JPS62501233A - 免疫精製における細胞に適用しうる分離のための製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫精製における細胞に適用しうる分離のための製品 本発明は生物学的媒体から細胞またはウィルスを分離するための製品に関する。

それは浮動性である粒子、即ちそれらが使用される媒体の密度より小さい密度を 有する粒子からなり、かかる粒子は抽出されるべき細胞に特定固定（結合）でき る巨大分子で被覆されている。

本明細書において「細胞」なる語によってバクテリア、細胞（動物または植物の ）、および遺伝的組換えによって得られる細胞を意味する。本発明はまた他の微 生物およびウィルスにも適用する。

免疫精製法において現在まで使用されている不溶性キャリヤーは一般に「ナイロ ン」の粒子、ガラス球、ポリスチレン球、シリカゲルまたはセルロース、アガロ ース、アクリルアミド、デキストラン等の誘導体を基にしたゲルである。

しかしながらかかるキャリヤーが球の形で存在するとき、それは分離されるべき 細胞と同時に沈降する欠点を有する。

近年かかる困難を克服するため、磁性ゲル、即ち現在までの種類と同じ種類であ るが、その中に磁荷を含有するゲルが脚光をあびて来ている。

それにも拘らずかかる粒子は高密度のものであり、急速に沈着し、ときには例え ば細胞精製法における細胞の如き分離された物質を部分的に破壊（機械的摩擦に よる破壊）する。更にこれらのゲルは磁界による分離を容易にするための装置（ 磁石）の使用を必要とする。

また分離されるべき細胞の密度を変えるため赤血球も使用された（バイオロジカ ル・アプストラクッ、第７８巻１９８４年、黒１９５６４、ジエイ・ウオームミ ースター等「ア・シンプル・メソッド・フォア・インムノセレクテイブ・セル・ セパレーション・ウィズ魯ザ魯アビシノービオチン・システム」、およびジャー ナル・オプ・インムノロジカル・メソッド、第６７巻第２号：３Ｂ９．３９４． １９８４年およびバイオロジカル・アプストラクッ、第６８巻１９６９年、４６ ７６４２、ジエイ・ダブリュー・ストッカー等「セパレイジョン・オプ・ヒユー マン魯七ルスーベアリング・ＨＬＡ　−ＤＲアンテイジエンス・ユージング・ア ーモノクローナル・アンティボディ・リセッティング・メソッド」およびティシ ュ−・アンテイジエンス、第３巻第３号第２１２頁〜第２２２頁１９７９年参照 ）。しかしながら赤血球は次の不都合がわる： １）それらは生物学的媒体中では浮動せず、むしろ細胞の生存が非常に不確実で ある特殊な溶液（フィコールの勾配−メトリシェード）中で浮動する； ２）赤血球の大きさは分離されるべき細胞の大きさと同じ程度の大きさである； 従って赤血球に固定される細胞の数によって種々の密度が大きな限界内で変化す ることがおる； ３）赤血球はそれ自体は工業的製品でない、それは安定化するこ・とが困難であ り、一定の細胞と特殊結合を生ぜしめない。

最後に［パンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）　Ｊと称される平面を用いる細胞の分離 は分析的利用のみを許容する。

本発明の目的は上述した不都合が存在しない製品にあり、分離されるべき細胞に よって担持される物質に対し指向された抗体またはレクチンが固定される低密度 キャリヤーを提供する。使用する粒子は塊々の種類（ポリエチレン、ポリプロピ レン）のおよび変化しうる最大寸法（０，１〜５００μｍ）の種々異なる形（球 、スティック、羽根等）のものでおることができる。例えばそれらはフランス特 許出願第８３０５６１８号に既述された方法により巨大分子のフィルムで被覆さ れる。

分離される細胞によって担持された物質に対して指向された抗体の固着（特定抗 体と称される）は、細胞によって担持される抗原の配向に対する特定抗体の特殊 配向を与えるため「リレーネットワーク」の中間を通って確実にされる。

