NO852705L - Fremgangsmaate for detektering av immunkomplekser i serum - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt metoder for detektering av sirkulerede immunkomplekser og reagenser som kan benyttes ved disse metoder, mere spesielt en metode for detektering av human Clq-holdige komplekser i humanserm inneholdende Cl, et prøvesett for gjennomføring av metoden, hybridcellelinje for fremstilling av monoklone antistoffer som selektivt reagerer med Clq i nærvær av Cl, og de således fremstilte monoklone antistoffer.

Immunkomplekser dannes i blodstrømmen mellom antigen og antistoff som en del av den normale immundefens mekanisme mot patogener og andre fremmedstoffer. Disse immunkomplekser tillater eliminering eller nøytralisering av fremmed-antigener og beskyttelser av verten. Under slilke omstend-igheter kan imidlertid disse immunkomplekser i seg selv forårsake skade hos verten. Disse sirkulerende immunkomplekser er relevante for et stort antall sykdommer, spesielt autoimmunsykdommer slik som rheumatoid arthritis, systemisk lupus erythematose (SLE) og lignende; kreft slik som leukemi og ovarialkreft; og et stort antall infeksjonssykdommer. Spesielt ved autoimmun sykdommer er det av nytte å detektere sirkulerende immunkomplekser ved diagnostisering av sykdomm-en og ved overvåking av dens behandling, se f. eks. A.N. Theofilopoulos og F.J. Dixon, i "Advances in Immunology", vol. 28, sidene 89 - 220, 1979, saqmt S.E. Richmann og J.C. Daniels i "Clinical Chemistry", vol. 28, side 1259 - 1271 ( 1982).

På grunn av denne interesse for detektering og overvåking av nivå av sirkulerende immunkomplekser er det beskrevet tallrike prøver for detektering av disse komplekser. Disse tidligere kjente prøver har generelt vært basert på: a) detektering av epitoper inneholdt i disse komplekser, b) reaktiviteten for disse komplekser med radiomerkede reagenser istand til binding til dem, eller c) binding av immunkompleksene til spesifikke respetorer funnet på vev eller celler. En utstrakt kjent teknikk foreligger som beskriver disse prøver.

De tidligere kjente prøver har imidlertid krevet isolering av de putative immunkomplekser som skal detekteres fra humanserum p.g.a. nærværet i dette serum av andre substanser som kryssreagerer i prøven og således påvirker detekteringen av immunkompleksene. Denne isolering av immunkompleksene fra serum har generelt vært gjennomført i den kjente teknikk ved utfelling, f. eks. med polyetylenglykol, ved gelfiltrer-ings kromatografi, eller ved fastfasekolonner.

Nødvendigheten ved den kjente teknikk av isolering av de sirkulerende immunkomplekser fra serum før gjennomføring av prøven er et vanskelig, kostbart og tidkrevende trinn. En metode som kunne eliminere behovet for immunkompleksisoler-ing fra serum ved å tillate detektering av immunkompleksene i serm ville være av vesentlig fordel. En slik prøve ville resultere i signifikant tidsbesparelse ved gjennomføring av immunkompleksanalyser, ville eliminere feil ved i den kjente prøving innført under isolasjonstrinnet (f. eks. ufullstend-ig isolering eller gjenvinning av immunkompleksene) og ville eliminere feil i forbindelse med denaturering av immunkompleksene under isolering.

De fleste antistoffer som er tilstede i immunkomplekset har

et sete på Fc delen av molekylet som reagerer med en komplementær komponent. Komplementsystemet er en del av en kompleks reaksjonsserie ved hjelp av hvilken stoffer med antistoffer bundet til seg ødelegges av vertens immunsystem.

Disse komplementkomponenter identifiseres ved bokstav- og tallforkortelser som begynner med bokstaven C. En av spesiell interesse er den første komplementkomponent Cl som i seg selv består av underenheter kalt Clq, Clr og Cls. Det er Clq underenheten av Cl som reagerer med Fc sete som angis ovenfor.

En av de kjente metoder for detektering av immunkomplekser har vært avhengig av detektering av bundet Clq (d.v.s. Clq som er festet til Fc setet av antistoffet i immunkomplekset) . Vanskeligheten med gjennomføring av en slik prøve i nærvær av serum er imidlertid at kjente stoffer som har reagert med bundet Clq også har reagert med Cl (som inneholder Clq) og som sirkulerte i serum. Fordi dette serum Cl er sterkt i overskudd sammenlignet med Clq bundet til komplekset, har det tidligere vært umulig å gjennomføre en Clq detekteringsanlayse i serum.

Siden Kohler og Milsteins arbeide i 1975 har mange forsøk vært rettet mot fremstilling av forskjellige hybridomer som fremstiller såkalte monoklone antistoffer. Disse monoklone antistoffer er ekstremt brukbare stoffer fordi de har en enkelt spesifisitet i motsetning til såkalte polyklone antistoffer som resultererer fra tradisjonell immunisering og tapping av eksperimentdyr.

Arbeid på dette område har samtidig indikert fordelene og komplikasjonene ved forsøk på å fremstille monoklone antistoffer fra hybridomer. Mens den generelle teknikk fra sitt konsept klart er forstått, møtes mange vanskeligheter og variasjoner er nødvendige for hvert spesifikke tilfelle.

Således er det ingen sikkerhet før man søker å fremstille et hybridom at man oppnår det ønskede hybridom, at det vil fremstille antistoffer hvis det oppnås, eller at antistoffer som fremstilles vil ha den ønskede spesifisitet. Graden av vellykkethet påvirkes prinsippielt av den type antigen som benyttes og seleksjonsteknikken som benyttes for isolering av det hybridom.

I den senere tid har M.D. Golan og medarbeidere benyttet teknikken til Kohler og Milstein for å fremstille et antall monoklone antistoffer mot Clq og har benyttet disse antistoffer for å studere konformasjonsendringer i Clq. De rapportere dette arbeid i "Journal of Immunology", vol. 192, side 445 - 447, i august 1982. Disse antistoffer ble fremstilt ved injisering av mus med Clq bundet til immunkomplekser som antigen, sammensmelting av miltceller fra disse mus med musemyelomceller, dyrking av de resulterende hybridomer og bedømmelse av disse mot human Clq festet via kanin antihuman Clq til en faswt fase. Disse antistoffer reagerte med et antall antigener men alle reagerte med nativserum Cl. Mange av antistoffene reagerte også med fluidfase Clq. Imidlertid reagerte disse antistoffer generelt dårlig med Clq bundet til immunkomplekser.

Forfatterne konkluderte med at "disse funn demonstrerer at bindingen av Clq til immunkomplekset eksponerer nye antigene determinanter". De nådde denne konklusjon fordi tapet av reaktivitet med deres antistoffer oppsto når Clq ble bundet til immunkompleksene. Antistoffene beskrevet i denne referanse ville ikke vær brukbare for en prøve på immunkomplekser i serum ved detektering av Clq bundet til immunkomplekser p.g.a. at nativ serum Cl klart ville forstyrre ethvert rewsultat. Således synes denne artikkel å antyde at den monoklone antistoffteknikk generelt ikke ville være brukbar for spesifikk detekterng av immunkomplekser.

Det er nu funnet at en spesifikk prøve påimmunkomplekser i serum kan antydes ved bruk av monoklone antistoffer rettet mot unike epitoper karakteristisk for Clq bundet til immunkompleksene som ikke er vist i nativserum Cl.

Ifølge en utførelsesform omfatter foreliggende oppfinnelse således et nytt hybridom istand til å fremstille et nytt pattedyr monoklont antistoff som reagerer med human Clq men som er i det vesentlige ikke reaktivt med human Cl, og det derved fremstilte monoklone antistoff. Det angjeldende monoklone antistoff vil selektivt reagere med et human Clq holdig kompleks i nærvær av human C1 og kan således benyttes for å påvise immunkomplekser inneholdende Clq i humanserum inneholdende human Cl. Mus-mus hybridomer som produserer musemonoklone antistoffer er foretrukket.

I et ytterligere trekk omfatter oppfinnelsen en fremgagsmåte og et prøvesett for detektering eller bestemmelse av human Clq holdig kompleks i et fluid. Denne metode tillater detekterng av komplekset i humanserum inneholdende nativserum Cl. Metoden omfatter: a) å tilveiebringe et selektivt antihuman Clq monoklont antistoff bundet til en fast fase; b) å bringe en prøve av dette fluid i kontakt med nevnte faste fase under betingelser som tillater en immunologisk reaksjon mellom nevnte human Clq holdige kompleks og nevnte antihuman Clq monoklone antistoff; c) separering av ikke-omsatt fluidprøve fra den faste fase; d) å kontakte den faste fase med et merket andre antistoff istand til å binde til Clq holdig kompleks som kan være bundet til den faste fase, under betingelser som tillater en immunologisk reaksjon mellom nevnte andre antistoff og nevnte bundede kompleks; e) separering av ikkeomsatt andre antistoff fra den faste fase; og f) detektering eller bestemmelse av merkingen som er tilstede på enten nevnte ikkeomsatte andre antistoff eller

nevnte faste fase og relatering av detekteringen eller bestemmelsen til nærværet eller mengden av Clq holdig kompleks i fluidprøven.

