JPH0739440B2

JPH0739440B2 - モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH0739440B2
Application number: JP5116318A
Authority: JP
Inventors: レツケル，ルドルフ・ピー; ハリス，ジヨーン・エル; ウエラーソン，ラルフ，ジユニア; シヨー，サリイ・エム; カプラン，ポール・エム
Original assignee: イムノメデイクス・インコーポレーテツド
Priority date: 1983-11-07
Filing date: 1993-04-20
Publication date: 1995-05-01
Anticipated expiration: 2010-05-01
Also published as: IL73437A0; EP0161306A1; AU3615384A; JPH06105699A; IT8423468A1; EP0161306A4; NO852705L; CA1247539A; AU575362B2; DK309285A; IL73437A; WO1985002261A1; DK309285D0; JPS61500315A; US4595654A; IT1177121B; IT8423468A0; EP0161306B1; ATE66531T1; JPH0731195B2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野】本発明は、一般に循環する免疫複合体
（ｉｍｍｕｎｅｃｏｍｐｌｅｘ）を検出する方法およ
びこれらの方法において有用な試薬に関し、さらに詳し
くはＣ１を含有するヒト血清中のヒトＣ１ｑ含有複合体
を検出する方法、この方法を実施するための試験キッ
ト、Ｃ１の存在下にＣｌｑと選択的に反応するモノクロ
ーナル抗体を生産する雑種細胞系統、およびそのように
生産されたモノクローナル抗体に関する。

【０００２】

【発明の背景】免疫複合体は、病原体および他の異質物
質に対する正常の免疫防御機構の一部として抗原と抗体
との間の血液流中において形成される。これらの免疫複
合体は、異質抗体の排除または中和および宿主の保護を
許す。しかしながら、ある環境下で、これらの免疫複合
体はそれら自体宿主への障害を起こす。これらの循環す
る免疫複合体は多数の病気、ことに自己免疫病、例え
ば、リウマチ様関節炎、全身の紅斑性狼瘡（ｓｙｓｔｅ
ｍｉｃｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｈｏｓｉｓ）
（ＳＬＥ）など；癌、例えば、白血病および卵巣癌；お
よび多数の感染病に関連がある。とくに自己免疫病にお
いて、病気の診断およびその処置の監視において循環す
る免疫複合体を検出することが有用である。例えば、次
の文献を参照：Ａ．Ｎ．テオフィロポウロス（Ｔｈｅｏ
ｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ）およびＦ．Ｊ．ディキソン（Ｄ
ｉｘｏｎ）、アドバンシズ・イン・イムノロジー（Ａｄ
ｖａｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｖｏ
ｌ．２８、８９〜２２０ページ（１９７９）およびＳ．
Ｅ．リッツマン（Ｒｉｔｚｍａｎｎ）およびＪ．Ｃ．ダ
ニエルス（Ｄａｎｉｅｌｓ）、クリニカラ・ケミストリ
ー（ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｖｏ
ｌ．２８、１２５９〜１２７１ページ（１９８２）。循
環免疫複合体のレベルの検出および監視におけるこの関
心のため、多数の試験がこれらの複合体の検出のために
記載された。これらの先行技術は一般に次に基づいてい
る：ａ）これらの複合体中に含有されるエピトープの検
出、ｂ）これらの複合体とそれらへ結合できる放射線標
識試薬との反応性、またはｃ）組織または細胞の中に見
出される特別の受容体への免疫複合体の結合。これらの
試験を記載する広範な技術が存在する。

【０００３】しかしながら、これらの先駆技術の試験
は、検出すべき推定上の免疫複合体をヒト血清から単離
することを必要とした。なぜなら、血清中に試験におい
て交差反応し、こうして免疫複合体の検出を妨害する他
の物質が存在するからである。血清からの免疫複合体の
この単離は、一般に、沈殿（例えば、ポリエチレングリ
コールを使用する）により、あるいは固相カラムにより
達成された。

【０００４】試験の実施前に、循環免疫複合体を血清か
ら単離することの必要性は、困難であり、経費を要し、
そして時間を要する。血清の免疫複合体の検出を可能と
することにより、血清からの免疫複合体の単離の必要性
を排除する方法は非常に有利であろう。このような検出
は免疫複合体の検定を実施する時間をかなり節約し、単
離工程の間に導入される先行技術の試験における誤差
（例えば、免疫複合体の不完全な単離または回収）を排
除し、そして単離の間における免疫複合体の変性により
導入される誤差を排除するであろう。

【０００５】免疫複合体中に存在するほとんどの抗体は
その分子のＦｃ部分上に補体の成分と反応する部位を有
する。補体系は抗体を結合して有する物質が宿主の免疫
系により破壊される反応の複雑な系列の部分である。こ
れらの補体成分は頭文字Ｃで始まる文字および数の略号
により識別される。とくに興味ある１つは第１補体（Ｃ
ｌ）であり、これ自体はＣ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓと
表示されるサブユニットから構成されている。前述のＦ
ｃ部位と反応するのはＣｌのＣ１ｑサブユニットであ
る。

【０００６】免疫複合体を検出する先行技術の１つは、
結合したＣｌｑ（すなわち、免疫複合体中の抗体のＦｃ
部位へ取り付けられたＣｌｑ）に依存した。しかしなが
ら、血清の存在下においてこのような試験を達成するた
めの困難は、結合Ｃｌｑと反応した先行技術の物質がま
たＣｌ（Ｃｌｑを含有する）と反応するということであ
る。この血清Ｃｌは化合物へ結合したＣｌｑに比較して
大きく過剰であるので、従来血清中でＣｌｑの検出を実
施することは不可能であった。

【０００７】１９７５年におけるコーラー（Ｋｏｈｌｅ
ｒ）およびマイルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）の独
創的な研究以来、非常な努力がいわゆるモノクローナル
抗体を生産する種々のハイブリドーマの生産に向けられ
てきた。これらのモノクローナル抗体はきわめて有用な
物質である。なぜなら、実験動物の伝統的な免疫化およ
び採血から得られるいわゆるポリクローナル抗体と反対
に、それらは単一の特異性を有するからである。

【０００８】この分野における研究は、ハイブリドーマ
からモノクローナル抗体を生産するための試みの報酬お
よび複雑さを同時に示した。一般的技術は概念的によく
理解されているが、各特定の場合について多くの困難に
直面しかつ変動が要求される。事実、所定のハイブリド
ーマを調製しようと試みる前に、所望のハイブリドーマ
が得られること、それが得られた場合それが抗体を生産
すること、あるいはそのように生産された抗体が所望の
特異性をもつことについての保証が存在しない。成功の
度合は主として用いる抗原の型および所望のハイブリド
ーマを単離ために使用する技術の選択により影響を受け
る。

【０００９】最近、Ｍ．Ｄ．ゴラン（Ｇｏｌａｎ）およ
び共同研究者はコーラーおよびマイルシュタイの技術を
使用してＣｌｑに対する種々のモノクローナル抗体を生
産し、そしてこれらの抗体を使用してＣｌｑにおけるコ
ンフォメーションの変化を研究した。彼らはこの研究を
ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ
ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．１９２、４４５〜
４４７（１９８２年８月号）に報告した。これらの抗体
は、抗原として免疫複合体へ結合したＣ１ｑをマウスに
注入し、これらのマウスからの脾細胞をマウスの骨髄腫
細胞と融合し、生ずるハイブリドーマを培養し、そして
それらをウサギ抗ヒトＣ１ｑを介して固相へ取り付けた
ヒトＣ１ｑに対してスクリーニングすることによって生
産された。これらの抗体は種々の抗原と反応したが、そ
れらのすべては天然血清Ｃ１と反応した。抗体の多くは
また流体相のＣ１ｑと反応した。しかしながら、これら
の抗体は一般に免疫複合体へ結合したＣ１ｑとの反応性
に劣った。

【００１０】著者らは「これらの抗体は免疫複合体への
Ｃ１ｑの結合が新しい抗原決定因子を暴露することを証
明する」と結論した。Ｃ１ｑが免疫複合体へ結合したと
き、それらの抗体との反応性が損失されるので、彼らは
この結論に達成した。この参考書中に開示されている抗
体は、免疫複合体へ結合したＣ１ｑの検出による血清中
の免疫複合体ついての試験のために有用でないであろ
う。なぜなら、天然Ｃ１はいかなる結果をも不明瞭にす
ることが明らかであるからである。事実、この文献はモ
ノクローナル抗体の技術が一般に免疫複合体の特定の検
出に有用でないであろうことを示唆しているように思わ
れる。

【００１１】天然血清Ｃ１において表示されない免疫複
合体へ結合したＣ１ｑに特徴的な独特のエピトープに向
けられたモノクローナル抗体を使用して、血清中の免疫
複合体についての特定の試験を案出できることが今回発
見された。

【００１２】

【発明の要約】１つの面において、本発明は、ヒトＣ１
ｑと反応（結合）するが、ヒトＣ１と実質的に非反応
（非結合）性である新規な哺乳動物のモノクローナル抗
体を生産することができる新規なハイブリドーマ、およ
びそれにより生産されたモノクローナル抗体からなる。
主題のモノクローナル抗体はヒトＣ１ｑ含有複合体とヒ
トＣ１の存在下に選択的に反応し、こうしてヒトＣ１を
含有する人間の血清中のＣ１ｑを含有する免疫複合休
（ヒトＣ１ｑ含有複合体、または単に「Ｃ１ｑ含有複合
体」もしくは「Ｃ１ｑ複合体」ということもある）を検
出するために使用することができる。マウスのモノクロ
ーナル抗体を生産するマウスーマウスハイブリドーマが
好ましい。