かかるリレーネットワークの中、本発明による製品は、幾つかの交互層のアビジ ン−ビオチン化化合物系から生ぜしめうる。

固体相へ固定するビオチン化化合物自体が、幾つかのビオチン分子が固定される 巨大分子（アルブミン、ヘモグロビン等の）である。ビオチン残基の各々は順次 アビジン分子に固定できる、このときビオチンに対し４個の固定位置を有するア ビジンはなおビオチン化化合物等の第二層を結合することができ、アビジンの最 後の層はそれ自体ビオチン化された特殊抗体に対し固定位置として作用する。

改変した形の例によれば、上記配向は抗体および抗免疫グロブリン系で得ること ができる： この場合、第一抗体は固体キャリヤーに固定される；かかる抗体は別の動物種（ ラットおよび抗マウス）の抗体を認識する；＃を製される細胞の第二特定抗体は 次いで第一抗体に固定される。有利な改変された形の例は三つの抗体の鎖を使用 することにある激抗体は軽量カッパまたはラムダ鎖に対して有利に指向される。

更に別の形の例によれば系は抗体および抗ハプテン型のものであることができる 。

後者の場合、固体相上で不動態化された抗体は抗ハプテン抗体である、即ち小さ い分子量の分子に対して指向される抗体である。同じハプテンは、抗ハプテン抗 体によってｇ職されることを可能にする化学カップリングにより精製を特徴とす る特定抗体に共有的に更に結合する。

かかる系は遊離ハプテン過剰によってシフトすることにより抗体および抗体複合 体の精製を可能にする。

下記実施例は例示として示し、本発明を限定するものではない。

実施例　１ 細胞性表面抗原に対して指向された単クローンビオチン抗体の本発明による浮動 性アビジン化球への不動態化。

８）アビジン化浮動性球の製造のため、前述したフランス特許出願第８３０５６ １８号の方法を餘照する。使用する材料は生物学的媒体の密度より小さい密度の ポリプロピレンまたはポリエチレンであることができる。球直径は５０〜３００ μｍ台である。アビジン化体へのビオチンの固定化能力を、球１２についてｌ　 ｎ　ｍｏ：ｌまで放射性標識付ビオチンの培養によって評価する。

ｂ）抗体１分子について固定されたビオチンの分子の数を、３Ｈ−ビオチン−Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドによって評価する。

特定表面抗原Ｔ８に対し指向するマウス（Ｂ９−１１）の単クローン抗体をリン パ球サブポピユレーションに吸収させる。ビオチンの２分子を有するかかる抗体 （１ｑ／ｍ１）を、ホスフェートでｐＨ７，４に緩衝した食塩溶液中で４℃で５ 時間培養させてアビジン化体に固定させる。次いで標本をいわゆる保存溶液で完 全に洗浄する。

洗浄および吸引中球の損失はナイロンフィルター「ナイルテツクスＣ，Ｎｙｌｔ ｅｘ　）の使用により避けられ、制御された液体比重測定法の下常・温で乾燥す る。

実施例　２ 単クローンビオチン化ラットおよび抗マウス免疫グロブリン鎖に抗体（ＲＡＭＫ 　）の腕の中間による細胞状表面抗原に対し指向された単クローンマウス抗体の 浮動性アビジン化体の不動態化。

１分子について２個のビオチン分子を有する単クローンＲＡＭ’に抗体を球に固 定するため実施例１に記載した如く操作する。抗体Ｂ９−１１へのＲＡＭＫ球の 結合能力を球１？について１００μＶに放射性標識付したＢ９−１１の培養によ り評価する。

ＲＡＭＫを有する球を洗浄し、乾燥した後、ホスフェートｐＨ７，４で緩衝した 食塩謀体中で４℃で１６時間培養して１■／１ｎｌｌの濃度で単クローンマウス 抗体を結合する。

