例如可列舉：藉由使用硫酸銨或硫酸鈉進行鹽析之分級法、聚乙二醇(PEG，Polyethylene glycol)分級法、乙醇分級法、二乙基胺基乙醇(DEAE，Diethylaminoethanol)離子交換層析法、凝膠過濾法等。又，根據免疫動物之種類與單株抗體之類型，亦可藉由使用結合有蛋白質A、蛋白質G、蛋白質L任一者之載體之親和層析法進行純化。
＜免疫測定方法＞
本發明中，藉由使用上述單株抗體或其抗原結合性片段，能夠非常高靈敏度地檢測腺病毒。以下，於實施例之前的記載中，除根據上下文可知並非如此之情況外，「單株抗體」意指「單株抗體或其抗原結合性片段」。
本發明中，腺病毒之檢測藉由如下方式進行：利用上述單株抗體與檢體中之腺病毒之抗原抗體反應來對腺病毒進行免疫測定。所謂單株抗體與腺病毒發生抗原抗體反應，意指單株抗體與腺病毒發生特異性反應。所謂「特異性」，意指於抗原之蛋白質與單株抗體混合存在之液系中，該抗體未與抗原蛋白質以外之成分發生達到可檢測程度之抗原抗體反應，或者即便發生了一些結合反應或締合反應，亦僅為明顯比該抗體與抗原蛋白質之抗原抗體反應弱之反應。
本發明中，作為免疫測定法，可採用競爭法、凝集法、西方墨點法、免疫染色法、三明治法等對於業者而言公知之任一方法。
作為本發明之免疫測定方法，較佳為三明治法。三明治法本身為免疫測定領域中眾所周知之方法，例如可藉由免疫層析法或酶聯免疫吸附分析(ELISA，Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)法進行。該等三明治法本身均為公知，本發明之方法除了使用上述特定之單株抗體以外，可藉由公知之三明治法進行。
三明治法中使用識別抗原之2種抗體(固定於固相之固定化抗體與標記抗體)，於本發明之方法中，該等2種抗體中之至少任一者為上述本發明之單株抗體。固定於固相之固定化抗體每單位面積可固定之抗體量有限，故為了更佳地達成本發明之提高靈敏度之目的，較佳為至少固定化抗體使用的是本發明之單株抗體。再者，於單一分子或單一複合體之中存在至少2個可被該單株抗體識別之抗原之情形時，亦可使用單一種類之該單株抗體作為固相化抗體及標記抗體進行三明治法。
於以三明治法為檢測原理之免疫測定中，作為固定抗體之固相，能夠藉由公知技術固定抗體者均可使用，例如可任意地選擇具有毛細管作用之多孔性薄膜(membrane)、粒子狀物質、試驗管、樹脂平板等公知者。又，作為標記抗體之物質，可使用酵素、放射性同位素、螢光物質、發光物質、有色粒子、膠體粒子等。利用上述各種材料之免疫測定法之中，尤其就臨床檢查之簡便性與快速性之觀點而言，較佳為使用有薄膜之側流式免疫測定法。
本發明中，於使用單株抗體定量或半定量腺病毒之情形時，定量或半定量亦必然伴隨「測定」，因此包含於本發明之「測定」中。即，於本發明中，免疫測定之「測定」包括定量、半定量、檢測各者。 [實施例]
以下，基於實施例更具體地說明本發明。當然，本發明並不限定於下述實施例。
(實施例1)   抗腺病毒單株抗體之製作 1.腺病毒抗原之製備 使具有敏感性之哺乳類細胞感染腺病毒，培養數日後，對腺病毒感染細胞之培養液照射紫外線，使用該經過紫外線照射而去活化者。
2.抗腺病毒單株抗體之製作 對BALB/c小鼠用1.之腺病毒去活化抗原進行免疫，經過一段時間飼養後，自小鼠摘取脾臟，藉由柯勒(Kohler)等人之方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))與小鼠骨髓瘤細胞(P3×63)融合，獲得數個產生抗腺病毒抗體之融合瘤細胞株。 對經過姥鮫烷處理之BALB/c小鼠於腹腔投予所取得之細胞株，約2週後，採集含有抗體之腹水。從獲得之腹水中，藉由使用蛋白質A管柱之親和層析法純化IgG，獲得數個抗腺病毒純化單株抗體。
以下之實施例中，使用考慮到反應性及特異性而於所獲得之數個抗腺病毒單株抗體當中選擇之2個抗體(抗體1及抗體2)。
(實施例2)   測定腺病毒之免疫測定器具 1.抗腺病毒抗體向硝化纖維素膜之固定化 準備將實施例1中製作之抗腺病毒抗體(抗體2)利用緩衝液稀釋而成之溶液及抗小鼠IgG抗體，於經聚對苯二甲酸乙二酯(PET，polyethylene terephthalate)薄膜襯底之硝化纖維素膜之樣品墊(sample pad)側呈線狀塗佈抗腺病毒抗體，於吸收體側呈線狀塗佈抗小鼠IgG抗體。其後，將硝化纖維素膜於溫風下充分乾燥，獲得抗腺病毒抗體固定化薄膜。
2.抗腺病毒抗體向著色聚苯乙烯粒子之固定化 使實施例1中製作之抗腺病毒抗體(抗體1)與著色聚苯乙烯粒子共價結合後，將著色聚苯乙烯粒子懸浮於懸浮液。繼而，藉由超音波處理使之充分地分散，獲得結合有抗腺病毒抗體之著色聚苯乙烯粒子。本說明書中，將此處獲得之粒子稱為抗腺病毒抗體固定化粒子。