Dette fluidet er hensiktsmessig humanserum men metoden kan også benyttes for detektering eller bestemmelse av et human Clq holdig kompleks også i andre fluider.

Prøvesettet ifølge oppfinnelsen for detektering av human Clq holdig kompleks omfatter en fastfase komponent med dertil festet selektivt antihuman Clq monoklont antistoff og en mengde av merket andre antistoff i stand til binding til nevnte Clq holdige kompleks når dette er bundet til antistoffet på den faste fase.

Uttrykkene "i det vesentlige ikke-reaktiv med human Cl" og "selektivt reagerer med human Clq" betyr at evnen for det monoklone antistoff til å detektere et Clq holdig immunkompleks ikke ugunstig påvirkes av nærværet av human C1 eller andre stoffer i humanserum.

Den vedagte figur 1 viser en standardkurve som benyttes ved gjennomføring av oppfinnelsen.

De angjeldende hybridomer ble fremstilt i henhold til følgende trinn: A. Immunisering av mus med human Clq. Mens Balb/c hunmus her ble brukt, er det tatt sikte på at andre musestammer eller også andre dyr slik som rotter eller kaniner kan benyttes. Immuniseringsoppsettet og konsentrasjonen av Clq antigen bør være slik at det dannes brukbare mengder av egnet primede splenocyter. Initialimmuniserng med 50 pg Clq på subkutan måte fulgt av en hyperimmuniseringserie på 5 injeksjoner er funnet å være effektive. Selv om human Clq hensiktsmessig ble benyttet som immunogen i det foreliggende tilfelle, er det tatt sikte på at andre stoffer inneholdende Clq spesifikke antigener eller epitoper (inkludert isolerte antigener) kan benyttes.

B. Å fjerne milten fra det immuniserte dyr og fremstilling av en miltsuspensjon i et egnet medium. C. Sammenføyning av suspenderte miltceller med myelomceller fra en egnet cellelinje med bruk av en egnet promoter. Selvfølgelig må myelomcellene som velges være kompatible med miltcellene og fortrinnsvis være av samme art. Murin cellelinjen Sp2/0-Ag14 (beskrevet i "Nature", vol. 276, sidene 269-270, 1978) er funnet å være effektive for bruk med de her benyttede musemiltceller, men det er ment at andre myelomcellelinjer kan benyttes. Mange myelomcellelinjer (fra mus og andre dyr) er kjente og tilgjengelige, generelt fra den akademiske verden eller forskjellige deponeringsbanker slik som American Type Culture Collection, i Rockville, Maryland, og Salk Institute Cell Distribution Center i La Jolla, California.

Myelomcellelinjen som benyttes bør fortrinnsvis være av den såkalte "medikamentresistente" type, slik at de ikke sammenføyede myolomceller ikke overlever i et selektivt medium, mens hybrider overlever. Den vanligste klasse av slike medikamentresistente myolomer er 8-azaguanin resi-stente cellelinjer som mangler enzymet hypoxanthin guanin fosforibosyl transferase og således ikke kan overleve i et HAT (hypoxanthin, aminopterin og thymidin) medium. Det er også generelt foretrukket at myelom cellelinjen som benyttes er av såkalt "ikke-sekreterende" type som ikke i seg selv gir noe antistoff selv om sekreterende typer kan benyttes.

Det her benyttede myelom er av en slik ikke-sekreterende type. Foretrukket forhold mellom cellene ovenfor er ca. 5 miltceller/myelomcelle. Mens sammenføyningspromoteren som benyttes ved fremstilling av de angjeldende hybridomer var polyetylen glykol med en midlere molekylvekt på ca. 1000, kommersielt tilgjengelig under betegnelsen "PEG 1000", er andre polyetylen glykoler og andre sammenføyningpromotere kjente i denne teknikk og kan med fordel benyttes. D. Fortynning og dyrking av blandingen av ikke-sammenføyet miltcelle, ikke sammenføyede myelomceller og sammenføyede celler i et selektivt medium som ikke understøtter vekst av ikke-sammenføyede myelomceller i et tidsrom tilstrekkelig til å tillate død for alle ikke-sammenføyede celler, ca. 1 uke. Mediet er et, f. eks. HAT medium, som ikke vil understøtte medikamentresistent (f. eks. 8-azaguanin resistent) ikke-sammenføyet myelomcellelinje. Således forsvinner disse ikke-sammenføyede myelomceller. Fordi ikke-sammenføyede milt celler ikke er ondartede, har de kun et endelig antall generasjoner og (etter et visst tidsrom) reproduserer de ikke lenger. De sammenføyede celler fortsetter på den annen side å reprodusere fordi de har den ondartede kvalitet som skyldes myelomforeldrene og enzymet som er nødvendig for å overleve i det valgte medium arvet fra miltcelleforeldrene.

E. Evaluering av supernatanten i hver beholder eller brønn inneholdende et hybridom med henblikk på nærvær av antistoff mot human Clq, som et første trinn, også hva angår Clq kompleks.

F. Seleksjon av hybridomer som fremstiller det ønskede antistoff. Denne seleksjon kan f. eks. skje ved begrensende fortynning der volumet av fortynningsmidlet statistisk beregnes til å isolere et visst antall celler (f. eks. 1 - 4) i hver separate beholder (f. eks. hver brønn på en microtiter plate). På denne måte kan individuelle hybridomer isoleres for ytterligere kloning.

Når først ønskede hybridomer er selektert (og hvis ønskelig klonet) kan det resulterende antistoff fremstilles på en av to måter.

Det reneste monoklone antistoff fremstilles ved in vitro dyrking av det ønskede hybridom i et egnet medium i et egnet tidsrom, fulgt av gjenvinning av antistoffet fra supernatanten. Det egnede medium og egnet dyrkingstidslengde er kjent eller kan lett bestemmes. Denne in vitro teknikk gir i det vesentlige monospesifikt, monoklont antistoff, i det vesentlige fritt for annet spesifikt antihuman iramunglobo-lin. Det er tilstede en liten mengde annet immunglobulin fordi mediet inneholder xenogent serum (f. eks. fetal kalveserum). Imidlertid gir denne in vitro metode ikke en tilstrekkelig mengde eller konsentrasjon av et antistoff for enkelte formål fordi konsentrasjonen av monoklont antistoff som fremstilles ved denne metode kun er ca. 50ug/ml.

For å fremtille en meget høyere konsentrasjon og mengde av monoklont antistoff kan det ønskede hydridom injiseres i vertsdyr av samme art som de som ble benyttet for å fremstille hybridomet, fortrinnsvis syngeniske eller semisyngen-iske dyr. Mus ble benyttet ifølge foreliggende søknad. Injeksjonen skjeddefortrinnsvis til peritoneum hos verten. Hybridomet vil forårsake dannelse av antistoff fremstillende tumorer hos verten etter en egnet inkubasjonstid, noe som resulterer i en meget høy konsentrajon av det ønskede antistoff på ca. 5 - 20 mg/l, i blodstrømmen og peritoneal eksudatet fra verten. Selv om disse verter også har vanlig antistoff i blod og bukvann, er konsentrasjonen av disse normale antistoffer ca. 5% av konsentrasjonen av det ønskede monoklone antistoff. Fordi det videre disse normale antistoffer ikke er antihumane i sin spesifisitet, er det monoklone antistoff som oppnås fra høstet ascit eller fra serum i det vesentlige fritt for forurensende antihuman immunglobulin. Dette monoklone antistoff har vanligvis høy titer (aktiv ved fortynninger på 1:100.000 eller derover) og et høyt forhold mellom spesifikt og ikke-spesifikt immunglobulin (ca. 1/20 eller derover).

Ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir spesifikke anti Clq igG isolert fra ascit fluid produsert som beskrevet ovenfor ved å føre fluidet gjennom en kromotografikolonne med dertil bundet protein A. Protein A av kommersielt tilgjengelig type er et protein som finnes på overflaten av visse arter staphylococcer som binder til Fc delen av et IgG molekyl og således tillater separering av IgG fra forurensende materiale.

IgG fraksjonen absorberes på en fast overflate slik som overflaten av en polystyren microtiter plate for å danne den faste fase som er nødvendig ifølge oppfinnelsen. Teknikker for belegning av antistoff på faste overflater er velkjente.

