JPS62501726A - サルモネラ菌検出用イムノアツセイシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 すルモネラ菌検出用イムノアッセイシステム的なサルモネラ菌の検出のための、 この抗血清調整物の、イムノアッセイシステムへの用途に関する。

更に、本発明は、チタナウスハイドＯキシオキサイド（ｔｉｔａｎｏｕｓ　ｈｙ ｄｒｏｘｙｏｘｉｄｅ　）　（以下水酸化チタン（Ｉ［［）という）の固体相面 上にバクテリアを固定化する方法に関する。

背景技術 食物及び他の被検物中のサルモネラ菌の存在を分析する方法は、かなりの程度、 伝統的な培養方法に依っていた。これらの方法は本来、厄介であり、コストがか かり、長時間を要するものである。従って、より実際的でかつ経済的な方法を開 発するために、かなり多くの研究がなされて来た。多くの革新的な方法が提案さ れてきたが、これらの努力は目的を達成し得たとするには程遠く、限界があるに もかかわらず、培養による方法が検出の主流を支配し続けて来た。

カウフマン−ホワイト・スキーム（にａｕｆｆｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｅｓｃｈｅｎ ａ　）は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型を、その０及びＨ−抗原 の血清学上の特性に基づき分類したものである。このアプローチは、分類の方法 としては、非常に成功したものであり、これまでに１８００以上のサルモネラ（ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型とバイオセロタイプの存在を認めている。しかし ながらこの免疫学的多様性は、イムノアッセイ法を用いるサルモネラ菌検出のプ ロセスを複雑なものにしている。

イムノアッセイ法によるサルモネラ菌の特異的な検出のためのベースとして〇− 抗原を用いることは、不可能である。なぜならサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ）　、アリシナ原上の相互関係が存在するためである。

サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の鞭毛と他の微生物の抗原との間の免疫学 的関係（交叉反応性）についての文献上の報告は少ない。しかしながら、サルモ ネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）とエシエリツヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　） どの間のＯ及びに−抗原の相互関係とは対照的に、これらの属の鞭毛の間には、 そのような関係はないことが知られている。

ラベルとして放射性アイソトープあるいは酵素を用いる、ラジオイムノアッセイ 、エンザイムイムノアツセイ等のイムノアッセイ法は、非常に特異的であり、感 受性が高く、そのため広く使用されている。

ラジオアイソトープでラベルされたあるいは酵素でラベルされたプローブを用い るイムノアッセイ法で分析が成功するため必要な重要な要素は、結合した抗体と 非結合の抗体とを効果的に分離することである。液体相上のイムノアッセイにお いては、分離は、高分子開の抗原の場合のように免疫吸着剤を用いるか、あるい は低分子量の抗原の場合のように活性炭を用いることによって容易ル・ポリスチ レンあるいはポリプロピレン・チューブ）への吸着性は、固体相ラジオイムノア ッセイを開発するためのベースとして用いられて来た。この特徴的な吸着性のた めに、免疫反応完了後に、固体相を水で洗うことによって未反応の放射性トレー サーを容易にかつ速く除去することができる。従って、分離技術が簡単なため、 固体相イムノアッセイの使用が増加している。また抗体及び抗原の固定化のため の物質として、イソシアネート置換プラスティック・ディスク、ポリスチレン・ ボール。

ナイロン、活性化チオール・セファロース、微粒子セルロースなどが開発されて 来た。

固体相支持体へ微生物を固定化することは、物質の生産あるいは減成を測定する ために酵素活性を利用することに使用される。微生物細胞を固定化する技術とし ては、例えば（ｉｌ　アルギン酸ゲル、ポリアクリルアミドゲル。

コラーゲン膜、金層水酸化物の沈澱物、寒天ペレット。

液体膜でトラップする、１ｉｉｌ　りＯマドグラフィーに用いる分離物あるいは イオン交換物質に吸着させる、（ｉ）　植物レクチンに選択的に結合させる、（ ｉＶ！　例えばカルボジイミドの如き二官能性試薬を用いて支持体に細胞を共有 結合させる、などがある。しかしながら、かかる技術の広い産業上のかかわりあ いのために、より新しい物質、より新しい技術を見出す努力が続いている。

固体相イムノアッセイ法による診断のための微生物の固定化に対しては、あまり 注目されて来なかった。固体相イムノアッセイ法による診断のための、サルモネ ラと伯のダラム・ネカテイブ・バクテリアの固定°化は、バクテリア・サスペン ションでマイクロプレートをコーティングすることによって達成された。この技 術によれば、固定化を完了するためには、１時間から１晩インキユベートするこ とが必要である。このアプローチの他の欠点としては、（ｉｌ　いくつかの要素 によって影響を受ける非特・異的抗原吸着によっている、（ｉｉ）　吸着後、分 離が起る、（面　少量の細胞しか、この技術によっては吸着できない、等がある 。

