JPH0731195B2 - 血清中の免疫複合体を検出する方法 - Google Patents

血清中の免疫複合体を検出する方法

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JPH0731195B2 JP59504118A JP50411884A JPH0731195B2 JP H0731195 B2 JPH0731195 B2 JP H0731195B2 JP 59504118 A JP59504118 A JP 59504118A JP 50411884 A JP50411884 A JP 50411884A JP H0731195 B2 JPH0731195 B2 JP H0731195B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般に循環する免疫複合体（immune comple
x）を検出する方法およびこれらの方法において有用な
試薬に関し、さらに詳しくはC1を含有するヒト血清中の
ヒトC1q含有複合体を検出する方法、この方法を実施す
るための試験キツト、C1の存在下にC1qと選択的に反応
するモノクローナル抗体を生産する雑種細胞系統、およ
びそのように生産されたモノクローナル抗体に関する。
発明の背景 免疫複合体は、病原体および他の異質物質に対する正常
の免疫防御機構の一部として抗原と抗体との間で血液流
中において形成される。これらの免疫複合体は、異質抗
体の排除または中和および宿主の保護を許す。しかしな
がら、ある環境下で、これらの免疫複合体はそれら自体
宿主への障害を起こす。これらの循環する免疫複合体は
多数の病気、ことに自己免疫病、例えば、リウマチ様関
節炎、全身の紅斑性狼瘡（systemic lupus erythematho
sis）（SLE）など；癌、例えば、白血病および卵巣癌；
および多数の感染病に関連がある。とくに自己免疫病に
おいて、病気の診断およびその処置の監視において循環
する免疫複合体を検出することが有用である。例えば、
次の文献を参照:A.N.テオフィロポウロス（Theofilopou
los）およびF.J.ディキソン（Dixon），アドバンシズ・
イン・イムノロジー（Advances in Immunology）,Vol.2
8,89−220ページ（1979）およびS.E.リッツマン（Ritzm
ann）およびJ.C.ダニエルス（Daniels），クリニカラ・
ケミストリー（C1inical Chemistry）,Vol.28,1259−12
71ページ（1982）。
循環免疫複合体のレベルの検出および監視においけるこ
の関心のため、多数の試験がこれらの複合体の検出のた
めに記載された。これらの先行技術は一般に次に基づい
ている:a）これらの複合体中に含有されるエピトープの
検出、ｂ）これらの複合体とそれらへ結合できる放射線
標識試薬との反応性、またはｃ）組織または細胞の中に
見出される特別の受容体への免疫複合体の結合。これら
の試験を記載する広範な技術が存在する。
しかしながら、これらの先駆技術の試験は、検出すべき
推定上の免疫複合体をヒト血清から単離することを必要
とした。なぜなら、血清中に試験において交差反応し、
こうして免疫複合体の検出を妨害する他の物質が存在す
るからである。血清からの免疫複合体のこの単離は、一
般に、沈殿（例えば、ポリエチレングリコールを使用す
る）により、あるいは固相カラムにより達成された。
試験の実施前に、循環免疫複合体を血清から単離するこ
との必要性は、困難であり、経費を要し、そして時間を
要する。血清の免疫複合体の検出を可能とすることによ
り、血清からの免疫複合体の単離の必要性を排除する方
法は非常に有利であろう。このような検出は免疫複合体
の検定を実施する時間をかなり節約し、単離工程の間に
導入される先行技術の試験における誤差（例えば、免疫
複合体の不完全な単離または回収）を排除し、そして単
離の間における免疫複合体の変性により導入される誤差
を排除するであろう。
免疫複合体中に存在するほとんどの抗体はその分子のFc
部分上に補体の成分と反応する部位を有する。補体系は
抗体を結合して有する物質が宿主の免疫系により破壊さ
れる反応の複雑な系列の部分である。これらの補体成分
は頭文字Ｃで始まる文字および数の略号により識別され
る。とくに興味ある１つは第１補体（C1）であり、これ
自体はC1q、C1rおよびC1sと表示されるサブユニットか
ら構成されている。前述のFc部位と反応するにはC1のC1
qサブユニットである。
免疫複合体を検出する先行技術の１つは、結合したC1q
（すなわち、免疫複合体中の抗体のFc部位へ取り付けら
れたC1q）に依存した。しかしながら、血清の存在下に
おいてこのような試験を達成するための困難は、結合C1
qと反応した先行技術の物質がまたC1（C1qを含有する）
と反応するということである。この血清C1は化合物へ結
合したC1qに比較して大きく過剰であるので、従来血清
中でC1qの検出を実施することは不可能であった。
1975年におけるコーラー（Kohler）およびマイルシュタ
イン（Milstein）の独創的な研究以来、非常な努力がい
わゆるモノクローナル抗体を生産する種々のハイブリド
ーマの生産に向けられてきた。これらのモノクローナル
抗体はきわめて有用な物質である。なぜなら、実験動物
の伝統的な免疫化および採血から得られるいわゆるポリ
クローナル抗体と反対に、それらは単一の特異性を有す
るからである。
この分野における研究は、ハイブリドーマからモノクロ
ーナル抗体を生産するための試みの報酬および複雑さを
同時に示した。一般的技術は概念的によく理解されてい
るが、各特定の場合について多くの困難に直面しかつ変
動が要求される。事実、所定のハイブリドーマを調製し
ようと試みる前に、所望のハイブリドーマが得られるこ
と、それが得られた場合それが抗体を生産すること、あ
るいはそのように生産された抗体が所望の特異性をもつ
ことについての保証が存在しない。成功の度合は主とし
て用いる抗原の型および所望のハイブリドーマを単離す
るために使用する技術の選択により影響を受ける。
最近、M.D.ゴラン（Golan）および共同研究者はコーラ
ーおよびマイルシュタイの技術を使用してC1qに対する
種々のモノクローナル抗体を生産し、そしてこれらの抗
体を使用してC1qにおけるコンフォメーションの変化を
研究した。彼らはこの研究をジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Journal of Immnology）,Vol.192,445−447（1
982年８月号）に報告した。これらの抗体は、抗原とし
て免疫複合体へ結合したC1qをマウスに注入し、これら
のマウスからの脾細胞をマウスの骨髄腫細胞と融合し、
生ずるハイブリドーマを培養し、そしてそれらをウサギ
抗ヒトC1qを介して固相へ取り付けたヒトC1qに対してス
クリーニングすることにっよって生産された。これらの
抗体は種々の抗原と反応したが、それらのすべては天然
血清C1と反応した。抗体の多くはまた流体相のC1qと反
応した。しかしながら、これらの抗体は一般に免疫複合
体へ結合したC1qとの反応性に劣った。
著者らは「これらの抗体は免疫複合体へのC1qの結合が
新しい抗原決定因子を露出することを証明する」と結論
した。C1qが免疫複合体へ結合したとき、それらの抗体
との反応性が損失されるので、彼らはこの結論に達成し
た。この参考書中に開示されている抗体は、免疫複合体
へ結合したC1qの検出による血清中の免疫複合体ついて
の試験のために有用でないであろう。なぜなら、天然C1
はいかなる結果をも不明瞭にすることが明らかであるか
らである。事実、この文献はモノクローナル抗体の技術
が一般に免疫複合体の特定の検出に有用でないであろう
ことを示唆しているように思われる。
天然血清C1において表示されない免疫複合体へ結合した
C1qに特徴的な独特のエピトープに向けられたモノクロ
ーナル抗体を使用して、血清中の免疫複合体についての
特定の試験を案出することが今回発見された。
発明の要約 １つの面において、本発明は、ヒトC1qと反応するが、
ヒトC1と実質的に非反応性である新規な哺乳動物のモノ
クローナル抗体を生産することができる新規なハイブリ
ドーマ、およびそれにより生産されたモノクローナル抗
体からなる。主題のモノクローナル抗体はヒトC1q含有
複合体とヒトC1の存在下に選択的に反応し、こうしてヒ
トC1を含有する人間の血清中のC1qを含有する免疫複合
体を検出するために使用することができる。マウスのモ
ノクローナル抗体を生産するマウス−マウスハイブリド
ーマは好ましい。