Til brønnene av denne antistoffbelagte microtiter plate settes prøver av serumet som skal prøves, fortrinnsvis fortynnet i buffer. Brønnene inkuberes fortrinnsvis for å tillate total immunologisk reaksjon selv om en slik inkubering ikke er vesentlig for gjennomføring av prøvemetoden. Etter inkubering blir fluidet i hver brønn fjernet og brønnene vasket for å fjerne gjenværende ikke-omsatt serum.

For å detektere nærværet av Clq komplekser belagt på brønnene er det foretrukket å bruke et antihuman IgG immunglobulin (hensiktsmessig kanin immunglobulin) merket med et enzym slik som pepperrot peroksydase. Antihuman IgG er spesielt brukbart for detektering av bundet immunkompleks forde det festes til antigeniske seter funnet på immunkompleksene men forskjellig fra de ved hjelp av hvilke komplekset er festet til microtiter plate brønnene. Fremgangsmåte for festing av enzymet til antistoffer er velkjente. Selv om et enzym er foretrukket som merkelapp for detektering av immunkomplekset kan andre merkelapper slik som radioisotoper eller fluorokromer benyttes. Selv om videre antihuman immunglobbulin er den foretrukne detektor kan andre stoffer som binder til Clq kompleksene benyttes. Detektoren kan f. eks. være et antistoff til en komplementkomponent slik som C4b, C3b o.l., eller til et antigenisk materiale funnet i immunkomplekset slik som DNA, hepatit B antigen eller lignende.

Etter tilsetning av enzym merket kanin antihuman IgG på de belagte brønner, blir microtiter platene fortrinnsvis tillatt inkubering for å tillate total immunologisk reaksjon, selv om slik inkubering ikke er vesentlig. Etter inkubering blir ikke-omsatt andre antistoff fjernet og brønnene vasket for å fjerne gjenværende ikke-omsatt andre antistoff. Den bundede enzym merkelapp kan så detekteres ved tilsetning av det egnede substrat som når det gjelder pepperrot peroksydase er o-fenylendiamin. Nærværet av merket andre antistoff og således av Clq komplekset indiker-es ved en farveendring i substratet. Denne prøve kan være kun kvalitativ (d.v.s. farve eller ikke farve) eller kan være kvantitativ fordi utvikling av farve i hver brønn er proporsjonal med mengden merket andre antistoff bundet til den faste fase. Forholdet mellom farveintensitet og Clq kompleks konsentrasjon i serum kan bestemmes fra en standard kurve oppnådd ved å gjennomføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fra kjente stoffer med varierende konsentrasjon. Hvis merkelappen på det andre antistoff ikke er et enzym kan egnede detektoranordninger (f. eks. en scintilla-sjon teller for en radioisotop eller en fluoressens detektor for en fluor krom) benyttes.

Det foreliggende prøvesett omfatter en egnet fastfase overflate (slik som micro titer brønner, kuler eller lignende) med selektivt antihumaqn Clq antistoff festet dertil og et merket andre antistoff istand til binding til Clq holdig kompleks når dette er bundet til antistoffet på den faste fase. Prøvesettet kan også inkludere midler for detekterng av merkelappen på det andre antistoff (f. eks. benyttes det et substrat for enzymet hvis en enzym merkelapp benyttes), såvel som andre ting som benyttes for å gjennom-føre oppfinnelsen.

Selv om den ovenfor beskrevne metode er beskrevet ved bruk av detektering av bundet merket andre antistoff som mål for bundet Clq holdig kompleks, skal det være klart at det likeledes ville være mulig å bestemme mengden ikke-bundet merket andre antistoff i realsjon til mengden andre antistoff som er tilsatt og å detektere nærværet eller å bestemme mengden bundet Clq holdig kompleks ut fra denne beregning.

Oppfinnelsen skal beskrives ytterligere under henvisning til de ledsagende eksempler som imidlertie ikke skal være begrensendee.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av Cia fra normal human serum

A. Buffere (instruksjonene angis for fremstilling av 1 liter for hver buffer). 1. 0.03M etylenglykol-bis (p-aminoetyl eter) N,N'-tetra-eddik syre (EGTA Sigma) pH 7,5. Konduktivitet 2.0 x 10"3 MHo (område 1,95 x 10~<3>til 2,05 x 10"<3>Mho) ved 0°C. Oppløs 11,41 g EGTA i 800 ml destillert vann. Tilsett 4,5 ml 50%-ig NaOH for å oppløseliggjøre EGTA.

Etter oppløsning, avkjøl til +4°C og gjennomfør sluttpH-justering ved dråpevis tilsetning av 50% NaOH og så kvantum satis til 1000 ml med destillert vann.

2. 0,069M etylendiamin tetra eddiksyre (EDTA), dinatriumsalt (Sigma) pH 5,0. Konduktivitet 3,9 x 10"<3>Mhos (område<3,85>xIO"<3>til 395 x10-3Mhos) ved 0.c

Oppløs 23,20 g EDTA i 800 ml destillert vann. Etter oppløsning, avkjøl til +5°C og gjennomfør slutt pH-justering ved dråpevis tilsetning av 50% NaOH og så kvantum satis til 1000 ml med destillert vann. 3. 0,04 EDTA dinatriumsalt (Sigma) pH 7,5. Konduktivitet 3,7 x 10~<3>Mhos(område 3,65 x 10~<3>til 3,75 x 10"<3>Mhos) ved 0°C.

Oppløs 13,45 g EDTA i 800 ml destillert vann. Etter oppløsning, avkjøl til +5°C og gjennomfør slutt pH-justering ved dråpevis 50% NaOH (omtrent 2,5 ml). Kvantis satis til 1000 ml med destillert vann. 4. 0,2M natrimacetat buffer pH 5,0 inneholdende 0,75 NaCl og 0,01M EDTA.

Oppløs 2,72 g natrim acetat; 43,83 g NaCl og 3,3 g EDTA i 800 ml destillert vann. Juster pH verdien med 1,OM eddiksyre. Kvantum satis til 1000 ml. 5. 0,005M natrium fosfat buffer pH 7,5 inneholdende 0,75M NaCl og 0,01M EDTA.

Opplø<s><1,13>g<Na>2H<p>04. 0f220 g NaH2P04.H220; 43,3 g NaCl; 3,36 g EDTA i 800 ml destillert vann. Undersøk pH verdien.

Juster hvis nødvendig med 1,OM NaOH eller 1,OM HC1. Kvantis satis til 1000 ml.

6. Natrium fosfat lager oppløsninger 0,2M.

a. Oppløs 27,6 g NaH2HPo4i destillert vann og kvantum satis til 100 ml.

Oppløs 28,39 g NaOUD_ . , ^....

2HP04 i destillerlt vann og kvantum satis til 1000 ml.

7. 0,005M fosfatbuffer pH 7,4 inneholdende 0,65M NaCl og 0,01M EDTA. Oppløs 37,99 NaCl og 0,336 g EDTA i ca. 500 ml destillert vann. Tilsett 20,75 ml 0,2M Na ~DO , c v, «„^*«vo 2Ht^u4 (reagens 6.b ovenfor) og 4,25 ml 0,2M NaH2Po4(reagens 6.a. ovenfor). Juster pH med 1M NaOH eller 1M HCl etter behov og kvantum satis til 1000 ml. Avluft under redusert trykk i minst 1/2 time før bruk. 8. 0,005M fosfatbuffer pH 7,4 inneholdende 0,65M NaCl, 0. 01M EDTA og 0,2% natrium azid. ;Oppløs 2 g natrium azid i 1000 ml buffer 7 ovenfor.;b. Oppsamling og preparering av normal human serum. ;Fullblod fra donorer av en hvilken som helst AB0 type trekkes inn i rør uten antikoaguleringsmiddel. Blod fra individuelle donorer bør holdes separat inntil begynnelsen av fraksjoneringen. Blodet koaguleres ved romtemperatur i 60 min. og så ved 5°C* i 2 timer. Serum separeres ved +5°C ved sentrifugering ved ca. 3.000 x g. Serum sentrifugeres igjen ved 20.000 x g i 60 minutter ved +5"C og fritt lipid fjernes ved aspirering. Hvis serumet ikke skal brukes umiddelbart bør det lagres frosset.

C. Fraksjonering av serum.

1. Alle trinn skjer ved 5°C. Sera fra forskjellige donorer slås sammen og det totale volum skrives opp. Serumet overføres så til "Spectrapor 1" dialyserør (23 mm flatedia-meter med molekylvektgrense 6000 til 8000) og dialyseres mot buffer 1 i 4 timer ved 5°C. Bufferen erstattes med frisk oppløsning og dialysen fortsettes i 16 timer som ovenfor.

Forholdet mellom buffer og seum i disse to trinn er som følger: trinn en - 800 ml buffer per 100 ml serum. Trinn to - 2400 ml buffer pr. 100 ml serum. Etter dialyse blir uoppløselig materiale, prcipitat 1, fjernet ved sentrifugering ved ca. 300 x g. Supernatanten dekanteres og kasseres.