発明の開示 第１に、本発明は、サルモネラ・オラニエンブルクンクッキー（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ　ｋｅｎｔｕｃｋｙ　）　、サルモネラ・ウボルタスーエクイ（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ　）　、サルし得る抗血清調整物に関 する。

サルモネラ（ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の鞭毛は、サルモネラ菌の特異的検出を可 能にする程に十分高濃度で共通のＨ−抗原決定基（他の微生物には共有されてい ない）を持っていることが見出された。１９７８−１９８０年の間に、オースト ラリアで単離され、血清型が決められたサルモネラ（Ｓａｌｎ＋ｏｎｅｌｌａ） のＨ−抗原組成物の詳細な研究の結果、９９％のその単離されたサルモネラ菌は 、１０ケ以上のＨ−抗原あるいは関連抗原を有していることが判明した。

本発明の好ましい第１の態様においては、抗血清調整物を構成する個々の抗血清 が、次のサルモネラ菌株、すなわち、サルモネラ・オラニエンブルク（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌ　ｌａＮα１２６７）、サルモネラ・ケンタラキー（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ５）及びサルモネラ・リイリー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｌ１ｌｌｅ）（Ｓ 、Ｒ，Ｌ、Ｎα１７２１　）から抽出される鞭毛に対して産生せしめられた抗血 清である。

これら１０）ｉのサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型の鞭毛の分子量、 抗原上の特徴は第１表に示した通りである。

本発明の更に一つの態様においては、バクテリアを特定の培地で培養し、ｐＨ３ 以下好ましくは２以下に、１時間以下好ましくは２０−４０分間バクテリアをさ らし、バクテリア細胞を採取し、次いでデポリマー化された鞭毛を回収すること により、鞭毛を単離する。

本発明の更に一つの態様においては、抗血清調整物の各々の抗血清成分は、アジ ュバント中の鞭毛エマルジョンを、動物へ数回皮肉注射して、免疫することによ って得られる。

第２に、本発明は、水酸化チタン（ＩＩＩ）と共にバクテリアの培地を撮どうす ることがら成る、固体相面上にバクテリアを固定化する方法に関する。

水酸化チタン（Ｉ［［）は、チタンクロライドの稀釈溶液をアンモニア溶液で中 和し、次いでサスペンションを食塩水で洗いアンモニウムイオンを除去すること によって得られる。

水酸化チタン（Ｉ［Ｉ）で微生物を固定化する方法は、簡単であって、一つのス テップによる方法であり、約１０分開成とうする。微生物の固定化の程度は、通 常振どう時間及び／又は程度を上げることによって向上する。これは、細胞と水 酸化チタン（Ｉ［Ｉ）粒子との接触可能性が増加するためである。それにもかか わらず、１０分間でほとんど十分な固定化が行なわれる。激しすぎる、あるいは 長時間すぎる振どうは、微生物の解離を引き起す可能性がある。しかしながら、 このようなことは、水酸化チタン（１［［）の場合には起らず、高い安定性を示 す。

第３に、本発明は、被検物中のバクテリアを固体相面上に固定化し、固体相面上 の不使用の面上をマスクするためにクラエンチング試薬を加え、第１の発明によ り得られるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　Ｈ−抗血清調整物を加え、次 いで結合した抗体を検出することからなる被検物中のサルモネラ（Ｓａ１ｍｏｎ ｅ土堕）血清型の検出方法に関する。

第３の発明における好ましい態様は、被検物を固体相に固定化する前に培養する 。更に好ましい態様は、固体相は、水酸化チタン（ＩＩＩ）又はマイクロ・トレ ーのいずれかである。

更に好ましい態様は、結合した抗体をラジオイムノアッセイあるいはエンザイム ノアツセイのいずれかで検出する。

各々の抗血清及び抗血清の混合物を 用いたサルモネラ菌の検出及び特定 サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型をＢＨＩ培地で培養し、食塩水で稀 釈し、標準プレート上の菌数測定のため試料ノ一部ヲ取り、最小検出固体群（ｍ ｉｎｉｍｕｎ　ｄｅｃｔａｂｌｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を、サルモネラ菌を水 酸化チタン（ＩＩＩ）に固定化後、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＭＡ）により 測定した。ここで用いた抗血清は、（ｉｌｌｏＩの個々の姐旦）、サルモネラ・ ケンタラキー（Ｓ、　ｋｅｎｔ、ｕｃｋｙ）　。

サルモネラ・テネシー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ）及びサル モネラ・ウェイクロス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｗａｙｃｒｏｓｓ　）の鞭毛に 対する４種の抗血清の混合物、及び（ｉｉ１１０種の抗血清の混合物である。個 々の抗血清あるいは抗血清混合物中の各成分は１：１０００に希釈した。