他の面において、本発明は流体中のヒトC1q含有複合体
を検出または決定する方法および試験キットからなる。
この方法によると、天然の血清C1を含有する人間の血清
中の複合体を検出することができる。この方法は、工
程、 ａ）固相へ取り付けられた選択的抗ヒトC1qモノクロー
ナル抗体を準備し、 ｂ）前記流体の試料を前記固相と接触させ、前記接触は
前記ヒトC1q含有複合体と前記抗ヒトC1qモノクローナル
抗体との間の反応を許す条件下に実施し、 ｃ）未反応の流体試料を前記固相から分離し、 ｄ）前記固相を標識第２抗体と接触させ、前記第２抗体
はC1q複合体へ結合することでき、前記C1q複合体は前記
固相へ結合することができ、前記接触は前記第２抗体と
前記結合複合体との間の免疫学的反応を許す条件下に実
施し、 ｅ）未反応の第２抗体を前記固相から分離し、そして ｆ）前記固相または前記未反応の第２抗体のいずれかの
上の前記標識を検出または決定し、そして前記検出また
は決定を前記流体試料中のC1q含有複合体の存在または
量に関係づける、 からなる。
この流体は便利には人間の血清であるが、この方法はま
た他の流体中のヒトC1q含有複合体を検出または決定す
るために同様によく使用することができる。
ヒトC1q含有複合体を検出する本発明の試験キットは、
選択的抗ヒトC1qモノクローナル抗体を取り付けて有す
る固相成分、およびヒトC1q含有複合体が前記固相上の
前記抗体へ結合されたとき、前記C1q含有複合体へ結合
することができるある量の標識第２抗体からなる。
「ヒトC1と実質的に非反応性」および「ヒトC1qと選択
的に反応する」は、C1q含有免疫複合体を検出するモノ
クローナル抗体の能力が人間の血清中のヒトC1または他
の物質の存在により悪影響を受けないことを意味する。
図面の簡単な説明 第１図は本発明の方法の実施に用いる標準曲線を表わ
す。
発明の詳細な説明 主題のハイブリドーマは次の工程のより調製した： A.ヒトC1qでマウスを免疫化する。Balb/c雌マウスをこ
こで使用したが、他のマウスの系統あるいは、事実、ラ
ットまたはウザギのような他の動物を使用できることが
考えられる。免疫化のスケジュールおよびC1q抗原の濃
度は有用な量の適当にプライミングされた（primed）脾
細胞を生産するようなものであるべきである。最初に50
μｇのC1qで皮下的に免疫化し、次いで５回の注入の超
免疫化は有効であることがわかった。ヒトC1qはここで
免疫原として便利に使用されたが、C1q特異性抗原また
はエピトープ（単離された抗原を包含する）を使用でき
ることが考えられる。
Ｂ、免疫化した動物から脾を取り出し、そして適当な媒
質中の脾懸濁液をつくる。
Ｃ、懸濁した脾細胞を適当な細胞系統からの骨髄腫細胞
と、適当な融合促進剤の使用により融合する。もちろ
ん、選択する骨髄腫細胞は脾細胞と適合性であるべきで
あり、そして好ましくは同一の種であるべきである。ネ
ズミの細胞系統Sp2/0−AG14［ネイチャー（Nature）,Vo
l.276,269−270ページ,1978に記載されている］はここ
で使用するマウスの脾細胞とともに使用するのに有効で
あることがわかったが、他の骨髄腫細胞を使用できるこ
とが考えられる。多くの骨髄腫細胞系統（マスおよび他
の動物の）が知られており、そして、一般に、学会のメ
ンバーあるいは種々の保管所、例えば、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（American T
ype Culture Collection,Rockville,Maryland）、およ
びソーク・インスチチュート・セル・ディストリビュー
ション・センター（Salk Institute Cell Distribution
Center,La Jolla,California）から入手可能である。
使用する骨髄腫細胞系統は好ましくはいわゆる「薬物抵
抗性」型であって、融合しない骨髄腫細胞は選択した媒
質中で生存せず、一方雑種（hybrid）が生存するような
ものであるべきである。このような薬物抵抗性の骨髄腫
の最も普通のクラスは８−アザグアニン抵抗性の細胞系
統であり、これは酵素のハイポキサンチングアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼの欠け、それゆえHAT
（ハイポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジ
ン）媒質中で生存することができない。また、使用する
骨髄腫細胞系統はそれ自体抗体を生産しないいわゆる
「非分泌（non−secreting）」型であることが好ましい
が、分泌型を使用することができる。ここで使用する骨
髄腫はこのような非分泌型である。細胞の好ましい比は
約５比細胞対骨髄腫細胞である。主題のハイブリドーマ
の調製において使用する融合促進剤は約1000の分子量を
有するポリエチレングリコール（PEG1000として商業的
に入手可能である）であったが、他のポリエチレングリ
コールおよびこの分野において既知の他の融合促進剤を
有利に使用することができる。
Ｄ、融合しない骨髄腫細胞の生長を支持しない選択した
媒質中で、融合しない脾細胞、融合しない骨髄腫細胞お
よび融合した細胞の混合物を希釈しかつすべての融合し
ない細胞を死亡させるために十分な時間培養する（約１
週間）。この媒質は薬物抵抗性（例えば、８−アザグア
ニジン抵抗性）の融合しない骨髄腫細胞を支持しないも
の（例えば、HAT媒質）である。それゆえ、これらの融
合しない骨髄腫細胞は死ぬ。融合しない脾細胞は悪性で
はないので、有限の数の世代を有するだけでありそして
（ある期間後）繁殖することができない。他方におい
て、融合した細胞は、骨髄腫の親により寄与される悪性
の品質および脾細胞の親により寄与される選択媒質中の
生存に必要な酵素を有するので、繁殖を続ける。
Ｅ、ハイブリドーマを含有する各容器［ウェル（wel
l）］内の上澄みをヒトC1qに対する抗体の存在について
（第１工程として）次いでヒトC1q複合体に対する抗体
の存在について評価する。
Ｆ、所望の抗体を生産するハイブリドーマを選択する。
この選択は、例えば、希釈を制限することにより実施す
ることができ、ここで希釈剤の体積を統計的に計算して
各別々の容器［例えば、マイクロターター・プレート
（microtiter plate）のウェル］内のある数の細胞（例
えば、１〜４）を単離する。このようにして、個々のハ
イブリドーマをさらにクローニングするために単離する
ことができる。
いったん所望のハイブリドーマが選択される（かつ必要
に応じてクローニングされる）と、生ずる抗体を２つの
方法のうちの１つで生産することができる。
最も純粋な抗体は、適当な媒質中で所望のハイブリドー
マを適当な期間の間生体外で培養し、次いで上澄み液か
ら抗体を回収することにより生産される。適当な培地お
よび適当な培養時間は知られているか、あるいは容易に
決定される。この生体外の技術は、他の特異的抗ヒト免
疫グロブリンを本質的に含まない、本質的に単一特異的
なモノクローナル抗体を生産する。培地は異種間血清
（例えば、ウシ胎児血清）を含有するので、少量の他の
免疫グロブリンは存在する。しかしながら、この生体外
方法により生産されるモノクローナル抗体の濃度はわず
かに約50ミクログラム/mlであるので、この方法はある
目的に対して十分な量または濃度の抗体を生産しないこ
とがある。
非常の大きい濃度および量のモノクローナル抗体を生産
するために、所望のハイブリドーマをハイブリドーマの
調製に使用した動物と同一の種の宿主動物、好ましくは
シンジェニック（syngenic）または準シンジェニック
（semi−syngenic）動物に注入することができる。マウ
スを本発明において使用した。この注入は好ましくは宿
主の腹膜中にする。ハイブリドーマは適当な潜伏時間後
に抗体生産性腫瘍を形成させ、宿主の血液流および腹膜
の滲出液（腹水）中に非常に高い濃度の所望の抗体（約
５〜20mg/ml）を生成する。これらの宿主はまたそれら
の血液および腹水中に正常の抗体を有するが、これらの
正常の抗体の濃度は所望のモノクローナル抗体の濃度の
わずかに約５％である。その上、これらの正常の抗体は
それらの特異性において抗ヒトではないので、収穫した
腹水からあるいは血清から得られたモノクローナル抗体
は汚染性の抗ヒト免疫グロブリンを本質的に含まない。
このモノクローナル抗体は通常高い力価をもち（1:100,
000以上に高い希釈度において活性であり）かつ高い特
異性対非特異性の比（約1/20）を有する。
主題の方法の実施において、特異性抗C1qIgGを前述のよ
うに生産された腹水流体から、この流体をプロテインＡ