【００１３】他の面において、本発明は流体中のヒトＣ
１ｑ含有複合体を検出または決定する方法および試験キ
ットからなる。この方法によると、天然の血清Ｃ１を含
有する人間の血清中の複合体を検出することができる。
この方法は、工程、ａ）固相へ取り付けられた選択的抗ヒトＣ１ｑモノクロ
ーナル抗体を準備し、ｂ）前記流体の試料を前記固相と接触させ、前記接触は
前記ヒトＣ１ｑ含有複合体と前記抗ヒトＣ１ｑモノクロ
ーナル抗体との間の反応を許す条件下に実施し、ｃ）未反応の流体試料の前記固相から分離し、ｄ）前記固相を標識第２抗体と接触させ、前記第２抗体
はＣ１ｑ複合体へ結合することができ、前記Ｃ１ｑ複合
体は前記固相へ結合することができ、前記接触は前記第
２抗体と前記結合複合体との間の免疫学的反応を許す条
件下に実施し、ｅ）未反応の第２抗体を前記固相から分離し、そしてｆ）前記固相または前記未反応の第２抗体のいずれかの
上の前記標識を検出または決定し、そして前記検出また
は決定を前記流体試料中のＣ１ｑ含有複合体の存在また
は量に関係づける、からなる。

【００１４】この流体は便利には人間の血清であるが、
この方法はまた他の流体中のヒトＣ１ｑ含有複合体を検
出または決定するために同様によく使用することができ
る。ヒトＣ１ｑ含有複合体を検出する本発明の試験キッ
トは、選択的抗ヒトＣ１ｑモノクローナル抗体を取り付
けて有する固相成分、およびヒトＣ１ｑ含有複合体が前
記固相上の前記抗体へ結合されたとき、前記Ｃ１ｑ含有
複合体へ結合することができるある量の標識第２抗体か
らなる。

【００１５】「ヒトＣ１と実質的に非反応性」および
「ヒトＣ１ｑと選択的に反応する」は、Ｃ１ｑ含有免疫
複合体を検出するモノクローナル抗体の能力が人間の血
清中のヒトＣ１または他の物質の存在により悪影響を受
けないことを意味する。

【００１６】発明の詳細な説明主題のハイブリドーマは次の工程により調製した：Ａ．ヒトＣ１ｑでマウスを免疫化する。Ｂａｌｂ／ｃ雌
マウスをここで使用したが、他のマウスの系統あるい
は、事実、ラットまたはウサギのような他の動物を使用
できることが考えられる。免疫化のスケジュールおよび
Ｃ１ｑ抗原の濃度は有用な量の適当にプライミングされ
た（ｐｒｉｍｅｄ）脾細胞を生産するようなものである
べきである。最初に５０μｇのＣ１ｑで皮下的に免疫化
し、次いで５回の注入の超免疫化は有効であることがわ
かった。ヒトＣ１ｑはここで免疫原として便利に使用さ
れたが、Ｃ１ｑ特異性抗原またはエピトープ（単離され
た抗原を包含する）を使用できることが考えられる。

【００１７】Ｂ．免疫化した動物から脾を取り出し、そ
して適当な媒質中の脾懸濁液をつくる。

【００１８】Ｃ．懸濁した脾細胞を適当な細胞系統から
の骨髄腫細胞と、適当な融合促進剤の使用により融合す
る。もちろん、選択する骨髄腫細胞は脾細胞と適合性で
あるべきであり、そして好ましくは同一の種であるべき
である。ネズミの細胞系統Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４［ネイ
チャー（Ｎａｔｕｒｅ）、Ｖｏｌ．２７６，２６９〜２
７０ページ、１９７８に記載されている］はここで使用
するマウスの脾細胞とともに使用するのに有効であるこ
とがわかったが、他の骨髄腫細胞を使用できることが考
えられる。多くの骨髄腫細胞系統（マウスおよび他の動
物）が知られており、そして、一般に、学会のメンバー
あるいは種々の保管所、例えば、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）、および
ソーク・インスチチュート・セル・ディストリビューシ
ョン・センター（ＳａｌｋＩｎｓｔｉｔｕｔｅＣｅ
ｌｌＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から入手可能で
ある。

【００１９】使用する骨髄腫細胞系統は好ましくはいわ
ゆる「薬物抵抗性」型であって、融合しない骨髄腫細胞
は選択した媒質中で生存せず、一方雑種（ｈｙｂｒｉ
ｄ）が生存するようなものであるべきである。このよう
な薬物抵抗性の骨髄腫の最も普通のクラスは８−アザグ
アニン抵抗性の細胞系統であり、これは酵素のハイポキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼの
欠け、それゆえＨＡＴ（ハイポキサンチン、アミノプテ
リン、およびチミジン）媒質中で生存することができな
い。また、使用する骨髄腫細胞系統はそれ自体抗体を生
産しないいわゆる「非分泌（ｎｏｎ−ｓｅｃｒｅｔｉｎ
ｇ）」型であることが好ましいが、分泌型を使用するこ
とができる。ここで使用する骨髄腫はこのような非分泌
型である。細胞の好ましい比は約５比細胞対骨髄腫細胞
である。主題のハイブリドーマの調製において使用する
融合促進剤は約１０００の分子量を有するポリエチレン
グリコール（ＰＥＧ１０００として商業的に入手可能で
ある）であったが、他のポリエチレングリコールおよび
この分野において既知の他の融合促進剤を有利に使用す
ることができる。

【００２０】Ｄ．融合しない骨髄腫細胞の生長を支持し
ない選択した媒質中で、融合しない脾細胞、融合しない
骨髄腫細胞および融合した細胞の混合物を希釈しかつす
べての融合しない細胞を死亡させるために十分な時間培
養する（約１週間）。この媒質は薬物抵抗性（例えば、
８−アザグアニジン抵抗性）の融合しない骨髄腫細胞を
支持しないもの（例えば、ＨＡＴ媒質）である。それゆ
え、これらの融合しない骨髄腫細胞は死ぬ。融合しない
脾細胞は悪性ではないので、有限の数の世代を有するだ
けでありそして（ある期間後）繁殖することができな
い。他方において、融合した細胞は、骨髄腫の親により
寄与される悪性の品質および脾細胞の親により寄与され
る選択媒質中に生存に必要な酵素を有するので、繁殖を
続ける。

【００２１】Ｅ．ハイブリドーマを含有する各容器［ウ
ェル（Ｗｅｌｌ）］内の上澄みをヒトＣ１ｑに対する抗
体の存在について（第１工程として）次いでヒトＣ１ｑ
複合体に対する抗体の存在について評価する。

【００２２】Ｆ．所望の抗体を生産するハイブリドーマ
を選択する。この選択は、例えば、希釈を制限すること
により実施することができ、ここで希釈剤の体積を統計
的に計算して各別々の容器［例えば、マイクロタイター
・プレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ）のウ
ェル］内のある数の細胞（例えば、１〜４）を単離す
る。このようにして、個々のハイブリドーマをさらにク
ローニングするために単離することができる。

【００２３】いったん所望のハイブリドーマが選択され
る（かつ必要に応じてクローニングされる）と、生ずる
抗体を２つの方法のうちの１つで生産することができ
る。

【００２４】最も純粋な抗体は、適当な媒質中で所望の
ハイブリドーマを適当な期間の間生体外で培養し、次い
で上澄み液から抗体を回収することにより生産される。
適当な培地および適当な培養時間は知られているか、あ
るいは容易に決定される。この生体外の技術は、他の特
異的抗ヒト免疫グロブリンを本質的に含まない、本質的
に単一特異的なモノクローナル抗体を生産する。培地は
異種間血清（例えば、ウシ胎児血清）を含有するので、
少量の他の免疫グロブリンが存在する。しかしながら、
この生体外方法により生産されるモノクローナル抗体の
濃度はわずかに約５０ミクログラム／ｍｌであるので、
この方法はある目的に対して十分な量または濃度の抗体
を生産しないことがある。

【００２５】非常に大きい濃度および量のモノクローナ
ル抗体を生産するために、所望のハイブリドーマをハイ
ブリドーマの調製に使用した動物と同一の種の宿主動
物、好ましくはシンジェニック（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）ま
たは準シンジェニック（ｓｅｍｉ−ｓｙｎｇｅｎｉｃ）
動物に注入することができる。マウスを本発明において
使用した。この注入は好ましくは宿主の腹膜中にする。
ハイブリドーマは適当な潜伏時間後に抗体生産性腫瘍を
形成させ、宿主の血液流および腹膜の滲出液（腹水）中
に非常に高い濃度の所望の抗体（約５〜２０ｍｇ／ｍ
ｌ）を生成する。これらの宿主はまたそれらの血液およ
び腹水中に正常の抗体を有するが、これらの正常の抗体
の濃度は所望のモノクローナル抗体の濃度のわずかに約
５％である。その上、これらの正常の抗体はそれらの特
異性において抗ヒトではないので、収穫した腹水からあ
るいは血清から得られたモノクローナル抗体は汚染性の
抗ヒト免疫グロブリンを本質的に含まない。このモノク
ローナル抗体は通常高い力価をもち（１：１００，００
０以上に高い希釈度において活性であり）かつ高い特異
性対非特異性の比（約１／２０）を有する。

【００２６】主題の方法の実施において、特異性抗Ｃ１
ｑＩｇＧを前述のように生産された腹水流体から、この
流体をタンパク質Ａを取り付けて有するクロマトグラフ
ィーのカラムに通すことによって単離する。タンパク質
Ａ［これはファーマシア・インコーポレーテッド（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｐｓｃａ
ｔａｗａｙ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）］は、ブドウ球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）のある種の表面上に
見出され、ＩｇＧ分子のＦｃ部分へ付着し、こうして汚
染物質からのＩｇＧの分離を可能とする。

【００２７】ＩｇＧ分画は固体表面、例えば、ポリスチ
レンのマイクロタイター・プレートの表面上へ吸着され
て、主題の方法において必要な固相を形成する。固体表
面上へ抗体を被覆する技術はこの分野においてよく知ら
れている。

【００２８】この抗体被覆されたマイクロタイター・プ
レートのウェルへ、試験すべき血清の試料、好ましくは
緩衝液中に希釈して、添加する。ウェルを好ましくはイ
ンキュベーションして完全な免疫学的反応を起こさせる
が、このようなインキュベーションは試験法の操作にと
って必須ではない。インキュベーションに引き続いて、
各ウェル中の流体を除去し、そしてウェルを洗浄して残
留する未反応の血清を除去する。