サルモネラ菌の検出のためのラジオイムノアッセイ法（ＲＩＭＡ）の特定は次の ようにして行なった。ナルモネラ菌以外の１６種のエンテＯバクテリアセエアエ （Ｅｒｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）　、すなわち、シトロバクタ−・フ ロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｒｒｅｕｎｄｉｉ）　、　エドワードシ イーラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ　ｔａｒｄａ）　、　エンチロバク ター−エアロジーンズ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）　、 エルピニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｈｅｒｂｉｃｏｌａ　）　、　ハフ ニア・アルベイ（ｌｌａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉ）　、プロテウス・レットゲリ（ Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｒｅｔｔｇｅｒｉ）　、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅ ｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）　、セラチア−ｖルセツセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　 ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）　、シゲラ・ダイセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　 ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）　、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｃｕｓ　ｍ１ ｒａｂｉｌｉｓ　）　、プロ７ウス・モルカニ（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｏｒｇａｎ ｉｉ）　、シゲラー’７Ｌ／キセネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｆｌｅｘｎｅｒｉ　 ）　、　イエ）Ｌｔ＞す・エンテロコリタイ力（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｅｎｔｅｒ ＯｃＯＩｉｔｉｃａ　）　、クレブシラ・ノイモニア（にＩｅｂｓｉｅｌｌａ　 ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ　）　、イエルシニア・ブソイドテブクロシス、（Ｙｅｒ ｓｉｎｉａ　ｐｓｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）　。

及びエツシエリッヒアー］リー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ　）を、 Ｂ）−１１培地で３０℃〜３７℃で生育せしめた。これらすべての種は、クレブ シェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌ　Ｉａ）及びシゲラ（５ｈｉｑｅｌ　ｌａ）を除いて 、運動型である。ＴＴＢ培地で二次培養した培養物を、３７℃で１８時間インキ ュベーション後、ＲＩＭＡでアッセイした。これらのアッセイでは、二つの異な る放射性アイソトープでラベルしたトレーサーを用いた。これらのトレーサーは 、サルモネラ菌検出に関して、その効果を確立するため分けて用いた。これらの トレーサーは１２５ニーラベル化プロティンＡ及びウサギ抗体（ニーラベル化ロ バ、抗ウサギＦ（ａｂ）　フラグメント、Ｉ　Ｆ　（ａｂ）２）であり、ラジオ ケミカル・センター・アメルシャ・イングランド（Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｅｎｔｒｅ、　Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から購入した。これら の試薬を用いたアッセイにおけるインキュベーション時間は、それぞれ３０”Ｃ １時間、３７℃２時間である。

７０種のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型も、ＢＨＩ培地で培養し、 次いでそれぞれ単独で、あるいは１６種のエンテロ、バクテリアの混合物ととも に、ＭＳＣＢ培地で二次培養した。サルモネラとエンテロバクテリアの混合物の ＭＳＣＢ培地への接種Ｇは１：１００であった。

４２℃で１８時間ＭＳＣＢ培地でインキュベーション後、ラベル化プロティンＡ を用いて、Ｒ（ＭＡによりサルモネラをアッセイした。このアッセイで用いた抗 血清は、１０種の抗血清混合物（ＰＦＡ）（１：４００）及びスパイサーーエド ワード・ポリバレント（Ｓｐｉｃｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ） 抗血清（ＳＥＡ）（１：　２’ＯＯ）からなる。

各）３１度の固定化サルモネラ細胞及び同種の抗ｔｌ清を用いてラジオイムノア ッセイを行なった。ＲＩＭＡによる、各種の抗血清を用いたサルモネラ（Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ）血清型の最小検出固体群（ｍｉｎｉｍｕｍ　ｄｅｔｅｃｔａｂ ｌｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　）　（１００）は第２表に示した通りである。

最小検出固体群は、抗血清により変動し、同種の抗血清（ｎ＝４８）で平均４． ６０±０．５４１−あった。

各々の抗血清の交叉反応性（％）と異種の抗血清の最小検出固体群ｌｏＱとの相 関係数（第２表及び第３表）は、各々の抗血清で変動し０．９８〜０．７６であ った。

しかしながら、そのような係数の総数（すべての抗血清）は０．６７であり、高 度に有意（ｐ＜０．００５）であり、回帰による変動（％）は４５．０であった 。

第２表及び第３表から、４　）Ｉの抗血清（ｚ６：ｅ、ｎ。

ｘ：ｚ　、ｚ　及びｚ２９）のみの混合物を用いて、１０種のサルモネラ血清型 を検出することが可能である。従ってそのような混合物を調整し、１０種のサル モネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）血清型の最小検出固体群の測定のための、Ｒ ＩＭＡに使用することができる。混合物中におけるそれぞれの抗血清の最終希釈 率はに４．ＯＯＯである。１０種のすべての血清型を検出し得るこの混合物を、 同様の最終希釈率を有する１０種の各々の抗血清からなる混合物と比較した。第 ４表の結果から、１０Ｆ！の抗血清の混合物は、４種の抗１ｆ１１清の混合物よ りも、検出感度がすぐれていることが判る。４種の抗血清混合物は、５．５２± ０．７６　（ｊ！００）の検出を可能にするが、１０種の抗血清混合物は４．６ ６±０．７２　（ｊ！ＯＣＩ＞（第４表）の検出を可能にする。そのような相異 は、を−テストにより高度に有意差（Ｄ＜０．００５＞があった。更に、１０種 の抗血清混合物を用いた、１０種のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ　）血 清型の最小検出固体群（Ｊ！００）と、各々の同種の抗血清（第２表では抗血清 希釈率は１：１０００であった）を用いた場合のそれとの間には有意差（ｐ＞０ ．４）はなかった。