Precipitatet vaskes en gang med frisk dialysebuffer (1) under hensyntagen til at man resuspenderer precipitatet. Vaskingen skjer i omtrent samme volum som utgangsserum. Precipitatet fjenes ved sentrifugering som ovenfor. Precipitatet oppløses igjen i buffer 4 i et forhold på 25 ml buffer pr. 100 ml utgangsserum ved langsom omrøring i 15 til 30 minutter. Materalet sentrifugeres så til slutt for å fjerne uoppløselige aggregater. 2. Gjennoppløst precipitat 1 ovenfor overføres til dialyse-rør og dialyseres mot buffer 2 i 4 timer. For hver 100 ml utgangsserum kreves det 3200 ml dialysebuffer 2. Etter dialyse blir uoppløselig materiale, precipitat 2, fjernet ved sentrifugering ved ca. 3000 x g. Supernatanten dekanteres og kasseres. Precipitatet vaskes en gang med frisk dialysebuffer ved et volum omtrent lik volumet av det dialyserte precipitat 1. Precipitatet gjenoppløses i buffer 5 i et forhold på 25 ml buffer pr. 100 ml utgangsserum ved mild omrøring i 15 til 30 minutter. Materialet sentrifugeres så for å fjerne uoppløselige aggregater. 3. Gjenoppløst precipitat 2 overføres til dialyserør og dialyseres mot buffer 3 i 5 timer. For hver 100 ml utgangsserum er det nødvendig med 3200 ml buffer 3. Etter dialyse fjernes uoppløselig materiale, precipitat 3, ved sentrifugering ved ca. 3000 x g. Supernatanten dekanteres og kasseres. Precipitatet vaskes en gang med frisk dialysebuffer og et volum omtrent lik volumet av precipitat 2 dialyseres. Precipitatet gjenoppløses så i buffer 7 i et forhold på 1 ml buffer/100 ml utgangsserum ved mild omrøring i 15 til 30 minutter. Hvis mer enn en sdentrifugeskål benyttes for å spinne ned precipitatet bør gjennoppløst buffer fordeles jevnt mellom disse og kun slås sammen etter at precipitatet er gjennoppløst. Det sammenslåtte materalet sentrifugeres til slutt ved 20.000 x g i 15 minutter for å fjerne uoppløselige aggregater.

D. Fremstilling og kjøring av en Bio-gel A5M kolonne.

1. Fest et strømadapter til en ende av en 2,6 x 100 cm kolonne. Blokker avløpsrøret. Fest et reservoar til den andre ende av kolonnen og tilsett ca. 20 ml deaerert buffer 7 . 2. Deaerer 600 ml Bio-Gel A5M, middel 200-400 mesh, i minst 1/2 time og hell forsiktig omrørt oppslemming inn i kolonnen . 3. Når det er dannet et sjikt på 2 til 5 cm tillates kolonnen å flyte. La den ikke tørke. 4. Når kolonnen er tørket, fjern overskytende gel til ønsket sjikthøyde på 100 cm, fjern reservoaret og fest et strømningsadapter til den åpne ende. 5. Tørk kolonnen over natt med 20 ml/time ved 5°C ved bruk av en pumpe. 6. Endre strømningshastigheten til 5,5 ml/time og fest til et UV detektorsett ved 280 nm og til en skriver og en fraksjonskollektor. 7. Juster basislinjen til 0. Sett fraksjonskollektoren for oppsamling av 2,0 ml prøver. 8. Pump Clq oppløsning inn i kolonnen og følg på med 700 deaerert buffer 7. 9. Kolonnen behandles til slutt med 200 ml deaerert buffer inneholdende natrium azid, buffer 8. 10. Clq toppen som alltid er den største på kromatogrammet, begynner vanligvis å vise seg ved ca. 300 ml merket (rør 150) .

Topprøven slås sammen i henhold til følgende protokoll: Trekk en tangent fra ca. midtpunktet på både oppadstigende og nedadstigende side av den optiske densitetskurve til basislinjen. Mål avstanden mellom de to basislinje skjær-ingspunkter. Reduser lengden av denne linje med 10% på hver side. Slå sammen rørene som faller over denne linje. Eksempel på denne prosedyre er vist i figur 1.

E. Preparering og drift av en protein A Sepharose CL 4B kolonne. 1. Sett 0,7 g protein A Sepharose CL 4B til en Bio Rad 0,7 x 10 cm kolonne. Tilsett 0,5 ml buffer 7 og tillat hydrati-sering og svelling i 5 til 10 minutter. 2. Vask kolonnen med ca. 25 ml buffer 7 ved gravitetsstrøm-ning. 3. Lås bunnen av kolonnen og fjern buffer fra toppen av kolonnesjiktet. 4. Fyll pumperørene med Clq preparat og fest pumpen til toppen av protein A kolonnene. Pump Clq preparat gjennom kolonnen i en mengde av 20 ml/time. Samle opp i enkeltrør.

Etter at all Clq oppløsning har passert gjennom kolonnen, tillat luft å pumpes gjennom kolonnen for å sikre total overføring av væske i kolonnen. 5. Regenerer kolonnen med 25 ml 0,1M citrat buffer pH 4,5 ved bruk av gravitetsstrømning.

Preparering av citratbuffer:

a. 0,1M sitronsyre (H3c6H507.H2O).

Oppløs 2,1 g destillert vann, kvantum satis til 100 ml.

b. 0,1M natrium sitrat (Na^^^ 2 H20)

Oppløs 2,94 g i destillert vann, kvantum satis til 100 ml. Bland 54,5 ml a. med 45,5 ml b. pH = 4,5 ± 0,1. 6. Ekvilibrer kolonnen med 25 ml fosfatbuffer 8 og lagre kolonnen i samme buffer.

F. Bestemmelse av Clq konsentrasjonen.

1. Clq konsentrasjonen bestemmes som følger: en OD 280nm avlesning gjennomføres ved bruk av buffer 7 som blindprøve. Ved å benytte extingsjonsverdien for Clq på E^<cm>=

6,8 mg Clq/ml = 0D280 x 10

6 .8 2. Konsentrer Clq toppen til ca. 1,0 mg Clq/ml på et Amicon xM 50 membran.

Denne formel benyttes:

Clq volumet etter konsentraon = Clq konsentrasjon mg/ml x volumet av Clq før konsentrasjon.

BEMERK: Før fjerning av konsentratet fra kammeret, frigi gasstrykket og fortsett omrøring i minst 30 minutter for å oppnå Clq absorbert på filterskiven. 3. Sluttkonsentrasjonen av Clq bestemmes ved OD280nm ved bruk av formelen fra F.1.

G. Renheten i sluttproduktet.

Renheten bestemmes ved polyakrylamid gel elektroforese i nærvær av SDS. Prosedyren er som følger:

1. Reagenser

a. Følgende reagenser oppnås fra BIO-RAD

DTT (dithiothreitol)

SDS (natrium dodecyl sulfat)

Ammonium persulfat

Pyronin Y

TEMED (N,N,N',N' tetrametyletylendiamin)

b. Coomassie Brilliant Blå G-250 (Eastman Kodak)

c. Fyll opp buffer 0,04M Tris; 0,02 natrium acetat; 0,002M EDTA pH 7,4 inneholdende 0,1% DS.

4,85 Tris (hydroksymetyl) aminometan

2,72 g natrium acetat . (NaC2H3o2.H20).

0,67 g EDTA

1,0 g SDS

Oppløs i ca. 800 ml destillert vann. Juster pH til 7,4 med 10% iseddik. Kvantum satis til 1 1 med destillert vann. d. Dialyse buffer: 0,01M Tris HC1, 0,001M EDTA pH 8,0 inneholdende 0,5% SDS.

1,211 g Tris

0,336 g EDTA

1,0 g SDS

Oppløs ca. 800 ml destillert vann. Juster pH til 8,0 med 0,1N HC1. Kvantum satis til 1 1 med destillert vann.

e. Akrylamid-bis reagens.

Oppløs 5,5 g akrylamid og 0,15 g bis-akrylamid i destillert vann, kvantum satis til 25 ml.

f. Ammonium persulfat 0,1 g/10 ml destillert vann (fremstill ny hver dag).

g. Prøveinkuberingsoppløsning

0,303 g Tris

0,084 g EDTA

Oppløs i ca. 10 ml destillert vann. Juster pH-verdien til 8,0 med 0,1N HC1. I denne oppløsning oppløses følgende:

2,5 g SDS

1,54 g DTT

Kvantum satis 25 ml med destillert vann.

h. 0,01% Pyronin Y. Oppløs 0,1 g Pyronin Y i 100 ml destillert vann. i. 30% sucrose. Oppløs 3 g sucrose i destillert vann, kvantum satis til 100 ml.

j. 25% isopropylalkohol 10% eddiksyre 0,025%Coomassie Blå G250.

