JP2000290299A - モノクローナル抗体及びこれを用いたアデノウイルス検出法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びこれを用いたアデノウイルス検出法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 アデノウイルスの検出の感度が高く、アデノ
ウイルスの血清型の同定法にも使用できるモノクローナ
ル抗体の提供。 【解決手段】 アデノウイルス血清型１、２、４、５、
６、７、８、１１、１９及び３７型と実質的に反応せ
ず、アデノウイルス血清型３に特異的に高い反応性を示
すことを特徴とするモノクローナル抗体の取得。
ウイルスの血清型の同定法にも使用できるモノクローナ
ル抗体の提供。 【解決手段】 アデノウイルス血清型１、２、４、５、
６、７、８、１１、１９及び３７型と実質的に反応せ
ず、アデノウイルス血清型３に特異的に高い反応性を示
すことを特徴とするモノクローナル抗体の取得。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、血清型が３型のア
デノウイルスに高感度に反応するモノクローナル抗体に
関するものであり、従来のアデノウイルスの検出及び診
断に利用されているモノクローナル抗体と併用すること
により、より高感度のアデノウイルスの検出及び診断に
利用できるものであり、本発明は疾病の検査及び診断技
術に属するものである。
デノウイルスに高感度に反応するモノクローナル抗体に
関するものであり、従来のアデノウイルスの検出及び診
断に利用されているモノクローナル抗体と併用すること
により、より高感度のアデノウイルスの検出及び診断に
利用できるものであり、本発明は疾病の検査及び診断技
術に属するものである。
【０００２】
【従来技術】アデノウイルスは、急性熱性咽頭炎、咽頭
結膜炎、急性気道炎、ウイルス性肺炎、急性濾胞性結膜
炎、流行性角結膜炎などの病原体として知られる。現在
ヒトアデノウイルスとしては４７の血清型が知られてい
るが、中でも３型のアデノウイルスは、小児の呼吸器疾
患（滲出扁桃炎、咽頭結膜熱（プール熱））に広く認め
られる代表的血清型である。アデノウイルスはヒトに感
染した場合、多彩な臨床症状を呈し、特異的な病状が少
ない為、臨床症状からアデノウイルスの感染を証明しさ
らに血清型まで特定することは困難である。また、アデ
ノウイルスの感染性は高く、集団感染を防ぐ為には早期
にウイルスの感染を証明する事が必要である。現在、ア
デノウイルスの検出同定には分離培養−中和法あるいは
PCR-RFLP法が使用されているが、分離培養−中和法は判
定までに２週間という長期間が必要であり、また、PCR-
RFLP法は感染力を保持していた病原体の証明とはならな
いという問題をそれぞれ有している。また、迅速かつ簡
便にアデノウイルスを検出する方法として抗アデノウイ
ルス抗体を用いた免疫クロマト法やEIAを用いた方法が
開発されているが、より高感度の迅速診断法またはこれ
に用いることのできる抗アデノウイルスモノクローナル
抗体が求められている。なお、アデノウイルスに対する
モノクローナル抗体及びこれを用いたアデノウイルス検
出法に関する代表的先行技術としては以下の文献に記載
のものが挙げられる。 <1> Application of a Solid-Phase Immunofluoromet
ric Assay to the Selection of Monoclonal Antibody
Specific for the Adenovirus Group-Reactive Hexon A
ntigen, Arch-Virol.1984;80, 1-10, <2> Comparison of Time-Resolved Fluoroimmunoassa
y with Monoclonal Capture-Biotinylated Detector En
zyme Immunoassay for Adenovirus Antigen Detection,
J-Clinical Microbiology, 1987 Sept,1662-1667, <3> Characterization of adenovirus hexons by thei
r epitope composition,Arch-Virol.1996;141:1891-190
7, <4> Rapid diagnosis of adenovirus pharygoconjunct
ival fever;use of a monoclonal antibody-based ELIS
A test during an outbreak, J-Virol-Methods,19
89, Jun;24(3):307-12, <5> Adenovirus Hexon Monoclonal Antibody That Is
Group Specific and Potentially Useful as a Diagnos
tic Reagent , J-Clinical Microbiology, 1983Feb, 3
60-364,
結膜炎、急性気道炎、ウイルス性肺炎、急性濾胞性結膜
炎、流行性角結膜炎などの病原体として知られる。現在