第４表 ｇ、　ｍ　５．４５　４．４０ Ｚ６　４．５２　４．３８ ｚ４．　ｚ２３４．６０　３．４８ ｅ、　ｎ、　ｘ　４．５４　４．４０ ｚ２９６．２６　５．２０ ｄ　５．４Ｂ　４．３４ １、２　５．５７　３．９５ １、　ｗ　６．３４　５．５６ ａ：抗血清混合物のそれぞれの成分の最終希釈率は１　：４０００であった。

ｂ＝用いた抗血清は、抗−ｅ、ｎ、ｘ；抗−２６：抗−２４，ｚ２３及び抗−２ ２９であった。

Ｃ：用いた抗血清は、第１表に示した抗血清から調整したものである。

それぞれの最終希釈率が１：１０００である各成分を用いて、より高濃度の１０ 種抗血清の混合物を調製した。

この混合物を用いていくつかのサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型の最 小検出固体群をＲＩＭＡによって測定した。

第５表の結果から、第４表の検出レベル（ｐ＞０．３５）に比較して、抗血清の 濃度が上昇した場合には、有意に検出感度が改良されないことが判る。

この抗血清は、１０種の抗血清［すなわちサルモネラ・インファンテイス（Ｓ、 　１ｎｆａｎｔｓ）　、サルモネラ・ギブ（」、ｌμ）、及びサルモネラ・とル ケンヘッド（Ｓ、　ｂｉｒｋｅｎｈｅａｄ）　］を生シセシメルタメニ用イルサ ルモネラ（Ｓａ１ｍＯｎｅｌ＋８）抗原と異なる、血清型に特異的なＨ−抗原［ カウフマン−ホワイト・スキーム（Ｋａｕｆｔｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｅ　５ｃｈｅ ｉａ　）　］を持つ他のサルモネラ（Ｓａｌｎｏｎｅｌｌａ）血清型を、検出す ることもできる。最小検出固体群（Ｈ，Ｄ、Ｐ　）は、３．４８−５．６３であ った。更に、この抗血清混合物はＲ［ｔｖｌＡを用いるサルモネラ検出に極めて 特異的であり、エツシエリツヒア・コリａｅｒｏｇｅｎｅｓ　）及びシトロネバ クター・フロインディー（Ｃ，ｆｒｅｉｎｄｉｉ）の単位／１００ｔｌｌｌを形 成する１０７コロニーまでの固体群を検出できなかった。そのような特異性は第 ６表に示されており、ＲＩＭＡを、トレーサーとして１２５Ｉ−ラベル化プロテ ィンＡ及び１２５Ｉ−ラベル化Ｆ（ａｂ）２を用いて行なった。第６表から明ら かなように、１６種のエンテロバクタ−のいずれも、いずれのシステムによって も、検出されなかった。

二つのラベル化された試薬は、ＴＴＢ培地で単独で生育せしめた、あるいは１６ 種のエンテロバクタ−の混合物とともに生育せしめた２０種のサルモネラ（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ）　ｒｆｎ清型の検出にも用いた。結果は、第７表に１２５Ｉ −ラベル化プロティンＡを用いたＲＩＭＡの、すべてのサルモネラ（ｓａｌｍｏ ｎｅｌｌａ）血清型を検出する能力として示されている。１０種の抗血清混合物 （１：４００）　、スバイサーーエトワード・ポリバレント（Ｓｐｉｃｅｒ−Ｅ ｄｗａｒｄｏ　ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ　）から入手し得るサルモネラ（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ）　Ｈ−抗原（１：２００）及び１２５ニーラベル化プロテインＡ を用いて、ＩＲＭ入培地とともＭＳＣＢ培地で培養した７７種のサルモネラ（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型の検出が可能であった。これらのほとんどのサルモ ネラは、アッセイで使用する１０種の抗血清を生ぜしめるために用いるサルモネ ラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）　Ｈ−抗原とは異なる血清型に特異的なＨ−抗原を 有していた。すべての血清型は、単独であるいはエンテロバクタ−混合物（第８ 表）ととも生育せしめた後に、検出可能であった。第８表の結果から、１０種の 抗血清の混合物の場合には、Ｓｐｉｃｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓｐｏ　１ｙｖａ　１ ｅｎｔからの抗血清の場合よりもすぐれていることが判る。このことは、前者の ラベル化プロティンＡの特。