3.結合有抗腺病毒抗體之著色聚苯乙烯粒子之塗佈、乾燥 於玻璃纖維不織布塗佈既定量之2.中製作之抗腺病毒抗體固定化粒子，於溫風下充分乾燥。本說明書中，將此處獲得之墊片稱為標記抗體墊。
4.腺病毒檢查器具之製作 將1.中製作之抗腺病毒抗體固定化薄膜、以及2.及3.中製作之標記抗體墊與其他構件(背襯片、吸收帶、樣品墊)進行貼合，剪切成寬5 mm，作為腺病毒檢查器具。
5.腺病毒檢查器具之反應性之確認 利用緩衝液稀釋各型之腺病毒感染細胞之培養液，製備各型之腺病毒之2倍稀釋系列。 將所製備之腺病毒稀釋液添加至檢體懸浮液(10 mM三羥甲基胺基甲烷(Tris，Tris(hydroxymethyl)aminomethane)(pH8.0)、1 w/v%聚氧乙烯辛基苯基醚、3 w/v%精胺酸、3 w/v%牛血清白蛋白(BSA，Bovine Serum Albumin))中，於4.中製作之腺病毒檢查器具滴加50 μL後，靜置5分鐘。
可於抗小鼠IgG抗體及抗腺病毒抗體兩者之塗佈位置目視確認到顯色之情形時判定為＋(陽性)。僅可於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置目視確認到顯色、於抗腺病毒抗體之塗佈位置無法目視確認到顯色之情形時判定為－(陰性)。又，於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置無法目視確認到顯色之情形時判定為無效。 採用判定為陽性之最小之腺病毒濃度作為最小檢測靈敏度，結果示於表1。
[表1]
腺病毒 最小檢測靈敏度
型 種       TCID50 /test copies/test
1       C       1.95×102       2.50×103
2       C       1.95×102       6.25×103
3       B       2.79×102       1.25×104
5       C       7.85×101       6.25×103
6       C       5.58×102       3.13×103
7       B       1.74×102       1.25×104
8       D       1.95×101       1.25×103
11       B       2.79×102       5.00×104
19       D       2.44×101       1.25×104
31       A       4.48×102       1.25×105
37       D       3.14×101       2.50×103
如表1所示，可確認使用本發明之抗腺病毒抗體之免疫測定器具與屬於A～D種之多個型別之腺病毒發生反應。 又，亦可確認到與53型、54型、56型、64型、79型、81型、85型各亞型之反應。
6.腺病毒檢查器具之特異性之確認 於4.中製作之腺病毒檢查器具滴加包含引起呼吸系統感染症之病毒之檢體懸浮液50 μL，靜置5分鐘。 可於抗小鼠IgG抗體及抗腺病毒抗體兩者之塗佈位置目視確認到顯色之情形時判定為＋。僅可於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置目視確認到顯色、於抗腺病毒抗體之塗佈位置無法目視確認到顯色之情形時判定為－。又，於抗小鼠IgG抗體之塗佈位置無法目視確認到顯色之情形時判定為無效。 結果示於表2。
[表2]
病毒名 測定結果
柯薩奇A9型病毒 －
柯薩奇B4型病毒 －
柯薩奇B5型病毒 －
柯薩奇B6型病毒 －
埃可2型病毒 －
埃可3型病毒 －
埃可4型病毒 －
埃可6型病毒 －
埃可9型病毒 －
埃可11型病毒 －
埃可30型病毒 －
1型單純疱疹病毒 －
A型人偏肺病毒 －
B型人偏肺病毒 －
A型流行性感冒病毒/新喀里多尼亞/20/99 (H1N1) －
A型流行性感冒病毒/北京/262/95 (H1N1) －
A型流行性感冒病毒/紐約/55/2004 (H3N2) －
A型流行性感冒病毒/廣島/52/2005 (H3N2) －
B型流行性感冒病毒/上海/361/2002 (山形) －
B型流行性感冒病毒/馬來西亞/2506/2004 (維多利亞) －
麻疹病毒 －
腮腺炎病毒 －
1型副流行性感冒病毒 －
2型副流行性感冒病毒 －
3型副流行性感冒病毒 －
4型副流行性感冒病毒 －
呼吸道細胞融合性病毒(RS病毒)A型LONG株 －
呼吸道細胞融合性病毒(RS病毒)B型CH-18株 －
如表2所示，使用本發明之抗腺病毒抗體之免疫測定器具雖然與腺病毒反應，但對於其他呼吸系統感染症之病因病毒不顯示交叉反應性，由此可確認與腺病毒發生特異性反應。
