FI82986C - Foerfarande foer koncentration och detektering av biomolekyler och celler. - Google Patents

Description

1 82986

Menetelmä biomolekyylien ja solujen konsentrolmiseksl ja detektoimiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää biologisten ainei-5 den, joilla on affiniteettiominaisuuksia, detektoimiseksi.

Tähänastiset menetelmät biologisten ja biokemiallisten materiaalien tutkimiseksi ovat olleet epätyydyttäviä, koska usein on ollut vaikea konsentroida mainittu materiaali tutkimista varten. On käytetty erilaisia menetel-10 miä, kuten pyörityskuivausta ja ultrasuodatusta, analysoitavan biologisen ja biokemiallisen materiaalin suuremman pitoisuuden aikaansaamiseksi. On kuitenkin käynyt ilmi, että on useita molekyylejä, joita ei voida konsentroida tällä tavalla, ja esimerkkejä niistä ovat antigeenit, nuk-15 leiinihapot, hormonit, entsyymit, ligandit, jne. Mainittujen menetelmien vakavana epäkohtana on se, että myös kon-taminoivat molekyylit konsentroituvat ja häiritsevät halutun materiaalin detektointia.

Tämä keksintö koskee menetelmää biologisten ja 20 biokemiallisten materiaalien, joilla on affiniteettiomi-naisuuksia, konsentrolmiseksl erottamalla. Tämä saadaan aikaan antamalla juoksevassa näytteessä olevan detektoitavan materiaalin, jolla on affiniteetti toisen materiaalin, kuten antigeeni-vasta-aineen, DNA-DNA:n, DNA-RNA:n, RNA-25 RNA:n lektiini-reseptorin, ligandin samoin kuin muiden reseptorien, esimerkiksi fagien ja virusten suhteen, kulkea yli kiinteän pinnan, jolle toinen materiaali, jonka suhteen detektoitavalla materiaalilla on affiniteetti, on kiinnitetty, siten että juoksevan aineen tilavuuteen ver-30 rattuna moninkertainen tilavuus ylittää pinnan. Tämän virtauksen aikana detektoitava materiaali kiinnittyy toiseen materiaaliin, jonka suhteen sillä on affiniteetti, ja muodostaa kompleksin, joka voidaan todeta erilaisten markke-rien, kuten entsyymien, radioaktiivisuuden, laser-sätei-35 lyn, jne avulla. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista patenttivaatimuksissa mainitut toimenpiteet.

2 82986 Tämän keksinnön mukainen detektointimenetelmä voidaan automatisoida ja sen herkkyys voidaan kohottaa ainakin kymmenkertaiseksi tähän asti tunnettuihin meneteImiin-kuten ELISA:an ("enzyme-linked immunosorbent assay"), jos-5 sa käytetään mikrolevyjä, tai RIA:han (radioimuunianalyysi), immuunitluoresenssiin, jne nähden /Voller, A., Bartlett, A. ja Bidwell, D:E., "Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques", J. Clin, Pathol- 31 (1978) 507-520; Overby, L.R. ja Ilushahwar, J.K., "Radioimmune 10 assays"teoksessa Rapid diagnosis in infectious disease, toim. M.W. Rytel, CRC Press, Boca, Fla., 1979, s 39-70; Dahle, A.B. ja Laake, M., "Diversity dynamics of marine bacteria studies by immunofluorescent staining on membrane filters", Appi. Environ. Microbiol., 43 (1982) 169-1767.

15 Virtaussuhteesta ja virtausajasta riippuen saavu tetaan huomattavasti alhaisempi havaitsemisraja. Baktee-ripitoisuus ja sidottujen aineiden määrät ovat muita muuttujia. Sidotun aineen määrä kasvaa spesifisyyden kasvaessa.

Virtausmäärä täytyy testata kullakin kerralla, ja 20 se riippuu mm detektoitavien molekyylien koosta.