を取り付けて有するクロマトグラフィーのカラムに通す
ことによって単離する。プロテインＡ［これはファーマ
シア・インコーポレーテッド（Pharmacia Incorporate
d,Pscataway.New Jersey）］は、ブドウ球菌（Staphylo
coccus）のある種の表面上に見出され、IgG分子のFc部
分へ付着し、こうして汚染物質からのIgGの分離を可能
とする。
IgG分画は固体表面、例えば、ポリスチレンのマイクロ
タイター・プレートの表面上え吸着されて、主題の方法
において必要な固相を形成する。固体表面上へ抗体を被
覆する技術はこの分野においてよく知られている。
この抗体被覆されたマイクロタイター・プレートのウェ
ルへ、試験すべき血清の試料、好ましくは緩衝液中に希
釈して、添加する。ウェルを好ましくはインキュベーシ
ョンして完全な免疫学的反応を起こさせるが、このよう
なインキュベーションは試験法の操作にとって必須では
ない。インキュベーションに引き続いて、各ウェル中の
流体を除去し、そしてウェルを洗浄して残留する未反応
の血清を除去する。
ウェル上へ被覆されたC1q複合体の存在について検出す
るために、酵素、例えば、セイヨウワサビのペルオキシ
ターゼで標識付けした抗ヒトIgG免疫グロブリン（便利
にはウサギ免疫グロブリン）を使用することが好まし
い。抗ヒトIgGは結合して免疫複合体の検出にとくに有
用である。なぜなら、それは複合体がマイクロタイター
・プレートのウェルへ取り付けられるものと異なる、免
疫複合体上に見出される抗原性部位へ付着するからであ
る。酵素を抗体へ取り付ける方法はこの分野においてよ
く知られている。酵素は免疫複合体の検出に好ましい標
識であるが、他の標識、例えば、放射性同位元素または
蛍光色素を使用することができる。その上、抗ヒト免疫
グロブリンが好ましい検出体であるが、C1q複合体へ結
合する他の物質を使用することができる。検出体は、例
えば、補体成分、例えば、C4b、C3bなど、あるいは免疫
複合体中に見出される抗原性物質、例えば、DMA、肝炎
Ｂ抗原などに対する抗体であることができるであろう。
被覆されたウェルへ酵素標識ウサギ抗ヒトIgGを添加し
た後、マイクロタイター・プレートを好ましくはインキ
ュベーションして免疫学的反応を完結させるが、このよ
うなインキュベーションは必須ではない。インキュベー
ション後、未反応の第２抗体を除去し、そしてウェルを
洗浄して残留する第２抗体を除去する。結合した酵素の
標識を次いで適当な基質の添加により検出することがで
き、ここで基質はセイヨウワサビのペルオキシターゼの
場合においてｏ−フェニレンジアミンである。標識付け
第２抗体の存在、こうしてC1q複合体の存在は基質にお
ける色の変化により指示される。この試験は単に定性的
（すなわち、着色または非着色）であるか、あるいは定
量的であることができる。なぜなら、各ウェルにおける
色の発現は固相へ結合した標識付け第２抗体の量に比例
するからである。色濃度と血清中のC1q複合体濃度の間
の関係は、この方法を変化する濃度の既知の物質につい
て実施することにより作られた標準曲線から決定でき
る。第２抗体上の標識が酵素ではないとき、適当な決定
手段（例えば、放射性同位元素についてシンチレーショ
ン・カウンターまたは蛍光色素について蛍光検出装置）
を使用することができる。
主題の試験キットは、選択的抗ヒトClq抗体を取り付け
て有する適当な固相表面（例えば、微小力価のウェル、
ビーズなど）と、ヒトC1q含有複合体が固相上の抗体へ
結合されたとき、C1q含有複合体へ結合することができ
る標識付け第２抗体とからなる。この試験キットは、ま
た、第２抗体上の標識を検出する手段（例えば、酵素の
標識を使用した場合、酵素の基質）、ならびに主題の方
法を実施するために使用する他の物質を含むことができ
る。
上の方法は結合されたC1q含有複合体の測度として結合
された標識第２抗体の検出を用いて説明したが、結合し
ない第２抗体の量を第２抗体の量に関して決定するこ
と、および結合したC1q含有複合体の存在を検出するこ
と、あるいは結合したC1q含有複合体の量をその計算か
ら決定することが等しく可能であることが理解されるで
あろう。
次の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実
施例は本発明を例示するために提供され、本発明の範囲
を限定するものではない。
実施例Ｉ 正常のヒトの血清からのC1qの調製 Ａ、緩衝液（１リットルの各緩衝液を調製するための説
明書が含まれいる）。
１、0.03モルのエチレングリコール−ビス（β−アミノ
エチルエーテル）N,N′−四酢酸［EGTA シグマ（Sigm
a）］pH7.5。導電性2.0×10-3モー（1.95×10-3〜2.05
×10-3モーの範囲）、０℃において。
800mlの水中に11.41gのEGTAを溶解する。4.5mlの50％の
NaOHを添加してEGTAを溶解する。
溶解したとき、＋４℃に冷却し、そして50％のNaOHの滴
下により最終のpH調節を行い、次いで十分な量の蒸留水
を添加して1000mlにする。
２、0.069モルのエチレンジアミノ四酢酸（EDTA）、二
ナトリウム塩（シグマ）pH5.0。導電性3.9×10-3モー
（3.85×10-3〜3.95×10-3モーの範囲）、０℃におい
て。
800mlの水中に23.20gのEDTAを溶解する。溶解したと
き、＋５℃に冷却し、そして50％のNaOHでpHを調節す
る。十分な量の蒸留水を添加して1000mlにする。
３、0.04モルのEDTA、二ナトリウム塩（シグマ）pH7.
5。導電性3.7×10-3モー（3.65×10-3〜3.75×10-3モー
の範囲）、０℃において。
800mlの水中に13.45gのEDTAを溶解する。溶解したと
き、＋５℃に冷却し、そして50％のNaOH（ほぼ2.5ml）
でpHを調節する。十分な量の蒸留水を添加して1000mlに
する。
４、0.2モルの酢酸ナトリウム緩衝液pH5.0、0.75モルの
NaClおよび0.01モルのEDTAを含有する。
2.73gの酢酸ナトリウム;43.83gのNaClおよび3.3gのEDTA
を800mlの蒸留水中に溶解する。pHを1.0モルの酢酸で調
節する。十分な量の蒸留水を添加して1000mlにする。
５、0.005モルのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5、0.75モ
ルのNaClおよび0.01モルのEDTAを含有する。
1.13gのNa2HPO4;0.0220gのNaH2PO4・H2O;43.3gのNaClお
よび3.36gのEDTAを800mlの蒸留水中に溶解する。pHを検
査する。必要に応じて、1.0モルのNaOHまたは1.0モルの
HClで調節する。十分な量の蒸留水を添加して1000mlに
する。
６、リン酸ナトリウム0.2モルを取って置く。
ａ、27.6gのNaH2PO4・H2Oを蒸留水中に溶解し、そして
十分な量の蒸留水を添加して1000mlにする。
ｂ、28.39gのNa2HPO4を蒸留水中に溶解し、そして十分
な量の蒸留水を添加して1000mlにする。
７、0.005モルのリン酸塩緩衝液pH7.4、0.65モルのNaCl
および0.01モルのEDTAを含有する。
37.99gのNaClおよび0.336gのEDTAをほぼ500mlの蒸留水
中に溶解する。20.75mlの0.2モルのNa2HPO4（上の試薬
６、ｂ）および4.25mlの0.2モルのNa2HPO4（上の試薬
６、ａ）を添加する。pHを１モルのNaOHまたは１モルの
HClで必要に応じて調節し、そして十分な量の蒸留水を
添加して1000mlにする。使用前に少なくとも30分間減圧
下に脱気する。
８、0.005モルのリン酸塩緩衝液pH7.4、0.65モルのNaC
l、0.01モルのEDTAおよび0.2％のナトリウムアジドを含
有する。
1000mlの緩衝液、上の＃７、中に3gのナトリウムアジド
を溶解する。
Ｂ、正常のヒトの血清の収集および調製。
ABO型の供与者からの全血を抗凝固剤を含まない管の中
に抜き出す。個々の供与者からの血液は分画化（fracti
onation）の開始まで別々に保持すべきである。血液は
室温において60分間、次いで＋５℃において２時間凝固
させる。血清を＋５℃においてほぼ3000×ｇにおける遠
心により分離する。血清を20,000×ｇにおいて60分間再
遠心し、そして遊離の脂質を吸引により除去する。血清
を直ちに使用しない場合、それを凍結して保存すべきで
ある。
Ｃ、血清の分画化 １、すべての工程は５℃において実施する。種々の供与
者からの血清をプールし、そして合計の容積を記録す