実施例】に記載したのと同じ方法で、球を保存のため洗浄し、乾燥する。

実施例　３ 単りローンビオチン化マウス抗ラット免疫グロブリン、カッパ鎖、抗体（ＭＡＲ Ｋ　）および単クローンラット抗マウス免疫グロブリン、カッパ鎖、抗体（ＲＡ ＭＫ　）の腕の中間による細胞状表面抗原に対し指向された単クローンマウス抗 体の浮動性アビジン化体の不ｗＪ態化。

ａ）ビオチン２分子を有する抗体ＭＡＲＫの１分子を球に結合するため実施例１ に記載した如く操作する。かかる球ＭＡＲＫは１２についてラット抗体１００μ ？を固定する能力を有する；かかる能力は放射性標識付単クローンラット抗体の 培養によって評価する。

球ＭＡＲＫは４℃で１６時間開）Ｉ７．４のホスフェートで緩衝した食塩水中１ ■／−の濃度で抗体ＲＡＭＫと培養する。単りローン放射性標識付マウス抗Ｂ９ −１１への球ＶＩＡＲＫ−ＲＡＭＫの結合能力は２ｑ／を球に評価される。

同じ条件で洗浄後、球ＭＡＲＫ−ＲＡＭＫを１ｑ／ｍＱの濃度で単クローンマウ ス抗体で培養し、次いで再び保存のため洗浄し、乾燥する。

ｂ）単クローンラット抗体を固定するため、アビジン化体への抗体の固定の順序 を交換することを考慮して同じ方法でそれを行なう。

インビトロ試験 Ａ：上述した種々異なる球系を用いＨＰＢＡＬＬラインのリンパ芽球細胞Ｔの固 定。

少量の球（約１ｑ）を、時々攪拌しつつ常温で２０分間】Ｏ％ＦＯ８％ＲＰＭＩ 　５　Ｘ　１０−’細胞／−で、細胞状ＨＰＢＡＬＬ懸濁准１００μにで培養す る。

球をｐＨ７，４ホスフエートで緩衝した食塩水で洗い、その後光学顕微鏡で観察 する。球１個についての可視結合細胞の数を計数する。

ａ）Ｂ９−１１を有する球（実施例１）による細胞の固定。

ｂ）Ｂ９−１１に有するＲＡＭＫ球（実施例２）による細胞の固定。

ｃ）Ｂ９−１１を有する球ＭＡＲＫ−ＲＡＭＫ　（実施例３）による細胞の固定 。

３檜の球、ａ）、ｂ）、およびＣ）に対し、特定抗体を有しないｖ８球は何ら特 定細胞状固定を示さない。

ａ）の場合、球１個について、２〜３個の細胞が観察される。

ｂ）の場合、球１個について１０〜２０個の細胞が観察され、Ｃ）の場曾、球１ 個について２０個より多くの細胞が観察される。

Ｂ：種々の単りローンマウス抗リンパ球Ｔ抗体を有する球ＭＡＲＫ　−ＲＡＭＫ でのＨＦＢＡＬＬラインのリンパ芽球細胞Ｔの固定。

Ａに記載した如く操作する。

下記のスケールを設ける。

−球１個について固定された細胞１未満。

十　球１個について固定された細胞１〜４゜＋十　球１個について固定された細 胞４〜１０゜＋十十球１個について固定された細胞１０〜２００＋＋＋十球１個 について固定された細胞２０より大。

試験した単クローン抗体のリスト 抗体　特異性　固定スケール ２５．３　１ＦＡ−１＋＋ Ｃ：予め特定率クローンマウス抗体で培養し、次いで球ＭＡＲＫ　−ＲＡＭＫと 接触させてＨＰＢＡＬＬラインのリンパ芽球細胞Ｔ５Ｘ］Ｏ’細胞／ｙＪで細胞 状ＨＰＢＡＬＬ懸濁液１００μλを直接率クローン抗リンパ球Ｔ１マウス抗体で 培養する。同じ大塩水溶液で２回洗浄して過剰の抗体を除去し細胞を再び媒体Ｒ ＰＭ１１０％ＦｏＳ中に懸濁させる。