異的結合性の有意差（ｐ＜０．００１）によって示される。

更に本発明は、非溶解性の支持体上にバクテリアを固定化する方法に関する。こ れによって、固体相イムノアッセイによるバクテリアの検出を容易にする。その ような方法の基準は、簡単であり、早く、効果的であって、イムノアッセイによ る抗原／抗体反応の測定を阻害しないということである。

固定化の実験は、水酸化チタン（■）、水酸化チタン（■）、水酸化ジルコニウ ム、及び他の微生物とともにサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）細胞を用いて 行なった。これらの微生物はＢＨＩ培地で３７℃で一晩生育せしめた。

培養物を、滅菌食塩水（ｐＨ６，８）で希釈し、望ましい細胞濃度とした。

金属水酸化物のサスペンションを、５０μｌ／チユーブの割合いでポリスチレン ・チューブに分配した。希釈したｖＡ胞サスペンションを加えて（１００μｍ） 、チューブを、室温で１０分間、反復振どう観で、特別の場合以外は、チューブ 中で金属水酸化物がサスペンションとして保たれるスピードで、振とうした。滅 菌食塩水（０，９ｄ）をそれぞれのチューブに加え、渦動せしめた後、チューブ を４℃で５分間遠心（１４００ｘｇ）した。

上清みの一部１００μｍを、希釈し、バクテリア個体群をスタンダード・プレー ト・カウント法（第９−１８表）により測定した。スタンダード・プレート・カ ウントは、同様に処理した、金属水酸化物を含まないチューブ（コントロール） についても行なった。固定化効果は次のようりして表わした。

固定化（％）−（コントロール・チューブ中の個体群−金属水酸化物を含むチュ ーブの上清み中の個体群）Ｘ１００／コントロール・チューブ中の個体群 ４種のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型の固定化データを第９表に示 した。３つのすべての金属水酸化物は、高程度に（≧９０％）固定化せしめるこ とができる。しかしながら、水酸化チタン（ＩＩＩ）を用いた固定化は、水酸化 チタン（ｒＶ）及び水酸化ジルコニウムの場合（ｐ＝＜０．０５及ｔＦ＜０．０ １　、　Ｔ−テストニにル）よりも、有意に効果的であった。固定化のデータは 、固定化の前後の生育筒のカウント数を比較することによって得た。少数の細胞 が固定化後に、上滑みあるいはサスペンション中に見られ、一方多数の細胞が金 属サスペンションをプレート化することによって回収された。このことは、細胞 はこれらの水酸化物で殺されるよりむしろかなりの数が固定化されることを示し ている。

水酸化チタン（ＤＩ）を用いた固定化（％）は水酸化チタン（ｍＶ）及び水酸化 ジルコニウムの場合（Ｐ−＜０．０５、＜ｏ、ｏｉ、ｔ−テスト）より、は　・ るかに効果的である。水酸化チタン（ＩＶ　）と水酸化ジルコニウムとの間では 、固定化には有意差がなかった。

第１２表 食塩水中のサルモネラの固定（に与える″（チタン　■　の六　の 容量　サルモネラ・エン　サルモネラ・μｌ　テリティディス　リイリー １０　６２．６　７０．１ ２５　７５．８　８０．３ ５０　９５．７　９９．６ ７５　９７、１　９９．７ １００　９６．０　９９．７ ぞれ１３．１ｘ１０　．４．９ｘ１０６コロニ形成ユニット７１００μｍであっ た。

第１３表 水酸化チタン（Ｉ［［）によるサルモネラｂの固定化に与える振どう時間８の効 果 娠どう　サルモネラ・エン　サルモネラ・時間　テリティディス　リイリー （Ｓ、　ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ　）　（Ｓ、ｔｉｔｌｅ　）５分　＞　７５． ３　９２．０ １０分　９８．１７　９７．０ ２ｈ’　９７．７　９７．７ ４　ｈ　’　８０．７　９９．４ ２４　ｈ’　９６．８　９６．８ ａ：２２℃でオーどタル・シエイカー（２０Ｏｒ、ｐ、ｍ、）ｂ：　Ｓ、　ｅｎ ｔｅｒｔｔｉｄｔｓ及びｓ、　ｔｉｔｌｅの数は、３．３×１０６及び４．９Ｘ １０６コ〇ニ一形成ユニツト／１００μｍであった。

