JP7291659B2 - アデノウイルスの免疫測定方法及び免疫測定器具 - Google Patents
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Description
本発明は、被検試料中に含まれるアデノウイルスを迅速、かつ、簡便に、しかも高感度で検出および測定し得るモノクローナル抗体、これを用いたアデノウイルスの免疫測定方法および免疫測定器具を提供することを目的とする。
[1] 配列番号1に示すアミノ酸配列の546~560番目の配列からなるポリペプチドと抗原抗体反応するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
[2] [1]に記載するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片と、検体中のアデノウイルスとの抗原抗体反応を利用してアデノウイルスを免疫測定することを含む、アデノウイルスの免疫測定方法。
[3] 前記免疫測定方法がサンドイッチ法であり、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が標識または固相の少なくともいずれか一方に使用される、[2]に記載の方法。
[4] [1]に記載するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む、アデノウイルスの免疫測定器具。
本発明のモノクロナール抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1に示すアミノ酸配列の21~944番目の配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する。配列番号1のアミノ酸配列は、944アミノ酸残基から構成される3型アデノウイルスGB株ヘキソン単量体蛋白質(GenBank Accession No. AB330084.1)の配列である。ウェスタンブロット法によるアデノウイルスの検出に本発明のモノクロナール抗体またはその抗原結合性断片を用いることで、分子量100kD付近の単量体と考えられるバンドと、200~300kDの三量体と考えられるバンドに抗原抗体反応による特異的なシグナルを検知することができる。ただし、単量体と思われる100kD付近のバンドに対しては非常に弱い反応しか認められない。
また、別の好ましい態様では、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1のアミノ酸配列の21~115番目、266~385番目、及び451~944番目から選ばれる少なくとも1つの範囲の配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する。
さらに、別の好ましい態様では、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号1のアミノ酸配列の21~45、56~115番目、266~385番目、451~485番目、526~575番目、581~615番目、656~725番目、766~795番目、801~830番目、851~875番目、及び886~944番目から選ばれる少なくとも1つの範囲の配列を有するポリペプチドと抗原抗体反応する。
上記の範囲のアミノ酸配列のポリペプチドと抗原抗体反応するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を用いることにより、高感度にアデノウイルスを検出することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、本発明のモノクローナル抗体が抗原抗体反応する上記特定のアミノ酸配列を含むアデノウイルスを含む複合体や抽出物、あるいは該アデノウイルス又はそれらの部分ペプチドを被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。免疫に用いるペプチドの長さは特に限定されないが、好ましくは5アミノ酸以上、より好ましくは10アミノ酸以上のペプチドを用いて免疫原とすることができる。
1.アデノウイルス抗原の調製
アデノウイルスを感受性のある哺乳類細胞に感染させ、数日間培養した後にアデノウイルス感染細胞の培養液を紫外線照射で不活化したものを用いた。
1.のアデノウイルス不活化抗原をBALB/cマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法(Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975))によりマウスミエローマ細胞(P3×63)と融合し、抗アデノウイルス抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が複数得られた。
取得した細胞株をプリスタン処理したBALB/cマウスに腹腔投与し、約2週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりIgGを精製し、精製抗アデノウイルスモノクローナル抗体を複数得た。
1.抗アデノウイルス抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
実施例1で作製した抗アデノウイルス抗体(抗体2)を緩衝液で希釈した液及び抗マウスIgG抗体を準備し、PETフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンのサンプルパッド側に抗アデノウイルス抗体、吸収体側に抗マウスIgG抗体をそれぞれ線状に塗布した。その後、ニトロセルロースメンブレンを温風下で十分に乾燥させ、抗アデノウイルス抗体固定化メンブレンを得た。
実施例1で作製した抗アデノウイルス抗体(抗体1)を着色ポリスチレン粒子に共有結合させた後に、着色ポリスチレン粒子を浮遊液に懸濁させた。次いで、超音波処理により十分に分散させた、抗アデノウイルス抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書においては、ここで得られた粒子を抗アデノウイルス抗体固定化粒子と呼ぶ。