【００２９】ウェル上へ被覆されたＣｌｑ複合体の存在
について検出するために、酵素、例えば、セイヨウワサ
ビのペルオキシダーゼで標識付けした抗ヒトＩｇＧ免疫
グロブリン（便利にはウサギ免疫グロブリン）を使用す
ることが好ましい。抗ヒトＩｇＧは結合して免疫複合体
の検出にとくに有用である。なぜなら、それは複合体が
マイクロタイター・プレートのウェルへ取り付けられる
ものと異なる、免疫複合体上に見出される抗原性部位へ
付着するからである。酵素を抗体へ取り付ける方法はこ
の分野においてよく知られている。酵素は免疫複合体の
検出に好ましい標識であるが、他の標識、例えば、放射
性同位元素または蛍光色素を使用することができる。そ
の上、抗ヒト免疫グロブリンは好ましい検出体である
が、Ｃ１ｑ複合体へ結合する他の物質を使用することが
できる。検出体は、例えば、補体成分、例えば、Ｃ４
ｂ、Ｃ３ｂなど、あるいは免疫複合体中に見出される抗
原性物質、例えば、ＤＮＡ、肝炎Ｂ抗原などに対する抗
体であることができるであろう。

【００３０】被覆されたウェルへ酵素標識ウサギ抗ヒト
ＩｇＧを添加した後、マイクロタイター・プレートを好
ましくはインキュベーションして免疫学的反応を完結さ
せるが、このようなインキュベーションは必須ではな
い。インキュベーション後、未反応の第２抗体を除去
し、そしてウェルを洗浄して残留する第２抗体を除去す
る。結合した酵素の標識を次いで適当な基質の添加によ
り検出することができ、ここで基質はセイヨウワサビの
ペルオキシダーゼの場合においてｏ−フェニレンジアミ
ンである。標識付け第２抗体の存在、こうしてＣｌｑ複
合体の存在は基質における色の変化により指示される。
この試験は単に定性的（すなわち、着色または非着色）
であるか、あるいは定量的であることができる。なぜな
ら、各ウェルにおける色の発現は固相へ結合した標識付
け第２抗体の量に比例するからである。色濃度と血清中
のＣ１ｑ複合体濃度の間の関係は、この方法を変化する
濃度の既知の物質について実施することにより作られた
標準曲線から決定できる。第２抗体上の標識が酵素では
ないとき、適当な決定手段（例えば、放射性同位元素に
ついてシンチレーション・カウンターまたは蛍光色素に
ついて蛍光検出装置）を使用することができる。

【００３１】主題の試験キットは、選択的抗ヒトＣ１ｑ
抗体を取り付けて有する適当な固相表面（例えば、微小
力価のウェル、ビーズなど）と、ヒトＣ１ｑ含有複合体
が固相上の抗体へ結合されたとき、Ｃ１ｑ含有複合体へ
結合することができる標識付け第２抗体とからなる。こ
の試験キットは、また、第２抗体上の標識を検出する手
段（例えば、酵素の標識を使用した場合、酵素の基
質）、ならびに主題の方法を実施するために使用する他
の物質を含むことができる。

【００３２】上の方法は結合されたＣ１ｑ含有複合体の
測度として結合された標識第２抗体の検出を用いて説明
したが、結合しない第２抗体の量を第２抗体の量に関し
て決定すること、および結合したＣ１ｑ含有複合体の存
在を検出すること、あるいは結合したＣ１ｑ含有複合体
の量をその計算から決定することが等しく可能であるこ
とが理解されるであろう。

【００３３】次の実施例により本発明をさらに説明す
る。これらの実施例は本発明を例示するために提供さ
れ、本発明の範囲を限定するものではない。

【００３４】

【実施例】実施例Ｉ正常のヒトの血清からのＣ１ｑの調製Ａ．緩衝液（１リットルの各緩衝液を調製するための説
明書が含まれている）。１. ０．０３モルのエチレングリコール−ビス（β−
アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ′−四酢酸［ＥＧＴＡ
シグマ（Ｓｉｇｍａ）］ｐＨ７．５。導電性２．０×１
０^-3モ−（１．９５×１０^-3〜２．０５×１０^-3モ−の
範囲）、０℃において。

【００３５】８００ｍｌの水中に１１．４１ｇのＥＧＴ
Ａを溶解する。４．５ｍｌの５０％のＮａＯＨを添加し
てＥＧＴＡを溶解する。

【００３６】溶解したとき、＋４℃に冷却し、そして５
０％のＮａＯＨの滴下により最終のｐＨの調節を行い、
次いで十分な量の蒸留水を添加して１０００ｍｌにす
る。

【００３７】２. ０．０６９モルのエチレンジアミン
四酢酸（ＥＧＴＡ）、二ナトリウム塩（シグマ）ｐＨ
５．０。導電性３．９×１０^-3モ−（３．８５×１０^-3
〜３．９５×１０^-3モ−の範囲）、０℃において。

【００３８】８００ｍｌの水中に２３．２０ｇのＥＤＴ
Ａを溶解する。溶解したとき、＋５℃に冷却し、そして
５０％のＮａＯＨでｐＨを調節する。十分な量の蒸留水
を添加して１０００ｍｌにする。

【００３９】３. ０．０４モルのＥＤＴＡ、二ナトリ
ウム塩（シグマ）ｐＨ７．５。導電性３．７×１０^-3モ
−（３．６５×１０^-3〜３．７５×１０^-3モ−範囲）、
０℃において。

【００４０】８００ｍｌの水中に１３．４５ｇのＥＤＴ
Ａを溶解する。溶解したとき、＋５℃に冷却し、そして
５０％のＮａＯＨ（ほぼ２．５ｍｌ）でｐＨを調節す
る。十分な量の蒸留水を添加して１０００ｍｌにする。

【００４１】４. ０．２モルの酢酸ナトリウム緩衝液
ｐＨ５．０、０．７５モルのＮａＣｌおよび０．０１モ
ルのＥＤＴＡを含有する。

【００４２】２．７３ｇの酢酸ナトリウム；４３．８３
ｇのＮａＣｌおよび３．３ｇのＥＤＴＡを８００ｍｌに
蒸留水中に溶解する。ｐＨを１．０モルの酢酸で調節す
る。十分な量の蒸留水を添加して１０００ｍｌにする。

【００４３】５. ０．００５モルのリン酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ７．５、０．７５モルのＮａＣｌおよび０．
０１モルのＥＤＴＡを含有する。

【００４４】１．１３ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄；０．０２２０
ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂０；４３．３ｇのＮａＣｌおよ
び３．３６ｇのＥＤＴＡを８００ｍｌの蒸留水中に溶解
する。ｐＨを検査する。必要に応じて、１．０モルのＮ
ａＯＨまたは１．０モルのＨＣｌで調節する。十分な量
の蒸留水を添加して１０００ｍｌにする。

【００４５】６. リン酸ナトリウム０．２モルを取っ
て置く。

【００４６】ａ. ２７．６ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏを
蒸留水中に溶解し、そして十分な量の蒸留水を添加して
１０００ｍｌにする。

【００４７】ｂ. ２８．３９ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄を蒸留
水中に溶解し、そして十分な量の蒸留水を添加して１０
００ｍｌにする。

【００４８】７. ０．００５モルのリン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７．４、０．６５モルのＮａＣｌおよび０．０１モル
のＥＤＴＡを含有する。

【００４９】３７．９９ｇのＮａＣｌおよび０．３３６
ｇのＥＤＴＡをほぼ５００ｍｌの蒸留水中に溶解する。
２０．７５ｍｌの０．２モルのＮａ₂ＨＰＯ₄（上の試薬
６、ｂ）および４．２５ｍｌの０．２モルのＮａ₂ＨＰ
Ｏ₄（上の試薬６、ａ）を添加する。ｐＨを１モルのＮ
ａＯＨまたは１モルのＨＣｌで必要に応じて調節し、そ
して十分な量の蒸留水を添加して１０００ｍｌにする。
使用前に少なくとも３０分間減圧下に脱気する。

【００５０】８. ０．００５モルのリン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ７．４、０．６５モルのＮａＣｌ、０．０１モルのＥ
ＤＴＡおよび０．２％のナトリウムアジドを含有する。

【００５１】１０００ｍｌの緩衝液、上の＃７、中に２
ｇののナトリウムアジドを溶解する。

【００５２】Ｂ．正常のヒトの血清の収集および調製。

【００５３】ＡＢＯ型の供与者からの全血を抗凝固剤を
含まない管の中に抜き出す。個々の供与者からの血液は
分画化（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）の開始まで別々
に保持すべきである。血液は室温において６０分間、次
いで＋５℃において２時間凝固させる。血清を＋５℃に
おいてほぼ３０００×ｇにおける遠心により分離する。
血清を２０，０００×ｇにおいて６０分間再遠心し、そ
して遊離の脂質を吸引により除去する。血清を直ちに使
用しない場合、それを凍結して保存すべきである。

【００５４】Ｃ．血清の分画化１．すべての工程は５℃において実施する。種々の供与
者からの血清をプールし、そして合計の容積を記録す
る。次いで、それをスペクトレイパー（Ｓｐｅｃｔｒａ
ｐｏｒ）＃１透析管（２３ｍｍの均一な直径、６０００
〜８０００の分子量のカットオフ）に移し、そして緩衝
液＃１に対して４時間＋５℃において透析する。緩衝液
を新しい溶液で置換し、そして透析を１６時間上のよう
に続ける。これらの２つの工程のための緩衝液対血清の
比は次の通りである：工程１−８００ｍｌの緩衝液／１
００ｍｌの血清。工程２−２４００ｍｌの緩衝液／１０
０ｍｌの血清。透析後、不溶性物質（沈殿＃１）をほぼ
３００×ｇにおける遠心により除去する。上澄み液をデ
カンテーションし、そして廃棄する。沈殿を新しい透析
緩衝液（＃１）で沈殿を再懸濁させないように注意しな
がら洗浄する。洗浄は出発血清とほぼ同一体積で実施す
る。沈殿を上のように遠心により除去する。沈殿を緩衝
液＃４中に２５ｍｌの緩衝液／１００ｍｌの血清の比で
１５〜３０分間ゆっくり撹拌することにより再溶解す
る。物質を最後に遠心して不溶性凝集物を除去する。