ヒトアデノウイルスとしては４７の血清型が知られてい
るが、中でも３型のアデノウイルスは、小児の呼吸器疾
患（滲出扁桃炎、咽頭結膜熱（プール熱））に広く認め
られる代表的血清型である。アデノウイルスはヒトに感
染した場合、多彩な臨床症状を呈し、特異的な病状が少
ない為、臨床症状からアデノウイルスの感染を証明しさ
らに血清型まで特定することは困難である。また、アデ
ノウイルスの感染性は高く、集団感染を防ぐ為には早期
にウイルスの感染を証明する事が必要である。現在、ア
デノウイルスの検出同定には分離培養−中和法あるいは
PCR-RFLP法が使用されているが、分離培養−中和法は判
定までに２週間という長期間が必要であり、また、PCR-
RFLP法は感染力を保持していた病原体の証明とはならな
いという問題をそれぞれ有している。また、迅速かつ簡
便にアデノウイルスを検出する方法として抗アデノウイ
ルス抗体を用いた免疫クロマト法やEIAを用いた方法が
開発されているが、より高感度の迅速診断法またはこれ
に用いることのできる抗アデノウイルスモノクローナル
抗体が求められている。なお、アデノウイルスに対する
モノクローナル抗体及びこれを用いたアデノウイルス検
出法に関する代表的先行技術としては以下の文献に記載
のものが挙げられる。 <1> Application of a Solid-Phase Immunofluoromet
ric Assay to the Selection of Monoclonal Antibody
Specific for the Adenovirus Group-Reactive Hexon A
ntigen, Arch-Virol.1984;80, 1-10, <2> Comparison of Time-Resolved Fluoroimmunoassa
y with Monoclonal Capture-Biotinylated Detector En
zyme Immunoassay for Adenovirus Antigen Detection,
J-Clinical Microbiology, 1987 Sept,1662-1667, <3> Characterization of adenovirus hexons by thei
r epitope composition,Arch-Virol.1996;141:1891-190
7, <4> Rapid diagnosis of adenovirus pharygoconjunct
ival fever;use of a monoclonal antibody-based ELIS
A test during an outbreak, J-Virol-Methods,19
89, Jun;24(3):307-12, <5> Adenovirus Hexon Monoclonal Antibody That Is
Group Specific and Potentially Useful as a Diagnos
tic Reagent , J-Clinical Microbiology, 1983Feb, 3
60-364,
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】現在アデノウイルスに
対するモノクローナル抗体は上記先行文献に記載されて
いるとおり多数作製されているが、いずれもアデノウイ
ルスの検出の感度は十分ではなく、高感度に反応するモ
ノクローナル抗体が求められている。また、アデノウイ
ルスの血清型の同定法に使用できるモノクローナル抗体
も必要とされている。本発明者等はそれらの要望に答え
るべく研究を行ったのである。
対するモノクローナル抗体は上記先行文献に記載されて
いるとおり多数作製されているが、いずれもアデノウイ
ルスの検出の感度は十分ではなく、高感度に反応するモ
ノクローナル抗体が求められている。また、アデノウイ
ルスの血清型の同定法に使用できるモノクローナル抗体
も必要とされている。本発明者等はそれらの要望に答え
るべく研究を行ったのである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、特定の血
清型に特異的に反応するモノクローナル抗体を作製する
ために種々検討を行ったところ、３、４、８、１９及び
３７型という５種類のアデノウイルス抗原を混合してマ
ウスの免疫を行って取得したモノクローナル抗体がアデ
ノウイルス血清型３型に特異的に反応するものであるこ
とを見出して本発明を完成した。
清型に特異的に反応するモノクローナル抗体を作製する
ために種々検討を行ったところ、３、４、８、１９及び
３７型という５種類のアデノウイルス抗原を混合してマ
ウスの免疫を行って取得したモノクローナル抗体がアデ
ノウイルス血清型３型に特異的に反応するものであるこ
とを見出して本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明はアデノウイルス血清型
１、２、４、５、６、７、８、１１、１９及び３７型と
実質的に反応せず、アデノウイルス血清型３に特異的に
高い反応性を示すことを特徴とするモノクローナル抗体
に関するものである。さらに、本発明は前記モノクロー