第二培養段階で、細胞状懸濁液を５Ｘ１０’細胞／−の濃度で球ＭＡＲＫ−ＲＡ ＭＫ　１　Ｆの存在中に入れる。

光学顕微鏡を用い、特に単一段階での培養中ネガティブＢＬ、の場合において、 細胞状固定における僅かな増大が観察される。

実施例　４ フルオログラフィ分析によってｌｓ［された骨ずいのリンパ球標本および末梢血 液のリンパ球標本から細胞状サブポピユレーションの除去。

末梢血液および骨すいからのリンパ球の分離をＢｏｙｕｍ　、　Ａによって既に 発表されたＦＩＣＯＬＬについての５度法で行なう（５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｃ１ １ｎ、　Ｌａｂ、工ｎｖｅｓｔ、　、　２（５ｕｐｒ１．９７　）　７７　。

１９６８）。

細胞の生存率をトリバンブルー排隙でチェックし、９５チより大でおると推定さ れる。

ＲＰＭ工、１０チＦＣ！Ｓ　ｌゴ中４Ｘ１０’細胞を回転撹拌下（５ｒｐｍ　） 常温で２時間乾燥ＭＡＲＫ−ＲＡＭＫ　Ｂ　９−１１球２０ｍｇを用い培養する 。参考例球を用い同じ培養を行なう。

培養完了時に、未反応細胞を傾瀉およびナイテックスフィルターを用いて吸引し て回収する。回収した細胞を計数し、参考例球と比較したとき、Ｂ９−１１で処 理した場合、３０〜５０チの減少細胞数が観察される。

回収したリンパ球を４℃で１時間２０μりのＢ９−１１を用いウシアルブミン０ ．２チを含有する食塩ポスフェート媒体中で培養する。洗浄後、フルオログラフ ィ分析のために作り、フルオロインチオシアネートで標色付けした螢光山羊抗マ ウスプローブを用い細胞を培養する。

末梢血液は抗体Ｂ９−１１を有するポジティブ細胞３゜チを含有する。参考例球 で処理したものは、その全部を保持している；抗体Ｂ９−１１を有する球による 処理ではがかる抗体に対しポジティブ細胞の全部を失う。

抗体Ｂ９−１１で５〜１０チのボジティビティを有する参考例球で処理した骨ず いのリンパ球は、Ｂ９−１１を有する球での処理に続いて、Ｂ９−１１を有する ネガティブになる。この同じリンパ球骨すいポピユレーションで】５チのボジテ イビティを有するＡＬＢい急性白血病の抗原に対する抗体（ＣＡＩ、ＬＡ　）は 球Ｂ９−１１で処理後１７％でポジティブでおる。

実施例　５ 移植するため骨ずいの試料を処理するために本発明による製品の利用。

これは本発明による製品にとって特に重要な応用である。

抗細胞Ｔ抗体を有する実施例２および３における如く処理した球１０〜３０ｆを 乾燥し、４５０　ｙ！の輸血袋（ｂｌｏｏｄｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｏｕｃｈ　） 中に入れる。その全体を通常の方法でγ線に曝露して滅菌する。使用時に球を緩 衝溶液で再湿潤し、次いで予め遠心分離し、Ｆ工０ＯＬＬバリヤーで半精製した 骨すい試料を導入し、球と細胞の間の接触を与えるゆっくりとした回転をしつつ ２時間球の存在下においた。傾瀉後、球に結合しなかった細胞を、患者に注射し 、患者の骨ずいの再構成をする。