Ｃ：チューブ内容物は２秒間のみ渦動せしめた。

ｄ：２００ｒ、ｐ、ｍ、テ）１１しく振トウシタ。

第１４表 水酸化チタン（ＩＩ［）によるサルモネフの固定化に与える緩衝液の効果 ＩＩ液　サルモネラ・　サルモネラ・ ウェイクロス　テネシー （Ｓ、　ｕ匹皿島）　（Ｓ、　ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ　）食塩水　９４．０　９９ ．８ イミダゾール− 食塩水　７１．７　９０．４ トリス− 食塩水　６９．１　７４．７ 食塩水　６２．９　７９．０ ホスフェート− 食塩水　４０．９　３０．７ ａ：　Ｓ、　ｗａｙｃｒｏｓｓ及びｓ、　ｔｅｎｎｅｓｓｅｅの数は、２．４７ ×１０　及び２．９３ｘｌＯ６コロニー形成ユニツト／１００μｌであった。

ｂ：食塩水のｐ）Ｉは６．８、他の緩衝液のＩ）ＩＩは７．２±０．１であった 。

第１５表 固定化ｐＨサルモネラ・　サルモネラ・リイリー　エンテリティ ３、００　８８．７　８２．６ ４．０５　９０．６　９１．１ ５．１０　９４．６　９６．２ ６．０５　９１．５　９２．０ ７．２５　９６．５　９６．０ ８．０２　８６．０　８２．７ ａ：　Ｓ、　ｌ１ｌｌｅ及びｓ、　ｅｎｔｅｒｉＮｄｉｓの個体群は３．６５ｘ １０　．２．９ｘ１０６コ〇ニー・フォーミング・ユニット／１０ｏμｌであっ た。

水酸化チタン（Ｔ［ｌ）によるサルモネラ以外の微生物の固定化 この固定化は、食塩水で希釈したＢＨＩ培地で生育せしめた培養物を用いて行な った。固定化の効果は、１００μｌの希釈培地、水酸化チタン（ＩＩＩ）サスペ ンション５０μｍを用いて、１０分間開成うして測定した。得られた結果（第１ ７表、第１８表）から、水酸化チタン（Ｉｆｆ）は、広範囲のダラム、ネガティ ブ及びダラム・ポジティブ・バクテリアを固定化する能力を持つ。固定化（％） は、それぞれ、８２．０−９９．９％、８８．１−９９．６％であった。

水酸化チタン（Ｉ［Ｉ）による、サルモネラ及び他のダラム・ネガティブ及びポ ジイティブ・バクテリアの固定化は、他の慣用的方法よりも優れている。

イムノアッセイによるサルモネラの検出サルモネラをＢＨＩ培地で３７℃で１８ 時間培養した［バルチモア・バイオロジカル・ラボラトリ−（Ｂａｌｔｉｍｏｒ ｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）にて］。次いでＭＳＣＢ及 びＴＴＢ培地に接種した。次いで選択培地を、４２℃で１８時間、３７℃で１８ 時間それぞれインキュベートした。またサルモネラを、他の１６種のエンテロバ クアリアの混合物とともに、接種比１：３００で、ＭＳＣＢ培地に接種した。混 合培養物を４２℃で１８時間インキュベートした。純粋培地での菌の生育は、ス タた。

また、固型食物を用いて、ツルバール・オムニ−ミキサー（Ｓｏｒｖａｌｌ　０ ｍｎ１−Ｈｉｘｅｒ）により、食物ホモジエネート（２５３食物サンプル、２２ ５ｄの緩衝ペプトン水）を得た。ホモジエネートに、ＢＨＩ培地のサルモネラ培 養物をストレート接種ワイヤーで接種し、次いで３７℃で１８−２４時間、増殖 せしめた。該培養物を、ＭＳＣＢ及びＴＴＢ培地に接抄しく１．０＆り　、４２ ℃で１８−２４時間、３７℃で１８−２４時間それぞれインキュベートした。得 られる培養物を、ＲＩＭＡ及び／又はＥｒＭＡによって、す・ルモネラについて アッセイした。ＲＩＭＡにおいては、培養物１００μｌを、ポリスチレン・チュ ーブ中の水酸化チタン（Ｉ［［）のサスペンション５０μｍに加えた。１０分間 の振とうによってバクテリアの固定化後、０．８５％ＮａＣ１，０，１％ＮａＮ ３及び２％ゼラチン（ＰＳＡＧ）を含む０．０５ＭＩＪンｌバッフ７−４希釈し ７ＣＰＦＡ　（１：　４００）１００μｍ及びＳＥＡ　（１：　２００）１００ μｍを加えた。

混合物を、３７℃で２時間、オービタル・シエイカー・インキュベーター（ｏｒ ｂｉｔａｌ　５ｈａｋｅｒ　１ｎｃｕｂａｔｏｒ）　テ１８０ｒ、ｐ、ｍ、でイ ンキュベートした。非結合の抗体を、食塩水３．０ｄｔ−希釈し、１７００ｘａ で５分間遠心分離し、吸引することによって、除いた。次いで、ＰＳＡＧで希釈 して約２５．０００ｃ、ｐ、ｍ、／１００ｕｌの１２５ニーラベル化プロテイン Ａ１００μｌを加えた。チューブをシエイカー・インキュベーターに、３０℃で １時Ｂ匠いた。