ナル抗体がアデノウイルス３、４、８、１９及び３７型
混合物により免疫したマウスの脾細胞とマウスミエロー
マ細胞とを融合することによって得られるハイブリドー
マにより産生されたものであることを特徴とする請求項
１記載のモノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体
がアデノウイルス３型に対する反応性をELISA法で測定
したときの吸光度ＯＤ490nmが２.１以上であることを特
徴とするモノクローナル抗体、ならびに前記モノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とするアデノウイルス検出
方法に関するものである。
１、２、４、５、６、７、８、１１、１９及び３７型と
実質的に反応せず、アデノウイルス血清型３に特異的に
高い反応性を示すことを特徴とするモノクローナル抗体
に関するものである。さらに、本発明は前記モノクロー
ナル抗体がアデノウイルス３、４、８、１９及び３７型
混合物により免疫したマウスの脾細胞とマウスミエロー
マ細胞とを融合することによって得られるハイブリドー
マにより産生されたものであることを特徴とする請求項
１記載のモノクローナル抗体、前記モノクローナル抗体
がアデノウイルス３型に対する反応性をELISA法で測定
したときの吸光度ＯＤ490nmが２.１以上であることを特
徴とするモノクローナル抗体、ならびに前記モノクロー
ナル抗体を用いることを特徴とするアデノウイルス検出
方法に関するものである。
【０００６】
【実施例】以下、実施例に基いて、本発明を詳細に説明
する。 〇 抗アデノウイスモノクローナル抗体の作製 (1)動物の免疫と抗体産生細胞の調製 アデノウイルス臨床株、Ad3x, Ad4x, Ad8x, Ad19x, Ad3
7xの５種類を、それぞれHEp−2細胞を用いて培養し、細
胞変性効果(ＣＰＥ)+++となったものを、６０℃にて２
時間処理にて不活化したものを免疫抗原(以下不活化抗
原)とし、３〜１０週齢のBALB/Cマウス(♀)の腹腔内に
フロインドの完全アジュバントとともに投与する。以後
２週間ごとに不活化抗原をフロインドの不完全アジュバ
ントとともに腹腔内投与を２〜５回繰り返す。細胞融合
に供するにあたって、免疫したマウスに融合処理の３〜
４日前に不活化抗原を腹腔内投与し最終免疫とする。細
胞融合当日に脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。すなわ
ち、脾臓をIscove's Modified Dulbecco's Medium
(ＩＭＤＭ)中で細断し、メッシュを通して細分化し、１
０００rpm、５分間遠心して上清を捨てＩＭＤＭで洗浄
を３回くりかえして、融合用脾細胞として提供する。 (2)ミエローマ細胞の調製 マウス由来のNS-1(ATCC名称；P3/NS1/1/Ag4-1)細胞株を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。 (3)ハイブリドーマの作製 (1)と(2)で得られた脾細胞とミエローマ細胞を、５〜１
０：１の割合となるように混合し、１０００rpm、５分
間遠心した後上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐし
た後、攪拌しながら３７℃で５０％ポリエチレングリコ
ール(PEG1000〜5000)１mlを１分間かけて加え、さらに
ＩＭＤＭ１〜２mlを数回加えて全量が２０mlになるまで
加える。１０００rpm×５分間遠心した後、上清を捨
て、フィーダー細胞として用意しておいたBALB/cマウス
胸腺細胞１×１０8個を加え、緩やかにほぐした後、Ｈ
ＡＴ(ヒホ゜キサンチンナトリウム、アミノフ゜テリン、チミシ゛ン)培地／[ＩＭＤ
Ｍ、牛胎児血清(FCS)20%]を２００mlを加え、メスピペ
ットによる吸い込み、吹き出しで緩やかに細胞を懸濁す
る。この懸濁液を９６well培養用マイクロプレートに１
００μlずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中３７
℃で２４時間培養する。以後、培養液が黄色味を帯びて
きたwellが出現したら、約２日間ごとに、培養上清１０
０μlを捨て新たなＨＡＴ培地１００μlを加える。この
操作を１０日〜１４日間繰り返しながら５％ＣＯ2イン
キュベーター内で、３７℃で培養する。この間培地交換
をする際に、得られる培養上清を次に示すELISAに供
し、アデノウイルス３、４、８、１９、３７型何れかに
反応する抗体を産生しているwellを選択する。
する。 〇 抗アデノウイスモノクローナル抗体の作製 (1)動物の免疫と抗体産生細胞の調製 アデノウイルス臨床株、Ad3x, Ad4x, Ad8x, Ad19x, Ad3
7xの５種類を、それぞれHEp−2細胞を用いて培養し、細
胞変性効果(ＣＰＥ)+++となったものを、６０℃にて２
時間処理にて不活化したものを免疫抗原(以下不活化抗
原)とし、３〜１０週齢のBALB/Cマウス(♀)の腹腔内に
フロインドの完全アジュバントとともに投与する。以後
２週間ごとに不活化抗原をフロインドの不完全アジュバ
ントとともに腹腔内投与を２〜５回繰り返す。細胞融合
に供するにあたって、免疫したマウスに融合処理の３〜