る。次いで、それをスペクトレイパー（Spectrapor）＃
１透析管（23mmの均一な直径、6000〜8000の分子量のカ
ットオフ）に移し、そして緩衝液＃１に対して４時間＋
５℃において透析する。緩衝液を新しい溶液で置換し、
そして透析を16時間上のように続ける。これらの２つの
工程のための緩衝液対血清の比は次の通りである。工程
１−800mlの緩衝液/100mlの血清。工程２−2400mlの緩
衝液/100mlの血清。透析後、不溶性物質（沈殿＃１）を
ほぼ300×ｇにおける遠心により除去する。上澄み液を
デカンテーションし、そして廃棄する。沈殿を新しい透
析緩衝液（＃１）で沈殿を再懸濁させないように注意し
ながら洗浄する。洗浄は出発血清とほぼ同一体積で実施
する。沈殿を上のように遠心により除去する。沈殿を緩
衝液＃４中に25mlの緩衝液/100mlの血清の比で15〜30分
間ゆっくり攪拌することにより再溶解する。物質を最後
に遠心して不溶性凝集物を除去する。
２、上の再溶解した沈殿＃１を透析管へ移し、そして緩
衝液＃２に対して４時間透析する。出発血清の100ml毎
に、3200mlの透析緩衝液＃２を必要する。透析後、不溶
性物質（沈殿＃２）をほぼ3000×ｇにおける遠心により
除去する。上澄み液をデカンテーションし、そして廃棄
する。沈殿を透析した沈殿＃１の体積にほぼ等しい体積
の新しい透析緩衝液で１回洗浄する。沈殿を緩衝液＃５
の中に25mlの緩衝液/100mlの出発血清の比で15〜30分間
おだやかに攪拌することにより再溶解する。次いで、物
質を遠心して不溶性凝集物を除去する。
３、再溶解した沈殿＃２を透析管へ移し、そして緩衝液
＃３に対して５時間透析する。出発血清の100ml毎に、3
200mlの透析緩衝液＃３を必要する。透析後、不溶性物
質（沈殿＃３）をほぼ3000×ｇにおける遠心により除去
する。上澄み液をデカンテーションし、そして廃棄す
る。沈殿を透析した沈殿＃２の体積にほぼ等しい体積の
新しい透析緩衝液で１回洗浄する。次いで、沈殿を緩衝
液＃７の中に1.0mlの緩衝液/100mlの出発血清の比で15
〜30分間おだやかに攪拌することにより再溶解する。１
個より多い遠心カップを使用して沈殿を回転させる場
合、再溶解用緩衝液をこれらのカップに均一に分割し、
そして沈殿が再溶解した後にはじめてプールする。プー
ルした物質を再度に20,000×ｇで15分間遠心して不溶性
凝集物を除去する。
Ｄ、バイオ−ゲル（Bio−Gel）A5Mカラムの調製および
展開 １、2.6×100cmのカラムの一端へ流れアダプターを取り
付ける。流出管を遮断する。溜をカラムの他方の端へ取
り付け、そしてほぼ20mlの脱気した緩衝液＃７を添加す
る。
２、600mlのバイオ−ゲルA5M、200〜400メッシュの媒質
を少なくとも30分間脱気し、そして攪拌したスラリーを
カラムの中になめらかに注ぐ。
２〜5cmの床が形成したとき、カラムの流れさせる。乾
燥させてはならない。
４、カラムが充填されたとき、過剰のゲルを除去して所
望の床の高さ（100cm）にし、溜を除去し、そして開い
た端に流れアダプターを取り付ける。
５、カラムを一夜20ml/時および５℃においてポンンプ
の使用により詰める。
６、流速を5.5ml/時に変え、そして280nmにセットしたU
V検出器および記録器および分画コレクターに取り付け
る。
７、基線をゼロに調節する。2.0mlの試料を収集するよ
うに分画コレクターをセットする。
８、C1q溶液をカラムの中に送り、そして次いで700mlの
脱気した緩衝液＃７を送る。
９、カラムを最後に200mlの脱気したナトリウムアジド
含有緩衝液（緩衝液＃８）で処理する。
10、C1qピークは、常にクロマトグラム上で最長であ
り、通常的300mlのマーク（管＃150）に出現し始める。
ピークの試料を次のプロトコール（protocol）に従いプ
ールする：光学濃度曲線の上昇側および下降側に両者上
のほぼ中心から基線へ接線を引く。２つの基線の交点の
間の距離を測定する。この直線の長さを両側において10
％だけ減少させる。この直線より上に落下する管をプー
ルする。この手順の例は第１図に示されている。
Ｅ、プロテインＡセファロース（Sepharose）CL 4Bカラ
ムの調製および展開 １、バイオ−ラド0.7×10cmのカラムへ、0.7gの調製Ａ
セファロースCL 4Bを添加する。5.0mlの緩衝液＃７を添
加し、そして５〜10分間水和および膨潤させる。
２、カラムをほぼ25mlの緩衝液＃７で重力流れにより洗
浄する。
３、カラムをしかり締め、そしてカラムの床の上部から
緩衝液を除去する。
４、ポンプ管にC1q調製物を充填し、そしてポンプのプ
ロテインＡカラムの上部へ取り付ける。C1q調製物をカ
ラムを通して20ml/時で送る。単一の管の中に集める。C
1q溶液のすべてがカラムを通過した後、カラムを通して
空気を送ってカラムの中の液体の完全な移送を確実にす
る。
５、カラムを25mlの0.1モルのクエン酸塩緩衝液pH4.5で
重力流れにより再生する。
クエン酸塩緩衝液の調製 ａ、0.1モルのクエン酸（H3C6H5O7・H2O）。
2.1gを蒸留水中に溶解し、そして十分な量の蒸留水を添
加して100mlにする。
ｂ、0.1モルのクエン酸ナトリウム（Na3C6H5O7・H
2O）。
2.94gを蒸留水中に溶解し、そして十分な量の蒸留水を
添加して100mlにする。54.5mlのａを45.5mlのｂと混合
する。pH＝4.5±0.1。
６、カラムを25mlのリン酸塩緩衝液＃８で平衡化し、そ
して同一緩衝液中にカラムを貯蔵する。
Ｆ、C1q濃度の決定 １、C1q濃度は次のように決定する:OD280nmの読みをブ
ラブンクとして緩衝液＃７の使用により行う。次式を使
用する： E1cmのC1qについての吸光値（extinction value）＝6.8
mgC1q/ml＝（OD280×10）/6.8 ２、C1qピークをアミコン（Amicon）xM 50膜上でほぼ1.
0mgC1q/mlの濃縮する。
この式を使用する： 濃縮後のC1q体積＝C1q濃度mg/ml×濃縮前のC1qの体積 注：室から濃縮物を取り出す前に、ガス圧を開放し、そ
して少なくとも攪拌を続けてフィルターのディスクへ吸
着したC1qを取り戻す。
３、C1qの最終濃度をOD280nmによりＦ、１から式を使用
して決定する。
Ｇ、最終生成物の純度 純度はSDSの存在下のポリアクリルアミドのゲルの電気
泳動により決定する。この手順は次の通りである： １、試薬 ａ、次の試薬はバイオ−ラド（BIO−RAD）により供給さ
れる： DDT（ジチオスレイトール） SDS（ドデシル硫酸ナトリウム） 過硫酸アンモニウム ピロニン（Pyronin）Ｙ TEMED（N,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミン） ｂ、クーマッシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie
Brilliant Blue）Ｇ−250（イーストマン・コッダク） c.タンク（Tank）緩衝液0.04モルのトリス（Tris）;0.0
2モルの酢酸ナトリウム;0.002モルのEDTA pH7.4、0.1％
のSDSを含有する。
4.85gのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 2.72gの酢酸ナトリウム（NaC2H3O2・H2O） 0.67gのEDTA 1.0gのSDS ほぼ800mlの蒸留水中に溶解する。pHを7.4に10％の表酢
酸で調節する。十分な量の蒸留水を添加して100mlにす
る。
ｄ、透析緩衝液:0.01モルのトリスHCl、0.001モルのEDT
A pH8.0、0.5％のSDSを菌株する。
1.211gのトリス 0.0336gのEDTA 1.0gのSDS ほぼ800mlの蒸留水中に溶解する。pHを8.0に0.1NのHCl
で調節する。十分な量の蒸留水を添加して100mlにす
る。
ｅ、アクリルアミドービス試薬 5.5gのアクリルアミドおよび0.15gのビス−アクリルア
ミドを蒸留水中に溶解し、そして0.15gのビス−アクリ
ルアミドを蒸留水中に溶解し、そして十分な量の蒸留水
を添加して25mlにする。
ｆ、過硫酸アンモニウム0.1g/10ml蒸留水。（毎日、新
しく調製する）。
試料のインキュベーション溶液 0.303gのトリス 0.084gのEDTA ほぼ10mlの蒸留水中に溶解する。pHを8.0に0.1NのHClで
調節する。この溶液に、次のものを溶解する： mlにする。
2.5gのSDS 1.54gのDTT 25mlとするのに十分な量の蒸留水。
ｈ、0.01％のピニロンＹ。0.01gのピロニンＹを100mlの
