CN113588948A - 一种基于elisa法定量检测新型冠状病毒n蛋白的试剂盒 - Google Patents

一种基于elisa法定量检测新型冠状病毒n蛋白的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于检测试剂盒的技术领域，本发明提供了一种基于ELISA法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒。本发明的试剂盒包括包被多克隆抗体的酶标板，酶标记单克隆抗体，新型冠状病毒N蛋白标准品，样品稀释液，洗涤液，显色液A，显色液B和终止液等组分。经验证，本发明中的试剂盒灵敏度较高，特异性好，与新型冠状病毒S蛋白、新型冠状病毒E蛋白及其它病毒蛋白均无交叉反应，检测时间短，重复性佳，操作简便，可以对多种样本中的新型冠状病毒N蛋白进行定量检测。

Description

一种基于ELISA法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒
技术领域
本发明涉及检测试剂盒的技术领域，尤其涉及一种基于ELISA法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-COV-2)是一种于2019年最新发现的新型冠状病毒，而冠状病毒是一类具有膜囊、基因组为线性单股正链的RNA病毒，分为α、β、γ、δ四个属，此次新型冠状病毒属于β冠状病毒属，它具有极强的传染性和致病力，自2019年年末爆发至目前为止已累计造成全球近亿人次的感染病例和近数百万人的死亡，新型冠状病毒至少含有四种结构蛋白：棘突蛋白S(Spike Protein)、囊膜蛋白E(Envelope Protein)、膜蛋白M(MembranceProtein)和核蛋白N(Nucleocapsid Protein)。其中的S蛋白位于病毒的囊膜表面，可以与宿主细胞的表面受体ACE2结合。S蛋白的空间结构可以划分为两个部分，S1和S2部分，S1包含受体结合区域(RBD)。而N蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白，也是冠状病毒RNA合成中的重要辅助因子，同时它也是冠状病毒编码蛋白中表达丰度最高的蛋白，在病毒的复制与免疫调节中发挥着重要作用，其序列保守、免疫原性高，通常可作为冠状病毒诊断检测的标志物。
目前对于病毒的检测方法主要有血清学检测(包括胶体金免疫层析法、酶联免疫吸附法、化学发光法)和核酸检测法(包括荧光定量PCR法、实时恒温扩增荧光法)。其中荧光定量PCR检测法具有较高的灵敏度和特异性，目前是临床上检测新冠病毒的“金标准”。荧光定量PCR法特异性强，灵敏度高，操作简单，基因扩增和逆转录可同时进行，耗时短。它的局限性是检测结果易受检测样本的处理方法(如采集、转运、储存等)、操作方法、实验室的环境等因素的影响。胶体金法耗时短，操作简便、易于判读检测结果，适合临床快检，但是只适用于定性诊断和辅助诊断。在新冠病毒感染的初期，患者体内未产生IgM抗体和IgG抗体或这两种抗体的滴度均很低，可导致检测的结果呈阴性，易造成漏检。另外对于使用免疫抑制剂进行治疗或免疫功能低下者，其检测结果的参考价值不大。
目前对于SARS-COV-2血清学检测多集中在SARS-COV-2抗体的检测，针对新冠病毒特异性蛋白，特别是N蛋白的检测的产品并不多。而新冠N蛋白作为新冠病毒中免疫原性高、表达最丰富的的蛋白，可作为新冠病毒疾病诊断的标志物。因此，开发一种定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒对于快速、准确地检测新冠病毒以及对疫情的控制具有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目的在于为克服现有技术中存在的上述缺陷，提供一种基于ELISA法中的双抗体夹心法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种基于ELISA法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：包被多克隆抗体的酶标板，酶标记单克隆抗体，新型冠状病毒N蛋白标准品，样品稀释液，洗涤液，显色液A，显色液B和终止液。
优选的，所述多克隆抗体为抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体，所述抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体的包被浓度为2～6μg/mL；