４日前に不活化抗原を腹腔内投与し最終免疫とする。細
胞融合当日に脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。すなわ
ち、脾臓をIscove's Modified Dulbecco's Medium
(ＩＭＤＭ)中で細断し、メッシュを通して細分化し、１
０００rpm、５分間遠心して上清を捨てＩＭＤＭで洗浄
を３回くりかえして、融合用脾細胞として提供する。 (2)ミエローマ細胞の調製 マウス由来のNS-1(ATCC名称；P3/NS1/1/Ag4-1)細胞株を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×１０7以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。 (3)ハイブリドーマの作製 (1)と(2)で得られた脾細胞とミエローマ細胞を、５〜１
０：１の割合となるように混合し、１０００rpm、５分
間遠心した後上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐし
た後、攪拌しながら３７℃で５０％ポリエチレングリコ
ール(PEG1000〜5000)１mlを１分間かけて加え、さらに
ＩＭＤＭ１〜２mlを数回加えて全量が２０mlになるまで
加える。１０００rpm×５分間遠心した後、上清を捨
て、フィーダー細胞として用意しておいたBALB/cマウス
胸腺細胞１×１０8個を加え、緩やかにほぐした後、Ｈ
ＡＴ(ヒホ゜キサンチンナトリウム、アミノフ゜テリン、チミシ゛ン)培地／[ＩＭＤ
Ｍ、牛胎児血清(FCS)20%]を２００mlを加え、メスピペ
ットによる吸い込み、吹き出しで緩やかに細胞を懸濁す
る。この懸濁液を９６well培養用マイクロプレートに１
００μlずつ分注し、５％ＣＯ2インキュベーター中３７
℃で２４時間培養する。以後、培養液が黄色味を帯びて
きたwellが出現したら、約２日間ごとに、培養上清１０
０μlを捨て新たなＨＡＴ培地１００μlを加える。この
操作を１０日〜１４日間繰り返しながら５％ＣＯ2イン
キュベーター内で、３７℃で培養する。この間培地交換
をする際に、得られる培養上清を次に示すELISAに供
し、アデノウイルス３、４、８、１９、３７型何れかに
反応する抗体を産生しているwellを選択する。
【０００７】〇 スクリーニング方法 Ad3x, 4x, 8x, 19x, 37xの不活化精製ウイルス２μg/ml
/PBS混合溶液を９６穴マイクロタイタープレートに５０
μl/well分注し、室温1時間以上または４℃一晩以上静
置して感作した後、０.０５％Tween20を含むＰＢＳで３
回洗浄し、１％BSA/PBSでブロッキングする。この抗原
感作プレートに、抗体を含むと思われる試料溶液５０μ
l/wellを分注し、室温1時間以上または４℃一晩以上反
応させる。反応後、０.０５％Tween20を含むＰＢＳで3
回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgGをＰ
ＢＳで適正濃度に希釈し、５０μl/wellを分注し、室温
1時間反応させ再び０.０５％Tween20を含むＰＢＳで３
回洗浄する。ペルオキシダーゼの基質であるオルトフェ
ニレンジアミンを１００μl/well分注して５分〜３０分
発色させた後、２N-Ｈ2ＳＯ4１００μl/wellを加えて反
応を停止し、分光光度計にて４９０nmでのＯＤ値を測定
し、一定以上の発色を示したものを陽性とする。ELISA
にて陽性とみなされ、すなわちアデノウイルス3x, 4x,
8x, 19x, 37x型のいずれかに反応する抗体を産生してい
るwellであり、かつ、コロニー状に生育してきたハイブ
リドーマの認められるwellについて、限界希釈法により
クローニングを行い、安定してアデノウイルス3x型に強
い抗体価の認められたものを３型のアデノイウイルスに
反応するモノクローナル抗体として選択した。なお、選
択できたものは、培地を徐々にＨＴ(ヒホ゜キサンチンナトリウム、チミ
シ゛ン)培地へと変換し、さらに正常培地へと変換する。こ
のようにして、１匹のマウスからＣ８というモノクロー
ナル抗体を得た。得られたモノクローナル抗体は工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ
−１７３５３として受託された。
/PBS混合溶液を９６穴マイクロタイタープレートに５０
μl/well分注し、室温1時間以上または４℃一晩以上静
置して感作した後、０.０５％Tween20を含むＰＢＳで３
回洗浄し、１％BSA/PBSでブロッキングする。この抗原
感作プレートに、抗体を含むと思われる試料溶液５０μ
l/wellを分注し、室温1時間以上または４℃一晩以上反
応させる。反応後、０.０５％Tween20を含むＰＢＳで3
回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識した抗マウスIgGをＰ
ＢＳで適正濃度に希釈し、５０μl/wellを分注し、室温
1時間反応させ再び０.０５％Tween20を含むＰＢＳで３
回洗浄する。ペルオキシダーゼの基質であるオルトフェ