非結合のアイソトープラベル化試薬を、希釈、遠心、吸引によって除き、族１１ 活性を、パラカード・セレクトロニツク・オートガンマ・スペクトロメーター（ ＰａｃｋａｒｄＳｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ａｕｔｏｇａｍｍａ　Ｓｐｅｃｔｒｏ ｍｅｔｅｒ）でカウントした。

コントロール・テストは、サルモネラＨ−抗血清を加えたＰＳＡＧｌ　００μｌ について行なった。正味の放射活性を、抗血清を含むチューブの放射活性から、 Ｈ−抗血清を含まないチューブの放射活性を差し引くことによってめた。エンザ イムイムノアツセイを、ポリスチレン・チューブにおける水酸化チタン（Ｉ［［ ）の′サスペンションを用いて行なった。抗菌剤ＮａＮ３を使用しないこと、そ して１２５ニーラベル化プロテインＡの代わりに、ヤギでの抗−ラビットＩｑＧ （全分子）−アルカリホスファターゼ複合体抗体２００μｌを用いる以外は、ラ ジオイムノアッセイと同様にして、ポリスチレン・チューブを固体相として用い た。酊素複合体の最適濃度は、チェッカー盤滴定による測定で、１：２５０であ ることが判った。３７℃で１時間インキュベートし、非結合の酵素複合体フラク ションを除去後、アルカリホスファターゼ２００μｌの一部を加えた。酸素は、 シグマ・ホスファターゼ１０４の錠剤を１．ＱｍＨ亜鉛及び１．ＱｍＨ塩化マグ ネシウム［１１０、４）を含む０．１Ｍグリシン緩衝液５ｍｆ！に加え゛ること によって、使用するその日に調整した。

３７℃で１時間インキュベーション後、遠心分離により水酸化チタン（ＩＩＩ） を除き、２００μｌを取って、平底のポリスチレン・マイクロプレートに移した 。タイターチック・ユニスカン（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　ｕｎｉｓｋａｎ）分光測光 器を用いて４０５　ｎｍの波長で、吸光度を測定した。正味の吸光度を、コント ロールの吸光度値（サルモネラＨ−抗血清の代わりにＰＳＡＧＩ　００μｌを加 えた）を差し引くことによって、それぞれのサンプルについてめた。

同時に、増殖培地をＸＬＤ寒天培地にぬり付け、サルモネラの存在あるいは非存 在を確認した。ｔＩ定のサルモネラコロニーは、慣用的培養方法により、確認し た。

食物サンプルのテスト ２３５の食物サンプルについて、サルモネラの存在を調べた。これらは、２０の 生ミルク、２８の低温殺菌を行なったミルク、３０のソフトチーズ［モザレラ（ ＩｎＯＺＺａｒｅｌｌａ）　、フエツタ（ｆｅｔｔａ　）　、リコタ（ｒｉｃｏ ｔｔａ　）　、ｍｌツテジ（ｃｏｔｔａｇｅ　）及びカシオツタ（ｃａｃｃｉｏ ｔｔａ　）　］　、　２６のチェダーチーズ、７０のミルクパウダー、２０のニ ワトリの死骸、１３のニワトリの肝臓、１０のタマゴ製品（タマゴパウダー及び タマゴヌードル）及び１８のこま切れビーフからなる。

サンプルについては、オーストラリア・スタンダード、アソシエーション（１９ ８３）の培養方法により、サルモネラの存在を調べた。増殖せしめ、次いでサン プルを選択後、ＭＳＣＢ培地のみについて、１：４００に希釈したＰＦＡ抗血清 及び１：２００に希釈したＳＥＡ抗血清を用い、イムノアッセイにより、サルモ ネラの存在を調べた。イムノアッセイは、固体相として、水酸化チタン（Ｉ［［ ）を用いて行なった。

生育せしめた後、培地について、１０種の抗血清混合物（ＰＦＡ）及びスパイサ ーーエドワード・ポリバレント（Ｓｐｅｃｅｒ−Ｅｄｗａｒｄｓ　ｐｏ＋ｙｖａ ＋ｅｎｔ　）抗血清（ＳＥＡ）調整物を用いて、ＲＩＭＡ、ＥＩＭＡにより、サ ルモネラの検出を行なった。第１９表（ＥＩＭＡ）に放射活性及び吸光度レスポ ンスが示されている。高いレスポンス値は、単独であるいは他のエンテロバクテ リアと共に培養したいずれでも、すべてのサルモネラについて得られている。デ ータはまた、ＳＥ、Ａに比べてＰＦＡが優れていることを示しているＰＦＡにつ いて得られる特異的結合放射活性と特異的吸光度は、ＳＥＡのそれよりも、有意 にすぐれている（Ｐ＜Ｏ，ＯＯｌ及び＜０．０５、ｔ−テストによる）。