蒸留水中に溶解する。
ｉ、30％のスクロース。3gのスクロースをを蒸留水中に
溶解し、そして十分な量の蒸留水を添加して10mlにす
る。
ｊ、25％のイソプロピルアルコール 10％の酢酸 0.02
5％のクーマッシー・ブルーＧ−250。
ほぼ500mlの蒸留水に、250mlのイソプロピルアルコール
および100mlの氷酢酸を添加する。0.25gのクーマッシー
・ブルーＧ−250を溶解し、そして十分な量の蒸留水を
添加して1000mlにする。
ｋ、10％のイソプロピルアルコール 10％の酢酸 0.00
25％のクーマッシー・ブルーＧ−250。
ほぼ500mlの蒸留水に、100mlのイソプロピルアルコール
および100mlの氷酢酸を添加する。0.025gのクーマッシ
ー・ブルーＧ−250を溶解し、そして十分な量の蒸留水
を添加して1000mlにする。
１、10％の酢酸、0.00125％のクーマッシー・ブルーＧ
−250。
ほぼ500mlの蒸留水に、100mlの氷酢酸を添加する。0.01
25gのクーマッシー・ブルーＧ−250を溶解し、そして十
分な量の蒸留水を添加して1000mlにする。
ｍ、10％の酢酸 ほぼ500mlの蒸留水に、100mlの氷酢酸を添加する。十分
な量の蒸留水を添加して1000mlにする。
２、手順 ａ、10％のアクリルアミドゲルの調製 次の成分を一緒に混合する： 7.5mlのタンク緩衝液（１、ｃ） 6.75mlのアクリルアミド−ビス溶液（１、ｅ） 0.0225mlのTEMED ほぼ15分間脱気し、そして0.7mlの過硫酸アンモニウム
溶媒（１、ｆ）。
ｂ、５×75mmのガラス管の一端をパラフィンフィルムで
覆い、そしてアメス・ゲル調製ラック（Ames Gel Prepa
ration Rack）中にセットする。0.4mlの30％スクロース
（１、ｉ）を管の底部へ添加し、管の側面へ接触しない
ように注意する。長さ2.5cmのプラスチック管を管の開
口端の上に配置し、そしてスクロースを上に横たえ、そ
して管をアクリルアミド溶液（２、ａ）で充填する。少
なくとも60分間重合させる。スクロースをタンク緩衝液
で数回洗浄する。ゲルは直ちに使用することができ、あ
るいは48時間まで貯蔵することができる。ゲルを貯蔵す
る場合、洗浄した区域をタンク緩衝液で充填し、そして
ゲルを膨潤した覆われた室内に＋５℃で配置する。
ｃ、試料の調製 C1qの調製物の半分をほぼ500mlの透析緩衝液（１、ｄ）
に対して室温において一夜透析する。
この透析した物質に、0.0525mlの試料のインキュベーシ
ョン溶液（１、ｇ）プラス0.055gのスクロースを添加す
る。この溶液を100℃において沸騰水中で、次のように
試験する:25μｌの処理した試料に、100mlのピロニンＹ
溶液（１、ｈ）を添加し、そしてゲル上に配置する。注
意して試料を上に横たえ、そして管にタンク緩衝液を充
填する。前に試験したC1q試料は、対象と展開（run）す
べきである。
ｄ、電気泳動 試料をカナルコ・ディスク（Canalco Disc）電気泳動セ
ルまたは同等物中で電気泳動させる。下の室にほぼ400m
lのタンク緩衝液を充填する。試料を上の室内に入れ、
次いでこれにタンク緩衝液を充填する。次いで、試料を
1ma/ゲルで15分間および3ma/ゲルで色素のバンドが管の
底部に到達するまで電気泳動させる。
着色 ゲルをバイオ・ラド（BIO RAD）のゲル電気泳動拡散デ
ステイナー（destainer）内で着色させる。あるいは、
ゲルは少なくとも50mlの着色溶液／ゲルを使用して管内
で別々に着色することができる。管を揺動装置上に配置
することにより、溶液を攪拌して保持する。
第１の着色溶液（１、ｊ）をデステイナー（ほぼ４リッ
トルを保持する）の中に注入する。木炭のカートリッジ
を取り出し、そしてデステイナーを磁気攪拌機上に配置
する。試料を一夜着色する。第２着色溶液（１、ｋ）を
第１溶液と交換し、そして着色を上のように６〜９時間
実施する。第３着色溶液（１、ｌ）を第２溶液と交換
し、そして着色を一夜実施する。脱着色（destaining）
溶液（１、ｍ）を第３溶液と交換し、木炭のカートリッ
ジを戻し、そしてゲルのバックグラウンドが透明となる
まで脱着色する。
ｆ、ゲルの解釈 この手順はC1qを分子量22,000、27,000および29,000の
３つの成分に破壊する。これらの３つの成分はゲル上の
最も早い移動バンドを表わす。すべての他のバンドは汚
染物質である。
ゲルを光電濃度計で読む。存在するすべてのバンドの合
計で割ったC1qバンドの合計は、C1q調製物の純度に等し
い。３つのゲルの平均値を最終結果として取る。
実施例II モノクローナル抗体の生産 Ａ、免疫化および細胞の交雑 雌のBalb/cマウス［ジャクソン・ラボラトリーズ（Jack
son Laboratories）；生後６〜８週］を、50ミクログラ
ムの実施例１におけるように調製したC1q抗原で皮下的
に免疫化した。レトロオービタル採血データ（retoorbi
tal bleed data）に基づき、３匹のマウスのうち１匹を
注射の超免疫化系列のために選択し、この系列は１ミク
ログラムのC1q抗原の１回の最初の腹腔内注射、引き続
く200ミクログラムのC1q抗原C1qの４回の毎日の連続的
腹腔内注射プラス80ミクログラムのC1q抗原（この４日
間の期間の第２日および第３日における注射IV）から成
っていた。最後の免疫化に引き続いて、マウスを殺し、
脾臓をマウスから切除し、そして脾組織をステンレス鋼
の篩に通過させることにより単一の細胞懸濁液をつくっ
た。
コーラー（Kohler）およびマイルステイン（Milstein）
により開発された手順に従い、細胞融合を実施した。10
mlのダルベッコ（Dulbecco）の変性イーグル培地（１−
グルタミンおよびグルコースで強化された）［DME、ギ
ブコ（Gibco）、ニューヨーク、グランドアイランド］
中のほぼ1.3×108の脾細胞を、4.7mlのDME中のほぼ2.6
×107のSP2/O−Ag14骨髄腫細胞と混合した。合わせた細
胞を遠心にかけ、そして上澄み液を除去し、次いで1ml
のRPMI 1640（ギブコ）中の35％のPEG 1000および５％
のDMSOを混合しながら添加した。この添加に引き続い
て、２回の連続の量のDME（1mlおよび2ml）を混合しな
がら添加し、次いで4mlおよび8mlの量のHT培地を添加し
た（このHT培地は500mlのDME中の68mgのハイポキサンチ
ンおよび365mgのチジミンから構成されていた）。これ
らの連続の添加および混合の工程の後、全体を遠心にか
け、上澄み液を除去し、そして得られる細胞の沈殿物を
40mlのHT培地中に再懸濁し、そして一夜インキュベーシ
ョンした。
Ｂ、ハイブリドーマの選択および生長 細胞融合後、細胞をHT培地で37℃および６％のCO2にお
いて100％の湿度の雰囲気中で培養した。次の日、懸濁
した細胞を400mlにHAT培地で希釈し、そして1mlのこの
溶液を１系列のマイクロタイター・プレートの各ウェル
中に入れた。プレートを37℃および６％のCO2および100
％の湿度において約２週間さらにインキュベーションし
た。
ハイブリドーマを含有する培養物より上の上澄み液を予
備的スクリーニングにかけて、ハイブリドーマの生産に
おいてマウスを最初に免疫化するために使用したヒトC1
q抗原に対するそれらの反応性を決定した。ヒトC1qをマ
イクロタイター・プレートのウェルの表面上へ被覆し、
次いで上澄み液の試料を添加することにより、エリサ
（ELISA）検定を実施した。未反応の上澄み液の除去
後、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ酵素で標識付け
したウザギの抗マウスIgG［マイルス−エーダ（Miles−
Yeda）］を使用して、抗Clq抗体の存在を検出した。ヒ
トC1qと反応したハイブリドーマ生産性抗体を二次培養
し、そしてさらにスクリーニングするためクローニング
した。
さらにスクリーニングすべき特定のハイブリドーマをマ
ウスに注入して腹水を生産し、そして得られる腹水をプ
ロテインＡカラムを通して流すことによってIgG分画を
単離した。このIgG分画を炭酸塩緩衝液（1.59gのNa2C
O3、2,93gのNaHCO3および0.2gのNaN3、十分な量の水を
添加して1000mlにする）中に50mg/mlの濃度に希釈す
る。0.2mlのアリコートをダイナテッチ（Dynatech）基
質板の各ウェルへ添加し、その後板をパラフィルム（pr
afilm）で緊密に覆い、そして２〜８℃において16〜22
時間インキュベーションした。このインキュベーション
に引き続いて、各ウェル中の流体を除去し、そしてウェ