ニレンジアミンを１００μl/well分注して５分〜３０分
発色させた後、２N-Ｈ2ＳＯ4１００μl/wellを加えて反
応を停止し、分光光度計にて４９０nmでのＯＤ値を測定
し、一定以上の発色を示したものを陽性とする。ELISA
にて陽性とみなされ、すなわちアデノウイルス3x, 4x,
8x, 19x, 37x型のいずれかに反応する抗体を産生してい
るwellであり、かつ、コロニー状に生育してきたハイブ
リドーマの認められるwellについて、限界希釈法により
クローニングを行い、安定してアデノウイルス3x型に強
い抗体価の認められたものを３型のアデノイウイルスに
反応するモノクローナル抗体として選択した。なお、選
択できたものは、培地を徐々にＨＴ(ヒホ゜キサンチンナトリウム、チミ
シ゛ン)培地へと変換し、さらに正常培地へと変換する。こ
のようにして、１匹のマウスからＣ８というモノクロー
ナル抗体を得た。得られたモノクローナル抗体は工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、ＦＥＲＭ Ｐ
−１７３５３として受託された。
【０００８】〇 モノクローナル抗体の大量作製 プリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）０.
５mlを腹腔内投与し、２〜４週間飼育した８〜１０週令
のマウス(BALB/c,♀)に、(3)で得られた抗アデノウイル
スモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を２〜１
０×１０6細胞/匹を腹腔内投与する。１０〜２１日でハ
イブリドーマは腹水癌化するので、このマウスから腹水
を採取し、遠心分離(3000rpmx5分)して固形分を除き上
清液を ProteinAカラムに通過させ、その吸着画分を集
め、精製モノクローナル抗体 IgG画分とし、２８０nmで
の吸光度測定によりIgG濃度を決定した。
５mlを腹腔内投与し、２〜４週間飼育した８〜１０週令
のマウス(BALB/c,♀)に、(3)で得られた抗アデノウイル
スモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を２〜１
０×１０6細胞/匹を腹腔内投与する。１０〜２１日でハ
イブリドーマは腹水癌化するので、このマウスから腹水
を採取し、遠心分離(3000rpmx5分)して固形分を除き上
清液を ProteinAカラムに通過させ、その吸着画分を集
め、精製モノクローナル抗体 IgG画分とし、２８０nmで
の吸光度測定によりIgG濃度を決定した。
【０００９】〇 Ｃ８の反応性 このようにして得られたＣ８の、アデノウイルスに対す
る反応性を次の２つの方法で調べた。方法１ ELISA法１ ６種類のアデノウイルス抗原(Ad3x、Ad4x、Ad8x、Ad1
9、Ad37xの臨床分離株及びプロトタイプAd37p)を９６穴
マイクロタイタープレートに結合する操作を行った。こ
こで用いたアデノウイルス抗原は何れもセシウム遠心に
より精製されており、横浜市立大学医学部眼科学教室よ
り入手した。いずれも６０℃にて２時間加熱して不活化
処理がされておりＢＣＡ法によりヘキソンタンパク濃度
は決定されていた。各臨床分離株の名称は以下の通りで
ある。 Ad3x=TC21309、Ad4x=札幌95-0187、Ad8x=19751、Ad19x=
V92-8266、 Ad37x=TC-20850-1。 これらのアデノウイルスをＰＢＳにてそれぞれ２μg/ml
に調製し９６穴マイクロタイタープレート(塩化ビニー
ル製、住友ベークライト社、MS7196F)に５０μl/well分
注する。室温(22℃〜26℃)１時間静置して感作した後、
０.０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄し、１％BSA/
PBSで３７℃４時間ブロッキングする。この抗原感作プ
レートに、Ｃ８の抗体をＰＢＳでIgG濃度０.１μg/mlに
調製した溶液５０μl/wellを分注し、室温(22℃〜26℃)
1時間反応させる。反応後、０.０５％Tween20を含むＰ
ＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識した抗マウス
IgG((H+L)(MBL社CODE330)をＰＢＳで２０００倍に希釈
し、５０μl/wellを分注し、室温(22℃〜26℃)1時間反
応させ再び０.０５％Tween20を含むＰＢＳで3回洗浄す
る。ペルオキシダーゼの基質であるオルトフェニレンジ
アミン(opd)の錠剤(opd15mg, Na2SO2 91.3mg, クエン酸
6.8mg, Na2CO3 16.9mgから成る)を０.０１５％Ｈ2Ｏ2を
含むpＨ５.２の２M-Tris-クエン酸バッファー１２mlに
溶解したものを１００μl/well分注して室温(22℃〜26
℃)３０分発色させた後、２N-Ｈ2ＳＯ4１００μl/well
を加えて反応を停止し、プレートリーダー (Molecular
Devices Vmax)にて４９０nm-６５０nmでのＯＤ値を測定
した。抗アデノウイルスモノクローナル抗体のコントロ
ールとして、<ケミコン社MAB8052>を用いた。MAB8052
は、Ad3型で免疫して得られたハイブリドーマが産生す