7.腺病毒檢查器具之性能比較 將4.中製作之腺病毒檢查器具(本品)之最小檢測靈敏度與市售之腺病毒套組進行比較。 分別使用緩衝液稀釋腺病毒感染細胞之培養液，製備2倍稀釋系列。於本品滴加50 μL包含腺病毒稀釋液之檢體懸浮液，靜置5分鐘後進行判定。對於市售套組，採用規定量之腺病毒稀釋液作為檢體，按照各套組之隨附說明書實施試驗並進行判定。 將本品中判定為陽性之最大之腺病毒稀釋倍率設為「1」時，市售之腺病毒套組判定為陽性之最大之稀釋倍率設為相對靈敏度，示於表3。
[表3]
         各型(種)之相對靈敏度*      
套組 1型 2型 3型 4型 11型 37型 54型
   (C) (C) (B) (E) (B) (D) (D)
本品    1 1 1 1 1 1 1
套組A    1 1/2 1 1 1 1 1
套組B    1/2 1/4 1/2 1/2 1/2 1/2 1/4
套組C    1/8 1/8 1/8 1/20 1/20 NT NT
套組D    1 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2 1/2
套組E    1/16 1/32 1/100 1/80 1/400 NT NT
套組F    1/2 1/4 1/2 1/2 1/2 1/2 1/4
套組G    1/4 1/8 1/8 1/8 1/4 1/4 1/4
套組H    1/8 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4 1/4
NT：未實施試驗
如表3所示，可確認使用本發明之抗腺病毒抗體之免疫測定器具對2型腺病毒之反應性最高，對其他型別之腺病毒亦具有與套組A並列最高之反應性。
(實施例3)   抗腺病毒單株抗體之抗原識別部位 藉由西方墨點法及液相層析聯合質譜分析法(LC-MS/MS，Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry)確認實施例1中獲得之抗腺病毒單株抗體之抗原識別部位。
1.腺病毒濃縮液之製備 使A549細胞感染腺病毒，進行培養。於培養第7天回收腺病毒感染細胞，藉由超音波處理使細胞破碎。自細胞破碎液藉由離心分離去除細胞殘渣，獲得腺病毒濃縮液。
2.未經還原處理之樣品製備 製備1.中獲得之腺病毒濃縮液之2倍稀釋系列，以最終濃度成為62.5 mM Tris-HCl(pH6.5)、10 w/v%甘油、2.3 w/v%SDS、0.05%溴酚藍(BPB，Bromophenol Blue)(色素)之方式添加各試劑，不實施加熱變性處理，進行慣例之十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE，sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)。
3.經過還原處理之樣品製備 製備1.中獲得之腺病毒濃縮液之2倍稀釋系列，以最終濃度成為62.5 mM Tris-HCl(pH6.5)、10 w/v%甘油、2.3 w/v%SDS、0.05%BPB(色素)、5% 2-巰基乙醇之方式添加各試劑，於95℃下實施1分鐘之加熱變性處理後，進行慣例之SDS-PAGE。
4.西方墨點法 將2.及3.中獲得之電泳後之凝膠轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF，Polyvinylidene Difluoride)膜。用脫脂乳封閉(blocking)後，利用磷酸鹽吐溫緩衝液(PBS-Tween，Phosphate Buffer Solution-Tween)充分洗淨。與經PBS-Tween調整為3.8 μg/mL之抗腺病毒抗體於室溫下反應1小時。利用PBS-Tween充分洗淨後，與經3000倍稀釋之辣根過氧化物酶(HRP，Horseradish Peroxidase)標記抗小鼠抗體於室溫下反應1小時。利用PBS-Tween充分洗淨後，使用化學發光檢測試劑檢測信號。 西方墨點法之結果示於圖1。
如圖1所示，實施例1中製作之2個抗體(抗體1、抗體2)均與2.(未經還原處理)中獲得之樣品所含之200 kD附近之蛋白質(六鄰體三聚體)發生強烈反應(左圖)。認為還原處理使六鄰體三聚體變為單體，3.(經過還原處理)中獲得之樣品於100 kD附近之蛋白質(六鄰體單體)觀察到非常弱之反應(右圖)。 將2.及3.中獲得之電泳後之凝膠用CBB染色之結果示於圖2。
如圖2之箭頭所示，2.(未經還原處理)中獲得之樣品所含之主要蛋白質為200 kD附近(左圖)、3.(經過還原處理)中獲得之樣品則為100～150 kD(右圖)。剪下圖中之四邊形所示之各染色區域，經胰蛋白酶水解後，藉由LC-MS/MS進行胺基酸序列解析。使用Mascot(Ver. 2.5)(Matrix Science公司)及Scaffold(Proteome Software公司)對獲得之多肽片段進行解析，結果可知各染色區域均以腺病毒之六鄰體蛋白質為主要構成成分。