ルをBPS−ツイーン（8.0gのNaCl、0.2gのKH2PO4、2.9g
のNa2HPO4・12H2O、0.2gのKClおよび0.5mlのツイーン2
0、水で希釈して1000mlにする）で３回洗浄した。
免疫複合体を含有することが知られているヒト血清を使
用することにより、抗体を評価した。この血清を４体積
のPBSツイーンを１体積の血清へ添加することにより1:5
に希釈した。この希釈した血清の0.2mlのアリコートを
試験抗体を含有する各ウェルへ添加し、次いでトレーを
パラフィルムで緊密に覆い、そして37℃において60分間
インキュベーションした。インキュベーション後、各ウ
ェル中の流体を除去し、そしてウェルをPBSツイーンで
３回洗浄した。ウザギ抗マウスIgG/セイヨウワサビのペ
ルオキシターゼ接合体（conjugate）［マイルス−エー
ダ（Miles−Yeda）］で1:10,000に希釈し、そしてこの
希釈した接合体の0.2mlのアリコートを各被覆ウェルへ
添加した。15〜25℃において暗所でさらに60分間インキ
ュベーションした後、各ウェル中の流体を除去し、そし
て各ウェルをPBSツイーンで３回洗浄した。最後に、各
ウェル中の酵素標識抗体の存在および量を過酸化物基質
の添加および生成した色の濃度の決定により検出した。
初期のスクリーニングにおいて陽性であったほぼ35のハ
イブリドーマのうち、５つは許容されうる程度に陽性で
あり、そしてC1q含有複合体に対して選択的であった。
これらのうち２つ（4A4B11および12A5B7と表示する）が
最良であり、そして試験キットの製造において使用する
ために選択した。
実施例III 試験キットの製造 ハイブリドーマ12A5B7および4A4B11からの腹水を、前述
のようにプロテインＡで精製した。得られるタンパク質
の分画を前述の炭酸塩緩衝液中で50ミクログラム/mlの
濃度に希釈し、そして0.2mlのアリコートをダイナテッ
チ基質板の各ウェルへ添加した。この添加後、板をパラ
フィルムで緊密に覆い、そして２〜８℃において16〜22
時間インキュベーションした。インキュベーション後、
各ウェル中の流体を除去し、そして前述のPBSツイーン
で３回洗浄した。特定の抗Clqモノクローナル抗体で被
覆されたこれらのトレーのウェルは、主題の試験キット
において使用すべき固相を形成する。
試験キットの他の成分は抗ヒトIgG/酵素接合体、PBSツ
イーン溶液、酵素の基質、および対照である。これらの
そしての物質は一般に便利さおよび標準化のためにキッ
ト内に含まれるであろう。主題の試験キットにおいて使
用される対照物質はヒト血清であり、これには異る量の
凍結乾燥された熱凝集IgGが添加されている。
キットの構成成分 本発明の好ましい実施態様における典型的なキットの構
成成分は、次の通りである： ヒトC1qに対するモノクローナル抗体（ネズミ）で被覆
された６微量滴定板（microtitration plate）（96ウェ
ル／板）;0.02％のチメロサールを含有する。
血漿の形態の６バケットのリン酸塩緩衝塩溶液（salin
e）；各パケットは8gのNaCl、0.2gのKH2PO4、1.16gのNa
2HPO4、0.2gのKClおよび0.2gのメチロサールを含有す
る。
１バイアルのポリソーベート（Polysorbate）−ポリエ
キシエチレンソルビタンモノラウレート、シグマ（Sigm
a）。
１バイアルの接合体濃厚物−セイヨウワサビのペルオキ
シダーゼへ接合したモノクローナル抗ヒトIgG（ネズ
ミ）;0.02％のチメロサールおよび0.0005％のゲンタマ
イシンサルフェートを含有する。接合はナカネ（Nakan
e）ら、ジャーナル・オブ・ヒストケム・アンド・サイ
トロジー（J.Histochem and Cytol.），22,1084−1974
の方法により実施する。ヒトIgGに対する腹水の典型的
な力価は８×105である。得られる物質をウシ胎児血清
で希釈して、次の性質を有する物質を生成する:A 4 9
2、150mg/ml HAG＜1.5;r2＞0.95;傾斜＞0.5;1およびｙ
−交点＜0.04。典型的な希釈は1:100であって接合体濃
厚物を生成する。
２バイアルのｏ−フェニレンジアミン・2HClのタブレッ
ト；各タブレットは、基質溶媒の100mlが26.5mgのクエ
ン酸、73.0mgのNa2HPO4および35.0mgのOPDを含有するよ
うに、十分なOPDおよび緩衝液を含有する。
１バイアルの３％の過酸化水素;N−フェニルアセタミド
を含有する。
２バイアルのハイ・ノーマル（High Normal）対照（凍
結乾燥した熱凝集IgGを添加したヒト血清）。
２バイアルのロウ・アブノーマル（Low Abnormal）対照
（凍結乾燥した熱凝集IgGを添加したヒト血清）。
２バイアルのハイ・アブノーマル（High Abnormal）対
照（凍結乾燥した熱凝集IgGを添加したヒト血清）。
実施例IV 試験手順の要約 Ａ、標本の収集 標本の収集前に特別の個体の調製は不必要である。全血
の試験標本は、受入れられた医学的技術により集めるべ
きである。標本を室温（20〜30℃）において少なくとも
２時間凝固させた後、血清を取り出なくてはならない。
Ｂ、試薬の調製 １、PBS−ポリソーベートの調製:1リットのガラス蒸留
したまたは脱インした水の中に１パケットのPBSの内容
物を完全に溶解させる。0.5mlのポリソーベート20を添
加しかつ混合する。PBS−ポリソーベートは、室温で貯
蔵するとき、１月間安定である。
２、接合体の調製：使捨て可能なガラスまたはプラスチ
ックの製品を使用しなくてはならない。接合体濃厚物は
使用前PBS−ポリソーベートで希釈しなくてはならな
い。1:50の典型的な希釈比について、0.4mlの接合体濃
厚物を19.6mlのPBS−ポリソーベートに添加する。20ml
の体積を１微量滴定板のために必要とする。接合体を使
用直前に調製し、かつ30分以内に使用すべきである。
３、基質の調製：使捨て可能なガラスまたはプラスチッ
クの製品を使用しなくてはならない。
ａ、24mlのガラス蒸留または脱イオンした水の中に８つ
のOPDタブレットを完全に溶解させる。ほぼ10分間タブ
レットを溶解させる。アリコートのミキサーをタブレッ
トの容易な溶解に使用することができる。
ｂ、使用直前に、100μｌの過酸化水素を添加しかつ混
合する。この体積は１微量滴定板のために十分である。
基質は室温において暗所で30分間安定である。基質は透
明ないし非常に淡い黄色であるべきである。認められう
るほどに黄色であるとき、それを廃棄し、そして必要に
応じてさらに基質を調製する。
４、4Nの硫酸の調製:8mlのガラス蒸留または脱イオンし
た水に1mlの濃（36N）硫酸を添加する。常に酸を水に添
加する。決して逆の手順を用いてはならない。この体積
は１微量滴定板のために十分である。
５、凍結乾燥した対照の再構成:1バイアルの各対照（ハ
イ・ノーマル対照、ロウ・アブノーマル対照およびハイ
・アブノーマル対照）を、0.5mlのガラス蒸留または脱
イオンした水の添加により再構成する。このバイアルに
水を添加し、そしておだやかに粉末を再懸濁させる。使
用前、再水和された対照を室温（20〜30℃）において15
分間静置させる。渦形成または激しい混合をしてはなら
ない。激しい混合は血清IgGを変性させ、そして異常に
高い値を生ずるであろう。再構成された対照を１研究日
のために使用することができる。各々の再構成された対
照のバイアルは同一の研究日において使用する場合、５
微量滴定板の各々ついてウェルを二重複製するために十
分である。
Ｃ、試験手順 １、PBS−ポリソーベートを調製する。試薬の節を参
照。
２、使捨てガラス管を使用し、PBS−ポリソーベート中
の３再構成対照および血清標本の1:5希釈物を調製す
る。倒立によりおだやかに混合する。渦を形成してはな
らない。例:0.125mlの対照または血清標本プラス0.5ml
のPBS−ポリソーベート（反復試験のために十分な体
積）。
３、ヒトC1qに対するモノクローナル抗体（ネズミ）で
被覆された微量滴定板から、使用直前に、保護カバーの
テープを除去する。
４、微量滴定板のウェルを激しい振盪により内容物を出
して空にする。
５、微量滴定板［ブランキグ（blanking）ウェルを含
む］をPBS−ポリソーベート３回洗浄する。洗浄後、板
を水取紙の上で軽くとんと叩いて過剰のPBS−ポリソー
ベートを除去する。洗浄後直ちに微量滴定板を使用す
る。微量滴定板の対照および試験のウェルを乾燥させて
はならない。
６、微量滴定板を板案内の上部に配置する。左のウェル
の第１垂直列を、微量滴定板のリーダー（reader）をブ
ランキングするために保存しておく。リーダーのブラン