Kiinteä pinta voi olla mikä tahansa immobilisoitu kiinteä pinta, mutta se on edullisesti hydrofobinen ja koostuu polymeerisistä aineista, kuten lasista, muovista, metallista, piistä, jne. Sitoutuminen mainitulle pinnal-25 le saadaan aikaan 1) passiivisella adsorptiolla hydrofobiselle pinnalle tai 2) immobilisoimalla spesifinen molekyyli, esimerkiksi vasta-aine, entsyymi tai antigeeni, kiinteään faasiin adsorption tai kovalenttisen sitoutumisen kautta.

30 Juokseva näyte voi koostua vedestä tai vesipohjai sista systeemeistä, esimerkeiksi puskurista, elimistön nesteistä, sykloniväliaineisiin imeytetyistä ilmanäytteis-tä tai soveltuviin puskurisysteemeihin uudelleensuspendoi-duista kiinteistä näytteistä, jotka sisältävät detektoita-35 vaa ainetta.

3 82986

Bakteeritutkimuksessa on havaittu edulliseksi, että näyte sisältää vähintään 10^ bakteeria/ml siihen sus-pendoituneena, mutta niinkin pienet bakteerimäärät kuin 10 /ml olivat detektoitavissa.

5 Halutun aineen pitoisuutta voidaan pienentää ja saada silti havaittavuusrajan ylittäviä tuloksia, jos näytteen tilavuutta suurennetaan.

Keksintöä rajoittamaton esimerkki tämän keksinnön mukaisesti käytettävästä välineestä esitetään liitteenä 10 olevassa kaavakuvassa, joka esittää immunologisen menetelmän avulla toteutettavaa konsentrointimenetelmää (kuv.l).

Näytettä (1), joka sisältää esimerkiksi antigeeniä, pumpataan pumpulla (2) putkeen (3),jonka sisäpinnoille on sidottu vasta-aineita. Näytteen virratessa putken läpi an-15 tigeenit tarttuvat vasta-aineisiin ja muodostavat kompleksin, joka todetaan erilaisten markkerien, esimerkiksi alka-lisen fosfataasin kanssa tapahtuvan värireaktion, avulla.

Tähän asti käytetyillä tutkimusmenetelmillä, kuten edellä mainituilla ELISA-menetelmillä, on rajoituksia pie-20 nimpien havaittavissa olevien antigeenimäärien (herkkyyden) suhteen. Erilaisia suoria pitoisuutta kasvattavia keinoja, kuten sentrifugointia ja ultrasuodatusta, on, kuten edellä mainittiin, käytetty pitoisuuden ja herkkyyden suurentamiseksi saavuttamatta tyydyttäviä tuloksia.

25 Kaniineista, jotka olivat saaneet Francisella tula- rensisista (tularemian aiheuttaja) peräisin olevia antigeenejä, saatujen vasta-aineiden kykyä tunnistaa kokonaisia F.tularensis-bakteereja tutkittiin. Tällöin havaittiin, että vasta-aineet sitoutuivat bakteerien pintoihin ja nii-30 tä voitiin käyttää diagnostisena välineenä. Kehitettiin mainittuihin vasta-aineisiin perustuva tutkimusjärjestelmä, jossa markkerivasta-aineet oli affiniteettipuhdistettu antigeenejä vastaan ja leimattu alkalisella fosfataasilla.

Kun mainittua diagnostista järjestelmää testattiin 35 kokonaisilla F. tularensis-bakteereilla käyttämällä niin 4 82986 kutsuttua mikrolevy-ELISAia, havaittiin, että pienin selvästi havaittavissa oleva bakteerimäärä mainitulla menetelmällä oli 105 bakteeria/ml (kuva 2).

Sentrifugoimalla tai ultrasuodattamalla tehty kon-5 sentroiminen antoi saman analyysituloksen (ts ei havaittu lisääntymistä, ei kuvassa).