所述包被多克隆抗体的酶标板还包括包被缓冲液和封闭液，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液的pH为8.5～9.5，所述碳酸盐缓冲液由碳酸钠、碳酸氢钠与定容用水按照1～2g:2.5～3g:0.8～1.2L的比例混合而成，所述封闭液为含有0.5～1.5％牛血清白蛋白，2～4％蔗糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH为7～7.5，所述磷酸盐缓冲液由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4～5g:0.1～0.5g:5.5～6g:650～750mL的比例混合而成；
所述酶标记单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的浓度为300～500ng/mL；
所述新型冠状病毒N蛋白标准品为重组新型冠状病毒N蛋白标准品。
优选的，所述样品稀释液为含有0.8～1.2％牛血清白蛋白、0.8～1.2％甘油和2.5～3.5％蔗糖的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的摩尔浓度为0.04～0.06mol/L。
优选的，所述洗涤液为含有0.04～0.06％的吐温20的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01～0.03mol/L，所述磷酸盐缓冲液由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4～5g:0.1～0.5g:5.5～6g:650～750mL的比例混合而成。
优选的，所述显色液A为过氧化尿素溶液；
所述显色液B为四甲基联苯胺溶液；
所述终止液为硫酸溶液，所述硫酸溶液的摩尔浓度为0.5～1.5mol/L。
本发明的有益效果如下：
本发明中的试剂盒灵敏度较高，特异性好，与新型冠状病毒S蛋白、新型冠状病毒E蛋白及其它病毒蛋白均无交叉反应，检测时间短(3-4小时)，重复性佳，操作简便，可以对多种样本中的新型冠状病毒N蛋白进行定量检测。
附图说明
图1为本发明实施例1中的新型冠状病毒N蛋白定量检测试剂盒的检测标准曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种基于ELISA法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括：包被多克隆抗体的酶标板，酶标记单克隆抗体，新型冠状病毒N蛋白标准品，样品稀释液，洗涤液，显色液A，显色液B和终止液。
在本发明中，所述多克隆抗体优选为抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体，所述抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体的包被浓度优选为2～6μg/mL，进一步优选为4μg/mL；
所述酶标板优选还包括包被缓冲液和封闭液，所述包被缓冲液优选为碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液的pH优选为8.5～9.5，进一步优选为9，所述碳酸盐缓冲液优选由碳酸钠、碳酸氢钠与定容用水按照1～2g:2.5～3g:0.8～1.2L的比例混合而成，进一步优选为由碳酸钠、碳酸氢钠与定容用水按照1.6g:2.9g:1L的比例混合而成；所述封闭液优选为含有0.5～1.5％牛血清白蛋白，2～4％蔗糖的磷酸盐缓冲液，进一步优选为含有1％牛血清白蛋白，3％蔗糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH优选为7～7.5，进一步优选为7.4，所述磷酸盐缓冲液优选由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4～5g:0.1～0.5g:5.5～6g:650～750mL的比例混合而成，进一步优选为由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4.06g:0.4165g:5.95g:700mL的比例混合而成；
所述酶标记单克隆抗体优选为辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的浓度优选为300～500ng/mL，进一步优选为400ng/mL；
所述新型冠状病毒N蛋白标准品优选为重组新型冠状病毒N蛋白标准品。
在本发明中，所述样品稀释液优选为含有0.8～1.2％牛血清白蛋白、0.8～1.2％甘油和2.5～3.5％蔗糖的Tris-HCl溶液，进一步优选为含有1％牛血清白蛋白、1％甘油和3％蔗糖的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的摩尔浓度优选为0.04～0.06mol/L，进一步优选为0.05mol/L。