Til ca. 500 ml destillert vann settes 250 ml isopropyl alkohol og 100 ml iseddik. 0,25 g Coomassie Blå G250 oppløses, kvantum satis til 1 1 med destillert vann.

k. 10% isopropyl alkohol, 10% eddiksyre, 0,0025% Coomassie Blå G-250.

Til ca. 500 ml destillert vann settes 100 ml isopropyl alkohol og 100 ml iseddik. 0,025 g Coomassie Blå G-250 oppløses, kvantum satis 1 1 med destillert vann. 1. 10% eddiksyre, 0,00125% Coomassie Blå G-250. Til ca. 500 ml destillert vann settes 100 ml isseddik. 0,0125 g Coomassie Blå G-250 oppløses, kvantum satis 1 1 med destillert vann.

m. 10% eddiksyre.

Til ca. 500 ml destillert vann settes 100 ml iseddik. Kvantum satis til 1 1 med destillert vann.

2. Prosedyre

a. Fremstilling av 10% akrylamid gel.

Bland sammen:

7,5 ml tank buffer (l.c).

6,75 ml akrylamid-bis oppløsning (l.e)

0,0225 ml TEMED

Avluft i ca. 15 min. og tilsett 0,7 ml av ammonium persul-fatoppløsningen (l.f).

b. Dekk en ende av 5 x 75 mm glassrør med parafilm og sett i Ames Gel Preparation Rack. Tilsett 0,4 ml 30% sucrose (l.i) i bunnen av rørene under hensyntagen til ikke å berøre sidene av rørene. Anbring 2,5 cm lange plastrør over den åpne ende av røret og legg over sucrose og fyll rørene med akrylamid oppløsning (2.a). Tillat polymerisering i minst 60 min. Skyll ut sucrose med et antall vaskinger med tank buffer. Gelene kan benyttes umiddelbart eller lagres i opptil 48 timer. Hvis gelene skal lagres, fyll det vaskede areal med tankbuffer og anbring gelene i fuktig dekket kammer +5°C.

c. Prøvepreparering.

En halv ml av Clq preparatet dialyseres mot ca. 500 ml dialysebuffer (1.d) over natt ved romtemperatur.

Til det dialyserte materiale settes 0,0525 ml av prøveinkub-eringsoppløsningen, (1.g) pluss 0,055 g sukkrose. Oppløs-ningen inkuberes ved 100°C i et kokende vannbad i 3 minutter. Prøven prøves i triplikat som følger: Til 25 ul av den behandlede prøve settes 10 ml pyronin Y oppløsning (1.h) og anbringes på en gel. Prøven overlegges omhyggelig og røret fylles med tankbuffer. En tidligere prøvet Clq prøve kan kjøres som kontroll.

d. Elektroforese.

Prøver underkastes elektroforese i en Canalco Dise elektro-foresecelle eller lignende. Det nedre kammer fylles med ca. 400 ml tankbuffer. Prøvene anbringes i det øvre kammer som så fylles med tankbuffer. Prøvene underkastes så elektroforese ved 1 ma/gel i 15 minutter og så ved 3 ma/gel inntil farvebåndet når bunnen av rørene.

Farvestoffbehandling.

Gelene farvestoffbehandles i en BI0 RAD gel elektroforese diffusjonsapparatur. Alternativt kan gelene farvestoffbehandles separat i rør ved bruk av minst 50 ml farvestoff oppløsning pr. gel. Oppløsningene holdes omrørt ved å anbringe rørene på et rystebord.

Den første farvebehandlingsoppløsning,(1.j) helles i apparaturen som rommer ca. 4 1. Karbonpatronen fjernes og anordningen anbringes på en magnetisk rører. Prøvene farvestoffbehandles over natt. Den andre farvestoffoppløs-ning (l.h) byttes ut mot den første og farvestoffbehandling gjennomføres som angitt ovenfor i 6 - 9 timer. Den tredje oppløsning (1.1) byttes ut mot den første og farvestoffbe handling fortsettes over natt. Farveanalyse oppløsningen (l.m) byttes ut mot den tredje farvestoffoppløsningen, karbonpatronen bringes tilbake og gelene avfarves inntil bakgrunnen er klar.

f. Tolkning av gelene.

Prosedyren bryter Clq opp i tre komponenter på 22.000, 27.000 og 29.000 molekylvekt. Disse tre komponenter representerer de hurtigst vandrende bånd på gelen. Alle andre bånd er forurensninger.

Gelene avleses på et fotovolt densitometer med en integrer-ingsfunksjon. Summen av Clq båndene dividert med summen av alle tilstedeværende bånd er lik prosentrenheten for Clq preparatet. Den midlere verdi av de tre gel tas som sluttresultat.

EKSEMPEL II

Fremstilling av monoklone antistoffer.

A. Immunisering og cellehybridiering.

Balb/c hunnmus (6 til 8 uker gamle fra Jackson Laboratories) ble immunisert sukkutant med 50 ug Clq antigen fremstilt som i Eksempel 1. Basert på de retroorbitale tappedata ble en av disse mus valgt for hyperimmuniseringsseien av injeksjoner bestående av en første intraperitoneal injeksjon på 1 mikrogram Clq antigen fulgt av fire daglige suksessive IP injeksjoner på 200 ug Clq antigen + 80 ug Clq antigen injisert IV på dag to og tre av denne fire dagers periode. Etter den siste immunisering ble musen avlivet, milten fjernet fra musen og en enkelt cellesuspensjon fremstilt ved å presse miltvevet gjennom en duk av rustfritt stål. Cellefusjon ble gjennomført i henhold til prosedyren utviklet av Kohler og Milstein. Omtrent 1,3 x 10° Q splenocyter i 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium forsterket med 1-glutamin og glucose (DME, Gibco, Grand Island, NewYork) ble blandet med ca. 2,6 x 10<7>sP2/0-Ag14 myelom celler i 4,7 ml DME. De kombinerte celler ble sentrifugert og supenatanten fjernet hvoretter 1 ml 35% PEG 1000 og 5% DMSO i RPMI 1640 medium fra Gibco ble tilsatt under blanding. Denne tilsetning ble fulgt av tilsetning av to suksessive mengder DME på 1 ml og 2 ml under omrøring, fulgt av tilsetning av en 4 ml og en 8 ml mengde HT medium (dette HT medium omfattet 68 mg hypxantin og 36,5 mg thymidin i 500 ml DME). Etter denne suksessive tilsetning og blandetrinnene ble det hele sentrifugert, supernatanten ble fjernet og den resulterende pellet av celler ble resuspendert i 40 ml HT medium og inkubert over natt.

B. Seleksjon og dyrking av hybridomer.

Etter cellefusjon dyrkes cellene i HT medium ved 37°C med 6%

<c>°2i en 100% fuktig atmosfære. Den følgende dag ble de suspenderte celler fortynnet til 400 ml med HAT medium og 1 ml av denne oppløsning ble anbragt i hver brønn i en seie mikrotiter plater. Platene ble inkubert ytterligere ved 37°C og 6% C02og 100% fuktighet i ca. 2 uker.

Supernatanter over kulturer inneholdende hybridomer ble underkastet en preliminær bedømmelse for å bestemme deres reaktivitet på human Clq antigen som opprinnelig ble benyttet for å immunisere mus ved fremstillingen av hybridomene. En ELISA analyse ble gjennomført ved å bringe human Clq på overflaten av brønner av mikrotiter plater fulgt av tilsetning av supernatantprøvene. Etter fjerning av den ikke-omsatte supernatant ble nærværet av anti-Clq antistoff detektert ved bruk av kanin antimuse IgG merket med pepperrot peroksydase enzym (Miles-Yeda). Hybridomene som fremstilte antistoffer som reagerte med human Clq ble dyrket videre og klonet for ytterligere bedømmelse.

De spesielle hybridomer som skulle bedømmes ytterligere ble injisert i mus for å fremstille ascit fluid og de resulterende ascit fluider ble renset ved føring over en protein A kolonne for å isolere IgG fraksjonen. Denne IgG fraksjon ble fortynnet i en karbonatbuffer (1,59 g Na2C0 2,933 g NaHCO^pg 0,2 g NaN3kvantum satis en liter med vann) til en konsentrasjon på 50 mg/ml. En 0,2 ml prøve ble tilsatt til hver brønn av en Dynatech substrat plate hvoretter platen ble dekket tett med parafilm og inkubert ved 2 - 8°C i 16 til 22 timer. Etter denne inkubering ble fluidet i hver brønn fjernet og brønnene vasket tre ganger med BPS-Tween

(<8,>0 g NaCl, 0,2 g KH2<p>04f2,9 g Na2HP04.12 H2O, 0,2g KC1 og 0,5 ml "Tween 20" fortynnet i vann til en liter oppløsning).