るモノクローナル抗体であり、４１種の血清型のアデノ
ウイルスと反応する。クローン名は<20/11>。(参考文
献；先行技術の記載のうち<1>,<2>.）取得抗体に関して
３回試験を行い、平均値と標準偏差を算出した。得られ
た結果を表１に示す。結果の数値はＯＤ490-650nmの値
である。なお、抗体の代わりにＰＢＳのみを抗原結合プ
レートに反応させた場合のバックグラウンド値は、何れ
も１０mＯＤ未満の値であったので、無視した。
る反応性を次の２つの方法で調べた。方法１ ELISA法１ ６種類のアデノウイルス抗原(Ad3x、Ad4x、Ad8x、Ad1
9、Ad37xの臨床分離株及びプロトタイプAd37p)を９６穴
マイクロタイタープレートに結合する操作を行った。こ
こで用いたアデノウイルス抗原は何れもセシウム遠心に
より精製されており、横浜市立大学医学部眼科学教室よ
り入手した。いずれも６０℃にて２時間加熱して不活化
処理がされておりＢＣＡ法によりヘキソンタンパク濃度
は決定されていた。各臨床分離株の名称は以下の通りで
ある。 Ad3x=TC21309、Ad4x=札幌95-0187、Ad8x=19751、Ad19x=
V92-8266、 Ad37x=TC-20850-1。 これらのアデノウイルスをＰＢＳにてそれぞれ２μg/ml
に調製し９６穴マイクロタイタープレート(塩化ビニー
ル製、住友ベークライト社、MS7196F)に５０μl/well分
注する。室温(22℃〜26℃)１時間静置して感作した後、
０.０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄し、１％BSA/
PBSで３７℃４時間ブロッキングする。この抗原感作プ
レートに、Ｃ８の抗体をＰＢＳでIgG濃度０.１μg/mlに
調製した溶液５０μl/wellを分注し、室温(22℃〜26℃)
1時間反応させる。反応後、０.０５％Tween20を含むＰ
ＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識した抗マウス
IgG((H+L)(MBL社CODE330)をＰＢＳで２０００倍に希釈
し、５０μl/wellを分注し、室温(22℃〜26℃)1時間反
応させ再び０.０５％Tween20を含むＰＢＳで3回洗浄す
る。ペルオキシダーゼの基質であるオルトフェニレンジ
アミン(opd)の錠剤(opd15mg, Na2SO2 91.3mg, クエン酸
6.8mg, Na2CO3 16.9mgから成る)を０.０１５％Ｈ2Ｏ2を
含むpＨ５.２の２M-Tris-クエン酸バッファー１２mlに
溶解したものを１００μl/well分注して室温(22℃〜26
℃)３０分発色させた後、２N-Ｈ2ＳＯ4１００μl/well
を加えて反応を停止し、プレートリーダー (Molecular
Devices Vmax)にて４９０nm-６５０nmでのＯＤ値を測定
した。抗アデノウイルスモノクローナル抗体のコントロ
ールとして、<ケミコン社MAB8052>を用いた。MAB8052
は、Ad3型で免疫して得られたハイブリドーマが産生す
るモノクローナル抗体であり、４１種の血清型のアデノ
ウイルスと反応する。クローン名は<20/11>。(参考文
献；先行技術の記載のうち<1>,<2>.）取得抗体に関して
３回試験を行い、平均値と標準偏差を算出した。得られ
た結果を表１に示す。結果の数値はＯＤ490-650nmの値
である。なお、抗体の代わりにＰＢＳのみを抗原結合プ
レートに反応させた場合のバックグラウンド値は、何れ
も１０mＯＤ未満の値であったので、無視した。
【００１０】
【表１】
【００１１】以上の結果から、取得したモノクローナル
抗体Ｃ8はアデノウイルス３型に対し常に2.1ＯＤ490nm
以上の高い反応性を示し、コントロールとして用いたMA
B8052と比較してもＡｄ３型に対しては格段に高い反応
性を有する事が明らかとなった。また、Ad4x、8x、37
x、37pに対しての反応性は、３型に対する反応性と比較
すれば格段に低く、Ｃ８はほぼＡｄ３型特異的な抗体で
あると考えられる。よって、Ｃ８を使用する濃度を調節
する事により、アデノウイルス３型の検出同定に用いる
事ができ、また、他のアデノウイルス全般に反応するモ
ノクローナル抗体と混合して用いる事により、アデノウ
イルスの検出感度を高めることが期待できる。これらの
ＯＤ値は、上記測定条件で測定したものであるが、本質
的には、抗原結合プレートに、５０μlの抗体溶液を反
応させ、ペルオキシターゼ標識抗マウスＩgＧとその基
質であるオルトフェニレンジアミンにより発色させるＥ
ＬＩＳＡ法により測定したものと言えるものである。
抗体Ｃ8はアデノウイルス３型に対し常に2.1ＯＤ490nm
以上の高い反応性を示し、コントロールとして用いたMA
B8052と比較してもＡｄ３型に対しては格段に高い反応
性を有する事が明らかとなった。また、Ad4x、8x、37
x、37pに対しての反応性は、３型に対する反応性と比較
すれば格段に低く、Ｃ８はほぼＡｄ３型特異的な抗体で
あると考えられる。よって、Ｃ８を使用する濃度を調節
する事により、アデノウイルス３型の検出同定に用いる
事ができ、また、他のアデノウイルス全般に反応するモ
ノクローナル抗体と混合して用いる事により、アデノウ