【００５５】２．上の再溶解した沈殿＃１を透析管へ移
し、そして緩衝液＃２に対して４時間透析する。出発血
清の１００ｍｌ毎に、３２００ｍｌの透析緩衝液＃２を
必要とする。透析後、不溶性物質（沈殿＃２）をほぼ３
０００×ｇにおける遠心により除去する。上澄み液をデ
カンテーションし、そして廃棄する。沈殿を透析した沈
殿＃１の体積にほぼ等しい体積の新しい透析緩衝液で１
回洗浄する。沈殿を緩衝液＃５の中に２５ｍｌの緩衝液
／１００ｍｌの出発血清の比で１５〜３０分間おだやか
に撹拌することにより再溶解する。次いで、物質を遠心
して不溶性凝集物を除去する。

【００５６】３．再溶解した沈殿＃２を透析管へ移し、
そして緩衝液＃３に対して５時間透析する。出発血清の
１００ｍｌ毎に、３２００ｍｌの緩衝液＃３を必要とす
る。透析後、不溶性物質（沈殿＃３）をほぼ３０００×
ｇにおける遠心により除去する。上澄み液をデカンテー
ションし、そして廃棄する。沈殿を透析した沈殿＃２の
体積にほぼ等しい体積の新しい透析緩衝液で１回洗浄す
る。次いで、沈殿を緩衝液＃７の中に１．０ｍｌの緩衝
液／１００ｍｌの出発血清の比で１５〜３０分間おだや
かに撹拌することにより再溶解する。１個より多い遠心
カップを使用して沈殿を回転させる場合、再溶解用緩衝
液をこれらのカップに均一に分割し、そして沈殿が再溶
解した後にはじめてプールする。プールした物質を最後
に２０，０００×ｇで１５分間遠心して不溶性凝集物を
除去する。

【００５７】Ｄ．バイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）Ａ５
Ｍカラムの調製および展開１. ２．６×１００ｃｍのカラムの一端へ流れアダプ
ターを取り付ける。流出管を遮断する。溜をカラムの他
方の端へ取り付け、そしてほぼ２０ｍｌの脱気した緩衝
液＃７を添加する。

【００５８】２. ６００ｍｌのバイオ−ゲルＡ５Ｍ、
２００〜４００メッシュの媒質を少なくとも３０分間脱
気し、そして撹拌したスラリーをカラムの中になめらか
に注ぐ。

【００５９】３. ２〜５ｃｍの床が形成したとき、カ
ラムを流れさせる。乾燥させてはならない。

【００６０】４. カラムが充填されたとき、過剰のゲ
ルを除去して所望の床の高さ（１００ｃｍ）にし、溜を
除去し、そして開いた端に流れアダプターを取り付け
る。

【００６１】５. カラムを一夜２０ｍｌ／時および５
℃においてポンプの使用により詰める。

【００６２】６. 流速を５．５ｍｌ／時に変え、そし
て２８０ｎｍにセットしたＵＶ検出器および記録器およ
び分画コレクターに取り付ける。

【００６３】７. 基線をゼロに調節する。２．０ｍｌ
の試料を収集するように分画コレクターをセットする。

【００６４】８. Ｃ１ｑ溶液をカラムの中に送り、そ
して次いで７００ｍｌの脱気した緩衝液＃７を送る。

【００６５】９. カラムを最後に２００ｍｌの脱気し
たナトリウムアジド含有緩衝液（緩衝液＃８）で処理す
る。

【００６６】１０. Ｃ１ｑピークは、常にクロマトグ
ラム上で最長であり、通常約３００ｍｌのマーク（管＃
１５０）に出現し始める。

【００６７】ピークの試料を次のプロトコール（ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ）に従いプールする：光学濃度曲線の上昇側
および下降側の両者上のほぼ中点から基線へ接線を引
く。２つの基線の交点の間の距離を測定する。この直線
の長さを両側において１０％だけ減少させる。この直線
より上に落下する管をプールする。この手順の例は図１
に示されている。

【００６８】Ｅ．タンパク質Ａセファロース（Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ）ＣＬ４Ｂカラムの調製および展開１．バイオ−ラド０．７×１０ｃｍのカラムへ、０．７
ｇの調製ＡセファロースＣＬ４Ｂを添加する。５．０
ｍｌの緩衝液＃７を添加し、そして５〜１０分間水和お
よび膨潤させる。

【００６９】２．カラムをほぼ２５ｍｌの緩衝液＃７で
重力流れにより洗浄する。

【００７０】３．カラムをしっかり締め、そしてカラム
の床の上部から緩衝液を除去する。４．ポンプ管にＣ１ｑ調製物を充填し、そしてポンプを
タンパク質Ａカラムの上部へ取り付ける。Ｃ１ｑ調製物
をカラムを通して２０ｍｌ／時で送る。単一の管の中に
集める。Ｃ１ｑ溶液のすべてがカラムを通過した後、カ
ラムを通して空気を送ってカラムの中の液体の完全な移
送を確実にする。

【００７１】５．カラムを２５ｍｌの０．１モルのクエ
ン酸塩緩衝液ｐＨ４．５で重力流れにより再生する。

【００７２】クエン酸塩緩衝液の調製ａ. ０．１モルのクエン酸（Ｈ₃Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇・Ｈ₂Ｏ）。

【００７３】２．１ｇを蒸留水中に溶解し、そして十分
な量の蒸留水を添加して１００ｍｌにする。

【００７４】ｂ. ０．１モルのクエン酸ナトリウム
（Ｎａ₃Ｃ₆Ｈ₅Ｏ₇・Ｈ₂Ｏ）。

【００７５】２．９４ｇを蒸留水中に溶解し、そして十
分な量の蒸留水を添加して１００ｍｌにする。５４．５
ｍｌのａを４５．５ｍｌのｂと混合する。ｐＨ＝４．５
±０．１。

【００７６】６. カラムを２５ｍｌのリン酸塩緩衝液
＃８で平衡化し、そして同一緩衝液中にカラムを貯蔵す
る。

【００７７】Ｆ．Ｃ１ｑ濃度の決定１. Ｃｌｑ濃度は次のように決定する：ＯＤ２８０ｎ
ｍの読みをブランクとして緩衝液＃７の使用により行
う。次式を使用する：

【００７８】

【数１】Ｅ^1cmのＣｌｑについての吸光値（extinction
value）＝６．８ｍｇＣ１ｑ／ｍｌ＝（ＯＤ２８０×１
０）／６．８２. Ｃ１ｑピークをアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ｘＭ
５０膜上でほぼ１．０ｍｇＣｌｑ／ｍｌに濃縮する。

【００７９】この式を使用する：

【００８０】

【数２】濃縮後のＣｌｑ体積＝Ｃ１ｑ濃度ｍｇ／ｍｌ×
濃縮前のＣ１ｑの体積注：室から濃縮物を取り出す前に、ガス圧を開放し、そ
して少なくとも撹拌を続けてフィルターのディスクへ吸
着したＣｌｑを取り戻す。

【００８１】３. Ｃ１ｑの最終濃度をＯＤ２８０ｎｍ
によりＦ、１から式を使用して決定する。

【００８２】Ｇ．最終生成物の純度純度はＳＤＳの存在下のポリアクリルアミドのゲルの電
気泳動により決定する。この手順は次の通りである：１．試薬ａ．次の試薬はバイオ−ラド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により
供給される：ＤＤＴ（ジチオスレイトール）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）過硫酸アンモニウムピロニン（Ｐｙｒｏｎｉｎ）ＹＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルエチレ
ンジアミン）ｂ．クーマッシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａ
ｓｓｉｅＢｒｉｌｌｉａｎｔＢｌｕｅ）−２５０
（イーストマン・コッダク）ｃ．タンク（Ｔａｎｋ）緩衝液０．０４モルのトリス
（Ｔｒｉｓ）；０．０２モルの酢酸ナトリウム；０．０
０２モルのＥＤＴＡｐＨ７．４、０．１％のＳＤＳを
含有する。

【００８３】４．８５ｇのトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン２．７２ｇの酢酸ナトリウム（ＮａＣ₂Ｈ₃Ｏ₂・Ｈ₂Ｏ）０．６７ｇのＥＤＴＡ１．０ｇのＳＤＳほぼ８００ｍｌの蒸留水中に溶解する。ｐＨを７．４に
１０％の氷酢酸で調節する。十分な量の蒸留水を添加し
て１００ｍｌにする。

【００８４】ｄ．透析緩衝液：０．０１モルのトリスＨ
Ｃｌ、０．００１モルのＥＤＴＡｐＨ８．０、０．５％
のＳＤＳを菌株する。

【００８５】１．２１１ｇのトリス０．０３３６ｇのＥＤＴＡ１．０ｇのＳＤＳほぼ８００ｍｌの蒸留水中に溶解する。ｐＨを８．０に
０．１ＮのＨＣｌで調節する。十分な量の蒸留水を添加
して１００ｍｌにする。

【００８６】ｅ．アクリルアミド−ビス試薬５．５ｇのアクリルアミドおよび０．１５ｇのビス−ア
クリルアミドを蒸留水中に溶解し、そして０．１５ｇの
ビス−アクリルアミドを蒸留水中に溶解し、そして十分
な量の蒸留水を添加して２５ｍｌにする。

【００８７】ｆ．過硫酸アンモニウム０．１ｇ／１０ｍ
ｌ蒸留水。（毎日、新しく調製する）。

【００８８】試料のインキュベーション溶液０．３０３ｇのトリス０．０８４ｇのＥＤＴＡほぼ１０ｍｌの蒸留水中に溶解する。ｐＨを８．０に
０．１ＮのＨＣｌで調節する。この溶液に、次のものを
溶解する：ｍｌにする。