キングのために製造者の説明を参照する。試験手順の基
質の添加まで、この列のウェルへPBS−ポリソーベート
洗浄溶液以外を添加してはならない。
７、微量滴定板をハイ・ノーマル、ロウ・アブノーマ
ル、ハイ・アブノーマルおよび試薬の対照について、二
重に、標識を付け、次いで血清標本に標識を付ける。
注：工程８〜10における対照および血清標本は、微量滴
定板へ10分以内に添加すべきである。ピペットの先端
は、各々の異る対照および試験標本について交換すべき
である。
８、200μｌの各希剤対照を、二重反復試験において、
適当なウェルへ添加する。
９、200μｌのPBS−ポリソーベートを二重反復試験の試
薬の対照ウェルおよびブランキングのウェルへ添加す
る。
10、200μｌの各希釈血清標本を適当なウェルへ添加す
る。血清標本はオペレーターにより二重反復試験間の変
動係数が絶えず10％より少ないような精度が達成される
まで二重反復試験する。
11、微量滴定板を板のカバーで覆い、そしてトレーを湿
った雰囲気中で32〜37℃において60分間インキュベーシ
ョンする。
ａ、37℃の水浴中において： カバーされた板は水の上に浮かず、水浴中の液面支持体
上に静置するようにする。インキュベーションの間浴の
カバーを保持する。板のレベルにおける気温を32〜37℃
とする。
ｂ、37℃の空気インキュベーター内において： インキュベーター内に蓋を有する容器を配置する。この
容器をインキュベーター内に残して、内部の温度が37℃
であるようにする。容器の底部に湿った紙タオルを配置
して湿気を維持する。微量滴定板を容器内に入れ、そし
てインキュベーション期間中蓋をしておく。
12、接合体の調製。試薬の節を参照。
13、エリサ（ELISA）の多チャンネル（multichannel）
洗浄びんを使用して、微量滴定板（ブランキングのウェ
ルを含む）をPBS−ポリソーベートで３回洗浄する。洗
浄手順は、次の通りでなくてはならない。
ａ、激しく振盪して内容物を出すことによりウェルを空
にする。
ｂ、洗浄びんを倒立させ、そしてびんを強制的に絞るこ
とによりウェルをPBS−ポリソーベートでよくフラッシ
ュする。
ｃ、激しく振盪して内容物を出すことにより、PBS−ポ
リソーベートを除去する。
ｄ、工程13bおよび13cを２回反復する。
ｅ、最後の洗浄後、倒立させた板を清浄な紙タオル上で
しっかり軽く叩いて過剰のPBS−ポリソーベートを除去
する。
ｆ、次の工程に直ちに進む。
洗浄工程の間手袋を着用すべきである。家庭用漂白剤を
洗浄物質へ添加した後、それを廃棄する。
注：試験の間、ウェルを乾燥させてはならない。ウェル
を乾燥させると、不当に高い吸収値が得られることがあ
る。
14、多チャンネルのミクロピペットを使用して、200μ
ｌの接合体を、ブランキングのウェルを除外して、すべ
てのウェルへ添加する。
15、微量滴定板を板カバーで覆い、そして室温において
暗い所で60分間インキュベーションする。
16、使用前10分に基質を調製する。この基質は透明ない
し非常に淡い黄色であるべきである。試薬の節を参照。
17、工程13に記載したように微量滴定板を洗浄する。次
の工程に直ちに進む。
18、多チャンネルのミクロピペットを使用して、200μ
ｌの基質を、ブランキングのウェルを含む、すべてのウ
ェルへ添加する。
19、微量滴定板を、蓋をしないで、暗い所に室温におい
て30分間配置する。
20、多チャンネルのミクロピペットを使用して、50μｌ
の4N硫酸を、ブランキングのウェルを含む、すべてのウ
ェルの中へ強制的に注入する。硫酸は急速にかつ均一に
ウェル全体に広がって、酵素を完全に不活性化すること
が重要である。板が暗所に貯蔵されない場合、硫酸を添
加後、１時間までに結果を読むことができる。
21、微量滴定板のリーダーを488〜492nmの波長にセット
し、そして製造者の説明に従い、基質および酸を含有す
るブランキング・ウェルを使用することによりリーダー
をブランキングする。
22、すべての微量滴定ウェルにおける色濃度を測定す
る。
結果の釈明 Ａ、試験の対照 １、試薬の対照：二重反復試験の試薬の対照の平均吸収
値を計算する。平均吸収値は0.05より小さくなくてはな
らない。0.05に等しいかあるいはそれより大きい場合、
新しく調製した試薬を使用して試験を反復すべきであ
る。
２、ノーマルおよびアブノーマルの対照：二重反復試験
したハイ・ノーマル、ロウ・ノーマルおよびハイ・アブ
ノーマルの平均の吸収値を計算する。二重反復試験は平
均値の20％以内であるべきである。
Ｂ、各血清についての免疫複合体濃度（ミクログラム/m
l HAG当量）の標準曲線の調製および決定 １、グラフの方法 ａ、直線のブラフ紙上にノーマル、ロウ・ノーマルおよ
びハイ・アブノーマルの対照についての吸収値を対応す
るミクログラム/ml HAG当量に対してプロットする。典
型的なmg/ml HAG当量は、ロウ・アブノーマル対照につ
いて20、ノーマル対照について50、そしてハイ・アブノ
ーマル対照について140である。
ｂ、プロットした点に最適に適合する直線を引く。
ｃ、曲線上において、各血清の吸収値（二重反復試験を
磁子した場合平均吸収値）に対応する点を探し、そして
対応するミクログラム/ml HAG当量を読み取る。
ｄ、上で決定した免疫複合体濃度をミクログラム/ml HA
G当量で報告する。
２、計算方法 計算は線形回帰プログラムで供給される種々の計算器で
行うことができる。製造者の説明に従いこれらのプログ
ラムを使用して、各試験試料について標準曲線および免
疫複合体濃度（ミクログラム/ml HAG当量）を確立す
る。
Ｃ、結果の解釈 １、陰性の結果 ０〜34ミクログラム/ml HAG当量の結果は、計算する免
疫複合体の有意水準について陰性と解釈することができ
る。
２、陽性の結果 ＞35ミクログラム/ml HAG当量の結果は、計算する免疫
複合体の有意水準について陽性と解釈することができ
る。
実施例Ｖ 活性な病気をもつ患者の血清中の循環性免疫複合体の検
出 供給される血清の収集 全血試料が患者から得られそしてこれを周囲温度におい
て少なくとも２時間凝固させた後、血清を遠心分離し
た。透明な血清を細胞要素から注意して分離し、そして
試験までカラス管内に保持した。過剰の血清を0.5mlの
分画に分け、そして将来使用するため−70℃で凍結し
た。
血清試料の試験 手順を実施例VIに記載する。
データの解釈 Ａ、吸収の読み（492nm）：吸収値はダイナテッチ（Dyn
atech）微量滴定板リーダーで得た。
Ｂ、標準極性の調製 １、標準曲線は３つの熱凝集した標準を使用して調製し
た（第１図参照） ２、曲線は25μg/mlから150μg/mlまで直線である。
Ｃ、患者の血清中の免疫複合体の濃度の決定 各血清についてのA492値を使用して、分析した各試料に
ついての免疫複合体濃度を次のようにして決定した： Ｄ、患者の評価：＞35μg/ml HAGの免疫複合体濃度は、
循環性免疫複合体の有機水準について陽性である。活性
の病気をもつ患者のすべては陽性であると試験された
が、正常は陰性であると試験された。
実施例VI エイズ（EIDS）危険群の検出のための主題の試験の使用 実施例IIIに記載するC1q複合体試験キットを使用してエ
イズ危険群、エイズを有する群およびエイズをもたない
群の両者、を評価した。これらの群はそれらの血液中に
有意な濃度の循環性免疫複合体を有する。この試験は免
疫複合体の検出に使用される現在のブドウ球菌（Staphy
lococcus）結合検定およびC1q結合検定と比較して実施
した。
この比較試験の結果を表Ｉに示す。
この表が示すように、主題の試験はエイズの被害者の97
％を検出し、一方また現在エイズを保持しない種々のエ
イズの危険群、例えば、同性愛者（homosexual）および
ハイチ人（Hitian）の実質的な比率を検出する。先行技
術の結果と比較すると、主題の試験は実際のエイズの被
害者の検出およびエイズの危険群の検出の両者において
きわめてすぐれていた。
実施例VII モノクローナル抗体の濃度 SDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動を、ある範囲の
低分子量の標準に対するここに記載する両者のハイブリ
ドーマにより生産されるモノクローナル抗体について実
施した。６点線形回帰により、各抗体の重い鎖（heavy
chain）は52,384であると決定され、一方各々の軽い鎖
は26,128であると決定された。
電気集中分析（electrofocusing analysis）は次の結果
を与えた:4A4B11抗体について、pIは6.6、6.5、6.4およ
び6.35において観測され;12A5B7抗体について、pIは6.