イルスの検出感度を高めることが期待できる。これらの
ＯＤ値は、上記測定条件で測定したものであるが、本質
的には、抗原結合プレートに、５０μlの抗体溶液を反
応させ、ペルオキシターゼ標識抗マウスＩgＧとその基
質であるオルトフェニレンジアミンにより発色させるＥ
ＬＩＳＡ法により測定したものと言えるものである。
【００１２】方法2 蛍光抗体法 不活化していないアデノウイルスとの反応性を確認する
為に以下の実験を行った。Ｃ８をＰＢＳで希釈し、１１
種類のアデノウイルス血清型(1p、2p、3p、4p、5p、6
p、7p、8p、11p、19p、37p)の各抗原をそれぞれスライ
ドガラス上に塗沫し、３７℃６０分湿潤箱中でインキュ
ベートする。FITC標識抗マウスIgGを添加し３７℃６０
分インキュベーションし、洗浄後、蛍光顕微鏡にて検
鏡。蛍光が認められたものを陽性とする。抗体の希釈濃
度は、Ad3pで明らかに蛍光が認められる以下の濃度まで
各抗体をＰＢＳで希釈して１1種類のアデノウイルス血
清型と反応させた(Ｃ8; 8.9μg/ml)。その結果を表２に
示す。
為に以下の実験を行った。Ｃ８をＰＢＳで希釈し、１１
種類のアデノウイルス血清型(1p、2p、3p、4p、5p、6
p、7p、8p、11p、19p、37p)の各抗原をそれぞれスライ
ドガラス上に塗沫し、３７℃６０分湿潤箱中でインキュ
ベートする。FITC標識抗マウスIgGを添加し３７℃６０
分インキュベーションし、洗浄後、蛍光顕微鏡にて検
鏡。蛍光が認められたものを陽性とする。抗体の希釈濃
度は、Ad3pで明らかに蛍光が認められる以下の濃度まで
各抗体をＰＢＳで希釈して１1種類のアデノウイルス血
清型と反応させた(Ｃ8; 8.9μg/ml)。その結果を表２に
示す。
【００１３】
【表２】
【００１４】上記濃度のＣ8の抗体において、Ad1p、2
p、3p、4p、5p、6p、7p、8p、11p、19p、37pの１１種類
の抗原のうち、Ａｄ３ｐに関しては高い反応性が認めら
れ、Ａｄ１１ｐ、Ａｄ３７ｐに関しては非常に僅かに反
応し反応性ありかなしかの判別ができなかった。その他
の Ad1p、2p、4p、5p、6p、7p、8p、19pの８種類の血清
型に関しては全く反応性は認められなかった。よって、
モノクローナル抗体Ｃ８は、アデノウイルス３型に特異
的に反応し、Ａd１p、２p、４p、５p、６p、７p、８p、
１１p、１９p及び３７pとは反応しないか、僅かの反応
性しか有しないものである。
p、3p、4p、5p、6p、7p、8p、11p、19p、37pの１１種類
の抗原のうち、Ａｄ３ｐに関しては高い反応性が認めら
れ、Ａｄ１１ｐ、Ａｄ３７ｐに関しては非常に僅かに反
応し反応性ありかなしかの判別ができなかった。その他
の Ad1p、2p、4p、5p、6p、7p、8p、19pの８種類の血清
型に関しては全く反応性は認められなかった。よって、
モノクローナル抗体Ｃ８は、アデノウイルス３型に特異
的に反応し、Ａd１p、２p、４p、５p、６p、７p、８p、
１１p、１９p及び３７pとは反応しないか、僅かの反応
性しか有しないものである。
【００１５】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体は、アデノ
ウイルス３型に特異的に反応するモノクローナル抗体で
あり、市販アデノウイルスモノクローナル抗体MAB8052
と比較してアデノウイルスとの反応性は高く、一定の条
件のELISA法において、２.１ＯＤ 490nmより高い吸光度
を示すものである。また、本発明のモノクローナル抗体
は、モノクローナル抗体を用いた広範囲の血清型のアデ
ノウイルスの検出法(EIA法, RIA法, 蛍光抗体法、免疫ク
ロマト法、免疫電気泳動法、その他これらの変法、応用を
含む)のいずれにも使用でき、高い感度を得られるもの
である。
ウイルス３型に特異的に反応するモノクローナル抗体で
あり、市販アデノウイルスモノクローナル抗体MAB8052
と比較してアデノウイルスとの反応性は高く、一定の条
件のELISA法において、２.１ＯＤ 490nmより高い吸光度
を示すものである。また、本発明のモノクローナル抗体
は、モノクローナル抗体を用いた広範囲の血清型のアデ
ノウイルスの検出法(EIA法, RIA法, 蛍光抗体法、免疫ク
ロマト法、免疫電気泳動法、その他これらの変法、応用を
含む)のいずれにも使用でき、高い感度を得られるもの
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 伊藤 典彦 神奈川県横浜市南区永田山王台21−17 (72)発明者 大野 重昭 神奈川県横浜市金沢区富岡西141−10 (72)発明者 青木 功喜 北海道札幌市白石区本通五丁目北南４−３ Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 CE12 DA15 4B065 AA90X AA95Y AB04 BA08 BD15 CA25 CA46 4H045 AA11 AA30 DA76 EA53 FA72 GA15 GA26
Claims (4)
- 【請求項１】 アデノウイルス血清型１、２、４、５、
６、７、８、１１、１９及び３７型と実質的に反応せ
ず、アデノウイルス血清型３に特異的に高い反応性を示