【００８９】２．５ｇのＳＤＳ１．５４ｇのＤＴＴ２５ｍｌとするのに十分な量の蒸留水。

【００９０】ｈ．０．０１％のピロニンＹ。０．０１ｇ
のピロニンＹを１００ｍｌの蒸留水中に溶解する。

【００９１】ｉ．３０％のスクロース。３ｇのスクロー
スを蒸留水中に溶解し、そして十分な量の蒸留水を添加
して１０ｍｌにする。

【００９２】ｊ．２５％のイソプロピルアルコール１０
％の酢酸０．０２５％のクーマッシー・ブルーＧ−２５
０。

【００９３】ほぼ５００ｍｌの蒸留水に、２５０ｍｌの
イソプロピルアルコールおよび１００ｍｌの氷酢酸を添
加する。０．２５ｇのクーマッシー・ブルーＧ−２５０
を溶解し、そして十分な量の蒸留水を添加して１０００
ｍｌにする。

【００９４】ｋ．１０％のイソプロピルアルコール１０
％の酢酸０．００２５％のクーマッシー・ブルーＧ−２
５０。

【００９５】ほぼ５００ｍｌの蒸留水に、１００ｍｌの
イソプロピルアルコールおよび１００ｍｌの氷酢酸を添
加する。０．０２５ｇのクーマッシー・ブルーＧ−２５
０を溶解し、そして十分な量の蒸留水を添加して１００
０ｍｌにする。

【００９６】ｌ．１０％の酢酸、０．００１２５％のク
ーマッシー・ブルーＧ−２５０。

【００９７】ほぼ５００ｍｌの蒸留水に、１００ｍｌの
氷酢酸を添加する。０．０１２５ｇのクーマッシー・ブ
ルーＧ−２５０を溶解し、そして十分な量の蒸留水を添
加して１０００ｍｌにする。

【００９８】ｍ．１０％の酢酸ほぼ５００ｍｌの蒸留水に、１００ｍｌの氷酢酸を添加
する。十分な量の蒸留水を添加して１０００ｍｌにす
る。

【００９９】２．手順ａ．１０％のアクリルアミドゲルの調製次の成分を一緒に混合する：７．５ｍｌのタンク緩衝液（１、ｃ）６．７５ｍｌのアクリルアミド−ビス溶液（１、ｅ）０．０２２５ｍｌのＴＥＭＥＤほぼ１５分間脱気し、そして０．７ｍｌの過硫酸アンモ
ニウム溶液（１、ｆ）。

【０１００】ｂ．５×７５ｍｍのガラス管の一端をパラ
フィンフィルムで覆い、そしてアメス・ゲル調製ラック
（ＡｍｅｓＧｅｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＲａｃ
ｋ）中にセットする。０．４ｍｌの３０％スクロース
（１、ｉ）を管の底部へ添加し、管の側面へ接触しない
ように注意する。長さ２．５ｃｍのプラスチック管を管
の開口端の上に配置し、そしてスクロースを上に横た
え、そして管をアクリルアミド溶液（２、ａ）で充填す
る。少なくとも６０分間重合させる。スクロースをタン
ク緩衝液で数回洗浄する。ゲルは直ちに使用することが
でき、あるいは４８時間まで貯蔵することができる。ゲ
ルを貯蔵する場合、洗浄した区域をタンク緩衝液で充填
し、そしてゲルを湿潤した覆われた室内に＋５℃で配置
する。

【０１０１】ｃ．試料の調製Ｃ１ｑの調製物の半分をほぼ５００ｍｌの透析緩衝液
（１、ｄ）に対して室温において一夜透析する。

【０１０２】この透析した物質に、０．０５２５ｍｌの
試料のインキュベーション溶液（１、ｇ）プラス０．０
５５ｇのスクロースを添加する。この溶液を１００℃に
おいて沸騰水中で、次のように試験する：２５μｌの処
理した試料に、１００ｍｌのピロニンＹ溶液（１、ｈ）
を添加し、そしてゲル上に配置する。注意して試料を上
に横たえ、そして管にタンク緩衝液を充填する。前に試
験したＣ１ｑ試料は対照として展開（ｒｕｎ）すべきで
ある。

【０１０３】ｄ．電気泳動試料をカナルコ・ディスク（ＣａｎａｌｃｏＤｉｓ
ｃ）電気泳動セルまたは同等物中で電気泳動させる。下
の室にほぼ４００ｍｌのタンク緩衝液を充填する。試料
を上の室内に入れ、次いでこれにタンク緩衝液を充填す
る。次いで、試料を１ｍａ／ゲルで１５分間および３ｍ
ａ／ゲルで色素のバンドが管の底部に到達するまで電気
泳動させる。

【０１０４】着色ゲルをバイオ・ラド（ＢＩＯＲＡＤ）のゲル電気泳動
拡散デステイナー（ｄｅｓｔａｉｎｅｒ）内で着色させ
る。あるいは、ゲルは少なくとも５０ｍｌの着色溶液／
ゲルを使用して管内で別々に着色することができる。管
を揺動装置上に配置することにより、溶液を撹拌して保
持する。

【０１０５】第１の着色溶液（１、ｊ）をデステイナー
（ほぼ４リットルを保持する）の中に注入する。木炭の
カートリッジを取り出し、そしてデステイナーを磁気撹
拌機上に配置する。試料を一夜着色する。第２着色溶液
（１、ｋ）を第１溶液と交換し、そして着色を上のよう
に６〜９時間実施する。第３着色溶液（１、ｌ）を第２
溶液と交換し、そして着色を一夜実施する。脱着色（ｄ
ｅｓｔａｉｎｉｎｇ）溶液（１、ｍ）を第３溶液と交換
し、木炭カートリッジを戻し、そしてゲルをバックグラ
ウンドが透明となるまで脱着色する。

【０１０６】ｆ．ゲルの解釈この手順はＣ１ｑを分子量２２，０００、２７，０００
および２９，０００の３つの成分に破壊する。これらの
３つの成分はゲル上の最も早い移動バンドを表わす。す
べての他のバンドは汚染物質である。

【０１０７】ゲルを光電濃度計で読む。存在するすべて
のバンドの合計で割ったＣｌｑバンドの合計は、Ｃ１ｑ
調製物の純度に等しい。３つのゲルの平均値を最終結果
として取る。

【０１０８】実施例ＩＩモノクローナル抗体の生産Ａ．免疫化および細胞の交雑雌のＢａｌｂ／ｃマウス［ジャクソン・ラボラトリーズ
（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；生後
６〜８週］を、５０ミクログラムの実施例１におけるよ
うに調製したＣ１ｑ抗原で皮下的に免疫化した。レトロ
オービタル採血データ（ｒｅｔｏｏｒｂｉｔａｌｂｌ
ｅｅｄｄａｔａ）に基づき、３匹のマウスのうち１匹
を注射の超免疫化系列のために選択し、この系列は１ミ
クログラムのＣ１ｑ抗原の１回の最初の腹腔内注射、引
き続く２００ミクログラムのＣ１ｑ抗原の４回の毎日の
連続的腹腔内注射プラス８０ミクログラムのＣ１ｑ抗原
（この４日間の期間の第２日および第３日における注射
ＩＶ）から成っていた。最後の免疫化に引き続いて、マ
ウスを殺し、脾臓マウスから切除し、そして脾組織をス
テンレス鋼の篩に通過させることにより単一の細胞懸濁
液をつくった。

【０１０９】コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびマイルス
テイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）により開発された手順に従
い、細胞融合を実施した。１０ｍｌのダルベッコ（Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ）の変性イーグル培地（１−グルタミンお
よびグルコースで強化された）［ＤＭＥ、ギブコ（Ｇｉ
ｂｃｏ）、ニューヨーク、グランドアイランド］中のほ
ぼ１．３×１０⁸の脾細胞を、４．７ｍｌのＤＭＥ中の
ほぼ２．６×１０⁷のＳＰ２／０−Ａｇｌ４骨髄腫細胞
と混合した。合わせた細胞を遠心にかけ、そして上澄み
液を除去し、次いで１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（ギブ
コ）中の３５％のＰＥＧ１０００および５％のＤＭＳ
Ｏを混合しながら添加した。この添加に引き続いて、２
回の連続の量のＤＭＥ（１ｍｌおよび２ｍｌ）を混合し
ながら添加し、次いで４ｍｌおよび８ｍｌの量のＨＴ培
地を添加した（このＨＴ培地は５００ｍｌのＤＭＥ中の
６８ｍｇのハイポキサンチンおよび３６５ｍｇのチミジ
ンから構成されていた）。これらの連続の添加および混
合の工程の後、全体を遠心にかけ、上澄み液を除去し、
そして得られる細胞の沈殿物を４０ｍｌのＨＴ培地中に
再懸濁し、そして一夜インキュベーションした。

【０１１０】Ｂ．ハイブリドーマの選択および生長細胞融合後、細胞をＨＴ培地で３７℃および６％のＣＯ
₂において１００％の湿度の雰囲気中で培養した。次の
日、懸濁した細胞を４００ｍｌにＨＴ培地で希釈し、そ
して１ｍｌのこの溶液を１系列のマイクロタイター・プ
レートの各ウェル中に入れた。プレートを３７℃および
６％のＣＯ₂および１００％の湿度において約２週間さ
らにインキュベーションした。

【０１１１】ハイブリドーマを含有する培養物より上の
上澄み液を予備的スクリーニングにかけて、ハイブリド
ーマの生産においてマウスを最初に免疫化するために使
用したヒトＣ１ｑ抗原に対するそれらの反応性を決定し
た。ヒトＣ１ｑをマイクロタイター・プレートのウェル
の表面上へ被覆し、次いで上澄み液の試料を添加するこ
とにより、エリサ（ＥＬＩＳＡ）検定を実施した。未反
応の上澄み液の除去後、セイヨウワサビのペルオキシダ
ーゼ酵素で標識付けしたウサギの抗マウスＩｇＧ［マイ
ルス−エーダ（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ）］を使用して、
抗Ｃ１ｑ抗体の存在を検出した。ヒトＣ１ｑと反応した
抗体産生ハイブリドーマを継代培養し、そしてさらにス
クリーニングするためクローニングした。