根據圖1及圖2，可知相較於六鄰體單體，實施例1中獲得之2個抗體均更強地與六鄰體三聚體之蛋白質發生反應，與單體之六鄰體蛋白質顯示弱反應。如圖所示，雖然本發明之抗體與六鄰體單體之反應為弱反應，但與單體中之特定之序列發生抗原抗體反應之本發明之抗體對於檢測腺病毒非常有效。
(實施例4)   利用肽微陣列PepStar(JPT Peptide Technologies公司製造，以下稱為「Pepstar」)進行之抗腺病毒單株抗體與腺病毒六鄰體蛋白之反應性解析 1.PepStar之製作 基於3型腺病毒GB株六鄰體蛋白質(基因銀行登記號AB330084.1)之胺基酸序列資訊，購入固定有表4所示之肽資料庫中揭示之多肽的肽微陣列Pepstar(JPT Peptide Technologies公司製造)。
[表4-1]
Figure 02_image001
[表4-2]
Figure 02_image003
[表4-3]
Figure 02_image005
[表4-4]
Figure 02_image007
2.利用Pepstar進行之抗腺病毒單株抗體之反應性解析 利用緩衝液稀釋實施例1中製作之2種抗腺病毒抗體，使各抗體在30℃下於Pepstar上反應1小時。反應後，於對應之孔中添加1 μg/ml之二次螢光標記抗小鼠IgG抗體，反應1小時。將孔上之反應產物洗淨並乾燥後，用高分辨率雷射掃描儀於635 nm下掃描載玻片，取得螢光強度分佈。將取得之結果圖像進行定量化，獲得各多肽之平均像素值。 為了將獲得之結果視覺化而對各個結合區域進行比較，製作由白(無結合)至紅(較強結合)之用不同顏色區分顯示螢光強度之熱區圖(圖3)。
根據圖3之熱區圖之結果，可了解實施例1中製作之2種抗腺病毒單株抗體針對腺病毒之六鄰體蛋白質之反應區域。
圖1係表示實施例3中進行之西方墨點實驗之結果的圖。 圖2係表示實施例3中進行之用考馬斯亮藍(CBB，Coomassie Brilliant Blue)將電泳後之凝膠染色之結果的圖。 圖3-1係表示3型腺病毒GB株六鄰體蛋白質之肽資料庫(peptide library)之索引(index)1～51的圖。 圖3-2係表示3型腺病毒GB株六鄰體蛋白質之肽資料庫之索引52～102的圖。 圖3-3係表示3型腺病毒GB株六鄰體蛋白質之肽資料庫之索引103～152的圖。 圖3-4係表示3型腺病毒GB株六鄰體蛋白質之肽資料庫之索引153～187的圖。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006

Claims (7)

  1. 一種單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有序列編號1所示之胺基酸序列之第21～944位之序列的多肽發生抗原抗體反應。
  2. 如請求項1之單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有自序列編號1所示之胺基酸序列之第21～131位、第266～412位及第448～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。
  3. 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有自序列編號1之胺基酸序列之第21～115位、第266～385位及第451～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。
  4. 如請求項1或2之單株抗體或其抗原結合性片段，其與具有自序列編號1之胺基酸序列之第21～45位、第56～115位、第266～385位、第451～485位、第526～575位、第581～615位、第656～725位、第766～795位、第801～830位、第851～875位及第886～944位選擇之至少一個範圍之序列的多肽發生抗原抗體反應。
  5. 一種腺病毒之免疫測定方法，其包括利用請求項1至4中任一項之單株抗體或其抗原結合性片段與檢體中之腺病毒之抗原抗體反應來對腺病毒進行免疫測定。
  6. 如請求項5之方法，其中，上述免疫測定方法為三明治法，上述單株抗體或其抗原結合性片段用於標記或固相之至少任一者。
  7. 一種腺病毒之免疫測定器具，其包含請求項1至4中任一項之單株抗體或其抗原結合性片段。
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