1、6.05、5.95および5.9において観測された。
両者の抗体は慣用の技術によりIgG1であると決定され
た。
前述のように、主題のモノクローナル抗体は、ことにC1
を含有する人間の血清における、ヒトC1q含有複合体の
存在の検出のために有用であり、こうして、先行技術に
より要求されたような、試験前のC1q含有複合体の血清
からの分離の必要性を排除する。モノクローナル抗体は
C1q含有複合体を検出する方法および試験キットにおい
て使用することができ、前記検出は病気の診断において
およびこのような病気の処置の監視において有用であ
る。
本発明によれば、ヒトC1qと反応するが、ヒトC1と実質
的に非反応性である抗体を生産することができるハイブ
リドーマが提供される。また、モノクローナル抗体、こ
のハイブリドーマを生産する方法、モノクローナル抗体
を生産する方法、およびこの抗体を使用してヒトC1q複
合体を検出する方法および試験キットが提供される。
C1qに対して特異的な２種類のモノクローナル抗体を生
産する２種類のみのハイブリドーマを説明したが、本発
明はこの特異性を示すすべてのモノクローナル抗体およ
びこのようなモノクローナル抗体を生産することができ
るすべてのハイブリドーマを包含することが考えられ
る。主題の抗体はサブクラスIgG1に属することが決定さ
れた。IgG1はネズミIgGの４つのサブクラスのうちの１
つである。IgGのこれらのサブクラスはいわゆる「固定
（fixed）」領域（region）において互いに異るが、特
異的抗原またはエピトープに対する抗体はIgGのサブク
ラスがどこに属するかに無関係に機能的に同一である、
いわゆる「可変（variable）」領域を有するであろう。
すなわち、ここに説明した特性を示すモノクローナル抗
体は、サブクラスIgG1、IgG2ａ、IgG2ｂまたはIgG3であ
るか、あるいはクラスIgM、IgA、または他の既知のIgク
ラスであることができる。これらのクラスまたはサブク
ラスの間の差は主題の抗体の選択に影響を与えないであ
ろうが、抗体と他の物質、例えば、補体または抗マウス
抗体とのそれ以上の反応に影響を及ぼすことがある。
ここに記載した開示に従い、C1qと選択的に反応するモ
ノクローナル抗体を生産する他のハイブリドーマを容易
に調製することができるのであろう。このようなハイブ
リドーマおよびモノクローナル抗体は、それらがここに
開示した２種類の例示の抗体とC1q上の同一のエピトー
プと反応するか否かに無関係に、本発明の範囲内に包含
されると考えられる。
ここに例示したハイブリドーマ技術を用いて前述のモノ
クローナル抗体を生産する方法は本発明の範囲に包含さ
れる。２種類のみのハイブリドーマの例が与えられてい
るが、当業者はここに提供された免疫化、融合および選
択の方法に従うことができ、そして記載した選択性を有
する抗体を生産することができる他のハイブリドーマを
得ることができると考えられる。既知のマウス骨髄腫細
胞系統および既知のマウスの種からの脾細胞から生産さ
れる個々のハイブリドーマは、前記ハイブリドーマによ
り生産される抗体を参照する以外それ以上同定できない
ので、前述の活性を有する抗体を生産するすべてのハイ
ブリドーマならびに前記ハイブリドーマを用いる前記抗
体をつくる方法は本発明の範囲内に包含されると考えら
れる。
また、他の抗体生産性哺乳動物種を使用して、ここに記
載する特異性を有するハイブリドーマを発生させること
ができるであろう。例えば、ここに記載する技術に従い
ラットを免疫化し、そしてラットの脾細胞をラットの骨
髄腫系統と融合することができるであろう。このような
ラット−ラット融合を実施する技術はよく知られてい
る。
上に例示した２種類のハイブリドーマは、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）（the Amer
ican Type Culture Collection,12301 Parklawn Drive,
Rockville,Maryland,U.S.A.20852）に1983年７月29日に
受託され、そしてATCC受託番号HB8327（ハイブリドーマ
4A4B11について）およびHB8328（ハイブリドーマ12A5B7
について）を与えられた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ (72)発明者 ウエラーソン，ラルフ，ジユニア アメリカ合衆国ニユ−ジヤ−ジイ州07920 バスキングリツジ・オツクスボウレイン 14 (72)発明者 シヨー，サリイ・エム アメリカ合衆国ニユ−ジヤ−ジイ州08876 サマービル・アパートメント６・ジエミニ ドライブ356・ビークマンガーデンズ（番 地なし) (72)発明者 カプラン，ポール・エム アメリカ合衆国ニユ−ジヤ−ジイ州08557 サージヤンツビル・ボツクス125グラマリ イロード（番地なし) (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ，129（２），Ｐ．445− 447，（1982) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉ ｍｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏ ｎ，59，Ｐ．990−1001，（1977)

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）ヒトC1q含有免疫複合体を含有する疑
    いのある流体試料を、ヒトC1q含有免疫複合体とそのC1q
    に特異的に反応する抗ヒトC1qモノクローナル抗体との
    間の免疫学的反応が可能な条件下に前記抗ヒトC1qモノ
    クローナル抗体と接触させ、それによつてC1q複合体−
    結合抗C1qを形成せしめ； ｂ）未反応の流体試料及び結合していない抗ヒトC1qモ
    ノクローナル抗体を該C1q複合体−結合抗C1qから分離
    し；そして ｃ）前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体に結合したC1q含
    有免疫複合体の存在又は量を検出又は決定する ことを特徴とするヒトC1q含有免疫複合体を含有する疑
    いのある流体中のヒトC1q含有免疫複合体の検出または
    決定方法。
  2. 【請求項２】前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体がヒトC
    1qと反応するが、ヒトC1と実質的に非反応性であるマウ
    スのモノクロ−ナル抗体である請求の範囲第１項記載の
    方法。
  3. 【請求項３】前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体がハイ
    ブリドーマATCC HB8327またはHB8328により生産される
    ものである請求の範囲第１項記載の方法。
  4. 【請求項４】ａ）固相に付着せしめられた前記抗ヒトC1
    qモノクローナル抗体を準備し： ｂ）ヒトC1q含有免疫複合体を含有する疑いのある流体
    の試料を、ヒトC1q含有免疫複合体と前記抗ヒトC1qモノ
    クローナル抗体との間の免疫学的反応が可能な条件下に
    固相と接触させ； ｃ）未反応の流体試料を固相から分離し； ｄ）固相を標識第２抗体と接触させ、その際第２抗体
    は、第２抗体と結合複合体との間の免疫学的反応が可能
    な条件下に固相に結合されていてもよいC1q含有免疫複
    合体に結合することができるものであり； ｅ）未反応の第２抗体を固相から分離し；そして ｆ）固相上または未反応の第２抗体上のいずれかの標識
    を検出または決定し、そして検出または決定を前記流体
    試料中のC1q含有免疫複合体の存在または量に関係づけ
    る、 ことを特徴とするヒトC1q含有免疫複合体を含有する疑
    いのある流体中のヒトC1q含有免疫複合体の検出または
    決定するための請求の範囲第１項記載の方法。
  5. 【請求項５】流体が天然のC1を含有するヒト血清である
    請求の範囲第４項記載の方法。
  6. 【請求項６】第２抗体がヒト以外の抗ヒトIgGである請
    求の範囲第４項記載の方法。
  7. 【請求項７】標識が放射性同位元素、酵素または蛍光色
    素である請求の範囲第４項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体がハイ
    ブリドーマATCCHB8327またはHB8328により生産されるも
    のである請求の範囲第４項記載の方法。
  9. 【請求項９】ヒトC1q含有免疫複合体に特異的に反応す
    る抗ヒトC1qモノクローナル抗体、および前記抗ヒトC1q
    モノクローナル抗体に結合したC1q含有免疫複合体の存
    在または量を検出または決定するための手段からなるこ
    とを特徴とするヒトC1q含有免疫複合体の検出のための
    試験キツト。
  10. 【請求項１０】前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体がヒ
    トC1qと反応するがヒトC1と実質的に非反応性であるマ
    ウスのモノクローナル抗体である請求の範囲第９項記載
    の試験キツト。
  11. 【請求項１１】前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体がハ
    イブリドーマATCC HB8327またはHB8328により生産され
    るものである請求の範囲第９項記載の試験キツト。
  12. 【請求項１２】ａ）前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体
    が付着せしめられた固相、および ｂ）ヒトC1q含有免疫複合体が固相上の抗体に結合され
    たとき、C1q含有免疫複合体に結合することができる標
    識第２抗体、からなることを特徴とするヒトC1q含有免
    疫複合体を検出するための請求の範囲第９項記載の試験
    キツト。
  13. 【請求項１３】固相がマイクロタイター・プレートのウ
    エルである請求の範囲第12項記載の試験キツト。
  14. 【請求項１４】前記抗ヒトC1qモノクローナル抗体がハ
    イブリドーマATCC HB8327またはHB8328により生産され
    るものである請求の範囲第12項記載の試験キツト。
  15. 【請求項１５】標識第２抗体がヒト以外の抗IgGである
    請求の範囲第12項記載の試験キツト。
  16. 【請求項１６】標識第２抗体上の標識が放射性同位元
    素、酵素および蛍光色素から成る群より選択される請求
    の範囲第12項記載の試験キツト。
  17. 【請求項１７】第２抗体上の標識を検出するための手段
    をさらに含む請求の範囲第12項記載の試験キツト。
  18. 【請求項１８】第２抗体上の標識が酵素であり、そして
    酵素の基質をさらに含み、その際該気質は酵素が作用し
    たとき色が変化するものである請求の範囲第12項記載の
    試験キツト。
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