Antistoffene ble bedømt ved å benytte et humanserum kjent å inneholde immunkomplekser. Dette serum ble fortynnet i 1:5 ved tilsetning av 4 volumer PBS Tween til et volumserm. En 0,2 ml mengde av det fortynnede serm ble tilsatt til hver brønn inneholdende prøveantistoff og disse ble så tett dekket med parafilm og inkubert 60 min. ved 37°C. Etter inkuberingen ble fluidet i hver brønn fjernet og brønnene vasket tre ganger med PBS Tween. Kanin antimuse IgG/pepperrot peroksydase konjugat (Miles-Yeda) ble fortynnet med 1:10.000 med PBS Tween og en 0,2 ml mengde av dete fortynnede konjugat ble tilsatt til hver belagte brønn. Etter ytterligere 60 minutters inkubering ved 15 til 25"C i mørke ble fluidet i hver brønn fjernet og hver brønn ble vasket tre ganger med PBS Tween. Til slutt ble nærværet og mengden anzym merket antistoff i hver brønn detektert ved tilsetning av peroksid substrat og bestemmelse av intensiteten av den oppnådde farve.

Av de omtrent 35 hybridomer som var positive ved den første bedømmelse var 5 akseptabelt positive og selektive mot Clq holdige komplekser. To av disse (kalt 4A4B11 og 12A5B7) var de beste og ble valgt for anvendelse ved fremstilling av prøvesett.

EKSEMPEL III

Fremstilling av prtivesett.

Ascetfluid fra hybridomene 12A5B7 og 4A4B11 ble renswt på protein A kolonner som beskrevet tidligere. Den oppnådde protein fraksjon ble fortynnet i den tidligere beskrevne karbonat buffer til en konsentrasjon på 50 ug/ ml og en mengde på 0,2 ml ble tilsatt til hver brønn på en Dynatec substratplate. Etter dette ble platen tett tildekket med parafilm og inkubert ved 2- 8°Ci 16- 22 timer. Etter inkuberingen ble fluidet i hver brønn fjernet og brønnene vasket tre ganger med den tidligere beskrevne PBS Tween.

Disse brønner belagt med spesifikt anti-Clq monoklont antistoff utgjør den faste fase som skal benyttes i det her beskrevne prøvesett.

De andre bestanddeler av settet er antihuman IgG/enzym konjugate, PBS-Tween oppløsningen, substratet for enzymet samt kontrollene. Disse andre materialer inkluderes generelt i et sett for standardiseringen og hensiktsmessig-hetens skyld. Kontrollsubstansene som benyttes i det angjeldende prøvesett er humanserum hvortil forskjellige mengder lyofilisert varmeaggregert IgG er tilsatt.

Sett komponenter.

Typiske sett komponenter i den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsen er de følgende: 6 mikrotiteringsplater med 96 brønner pr. plate, belagt med monoklont antistoff (Murin) mot human Clq; inneholdende 0,02% timerozal; 6 pakker fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) i krystallinsk form; hver pakke inneholder 8 g NaCl, 0,2 g KH2<p>o4,1,16g<Na>2HP04, 0,2 g KC1, og 0,2 g timerosal;

i ampulle polysorbat 20 - polyoksyetylen sorbitan monolau-rat, Sigma;

1 ampulle konjugat konsentrat - monoklont anti-human IgG (murin) konjugert til pepperrot peroksydase; inneholdende

0,02% timerosal og 0,005% gentamicin sulfat. Konfigurasjon-en oppnås ved fremgangsmåten i henhold til Nakane, et al. J. Histochem and Cytol., 22, 1084-1974. En typisk titer av ascit mot human IgG er 8 x 10^. Det resulterende materale fortynnes med fetal kalveserum for derved å oppnå et materiale med følgende egenskaper; A 492 med 150 mg/ml HAG < 1.5; r<2>>0,95; helling > 0,5 og y-skjæring < 0,04. En typisk fortynning er 1:100 for å oppnå konjugat konsentratet ;

2 ampuller o-fenyldiamin . 2 HC1 (0PD) tabletter; hver

tablett inneholdende tilstrekkelig 0PD og buffer slik at 100 ml av substrat oppløsningen inneholder 26,5 mg sitronsyre,

73,0 mg Na2H<p>Q4f<Qg>35Q mg av QpD

1 ampulle 3% hydrogen peoksyd inneholdende N-fenylacetamid; 2 ampuller høy normal kontroll (human serum til hvilket det er satt lyofilisert varmeaggregert IgG; 2 ampuller lavabnorm kontroll (human serum til hvilket det er satt lyofilisert varmeaggregert IgG) 2 ampuller høyabnorm kontroll (human seum til hvilket det er satt lyofilisert varmeaggregert IgG).

EKSEMPEL IV

OPPSUMMERING AV PRØVEPROSEDYREN.

A. Prøvesamling.

Det er ikke nødvendig med noen spesiell preparering

av individene før prøvesamling. Fullblodprøven bør samles ved aksepterte medisinske teknikker. Prøven tillates agglomerering i minst to timer ved romtemperatur, 20 - 30°C, før serum fjernes.

B. Fremstilling av reagenser

1. Fremstilling av PBS- Polvsorbat: Innholdet av 1 pakke PBS oppløses fullstendig i 1 1 glassdestillert eller -deionisert vann. 0,5 ml polysorbat 20 tilsettes og det hele blandes. PBS polysorbat er stabil i 1 måned lagret ved romtemperatur. 2. Fremstilling av konju<g>at: Engangsglass eller plast benyttes. Konjugat konsentratet må fortynnes med PBS polysorbat før bruk. For et typisk fortynningsforhold på 1:50 tilsettes 0,4 ml konjugat konsentrat til 19,6 ml PBS polysorbat. Et volum på 20 ml er nødvendig for en mikrotit-reringsplate. Konjugatet bør fremstilles akkurat før bruk og bør brukes i løpet av 30 minutter. 3. Fremstilling av substrat: Engangsglass eller -plast benyttes. a. Åtte 0PD tabletter oppløses i 24 ml glass-destillert eller deionisert vann. Man tillater tablettene oppløsning i ca. 10 min. En mengdeblander kan benyttes for enkel oppløsning av tablettene. b. Akkurat før bruk tilsettes 100 ul hydrogenpeoksyd og det hele blandes. Dette volum er tilstrekkelig for 1 mikrotit-reringsplate. Substratet er stabilt i 30 minutter ved romtemperatur i mørke. Substratet bør være klart til meget blekt gult. Hvis det er merkbart gult av farve kasseres det og det fremstilles mere substrat etter behov. 4. Fremstilling av 4N svovelsyre: 1 ml konsentrert, d.v.s. 36N, svovelsyre til 8 ml glassdestillert eller deionisert vann. Syre settes alltid til vann. Aldri omvendt. Dette volum er tilstrekkelig for en mikrotiteringsplate. 5. Rekonstituering av l<y>ofilisert kontroller: En ampulle av hver kontroll rekonstitueres (høy normal kontroll, lav abnorm kontroll og høy abnorm kontroll) ved tilsetning av 0. 5 ml glassdestillert eller deionisert vann til hver ampulle. Vann tilsettes til ampullene og pulveret resuspen-deres forsiktig. De rehydratiserte kontroller tillates henstand ved romtemperatur (20 til 30°C) i 15 minutter før bruk. Forsiktig blanding, ikke heftig. Heftig blanding vil forårsake denaturering av serum IgG og resultere i abnormt høye verdier. Rekonstituerte kontroller kan benyttes for en arbeidsdag. Hver rekonstituert ampulle med kontroll er tilstrekkelig for duplikatbrønner på hver av 5 mikrotitrer-ingsplater hvis de kjøres i løpet av samme arbeidsdag.

C. Prøveprosedvre.

1. Fremstill PBS-polysorbat. Se "Fremstilling av reagenser" 2. Under anvendelse av engangsglassrør fremstilles 1:5 fortynninger av de tre rekonstituerte kontroller og serum-prøvene i PBS polysorbat. Det hele blandes mildt ved inversjon. Rør forsiktig. Eksempel: 0,125 ml kontroll eller serumprøve pluss 0,5 ml PBS polysorbat (tilstrekkelig volum for duplikatprøving). 3. Fjern det beskyttende dekke fra mikrotiteringsplaten belagt med monoklont antistoff (murin) mot human Clq umiddelbart før bruk. 4. Tøm brønnene i mikrotitreringsplatene ved heftig utrusting av innholdet. 5. Mikrotitreringsplatene vaskes (inkludert blanke brønner) tre ganger med PBS-polysorbat. Etter den siste vasking bankes platene forsiktig på absorberende papir for å fjerne overskudd av PBS-polysorbatet. Mikrotitreringsplatene benyttes umiddelbart etter vasking. Man lar ikke kontroll-og prøvebrønner i platen tørke ut. 6. Mikrotitreringsplaten anbringes på toppen av en plate guide. Den første vertikale rekke av brønner til venstre reserveres for blanking av mikrotitreringsplateavleseren. Det henvises til produsentens instruksjoner. Ingen tilset-ninger bortsett fra PBS-polysorbat vaskeoppløsning skjer til denne rekke av brønner inntil substrattilsetningen i prøveprosedyren. 7. Mikrotitreringsplatene merkes for høynormal, lavabnorm, høyabnorm og reagenskontroll i duplikat fulgt av serumprøv-er.