Tularemian epidemiologiaa koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että F.tularensis voi esiintyä vedessä ja ilmassa ja se voi levitä niiden kautta. Siten on tullut 10 esiin tarve saada aikaan pieniä bakteerimääriä sisältävän veden ja ilman tutkimismenetelmä. Toinen olemassa oleva tarve on pystyä tutkimaan hyvin pieniä näytteitä, kuten elimistön nesteitä.

Kuten edellä mainittiin, osoittautuivat ELISA-mene-15 telmät käytössä epätyydyttäviksi, koska pienimmät mainituilla menetelmillä havaittavissa olevat bakteerimäärät vastaavat pitoisuutta 10^ bakteeria/ml.

Siksi tehtiin kokeita, joissa käytettiin hyväksi F. tularensisin affiniteettia tiettyihin vasta-aineisiin 20 testin herkkyyden parantamiseen.

Pinta-antigeeni valmistettiin G. Sandströmin, A. Tärnvikin, H. Wolf-Watzin ja S. Löfgrenin kuvaamalla tavalla /''Preparation of antigen from Francisella tularensis for demonstration of antibodies by the ELISA", FOA Report 25 C 4Q179-B 3, kesäkuu 1983, Uumaja, Ruotsi/.

Eristettiin pinta-antigeeni /Sandström et ai., Inf. Imm. 45 (1984) 101-1067, joka immunisoidussa kaniinissa sai aikaan spesifisten F.tularensisin vastaisten vasta-aineiden muodostumisen /Sandström, G. ja Wolf-Watz, H., 30 "Rapid identification of Francisella tularensis in water", FOA Report C 40188-B 3, marraskuu 1983, Uumaja, Ruotsi/. Kaniinin seerumit

Kaniinit immunisoitiin F.tularensis-antigeenilla G. Sandströmin ja II. Wolf-Watzin kuvaamalla tavalla 35 /"Rapid indentification of Francisella tularensis on l: 5 82986 water", FOA Report C 4Q188-B 3, marraskuu 1983, Uumaja, Ruotsi/,

Affiniteettipuhdistus ja alkalinen fosfataasi-liittäminen kaniinin vasta-aineisiin 5 Elävän F.tularensis-rokotekannan (F.tularensis LVS) toimitti the US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, Fort Detrick, Frederick, Md., USA. Villin F.tularensis var. palaerctica-kannan (kanta SBL R45) toimitti R. Möllby, The National Swedish Bacteriolo-10 gical Laboratory, Tukholma, Ruotsi.

Näiden kahden F.tularensis-kannan bakteereja kasvatettiin muunnetulla Thayer-Martin-agarilla, joka sisälsi Gc-alustapohjaa (36 g/1; Difco Laboratories, Detroit,

Mich., US), hemoglobiinia (10 g/1, Difco) ja IsoVitalexia 15 (1Q mg/1; BBL Microbiology Systems, Cockneysville, Md.,

O

US) 37 C:ssa ilmassa, joka sisälsi 5 % CC^ja. Bakteeripopu-laatio määritettiin laskemalla elävät bakteerit.

Nestekoe:

Vesijohtoveden pH säädettiin arvoon 5,0 käyttämällä 20 0,01 M suolahappoa. Kuhunkin näytteeseen lisättiin Tween® 20:ä pitoisuudeksi 0,05 tilavuus-%. F.tularensis-bakteere- 12 3 4 ja suspendoitiin pitoisuuksiksi 0, 10 , 10 , 10 , 10 ja 5 vastaavasti 10 /ml, tai vaihtoehtoisesti sykloniväliainee-seen lisättiin 0,05 tilavuus-% Tween® 20 :ä /Olsson, T. , 25 Stymne, S. ja Thore, A., "Detektion av bakterieaerosoler med luminescensanalys 1. Luminescensanalys av luftpro-ver", FOA Report C 40061-B 2, 1977, Ursvik, Ruotsi/. Vertailuesimerkki Antigeeni - vasta-aine 30 Mikrolevy-ELISA suoritettiin suurin piirtein

Vollerin, et ai. menetelmällä /"Enzyme immuno assays with special reference to ELISA techniques", J. Clin, Pathol.