【０１１２】さらにスクリーニングすべき特定のハイブ
リドーマをマウスに注入して腹水を生産し、そして得ら
れる腹水をプロテインＡ（タンパク質Ａという場合もあ
る）カラムを通して流すことによってＩｇＧ分画を単離
した。このＩｇＧ分画を炭酸塩緩衝液（１．５９ｇのＮ
ａ_２ＣＯ_３、２．９３ｇのＮａＨＣＯ_３および０．２ｇ
のＮａＮ_３、十分な量の水を添加して１０００ｍｌにす
る）中に５０ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。０．２ｍｌ
のアリコートをダイナテッチ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）基板
の各ウェルへ添加し、その後板をパラフィルム（ｐｒａ
ｆｉｌｍ）で緊密に覆い、そして２〜８℃において１６
〜２２時間インキュベーションした。このインキユベー
ションに引き続いて、各ウェル中の流体を除去し、そし
てウェルをＰＢＳ−ツィーン（８．０ｇのＮａＣｌ、
０．２ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、２．９ｇのＮａ_２ＨＰＯ_４・
１２Ｈ_２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌおよび０．５ｍｌのツィ
ーン２０、水で希釈して１０００ｍｌにする）で３回洗
浄した。

【０１１３】免疫複合体を含有することが知られている
ヒト血清を使用することにより、抗体を評価した。この
血清を４体積のＰＢＳツィーンを１体積の血清へ添加す
ることにより１：５に希釈した。この希釈した血清の
０．２ｍｌのアリコートを試験抗体を含有する各ウェル
へ添加し、次いでトレーをパラフィルムで緊密に覆い、
そして３７℃において６０分間インキュベーションし
た。インキュベーション後、各ウェル中の流体を除去
し、そしてウェルをＰＢＳツィーンで３回洗浄した。ウ
サギ抗マウスＩｇＧ／セイヨウワサビのペルオキシダー
ゼ接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）［マイルス−エーダ
（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ）］で１：１０，０００に希釈
し、そしてこの希釈した接合体の０．２ｍｌのアリコー
トを各被覆ウェルへ添加した。１５〜２５℃において暗
所でさらに６０分間インキュベーションした後、各ウェ
ル中の流体を除去し、そして各ウェルをＰＢＳツィーン
で３回洗浄した。最後に、各ウェル中の酵素標識抗体の
存在および量を過酸化物基質の添加および生成した色の
濃度の決定により検出した。

【０１１４】初期のスクリーニングにおいて陽性であっ
たほぼ３５のハイブリドーマのうち、５つは許容されう
る程度に陽性であり、そしてＣ１ｑ含有複合体に対して
選択的であった。すなわち、これらの５つのハイブリド
ーマの産生するモノクローナル抗体は血清中のＣ１ｑ含
有複合体に結合するが、Ｃ１には結合しなかった。これ
らのうちの２つ（４Ａ４Ｂ１１および１２Ａ５Ｂ７と表
示する）が最良であり、そして試験キットの製造におい
て使用するために選択した。

【０１１５】実施例ＩＩＩ試験キットの製造ハイブリドーマ１２Ａ５Ｂ７および４Ａ４Ｂ１１からの
腹水を、前述のようにタンパク質Ａで精製した。得られ
るタンパク質の分画を前述の炭酸塩緩衝液中で５０ミク
ログラム／ｍｌの濃度に希釈し、そして０．２ｍｌのア
リコートをダイナテッチ基質板の各ウェルへ添加した。
この添加後、板をパラフィルムで緊密に覆い、そして２
〜８℃において１６〜２２時間インキュベーションし
た。インキュベーション後、各ウェル中の流体を除去
し、そして前述のＰＢＳツィーンで３回洗浄した。特定
の抗Ｃ１ｑモノクローナル抗体で被覆されたこれらのト
レーのウェルは、主題の試験キットにおいて使用すべき
固相を形成する。

【０１１６】試験キットの他の成分は抗ヒトＩｇＧ／酵
素接合体、ＰＢＳツィーン溶液、酵素の基質、および対
照である。これらのそしての物質は一般に便利さおよび
標準化のためにキット内に含まれるであろう。主題の試
験キットにおいて使用される対照物質はヒト血清であ
り、これには異なる量の凍結乾燥された熱凝集ＩｇＧが
添加されている。

【０１１７】キットの構成成分本発明の好ましい実施態様における典型的なキットの構
成成分は、次の通りである：ヒトＣ１ｑに対するモノク
ローナル抗体（ネズミ）で被覆された６微量滴定板（ｍ
ｉｃｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎｐｌａｔｅ）（９６ウェ
ル／板）；０．０２％のチメロサールを含有する。

【０１１８】血漿の形態の６パケットのリン酸塩緩衝液
溶液（ｓａｌｉｎｅ）；各パケットは８ｇのＮａＣｌ、
０．２ｇのＫＨ₂ＰＯ₄、１．１６ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、
０．２ｇのＫＣｌおよび０．２ｇのチメロサールを含有
する。

【０１１９】１バイアルのポリソーベート（Ｐｏｌｙｓ
ｏｒｂａｔｅ）−ポリエキシエチレンソルビタンモノラ
ウレート、シグマ（Ｓｉｇｍａ）。

【０１２０】１バイアルの接合体濃厚物−セイヨウワサ
ビのペルオキシダーゼへ接合したモノクローナル抗体ヒ
トＩｇＧ（ネズミ）；０．０２％のチメロサールおよび
０．０００５％のゲンタマイシンサルフェートを含有す
る。接合はナカネ（Ｎａｋａｎｅ）ら、ジャーナル・オ
ブ・ヒストケム・アンド・サイトロジー（Ｊ．Ｈｉｓｔ
ｏｃｈｅｍａｎｄＣｙｔｏｌ．）、２２、１０８４
〜１９７４の方法により実施する。ヒトＩｇＧに対する
腹水の典型的な力価は８×１０⁵である。得られる物質
をウシ胎児血清で希釈して、次の性質を有する物質を生
成する：Ａ４９２、１５０ｍｇ／ｍｌＨＡＧ＜１．
５；ｒ²＞０．９５；傾斜＞０．５；１およびｙ−交点
＜０．０４。典型的な希釈は１：１００であって接合体
濃厚物を生成する。

【０１２１】２バイアルのｏ−フェニレンジアミン・２
ＨＣｌのタブレット；各タブレットは、基質溶液の１０
０ｍｌが２６．５ｍｇのクエン酸、７３．０ｍｇのＮａ
₂ＨＰＯ₄および３５．０ｍｇのＯＰＤを含有するよう
に、十分なＯＰＤおよび緩衝液を含有する。

【０１２２】１バイアルの３％の過酸化水素；Ｎ−フェ
ニルアセタミドを含有する。

【０１２３】２バイアルのハイ・ノーマル（Ｈｉｇｈ
Ｎｏｒｍａｌ）対照（凍結乾燥した熱凝集ＩｇＧを添加
したヒト血清）。

【０１２４】２バイアルのロウ・アブノーマル（Ｌｏｗ
Ａｂｎｏｒｍａｌ）対照（凍結乾燥した熱凝集ＩｇＧ
を添加したヒト血清）。

【０１２５】２バイアルのハイ・アブノーマル（Ｈｉｇ
ｈＡｂｎｏｒｍａｌ）対照（凍結乾燥した熱凝集Ｉｇ
Ｇを添加したヒト血清）。

【０１２６】実施例ＩＶ試験手順の要約Ａ．標本の収集標本の収集前に特別の固体の調製は不必要である。全血
の試験標本は、受入れられた医学的技術により集めるべ
きである。標本を室温（２０〜３０℃）において少なく
とも２時間凝固させた後、血清を取り出さなくてはなら
ない。

【０１２７】Ｂ．試薬の調製１．ＰＢＳ−ポリソーベートの調製：１リットルのガラ
ス蒸留したまたは脱イオンした水の中に１パケットのＰ
ＢＳの内容物を完全に溶解させる。０．５ｍｌのポリソ
ーベート２０を添加しかつ混合する。ＰＢＳ−ポリソー
ベートは、室温で貯蔵するとき、１月間安定である。

【０１２８】２．接合体の調製：使捨て可能なガラス
またはプラスチックの製品を使用しなくてはならない。
接合体濃厚物は使用前ＰＢＳ−ポリソーベートで希釈し
なくてはならない。１：５０の典型的な希釈比につい
て、０．４ｍｌの接合体濃厚物を１９．６ｍｌのＰＢＳ
−ポリソーベートに添加する。２０ｍｌの体積を１微量
滴定板のために必要とする。接合体は使用直前に調製
し、かつ３０分以内に使用すべきである。

【０１２９】３．基質の調製：使捨て可能なガラスまた
はプラスチックの製品を使用しなくてはならない。

【０１３０】ａ．２４ｍｌのガラス蒸留または脱イオン
した水の中に８つのＯＰＤタブレットを完全に溶解させ
る。ほぼ１０分間タブレットを溶解させる。アリコート
のミキサーをタブレットの容易な溶解に使用することが
できる。

【０１３１】ｂ．使用直前に、１００μｌの過酸化水素
を添加しかつ混合する。この体積は１微量滴定板のため
に十分である。基質は室温において暗所で３０分間安定
である。基質は透明ないし非常に淡い黄色であるべきで
ある。認められうるほどに黄色であるとき、それを廃棄
し、そして必要に応じてさらに基質を調製する。

【０１３２】４．４Ｎの硫酸の調製：８ｍｌのガラス蒸
留または脱イオンした水に１ｍｌの濃（３６Ｎ）硫酸を
添加する。常に酸を水に添加する。決して逆の手順に用
いてはならない。この体積は１微量滴定板のために十分
である。