在本发明中，所述洗涤液优选为含有0.04～0.06％的吐温20的磷酸盐缓冲液，进一步优选为含有0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度优选为0.01～0.03mol/L，进一步优选为0.02mol/L，所述磷酸盐缓冲液优选由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4～5g:0.1～0.5g:5.5～6g:650～750mL的比例混合而成，进一步优选为由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4.06g:0.4165g:5.95g:700mL的比例混合而成。
在本发明中，所述显色液A优选为过氧化尿素溶液；
所述显色液B优选为四甲基联苯胺溶液；
所述终止液优选为硫酸溶液，所述硫酸溶液的摩尔浓度优选为0.5～1.5mol/L，进一步优选为1mol/L。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中的新型冠状病毒全病毒蛋白灭活纯化液购买自浙江天元生物药业有限公司；抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体购买自无锡迪腾敏生物科技有限公司，产品编号为3A12；重组新型冠状病毒N蛋白标准品购买自上海近岸科技有限公司；干燥剂为普通市售食品级干燥剂；抗体稀释液购买自北京梅科万德生物科技有限公司。
实施例1
(1)抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY多克隆抗体的制备：
1)动物免疫：
采用6月龄，体重为1200g的雌性海兰褐蛋鸡正常饲养一周后免疫，将新型冠状病毒全病毒蛋白灭活纯化液(蛋白浓度为600μg/mL)与佐剂(初步免疫采用完全弗氏佐剂，加强免疫用不完全弗氏佐剂)按照体积比为1:1的比例混合，用微型高速搅拌器搅拌混匀制成乳化剂。初步免疫分别于蛋鸡的双翅下、左右背部皮下进行多点注射，每隔15天免疫1次，共免疫4次，初步免疫结束后过两个月对蛋鸡进行加强免疫，每隔60天加强免疫1次，共免疫3次，收集免疫蛋鸡的鸡蛋。
2)鸡卵黄IgY多克隆抗体的纯化：
把收集的鸡蛋用灭菌水清洗，之后用75％酒精擦拭；
把鸡蛋的壳去掉，用蛋液分离器分离蛋黄和蛋白，再在无菌滤纸上滚动去除多余的蛋白，之后把蛋黄转移至无菌的量筒中，测量体积为15mL。加入用量为蛋黄体积3倍的无菌PBS缓冲液(0.1mol/L，pH7.4)，充分混匀，加入PEG-6000至终浓度为3.5％(W/V)，搅拌至完全溶解，而后室温下静置30分钟，然后于10000r/min，4℃的条件下离心20min，取上清液0.45μm微孔滤膜过滤，而后再加入PEG-6000至终浓度为8.5％(W/V)，充分搅拌待粉末完全溶解后，室温下静置30min，而后于10000r/min，4℃的条件下离心20min，弃去上清液，沉淀物加10mLPBS溶液(0.1mol/L，pH7.4)溶解；
加入1.2g PEG-6000至终浓度为12％(W/V)，搅拌至粉末完全溶解，室温下静置30分钟，然后于10000r/min，4℃的条件下离心20min，弃去上清，沉淀物加1.2mLPBS溶液(0.1mol/L，pH7.4)溶解；
把透析袋用超纯水煮沸20min，取出放置于PBS溶液(0.02mol/L，pH7.4)中冷却，然后将上一步得到的沉淀溶解物加入到透析袋中，放入装有PBS溶液(0.02mol/l，pH7.4)的烧杯，透析16个小时，其间每隔4小时换液一次。最终得到抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体，于-20℃下保存备用。
(2)辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备：
1)称取10mg的HRP溶解于0.5mL蒸馏水中；
2)加入0.5mL现配的0.1mol/L的高碘酸钠溶液，混匀后置于4℃冰箱30分钟；
3)加入0.5mL现配的0.16mol/L乙二醇溶液，混匀后，室温下静置30分钟；
4)加入5mg纯化的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，向溶液中加入0.02M碳酸盐缓冲液(pH10.0),使pH升高至9.0左右，混匀后于4℃冰箱静置16小时；
5)加入0.4mL浓度为5mg/mL的硼氢化钠溶液，混匀，于4℃冰箱中静置2小时；
6)将上述溶液装入透析袋中，于pH7.4，0.02mol/L的PBS溶液中透析16个小时，换液三次后收集酶标记的抗体液。
(3)基于ELISA法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒的组建：
包含以下试剂：
1)包被抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体的酶标板；