BEMERK: Kontrollene og serumprøver i trinnene 8-10 bør tilsettes til mikrotitreringsplaten i løpet av ti minutter. Pipettespisser bør byttes for hver forskjellig kontroll og hver prøve.

8. 200 ul av hver fortynnede kontroll tilsettes i duplikat til de dertil bestemte brønner. 9. 200 ul PBS-polysorbat tilsettes til duplikat reagenskon-trollbrønnene og de blanke brønner. 10. 200 pl av hver fortynnet serumprøve tilsettes til de dertil bestemte brønner. Serumprøvene bør behandles i duplikat inntil presisjon oppnås av personalet slik at variasjonskoeffisienten mellom duplikater er konsistent mindre enn 10%.

Mikrotitreringsplaten dekkes med et platedeksel og inkuberes i fuktige omgivelser ved 32 - 37°C i 60 minutter.

a. I et 37°C vannbad:

Den dekkede plate skal ikke flyte på vannet men hvile på en nivåbærer i vannbadet. Vannbadet holdes dekket under inkubering. Lufttemperaturen på platenivået bør være 32 - 37°C.

b. I en 37°C luftinkubator:

En beholder med lokk plasseres i inkubatoren. Denne etterlates i inkubatoren for å sikre at temperaturen innvendig er 37°C. Fuktigheten opprettholdes ved å anbringe fuktige papirhåndklær i bunnen av beholderen. Mikrotitreringsplaten anbringes inne i beholderen og lokket oldes på i inkuberingsperioden. 12. Konjugat fremstilles. Det henvises til "fremstilling av reagenser". 13. Mikrotitreringsplaten vaskes (inkludert blanke brønner) tre ganger med PBS-polysorbat ved bruk av ELISA multikanal vaskeflaske. Vaskeprosedyren må være grundig:

a. Tomme brønner ved heftig utrysting av innholdet.

b. Vaskeflasken snus og brønnene spyles grundig med PBS-polysorbat ved kraftig pressing av flasken. c. Fjern PBS-polysorbat ved heftig utrysting av innholdet.

d. Gjenta trinnene 13b og 13c to ganger.

e. Etter ferdig vasking bankes den inverterte plate fast mot et rent papirhåndkle for å fjerne overskudd av PBS-polysorbat .

f. Man går umiddelbart videre til neste trinn.

Hanske bør bæres under vasketrinnene. Husholdningsblekemid-del bør tilsettes til avfallsstoffer før disponering.

BEMERK: Tillat ikke brønnene å tørke ut under prøven. Tørking av brønnene kan resultere i gale høye absorbsjons-verdier. 14. Under anvendelse av en multikanal mikropipette tilsettes 200 pl konjugat til alle brønner bortsettfra til de blanke. 15. Mikrotitreringsplaten dekkes med et platedeksel og platene inkuberes ved romtemperatur i mørke i 60 minutter. 16. Substratet fremstilles 10 minutter før bruk. Substratet bør være klart til meget lett gult av farge. Det henvises til "fremstilling av reagenser". 17. Mikrotitreringsplaten vaskes som beskrevet i trinn 13. Man går umiddelbart videre til neste trinn. 18. Ved bruk av en multikanal mikropipette tilsettes 200 pl substrat til alle brønner inkludert de blanke. 19. Mikrotitreringsplaten anbringes udekket i mørke ved romtemperatur i 30 minutter. 20. Ved bruk av en multikanal mikropipette sprøytes med kraft 50 ul 4N svovelsyre til hver brønn inkludert de blanke. Det er viktig at svovelsyren hurtig spres enhetlig i brønnen for fullstendig å innaktivere enzymet. Resultatet kan avleses opptil en time etter at svovelsyren er tilført hvis platene anbringes i mørke. 21. Mikrotitreringsplateavleseren stilles på bølgelengde 488 til 492 nm og avleseren nullstilles i henhold til produsentens instruksjoner ved å benytte de blanke brønner inneholdende substrat og syre. 22. Farveintensiteten i alle mikrotitreringsbrønner måles.

TOLKING AV RESULTATENE.

A. Prøvekontrollene

1. Reagenskontroll: Den midlere absorbansverdi beregnes for duplikatreagenskontrollen. Den midlere absorbansverdi må være mindre enn 0,05. Hvis den er lik eller større enn 0,05 bør prøven gjentas ved bruk av nyfremstilte reagenser. 2. Normale og abnormale kontroller:Man beregner den midlere absorbansverdi for duplikat høynormal, lav abnormal kontroll. Duplikatene bør ligge innen 20% fra middelverdi-en .

B. Oppretting av standardkurven og bestemmelse av immunkompleks konsentrasjonen i ug/ml HAG ekvivalenter for hvert serum.

1. Grafisk metode

A. De midlere absorbansverdier oppføres for normal, lavabnormal og høyabnormal kontroll mot de tilsvarende ug/ml HAG ekvivalenter på lineært diagrampapir. Typiske ug/ml HAG ekvivalenter er 20 for lavabnormal kontroll, 50 for normal kontroll og 140 for høyabnormal kontroll.

b. En rett linje trekkes for best mulig å passe til de anførte verdier. c. På kurven anbringes punkt tilsvarende absorbansverdien (eller den gjennomsnitlige absorbansverdi hvis duplikater blir gjennomført) for hvert serum og man avleser de tilsvarende ug/ml HAG ekvivalenter. d. Immunkompleks konsentrasjonen angis i ug/ml HAG ekvivalenter som bestemt ovenfor.

2. Beregningsmetoden.

Beregninger kan skje ved hjelp av et antall kalkulatorer utstyrt med lineære regresjonsprogrammer. Produsentens instruksjoner for bruk av disse programmer følges for å opprette standardkurven og immunkomplekskonsentrasjonen i ug/ml HAG ekvivalenter for hver prøve.

C. Tolking av resultatene.

1. Negative resultater.

Resultater fra 0 til 34 ug/ml HAG ekvivalenter kan tolkes som negative for signifikante nivåer av sirkulerende immunkomplekser.

2. Positive resultater.

Resultater på over 35 ug/ml HAG ekvivalenter kan tolkes som positive for signifikante nivåer av sirkulerende immunkomplekser .

EKSEMPEL V

Detektering av sirkulerende immunkomplekser i serum fra pasienter med aktive sykdommer.

Samling av serum.

Fullblodprøver oppnås fra pasienter og tillates koagulering ved omgivelsestemperatur i minst to timer hvoretter serumet sentrifugeres. Det klare serum separeres omhyggelig fra cellulære elementer og holdes i glassrør til prøving. Overskytende serum bringes til 0,5 ml andeler og fryses ved

-70°C for bruk i fremtidig prøving.

Undersøkelse av serumprdvene.

Prosedyren er angitt i Eksempel IV.

Tolkning av data.

A. Absorbsionsavlesninger ( 492nm): Absorbsjonsavlesningene ble oppnådd på en Dynatech Model MR600 mikrotiteringsplate avleser.

B. Standard kurve fremstilling:

En standard kurve ble laget ved bruk av tre varmeaggregerte standarder, se fig. 1.

2. Kurven er lineær fra 25 til 150ug.

C. Bestemmelse av immunkompleks konsentrasjonen i pasient sera: Ved bruk av A492 verdiene for hvert serum ble immunkompleks konsentrasjonen for hver analyserte prøve bestemt til å være følgende: D. Pasientbedømmelse: Immunkompleks konsentrasjonene på over 35 ug/ml HAG er positive for signifikante nivåer av sirkulerende immunkomplekser. Alle pasienter med aktive sykdommer viste seg positive mens de normale viste seg negative.

EKSEMPEL VI

Bruken av angjeldende prøve for detektering av AIDS risiko-gruppen

Clq kompleks prøvesettet som beskrevet i Eksempel III ble benyttet for å bedømme AIDS risikogrupper, både de med AIDS og de som ikke hadde AIDS. Disse gruppe har signifikante konsentrasjoner av sirkulerende immun komplekser i blodet. Denne prøving ble gjennomført sammenlignet med den verseren-de staphylococcus bindeanalyse og Clq bindeanalyse som benyttes for detektering av immunkomplekser.