2で作製した抗アデノウイルス抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量塗布し、温風下で十分に乾燥させた。本明細書においては、ここで得られたパッドを標識抗体パッドと呼ぶ。
1で作製した抗アデノウイルス抗体固定化メンブレンと2および3で作製した標識抗体パッドを他部材(バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド)とを貼り合せて5mm幅に切断し、アデノウイルス検査デバイスとした。
各型のアデノウイルス感染細胞の培養液を緩衝液で希釈し、それぞれの型のアデノウイルスの2倍希釈系列を調製した。
調製したアデノウイルス希釈液を検体浮遊液(10mM Tris(pH8.0)、1w/v%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、3 w/v%アルギニン、3 w/v%BSA)に添加し、4で作製したアデノウイルス検査デバイスに50μL滴加した後、5分間静置した。
陽性と判定された最小のアデノウイルス濃度を最小検出感度とし、結果を表1に示す。
また、53型、54型、56型、64型、79型、81型、85型の各亜型に対する反応も確認できた。
4で作製したアデノウイルス検査デバイスに、呼吸器感染症を引き起こすウイルスを含む検体浮遊液を50μL滴加し、5分間静置した。
抗マウスIgG抗体及び抗アデノウイルス抗体の両方の塗布位置で発色を目視で確認できた場合に+と判定する。抗マウスIgG抗体の塗布位置のみで発色を目視で確認でき、抗アデノウイルス抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は-と判定する。また、抗マウスIgG抗体の塗布位置で発色を目視で確認できない場合は無効と判定する。
結果を表2に示す。
4で作製したアデノウイルス検査デバイス(本品)の最小検出感度を、市販のアデノウイルスキットと比較した。
アデノウイルス感染細胞の培養液をそれぞれ緩衝液を用いて希釈し、2倍希釈系列を調製した。アデノウイルス希釈液を含む検体浮遊液を本品に50μL滴加し、5分間静置後に判定した。市販キットについては、規定量のアデノウイルス希釈液を検体として、各キットの添付文書に従って試験を実施し判定した。
本品で陽性と判定された最大のアデノウイルス希釈倍率を「1」としたとき、市販のアデノウイルスキットが陽性と判定された最大の希釈倍率を相対感度とし、表3に示す。
実施例1で得た抗アデノウイルスモノクローナル抗体の抗原認識部位をウエスタンブロッティング及びLC-MS/MSで確認した。
アデノウイルスをA549細胞に感染させ、培養した。培養7日目にアデノウイルス感染細胞を回収し、超音波処理により細胞を破砕した。細胞破砕液から遠心により細胞残渣を除去し、アデノウイルス濃縮液を得た。
1で得たアデノウイルス濃縮液の2倍希釈系列を調製し、終濃度が62.5mM Tris-HCl(pH6.5)、10w/v%グリセロール、2.3w/v%SDS、0.05%BPB(色素)となるように各試薬を添加し、加熱変性処理をせずに定法のSDS-PAGEを行った。
1で得たアデノウイルス濃縮液の2倍希釈系列を調製し、終濃度が62.5mM Tris-HCl(pH6.5)、10w/v%グリセロール、2.3w/v%SDS、0.05%BPB(色素)、5% 2-メルカプトエタノールとなるように各試薬を添加し、95℃で1分間の加熱変性処理後、定法のSDS-PAGEを行った。
2及び3で得られた泳動後のゲルを、PVDF膜に転写した。スキムミルクでブロッキングを行った後、PBS-Tweenで十分に洗浄した。PBS-Tweenで3.8 μg/mLに調整した抗アデノウイルス抗体を室温で1時間反応させた。PBS-Tweenで十分に洗浄した後、3000倍に希釈したHRP標識抗マウス抗体を室温で1時間反応させた。PBS-Tweenで十分に洗浄した後、化学発光検出試薬を用いてシグナルを検出した。
ウエスタンブロッティングの結果を図1に示す。
2及び3で得られた泳動後のゲルをCBBで染色した結果を図2に示す。
1.PepStarの作製
3型アデノウイルスGB株ヘキソン蛋白質(GenBank Accession No. AB330084.1)のアミノ酸配列情報をもとに、表4に示すペプチドライブラリーに示すペプチドを固定化したペプチドマイクロアレイPepstar(JPT Peptide Technologies社製)を購入した。
実施例1で作製した2種類の抗アデノウイルス抗体を緩衝液で希釈し、それぞれの抗体をPepstar上で30℃で1時間反応させた。反応後、1μg/mlの二次蛍光標識抗マウスIgG抗体を対応するウェルに加え、1時間反応させた。ウェル上の反応生成物を洗浄および乾燥した後に、スライドを635 nmの高解像度レーザースキャナーでスキャンして、蛍光強度プロファイルを取得した。得られた結果の画像を定量化して、各ペプチドの平均ピクセル値を得た。
得られた結果を視覚化し、個々の結合領域を比較するために、白色(結合なし)から赤色(強い結合)に色分けされた蛍光強度を示すヒートマップ図(図3)を作成した。
Claims (4)
- 配列番号1に示すアミノ酸配列の546~560番目の配列からなるポリペプチドと抗原抗体反応するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
- 請求項1に記載するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片と、検体中のアデノウイルスとの抗原抗体反応を利用してアデノウイルスを免疫測定することを含む、アデノウイルスの免疫測定方法。
- 前記免疫測定方法がサンドイッチ法であり、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性断片が標識または固相の少なくともいずれか一方に使用される、請求項2記載の方法。
- 請求項1に記載するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を含む、アデノウイルスの免疫測定器具。
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