2)辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体；
3)重组新型冠状病毒N蛋白标准品；
4)样品稀释液：含有1％牛血清白蛋白、1％甘油、3％蔗糖的Tris-HCl溶液(Tris-HCl溶液的摩尔浓度为0.05mol/L)；
5)洗涤液：含有0.05％的吐温20的pH7.4，0.02mol/L的磷酸盐缓冲液(磷酸盐缓冲液由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4.06g:0.4165g:5.95g:700mL的比例混合而成)；
6)显色液A：过氧化尿素溶液；
7)显色液B：四甲基联苯胺溶液；
8)终止液：1mol/L的硫酸溶液。
(4)酶标板的制备：
1)酶标板的包被：用包被缓冲液(即pH为9的碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液由碳酸钠、碳酸氢钠与定容用水按照1.6g:2.9g:1L的比例混合而成)将新冠全病毒鸡卵黄IgY抗体稀释至4μg/ml的浓度，以100μL/孔的量包被酶标板，于4℃下静置15小时；
2)封闭：提前配制封闭液(封闭液为含有1％牛血清白蛋白，3％蔗糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4.06g:0.4165g:5.95g:700mL的比例混合而成)；拍干酶标板包被液，每孔加350μL的洗涤液，浸泡5分钟，拍干，而后加预先配制好的封闭液，每孔加195μL，20-25℃静置4小时，拍干；
3)干燥：预先开启干燥房，待空气相对湿度下降至3％以下时，将酶标板干燥2小时后，与干燥剂一起装入铝箔袋中，真空封装。
(5)重组新型冠状病毒N蛋白标准品的制备：取原倍的重组新型冠状病毒N蛋白，用样品稀释液分步稀释至最终浓度62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.81ng/mL、3.90ng/mL。阴性参考品(0ng/mL)为样品稀释液。
(6)辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白抗体工作液的制备：用抗体稀释液将辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白抗体稀释至指定浓度400ng/mL，即得辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白抗体工作液。
实验例1
对实施例1中的试剂盒进行灵敏度测定：
取实施例1中制作完成的酶标板，每孔加100μL重组新型冠状病毒N蛋白标准品(62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.81ng/mL、3.90ng/mL)和阴性参考品，N蛋白标准品每组作两个重复，阴性参考品作10个重复进行测试。
以标准品的浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标拟合标准曲线(R2大于0.98)和线性方程，计算10个阴参OD值的平均值，加上2SD值，得到的OD值(Y1)，再代入方程计算相应的X值(新型冠状病毒N蛋白浓度)，即为试剂盒检测的灵敏度。结果如表1所示。
表1试剂盒灵敏度测试
Figure BDA0003194630310000081
由表1可知，该试剂盒对新型冠状病毒N蛋白的检测灵敏度良好，为0.738ng/mL。
实验例2
对实施例1中的试剂盒的特异性进行测定：
用新型冠状病毒N蛋白检测试剂盒同时检测试剂盒的阴性参考品、新型冠状病毒N蛋白阳性标准品(N蛋白浓度为62.5ng/ml)和8个其它不同类型的不含新型冠状病毒N蛋白的样品。结果如表2所示。
表2特异性验证结果
Figure BDA0003194630310000091
Figure BDA0003194630310000101
由表2可知，试剂盒阴性对照和阳性对照OD值正常，试剂盒有效；针对新型冠状病毒S蛋白样液、新型冠状病毒E蛋白样液、乙型流感病毒原液、寨卡病毒原液、狂犬病毒抗原样液、布尼亚病毒抗原样液、流脑原液A型、带状疱疹病毒gE蛋白样液等8个样液，检测结果表明8个样品OD值均小于阳性判定标准Cutoff值，可以均判定为阴性，证明试剂盒的特异性较好。
实验例3
对实施例1中的试剂盒进行加速稳定性测试：
将实施例1的试剂盒分别置于37℃存放0、1、3天，再对阴性参考品和5个新型冠状病毒N蛋白标准品(62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.81ng/mL、3.90ng/mL)进行检测，可接受标准：与对照组(0天)比较，试验组的RSD(相对标准偏差)小于10％。不同时间的测试结果如表3所示。