補正書の翻訳文提出書（特ｒ醜第１８４条の７第１１１１）昭和６１年９月１２ 日 礪

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．サルモネラ・オラニエンブルク（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｏｒａｎｉｅｎｂｅ ｒｇ），サルモネラ・エンテリテイデイス（Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒ ｉｔｉｄｉｓ），サルモネラ・ケンタツキー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｋｅｎｔ ｕｃｋｙ），サルモネラ・ウエイクロス（Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ　ｗａｙｃｒｏ ｓｓ），サルモネラ・アポルタス−エクイ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ａｂｏｒｔ ｕｓ−ｅｑｕｉ），サルモネラ・テネシー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｅｎｎｅ ｓｓｅｅ），サルモネラ４，１２：ｄ：−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　４，１２： ｄ：−），サルモネラ１，４，５，：−：１，２（Ｓｓｌｍｏｎｅｌｌａ　１， ４，５，：−：１，２），サルモネラ・ウオーシングトン（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ　ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）及びサルモネラ・リイリー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌ ａ　ｌｉｌｌｅ）からなる群より選ばれる少なくとも８種のサルモネラ（Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ）血清型の鞭毛に対する各々の抗血清の混合物からなる調整物で あつて、実質的にすベてのサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型と反応し 得る抗血清調整物。
2. ２．調整物が、すベてのサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型の鞭毛に対 する各々の抗血清を含む、請求の範囲第１項記載の抗血清調整物。
3. ３．サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）血清型が、サルモネラ・オラニエンブ ルク（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｏｒａｎｉｅｎｂｕｕｇ）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ． １２５４），サルモネラ・エンテリテイデイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔ ｅｒｉｔｉｄｅｓ）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ．１２６７），サルモネラ・ケンタツキ ー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ．１２８５ ），サルモネラ・ウエイクロス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｗａｙｃｒｏｓｓ）（ Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ．１３１２），サルモネラ・アポルタス−エクイ（Ｓａｌｍｏ ｎｅｒａａｂｏｒｔｕｓ−ｅｑｕｉ）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ．１４５１），サルモ ネラ・テネシー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｅｎｎｅｓｓｅ）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．Ｎ Ｏ．１６２３），サルモネラ・４，１２：ｄ：−（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ４，１ ２：ｄ：−）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ．１６３４），サルモネラ１，４，５，１２： −：１，２（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ１，４，５，１２：−：１，２）（Ｓ．Ｒ． Ｌ．ＮＯ．１６３５），サルモネラ・ウオーシングトン（Ｓａｌｎｏｎｅｌｌａ 　ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ．１６９５）及びサルモネラ・ リイリー（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｌｉｌｌｅ）（Ｓ．Ｒ．Ｌ．ＮＯ．１７２１ ）である請求の範囲第１項又は第２項記載の抗血清調整物。
4. ４．鞭毛が、ｐＨ３以下の培地でバクテリアを１時間以内培養し、バクテリア細 胞を採集し次いでテポリマー化された鞭毛を抽出したものである請求の範囲第１ 項〜第３項のいずれか１項記載の抗血清調整物。
5. ５．バクテリアをＰＨ２以下の培地で培養する請求の範囲第４項記載の抗血清調 整物。
6. ６．バクテリアをＰＨ３以下の培地で２０〜４０分間培養する請求の範囲第４項 記載の抗血清調整物。
7. ７．各々の抗血清成分が、動物をアジユバントと共に鞭毛を皮下注射して免疫し て産生する抗体である請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の抗血清調 整物。
8. ８．水酸化チタン（ＩＩＩ）（ｔｉａｔｎｏｕｓ　ｈｙｄｒｏｘｙｏｘｉｄｅ） と共にバクテリアの培地を振とうすることから成る、固体相面上にバクテリアを 固定化する方法。
9. ９．バクテリアがサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属である請求の範囲第８ 項記載の方法。
10. １０．バクテリアの培地を水酸化チタン（ＩＩＩ）とともに少なくとも５分間振 とうする請求の範囲第８項記載の方法。
11. １１．バクテリアの培地を水酸化チタン（ＩＩＩ）とともに少なくとも８分間振 とうする請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．被検物中のバクテリアを固体相面上に固定化し、固体相面上の不使用の面 上をマスクするためにクウエンチング試薬を加え、請求の範囲第１項〜第３項の いずれか１項記載のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｈ抗血清調整物を加え 、次いで結合した抗体を検出することから成る被検物中のサルモネラ（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ）血清型の検出方法。
13. １３．固定化する前に、被検物を培養する請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．バクテリアを水酸化チタン（ＩＩＩ）上に固定化する請求の範囲第１２項 又は第１３項記載の方法。
15. １５．結合した抗体をラジオイムノアツセイ法により検出する請求の範囲第１２ 項記載の方法。
16. １６．結合した抗体をエンザイムイムノアツセイ法により検出する請求の範囲第 １２項記載の方法。