【０１３３】５．凍結乾燥した対照の再構成：１バイア
ルの各対照（ハイ・ノーマル対照、ロウ・アブノーマル
対照およびハイ・アブノーマル対照）を、０．５ｍｌの
ガラス蒸留または脱イオンした水の添加により再構成す
る。このバイアルに水を添加し、そしておだやかに粉末
を再懸濁させる。使用前、再水和された対照を室温（２
０〜３０℃）において１５分間静置させる。渦形成また
は激しい混合をしてはならない。激しい混合は血清Ｉｇ
Ｇを変性させ、そして異常に高い値を生ずるであろう。
再構成された対照を１研究日のために使用することがで
きる。各々の再構成された対照のバイアルは同一の研究
日において使用する場合、５微量滴定板の各々ついてウ
ェルを二重複製するために十分である。

【０１３４】Ｃ．試験手順１．ＰＢＳ−ポリソーベートを調製する。試薬の節を参
照。

【０１３５】２．使捨てガラス管を使用し、ＰＢＳ−ポ
リソーベート中の３再構成対照および血清標本の１：５
希釈物を調製する。倒立によりおだやかに混合する。渦
を形成してはならない。例：０．１２５ｍｌの対照また
は血清標本プラス０．５ｍｌのＰＢＳ−ポリソーベート
（反復試験のために十分な体積）。

【０１３６】３．ヒトＣ１ｑに対するモノクローナル抗
体（ネズミ）で被覆された微量滴定板から、使用直前
に、保護カバーのテープを除去する。

【０１３７】４．微量滴定板のウェルを激しい振盪によ
り内容物を出して空にする。

【０１３８】５．微量滴定板［ブランキング（ｂｌａｎ
ｋｉｎｇ）ウェルを含む］をＰＢＳ−ポリソーベートで
３回洗浄する。洗浄後、板を水取紙の上で軽くとんと叩
いて過剰のＰＢＳ−ポリソーベートを除去する。洗浄後
直ちに微量滴定板を使用する。微量滴定板の対照および
試験のウェルを乾燥させてはならない。

【０１３９】６．微量滴定板を板案内の上部に配置す
る。左のウェルの第１垂直列を、微量滴定板のリーダー
（ｒｅａｄｅｒ）をブランキングするために保存してお
く。リーダーのブランキングのために製造者の説明を参
照する。試験手順の基質を添加まで、この列のウェルへ
ＰＢＳ−ポリソーベート洗浄溶液以外を添加してはなら
ない。

【０１４０】７．微量滴定板をハイ・ノーマル、ロウ・
アブノーマル、ハイ・アブノーマルおよび試薬の対照に
ついて、二重に、標識を付け、次いで血清標本に標識を
付ける。

【０１４１】注：工程８〜１０における対照および血清
標本は、微量滴定板へ１０分以内に添加すべきである。
ピペットの先端は、各々の異る対照および試験標本につ
いて交換すべきである。

【０１４２】８．２００μｌの各希釈対照を、二重反復
試験において、適当なウェルへ添加する。

【０１４３】９．２００μｌのＰＢＳ−ポリソーベート
を二重反復試験の試薬の対照ウェルおよびブランキング
のウェルへ添加する。

【０１４４】１０．２００μｌの各希釈血清標本を適当
なウェルへ添加する。血清標本はオペレーターにより二
重反復試験間の変動係数が絶えず１０％より少ないよう
な精度が達成されるまで二重反復試験する。

【０１４５】１１．微量滴定板を板のカバーで覆い、そ
してトレーを湿った雰囲気中で３２〜３７℃において６
０分間インキュベーションする。

【０１４６】ａ．３７℃の水浴中において：カバーされ
た板は水の上に浮かず、水浴中の液面支持体上に静置す
るようにする。インキュベーションの間浴のカバーを保
持する。板のレベルにおける気温を３２〜３７℃とす
る。

【０１４７】ｂ．３７℃の空気インキュベーション内に
おいて：インキュベーション内に蓋を有する容器を配置
する。この容器をインキュベーション内に残して、内部
の温度が３７℃であるようにする。容器の底部に湿った
紙タオルを配置して湿気を維持する。微量滴定板を容器
内に入れ、そしてインキュベーション期間中蓋をしてお
く。

【０１４８】１２．接合体の調製。試薬の節を参照。

【０１４９】１３．エリサ（ＥＬＩＳＡ）の多チャンネ
ル（ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ）洗浄びんを使用して、
微量滴定板（ブランキングのウェルを含む）をＰＢＳ−
ポリソーベートで３回洗浄する。洗浄手順は、次の通り
でなくてはならない。

【０１５０】ａ．激しく振盪して内容物を出すことによ
りウェルを空にする。

【０１５１】ｂ．洗浄びんを倒立させ、そしてびんを強
制的に絞ることによりウェルをＰＢＳ−ポリソーベート
でよくフラッシュする。

【０１５２】ｃ．激しく振盪して内容物を出すことによ
り、ＰＢＳ−ポリソーベートを除去する。

【０１５３】ｄ．工程１３ｂおよび１３ｃを２回反復す
る。

【０１５４】ｅ．最後の洗浄後、倒立させた板を清浄な
紙タオル上でしっかり軽く叩いて過剰のＰＢＳ−ポリソ
ーベートを除去する。

【０１５５】ｆ．次の工程に直ちに進む。

【０１５６】洗浄工程の間手袋を着用すべきである。家
庭用漂白剤を洗浄物質へ添加した後、それを廃棄する。

【０１５７】注：試験の間、ウェルを乾燥させてはなら
ない。ウェルを乾燥させると、不当に高い吸収値が得ら
れることがある。

【０１５８】１４．多チャンネルのミクロピペットを使
用して、２００μｌの接合体を、ブランキングのウェル
を除外して、すべてのウェルへ添加する。

【０１５９】１５．微量滴定板を板カバーで覆い、そし
て室温において暗所で６０分間インキュベーションす
る。

【０１６０】１６．使用前１０分に基質を調製する。こ
の基質は透明ないし非常に淡い黄色であるべきである。
試薬の節を参照。

【０１６１】１７．工程１３に記載したように微量滴定
板を洗浄する。次の工程に直ちに進む。

【０１６２】１８．多チャンネルのミクロピペットを使
用して、２００μｌの基質をブランキングのウェルを含
む、すべてのウェルへ添加する。

【０１６３】１９．微量滴定板を、蓋をしないで、暗所
に室温において３０分間配置する。２０．多チャンネルのミクロピペットを使用して、５０
μｌの４Ｎ硫酸を、ブランキングのウェルを含む、すべ
てのウェルの中へ強制的に注入する。硫酸は急速にかつ
均一にウェル全体を広がって、酵素を完全に不活性化す
ることが重要である。板が暗所に貯蔵されない場合、硫
酸を添加後、１時間までに結果を読むことができる。

【０１６４】２１．微量滴定板のリーダーを４８８〜４
９２ｎｍの波長にセットし、そして製造者の説明に従
い、基質および酸を含有するブランキング・ウェルを使
用することによりリーダーをブランキングする。

【０１６５】２２．すべての微量滴定ウェルにおける色
濃度を測定する。

【０１６６】結果の解釈Ａ．試験の対照１．試薬の対照：二重反復試験の試薬の対照の平均吸収
値を計算する。平均吸収値は０．０５より小さくなくて
はならない。０．０５に等しいかあるいはそれより大き
い場合、新しく調製した試薬を使用して試験を反復すべ
きである。

【０１６７】２．ノーマルおよびアブノーマルの対照：
二重反復試験したハイ・ノーマル、ロウ・アブノーマル
およびハイ・アブノーマルの平均の吸収値を計算する。
二重反復試験は平均値の２０％以内であるべきである。

【０１６８】Ｂ．各血清についての免疫複合体濃度（ミ
クログラム／ｍｌＨＡＧ当量）の標準曲線の調製およ
び決定１．グラフの方法ａ．直線のグラフ紙上にノーマル、ロウ・アブノーマル
およびハイ・アブノーマルの対照についての吸収値を対
応するミクログラム／ｍｌＨＡＧ当量に対してプロッ
トする。典型的なｍｇ／ｍｌＨＡＧ当量は、ロウ・ア
ブノーマル対照について２０、ノーマル対照について５
０、そしてハイ・アブノーマル対照について１４０であ
る。

【０１６９】ｂ．プロットした点に最適に適合する直線
を引く。

【０１７０】ｃ．曲線上において、各血清の吸収値（二
重反復試験を磁子した場合平均吸収値）に対応する点を
探し、そして対応するミクログラム／ｍｌＨＡＧ当量
を読み取る。

【０１７１】ｄ．上で決定した免疫複合体濃度をミクロ
グラム／ｍｌＨＡＧ当量で報告する。

【０１７２】２．計算方法計算は線形回帰プログラムで供給される種々の計算器で
行うことができる。製造者の説明に従いこれらのプログ
ラムを使用して、各試験試料について標準曲線および免
疫複合体濃度（ミクログラム／ｍｌＨＡＧ当量）を確
立する。

【０１７３】Ｃ．結果の解釈１．陰性の結果０〜３４ミクログラム／ｍｌＨＡＧ当量の結果は、計
算する免疫複合体の有意水準について陰性と解釈するこ
とができる。

【０１７４】２．陽性の結果＞３５ミクログラム／ｍｌＨＡＧ当量の結果は、計算
する免疫複合体の有意水準について陽性と解釈すること
ができる。

【０１７５】実施例Ｖ活性な病気をもつ患者の血清中の循環性免疫複合体の検
出供給される血清の収集全血試料が患者から得られそしてこれを周囲温度におい
て少なくとも２時間凝固させた後、血清を遠心分離し
た。透明な血清を細胞要素から注意して分離し、そして
試験までガラス管に保持した。過剰の血清を０．５ｍｌ
の分画に分け、そして将来使用するための−７０℃で凍
結した。

【０１７６】血清試料の試験手順の実施例ＶＩに記載する。

【０１７７】データの解釈Ａ．吸収の読み（４９２ｎｍ）：吸収値はダイナテッチ
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）微量滴定板リーダーで得た。