表3试剂盒加速稳定性测试结果
Figure BDA0003194630310000102
Figure BDA0003194630310000111
由表3可知，与对照组(0天)参考品吸光值相比，试验组(1天和3天)OD450的RSD值均小于10％，说明试剂盒加速稳定性验证合格，试剂盒在4℃条件下可保存约6个月。
实验例4
应用实施例1中的试剂盒定量检测新型冠状病毒N蛋白含量：
1.取出试剂盒内试剂及酶标板，在室温下静置30分钟，加入新型冠状病毒N蛋白定量参考品(0ng/mL、3.90ng/mL、7.81ng/mL、15.62ng/mL、31.25ng/mL、62.5ng/mL)，各浓度做平行两孔，100μL/孔。加内部参比、供试品，各做平行两孔，100μL/孔。(同时设空白对照1孔，只加显色液和终止液)加样完毕后，将微孔板贴上封板摸，37℃水浴下放置120min后，加入洗涤液350μL/孔，洗板4次，拍干。
2.每孔加入HRP标记新型冠状病毒N蛋白抗体工作液100μL，空白孔不加，于37℃水浴下放置60min后，加入洗涤液350μL/孔，洗板4次，拍干。
3.各孔加入显色液A和显色液B，各50μL，于37℃水浴下放置10min，各孔加入终止液50μL，终止反应。
4.10min内用酶标仪测定各孔在450nm(参比波长620nm)波长下的光吸收值(A值)。
5.定量标准曲线的建立：以定量参考品的新型冠状病毒N蛋白浓度为横坐标，测定A值为纵坐标绘制标准曲线(如图1所示)，得出线性方程。(定量标准曲线线性相关系数的平方(R2)应大于0.97)。根据测得的样品A值代入线性方程，计算样品中的新型冠状病毒N蛋白含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种基于ELISA法定量检测新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被多克隆抗体的酶标板，酶标记单克隆抗体，新型冠状病毒N蛋白标准品，样品稀释液，洗涤液，显色液A，显色液B和终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述多克隆抗体为抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体，所述抗新型冠状病毒全病毒鸡卵黄IgY抗体的包被浓度为2～6μg/mL；
所述包被多克隆抗体的酶标板还包括包被缓冲液和封闭液，所述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液的pH为8.5～9.5，所述碳酸盐缓冲液由碳酸钠、碳酸氢钠与定容用水按照1～2g:2.5～3g:0.8～1.2L的比例混合而成，所述封闭液为含有0.5～1.5％牛血清白蛋白，2～4％蔗糖的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH为7～7.5，所述磷酸盐缓冲液由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4～5g:0.1～0.5g:5.5～6g:650～750mL的比例混合而成；
所述酶标记单克隆抗体为辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述辣根过氧化物酶标记的抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的浓度为300～500ng/mL；
所述新型冠状病毒N蛋白标准品为重组新型冠状病毒N蛋白标准品。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含有0.8～1.2％牛血清白蛋白、0.8～1.2％甘油和2.5～3.5％蔗糖的Tris-HCl溶液，所述Tris-HCl溶液的摩尔浓度为0.04～0.06mol/L。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含有0.04～0.06％的吐温20的磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.01～0.03mol/L，所述磷酸盐缓冲液由Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NaCl与定容用水按照4～5g:0.1～0.5g:5.5～6g:650～750mL的比例混合而成。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液A为过氧化尿素溶液；
所述显色液B为四甲基联苯胺溶液；
所述终止液为硫酸溶液，所述硫酸溶液的摩尔浓度为0.5～1.5mol/L。
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