すことを特徴とするモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 アデノウイルス３、４、８、１９及び３
７型混合物により免疫したマウスの脾細胞とマウスミエ
ローマ細胞とを融合することによって得られるハイブリ
ドーマにより産生されたものであることを特徴とする請
求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 アデノウイルス３型に対する反応性をEL
ISA法で測定したときの吸光度ＯＤ490nmが２.１以上で
あることを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項４】 請求項１記載のモノクローナル抗体を用
いることを特徴とするアデノウイルス検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11099560A JP2000290299A (ja) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | モノクローナル抗体及びこれを用いたアデノウイルス検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11099560A JP2000290299A (ja) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | モノクローナル抗体及びこれを用いたアデノウイルス検出法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000290299A true JP2000290299A (ja) | 2000-10-17 |
Family
ID=14250545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11099560A Pending JP2000290299A (ja) | 1999-04-07 | 1999-04-07 | モノクローナル抗体及びこれを用いたアデノウイルス検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000290299A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021210633A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| WO2021210631A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| WO2021210632A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| WO2021210630A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
-
1999
- 1999-04-07 JP JP11099560A patent/JP2000290299A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021210633A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| WO2021210631A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| WO2021210632A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| WO2021210630A1 (ja) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | デンカ株式会社 | アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 |
| KR20220167284A (ko) | 2020-04-16 | 2022-12-20 | 덴카 주식회사 | 아데노바이러스의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구 |
| KR20220167285A (ko) | 2020-04-16 | 2022-12-20 | 덴카 주식회사 | 아데노바이러스의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구 |
| KR20220167283A (ko) | 2020-04-16 | 2022-12-20 | 덴카 주식회사 | 아데노바이러스의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구 |
| KR20220167286A (ko) | 2020-04-16 | 2022-12-20 | 덴카 주식회사 | 아데노바이러스의 면역 측정 방법 및 면역 측정 기구 |
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