Resultatene av denne sammenlignende utprøving er vist i Tabell I. Tabellen antyder at foreliggende prøve detekterte 97% av AIDS ofrene mens den også detekterte vesentlige andeler av de forskjellige AIDS risikogruppe som ikke på tidspunktet var bærere av AIDS, slik som homoseksuelle og haitiere. Det var 5% falske positive verdier. Sammenlignet med den kjente teknikk er disse prøver langt overlegne både hva angår detektering av virkelige AIDS ofre og ved detekterng av AIDS risikogrupper.

EKSEMPEL VII

Monoklon antistoff karakterisering.

En SDS polyakrylamid gel elektroforese analyse ble gjennom-ført på monoklone antistoffer fremstilt ved begge hybridomer som her er beskrevet mot et område av lavmolekylvekt standarder. Ved seks-punkt lineær regresjon ble den tunge kjede av hvert antistoff bestemt til 52,384, mens den lette ble bestemt til 26,128.

En elektrofokuseringsanalyse ga følgende resultater:

For 4A4B11 ble antistoff pl observert ved 6,6, 6,5, 6,4 og 6,35; for 12A5B7 ble disse observert ved 6,1, 6,05, 5,95 og 5,9.

Beggeantistof f er ble bestemt til å være I<g>G.]ve(j konvensjo-nelle teknikker.

Som besrkevet ovenfor er det her besrkevne monoklone antistoff brukbart for detektering av nærværet av human Clq holdige komplekser, spesielt i humanserum som inneholder Cl, og overflødiggjør således nødvendigheten av å separere Clq holdige komplekser fra serum før prøving slik det tidligere har vært nødvendig. Det monoklone antistoff kan benyttes i foreliggende metode og prøvesett for detektering av Clq holdige komplekser, spesielt i serm, hvilken detektering er brukbar ved diagnose av sykdommer og i overvåking av behandlingen av slike sykdommer.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes det hybridomer som er istand til å produsere antistoff som reagerer med human Clq men som er idet vesentlige ikke-reaktivt overfor human Cl. Videre tilveiebringes det monoklone antistoff, fremgangsmåter for fremstilling av dette hybridom, metoder for fremstilling av monoklont antistoff og metoder og prøvesett for anvendelse av antistoffet for detekterng av human Clq holdige komplekser.

Selv om kun to hybridomer som produserer to monoklone antistoffer spesifikke for Clq er beskrevet, skal det være klart at oppfinnelsen omfatter alle monoklone antistoffer som viser denne spesifisitet og alle hybridomer som er istand til å produsere slike monoklone antistoffer. Det ble bestemt at angjeldende antistoffer hører til underklassen ^G<->j som er en av fire underklasser for murin IgG. Disse underklasse IgG skiller seg fra hverandre ved de såkalte "fikserte" regioner selv om et antistoff mot et spesifikt antigen eller epitop vil ha såkalte "variabel" region som er funksjonelt identisk uansett hvilken underklasse IgG den hører til. Det vil si at et monoklont antistoff som viser de her beskrevne karakterstika kan være av underklassen<IgG>1, IgG2a, IgG2b eller IgG3eller av klassene IgM, IgA eller andre kjente lg klasser. Differansene mellom disse klasser eller underklasse vil ikke påvirke selektiviteten for det angjeldende antistoff men kan bevirke ytterligere reakjson av antistoffet med andre stoffer slik som (f. eks.) komplement- eller anti-muse antistoffer.

Ved å følge den her gitte beskrivelse kan man lett fremstille andre hybridomer som produserer monoklone antistoffer som selektivt reagerer med Clq. Slike andre hybridomer og monoklone antistoffer ansees for å ligge innenfor oppfinnel-sens ramme, uansett hvorvidt de reagerer med den samme epitop på Clq eller ikke slik de to her beskrevne eksempler på antistoffer gjør.

Inkludert i oppfinnelsen er også fremgangsmåte for fremstilling av monoklone antistoffer som besrkevet ovenfor under anvendelse av den her beskrevne hybridom teknikk. Selv om kun to eksempler på hybridomer er gitt er det ment at fagmannen kan følge immuniserings-, fusjons- og seleksjons-metodene som her beskrives og oppnå andre hybridomer istand til å produsere antistoffer med den beskrevne selektivitet.

Fordi de individuelle hybridomer som fremstilles fra en kjent muse myelom cellelinje og en miltcelle fra en kjent museart ikkekan identifiseres ytterligere bortsett fra referanse til antistoffet som produseres av hybridomet, er det ment at alle hybridomer som produserer antistoff med den ovenfor beskrevne aktivitet er inkludert innenfor oppfinnel-sens ramme på samme måte som fremgangsmåter for fremstilling av antistoffet under anvendelse av hybridomet.

Det er også ment at andre antistoff produserende pattedyr-arter kan benyttes for å generere hybridomer med den her beskrevne spesifisitet. Man kan f. eks. immunisere rotter ved å følge de ovenfor beskrevne teknikker og føye splenocyter sammen med en rotte myelom linje. Teknikker for å gjennomføre slike rotte-rotte fusjoner er velkjente.

De to hybridomer som er beskrevet ovenfor er deponert hos The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive Rockville, Maryland 20852, den 29. juli 1983 og er gitt ATCC nr. HB8327 for hybridom 4A4B11 og ATCC nr. HB8328 for hybridom 12A5B7.

Claims (20)

1. Pattedyr monoklont antistoff som reagerer med human Clq men som er i det vesentlige ikke-reaktivt med human Cl.

2. Antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er muse monoklont antistoff.

3. Muse monoklont antistoff som selektivt reagerer med human Clq holdig kompleks i human serum inneholdende human Cl.

4. Antistoff ifølge krav 3, karakterisert ved at det fremstilles av hybridom ATCC HB8327 eller HB8328.

5. Hybridom istand til å produsere pattedyr monoklont antistoff som reagerer med human Clq men som er i det vesentlige ikke-reaktivt med human Cl.

6. Mus-mus hybridom i stand til å gi et monoklont antistoff som selektivt reagerer med human Clq holdig kompleks i human serum inneholdende human Cl.

7. Hybridom ifølge krav 6, tildannet ved fusjon av celler fra en muse myelom linje og miltceller fra en mus på forhånd immuniset med human Clq.

8. Hybridom ifølge krav 7, karakterisert ved at det er ATCC HB8327 eller HB8328.

9. Fremgangsmåte for detektering eller bestemmelse av et human Clq holdig kompleks i et fluid man tror inneholder nevnte kompleks, karakterisert ved at den omfatter: a) å tilveiebringe et selektivt antihuman Clq monoklont antistoff bundet til en fast fase; b) å bringe en prøve av fluidet i kontakt med den faste fase under betingelser som tillater en immunologisk reaksjon mellom nenvte human Clq holdige kompleks og nevnte anti-human Clq monoklone antistoff; c) å separere ikke-omsatt fluide prøve fra den faste fase; d) å bringe den faste fase i kontakt med et merket andre antistoff istand til å binde til Clq kompleks som kan vær bundettil den faste fase under betingelser som tillater immunologisk reaksjon mellom nevnte andre antistoff og nevnte bundede kompleks; e) å separere ikke-omsatt andre antistoff fra den faste fase; og f) detektering eller bestemmelse av nevnte merkelapp på enten nevnte faste fase eller det ikke-omsatte andre antistoff og relatering av detekteringen eller bestemmelsen til nærværet eller mengden av Clq holdig kompleks i den flytende prøve.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at fluidet er humanserum inneholdende nativ Cl.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det andre antistoff er ikke-human anti-human IgG.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at merkelappen er en radioisotop, et enzym eller en fluorokrom.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at det selektive anti-human Clq monoklone antistoff er valgt blant de som produseres av hybridomeneATCC HB8327 og HB8328.

14. Prøvesett for detektering av human Clq holdige komplekser, karakterisert ved at de omfatter: a) en fast fase med selektivt anti-human Clq monoklont antistoff festet dertil; og b) et merket andre antistoff istand til binding til nevnte Clq holdige kompleks når nevnte kompleks er bundet til antistoffet på den faste fase.

15. Sett ifølge krav 14, karakterisert ved at den faste fase er en brønn i en mikrotiter plate.

16. Sett ifølge krav 14, karakterisert ved at den selektive anti-human Clq monoklon er valgt blant antistoffer fremstilt av hybridomer ATCC HB8327 og HB8328.

17. Sett ifølge krav 14, karakterisert ved at det merkede andre antistoff er ikke-human anti-human IgG.

18. Sett ifølge krav 14, karakterisert ved at merkelappen på det merkede andre antistoffer vlagt blant radioisotoper, enzymer og fluorokromer.

19. Sett ifølge krav 14, karakterisert ved at det videre omfatter midler for deteketering avmerkelappen på nevnte andre antisoff.

20. Sett ifølge krav 14, karakterisert v e d at merkelappen på det andre antistoff er et enzym og som ytterligere inkluderer et substrat for enzymet, hvilket substrat forandrer farve ved påvirkning av enzymet.