【０１７８】

【表１】患者性別診断Ａ４９２Ｈ．Ｒ．女性リウマチ用関節炎１．０６４Ｇ．Ｔ．女性リウマチ用関節炎１．１３０Ｙ．Ｏ．女性リウマチ用関節炎１．０１５Ｎ．Ｍ．男性リウマチ用関節炎１．１０２Ｄ．Ｍ．女性全身の紅斑性狼瘡０．９４６Ｂ．Ｒ．女性全身の紅斑性狼瘡０．９７３Ｓ．Ｄ．男性急性肝炎Ｂ１．１８６Ｒ．Ｖ．男性急性肝炎Ｂ１．０６７Ｅ．Ｌ．男性エイズ（ＡＩＤＳ）の患者０．５８１Ｔ．Ｄ．男性エイズ（ＡＩＤＳ）の患者１．１３８Ｒ．Ｗ．男性正常０．３９７Ｋ．Ｗ．女性正常０．２４８Ｂ．標準極性の調製１．標準曲線は３つの熱凝集した標準を使用して調製し
た（第１図参照）２．曲線は２５μｇ／ｍｌから１５０μｇ／ｍｌまで直
線でる。

【０１７９】Ｃ．患者の血清中の免疫複合体の濃度の決
定各血清についてのＡ４９２値を使用して、分析した各試
料についての免疫複合体濃度を次のようにして決定し
た：

【０１８０】

【表２】免疫複合体濃度患者Ａ４９２ (μｇ／ｍｌＨＡＧ当量）Ｈ．Ｒ．（リウマチ用関節炎）１．０６４１０２Ｇ．Ｔ．（リウマチ用関節炎）１．１３０１０９Ｙ．Ｏ．（リウマチ用関節炎）１．０１５９５Ｎ．Ｍ．（リウマチ用関節炎）１．１０２１０８Ｄ．Ｍ．（全身の紅斑性狼瘡）０．９４６８５Ｂ．Ｒ．（全身の紅斑性狼瘡）０．９７３８９Ｓ．Ｄ．（急性肝炎Ｂ）１．１８６１２０Ｒ．Ｖ．（急性肝炎Ｂ）１．０６７１０８Ｅ．Ｌ．（エイズ（ＡＩＤＳ））０．５８１４７Ｔ．Ｄ．（エイズ（ＡＩＤＳ））１．１３８１０９Ｒ．Ｗ．（正常）０．３９７＜１０Ｋ．Ｃ．（正常）０．２４８＜１０Ｄ．患者の評価：＞３５μｇ／ｍｌＨＡＧの免疫複合
体濃度は、循環性免疫複合体の有意水準について陽性で
ある。活性の病気をもつ患者のすべては陽性であると試
験されたが、正常は陰性であると試験された。

【０１８１】実施例ＶＩエイズ（ＡＩＤＳ）危険群の検出のための主題の試験の
使用実施例ＩＩＩに記載するＣｌｑ複合体試験キットを使用
してエイズ危険群、エイズを有する群およびエイズをも
たない群の両者、を評価した。これらの群はそれらの血
液中に有意な濃度の循環性免疫複合体を有する。この試
験は免疫複合体の検出に使用される現在のブドウ球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）結合検定およびＣｌ
ｑ結合検定と比較して実施した。

【０１８２】この比較試験の結果を表１に示す。

【０１８３】

【表３】

【０１８４】この表が示すように、主題の試験はエイズ
の被害者の９７％を検出し、一方また現在エイズを保持
しない種々のエイズの危険群、例えば、同性愛者（ｈｏ
ｍｏｓｅｘｕａｌ）およびハイチ人（Ｈｉｔｉａｎ）の
実質的な比率を検出する。先行技術の結果と比較する
と、主題の試験は実際のエイズの被害者の検出およびエ
イズの危険群の検出の両者においてきわめてすぐれてい
た。

【０１８５】実施例ＶＩＩモノクローナル抗体の濃度ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動を、ある範囲
の低分子量の標準に対するここに記載する両者のハイブ
リドーマにより生産されるモノクローナル抗体について
実施した。６点線形回帰により、各抗体の重い鎖（ｈｅ
ａｖｙｃｈａｉｎ）は５２，３８４であると決定さ
れ、一方各々の軽い鎖は２６，１２８であると決定され
た。

【０１８６】電気集中分析（ｅｌｅｃｔｒｏｆｏｃｕｓ
ｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ）は次の結果を与えた：４Ａ
４Ｂ１１抗体について、ｐＩは６．６、６．５、６．４
および６．３５において観測され：１２Ａ５Ｂ７抗体に
ついて、ｐＩは６．１、６．０５、５．９５および５．
９において観測された。

【０１８７】両者の抗体は慣用の技術によりＩｇＧ₁で
あると決定された。

【０１８８】前述のように、主題のモノクローナル抗体
は、ことにＣｌを含有する人間の血清における、ヒトＣ
１ｑ含有複合体の存在の検出のために有用であり、こう
して、先行技術により要求されたような、試験前のＣ１
ｑ含有複合体の血清からの分離の必要性を排除する。モ
ノクローナル抗体はＣｌｑ含有複合体を検出する方法お
よび試験キットにおいて使用することができ、前記検出
は病気の診断においておよびこのような病気の処置の監
視において有用である。

【０１８９】本発明によれば、ヒトＣ１ｑと反応する
が、ヒトＣ１と実質的に非反応性である抗体を生産する
ことができるハイブリドーマが提供される。また、モノ
クローナル抗体このハイブリドーマを生産する方法、モ
ノクローナル抗体を生産する方法、およびこの抗体を使
用してヒトＣ１ｑ複合体を検出する方法および試験キッ
トが提供される。

【０１９０】Ｃ１ｑに対して特異的な２種類のモノクロ
ーナル抗体を生産する２種類のみのハイブリドーマを説
明したが、本発明はこの特異性を示すすべてのモノクロ
ーナル抗体およびこのようなモノクローナル抗体を生産
することができるすべてのハイブリドーマを包含するこ
とが考えられる。主題の抗体はサブクラスＩｇＧ₁に属
することが決定された。ＩｇＧ₁はネズミＩｇＧの４つ
のサブクラスのうちの１つである。ＩｇＧのこれらのサ
ブクラスはいわゆる「固定（ｆｉｘｅｄ）］領域（ｒｅ
ｇｉｏｎ）において互いに異るが、特異的抗原またはエ
ピトープに対する抗体はＩｇＧのサブクラスがどこに属
するかに無関係に機能的で同一である、いわゆる［可変
（ｖａｒｉａｂｌｅ）」領域を有するであろう。すなわ
ち、ここに説明した特性を示すモノクローナル抗体は、
サブクラスＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂ａ、ＩｇＧ₂ｂまたはＩｇ
Ｇ₃であるか、あるいはクラスＩｇＭ、ＩｇＡ、または
他の既知のＩｇクラスであることができる。これらのク
ラスまたはサブクラスの間の差は主題の抗体の選択に影
響を与えないであろうが、抗体と他の物質、例えば、補
体または抗マウス抗体とのそれ以上の反応に影響うを及
ぼすことがある。

【０１９１】ここに記載した開示に従い、Ｃ１ｑと選択
的に反応するモノクローナル抗体を生産する他のハイブ
リドーマを容易に調製することができるであろう。この
ようなハイブリドーマおよびモノクローナル抗体は、そ
れらがここに開示した２種類の例示の抗体とＣ１ｑ上の
同一のエピトープと反応するか否かに無関係に、本発明
の範囲内に包含されると考えられる。

【０１９２】ここに例示したハイブリドーマ技術を用い
て前述したモノクローナル抗体を生産する方法は本発明
の範囲に包含される。２種類のみのハイブリドーマの例
が与えられているが、当業者はここに提供された免疫
化、融合および選択の方法に従うことができ、そして記
載した選択性を有する抗体を生産することができる他の
ハイブリドーマを得ることができると考えられる。既知
のマウス骨髄腫細胞系統および既知のマウスの種からの
脾細胞から生産される個々のハイブリドーマは、前記ハ
イブリドーマにより生産される抗体を参照する以外それ
以上同定できないので、前述の活性を有する抗体を生産
するすべてのハイブリドーマならびに前記ハイブリドー
マを用いる前記抗体をつくる方法は本発明の範囲内に包
含されると考えられる。

【０１９３】また、他の抗体生産性哺乳動物種を使用し
て、ここに記載する特異性を有するハイブリドーマを発
生させることができるであろう。例えば、ここに記載す
る技術に従いラットを免疫化し、そしてラットの脾細胞
をラットの骨髄腫系統と融合することができるであろ
う。このようなラット−ラット融合を実施する技術はよ
く知られている。

【０１９４】上に例示した２種類のハイブリドーマは、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）（ｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌ
ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１Ｐａｒ
ｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．２０８５２）に１９８３年７
月２９日受託され、そしてＡＴＣＣ受託番号ＨＢ８３２
７（ハイブリドーマ４Ａ４Ｂ１１について）およびＨＢ
８３２８（ハイブリドーマ１２Ａ５Ｂ７について）を与
えられた。

【図面の簡単な説明】

【図１】図は本発明の方法の実施に用いる標準曲線を表
わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 33/564 Ｚ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者シヨー，サリイ・エムアメリカ合衆国ニユージヤージイ州08876 サマービル・アパートメント６・ジエミニドライブ356・ビークマンガーデンズ（番地なし) (72)発明者カプラン，ポール・エムアメリカ合衆国ニユージヤージイ州08557 サージヤンツビル・ボツクス125グラマリイロード（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトＣ１含有血清中のヒトＣ１と結合し
ないが、ヒトＣ１ｑを含有する免疫複合体と結合する哺
乳動物のモノクローナル抗体。
【請求項２】マウスモノクローナル抗体である請求項
１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】ヒトＣ１を含有するヒト血清中のヒトＣ
１ｑ含有免疫複合体と特異的に反応するマウスモノクロ
ーナル抗体である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８３２７
またはＨＢ８３２８により生産される請求項３記載のモ
ノクローナル抗体。