一般に本発明による製品は非常に大きい利用分野を見出す。非限定的方法で、下 記応用をあげることができるニー移植骨ずいからのＴ細胞の除去、 ＝繊維芽細胞の細胞培養からの除去、 −抗ＨＬＡ抗体または抗−β−ミクログロブリンを使用する脱臼血球（ｄｅｌｅ ｕｋｏｃｙｔｅｌ　）血液の製造、の如きそれが分取型（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖ ｅ　ｔｙｐｅ　）の細ｍ遷択の場合、または −パンクレアチンＢ細胞の製造（ランゲルハンス島でのインシュリンの製造）Ｓ −汚染培地からの細胞または微生物の回収、の如きポジティブ分離の細胞選択の 場合、または−ＴおよびＢリンパ球の場合における減少（５ｕｂｔｒａｃｔｉｖ ｅ　）操作、 ＋　リンパ球Ｔ４＋およびＴ８＋サブポピユレーション、−白血病細胞（０ａｌ ｌｌＬ”　）等 の如き分析型の細胞選択の場合、または−ポジティブ検出（細胞状抗原を用いる 細胞との反応後味の標職付け） の細胞選択の場合、または 一しア番サブポピユレーションの定址化等がある。

また（例えば飲料用水をコントロールする）大量の試料からのウィルスの濃度、 検出、同定、生物学的媒体の梢製に本発明の製品を応用する可能性をあげること ができる。

本発明を純粋に例にて説明しただけであり、全くこれに限定するものではないこ と、均等的に個々の改変が本発明の範囲を逸脱することなく当業者にとってなし うろことを理解すべきでおる。特に一定の抗体をレクチンによって本発明による 製品で置換できる。

ｒｆｆｉｌＥ！”Ｊ害浦牛 Ａ？ＪＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＲＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ、５ＥＡＲＣＨＲＥ ＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．抽出される細胞に特定的に固定できる巨大分子で被覆され、細胞が抽出され る媒体の密度より小さい密度の、かかる細胞の固定を可能にするため特定指向性 が与えられた微細なキヤリヤーからなる細胞に適用できる分離用製品。
2. ２．微細キヤリヤーが、ポリエチレンおよびポリプロピレンからなる群から選択 した単位密度より小さい密度を有する材料の直径１０〜５００μｍの球で構成さ れている請求の範囲第１項記載の製品。
3. ３．上記巨大分子を単クローンおよび多クローン抗体の中から選択する請求の範 囲第１項記載の製品。
4. ４．巨大分子がレクチンである請求の範囲第１項記載の製品。
5. ５．上記キヤリヤーの被覆が幾つかの交互層のアビジン−ビオチン化化合物によ つて提供される請求の範囲第１項記載の製品。
6. ６．キヤリヤーから出発して、連続被覆層がビオチン化アルブミン−アビジン− ビオチン化抗体１−抗体２−抗体３−等である請求の範囲第１項記載の製品。
7. ７．抗体３が精製される細胞の特定抗体であり、抗体２が抗体３の軽量鎖に対し て指向され、抗体１が抗体２の軽量鎖に対して指向されている請求の範囲第６項 記載の製品。
8. ８．抗体２がマウス抗体のカツパ鎖に対して指向された単クローンラツト抗体で あり、抗体１がラツト抗体のカツパ鎖に対し指向された単クローンマウス抗体で ある請求の範囲第７項記載の製品。
9. ９．上記キヤリヤーの被覆が抗体−免疫グロブリン系で確実にされている請求の 範囲第１項記載の製品。
10. １０．上記キヤリヤーの被覆が抗体−抗ハプテン系からなる請求の範囲第１項記 載の製品。
11. １１．抗体がヒト白血球サブポピユレーシヨンに対し指向されている請求の範囲 第３項記載の製品。
12. １２．Ｔ細胞に対し指向されている抗体を有する微細キヤリヤーが移植されるべ き骨ずい試料の精製を可能にするに充分な量で使用に供する袋中に入れる請求の 範囲第３項記載の製品。
13. １３．生物学的等の媒体の精製、ウイルスの濃縮、検出および同定の分取または 分析の細胞選択分野への請求の範囲第１項記載の製品の応用。