31 (1978) 507-5207· F.tularensis-antigeenin vastaisella kaniinin antiseerumilla, joka oli laimennettu suhteessa 35 100:1 (ELISA-tiitteri 1:5000) 0,05 M natriumvetykarbo- 6 82986 naattipuskurilla, pH 9,6, päällystettiin mikromaljat (Flow Laboratories Svenska AB, Tukholma, Ruotsi). Baktee-risuspensiot lisättiin mikrolevyille, joita inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa. Seuraavassa vaiheessa annettiin liuok-5 sen, joka sisälsi affiniteettipuhdistettuja, alkalisella fosfataasilla leimattuja F.tularensis-antigeenin vastaisia kaniinin vasta-aineita, vaikuttaa tunnin ajan 37°C: ssa. Reaktio kehitettiin lisäämällä entsyymin substraattia, ja mitattiin absorbanssi aallonpituudella 405 nm.

10 Siten saadut tulokset esitetään kuvassa 2 ja taulukossa 2.

Esimerkki

Antigeeni - vasta-aine

Menetelmä toteutettiin muoviputkissa (Tygon^5/;

Noax AB, Tukholma, Ruotsi), jotka oli yhdistetty peristalt-15 tiseen pumppujärjestelmään (Technicon Corp., Ardesly, USA). Putken tilavuus oli 40^ul/cm putkea. Kussakin kokeessa järjestelmään yhdistettiin 10 cm putkea. Stationääritilassa olevan antiseerumin annettiin asettua pinnalle yön yli huoneen lämpötilassa. Tutkittavia näytteitä johdettiin 20 putken läpi virtausnopeudella 1,9 ml/min (kuv. 3).

Joissakin kokeissa tutkittavat näytteet olivat paikallaan putkessa, kun taas toisissa kokeissa näytteen annettiin virrata putken läpi.

Huuhtelun jälkeen tehtiin käsittely paikallaan ole-25 villa alkalisella fosfaatilla leimatuilla vasta-aineilla 37°C:ssa tunnin ajan. Putket irroitettiin pumppujärjestel-mästä ja leikattiin kummastakin päästä 5 cm:n pituisiksi, ja lisättiin alkalisen fosfataasin substraattia. Kun oli inkuboitu 37°G:ssa 3Q min, kunkin putken sisältö (200^ul) 30 siirrettiin mikrolevyn syvennykseen, ja mitattiin absorbanssi aallonpituudella 405 nm. Kustakin näytteestä tehtiin kolme rinnakkaismääritystä, ja laskettiin keskiarvot.

Kun näytteet olivat olleet paikallaan putkessa, saatiin pienempiä ELISA-arvoja kuin silloin, kun näytteet 35 olivat virranneet putken läpi (kuva 3).

7 82986 Käyttämällä tämän keksinnön mukaista menetelmää saatiin aikaan suurempi herkkyys. Tutkittavan näytteen määrän ollessa rajoittamaton on mahdollista havaita niin-kin pienin F.tularensis-pitoisuus kuin 10 /ml (kuva 4).

5 Elävien F.tularensis-bakteerien laskenta ennen putken läpi kulkemista ja sen jälkeen ei osoittanut mitattavissa olevaa bakteerien vähenemistä.

Tutkittiin mahdollisuuksia kierrättää erilaisia tilavuuksia F.tularensisia sisältäviä tutkittavia näyttei-10 tä. Pienin tilavuus, jota käytännössä voitiin kierrättää, oli 5 ml tutkittavaa näytettä. Herkkyys kasvoi vähintään 10-kertaiseksi (kuva 5), yleensä 10- - 100-kertaiseksi suhteessa tutkittavan näytteen kierrätysaikaan (kuva 4). Kier- 4 rättämällä 10 F.tularensis-bakteeria suspendoituina 5, 15 15 ja 5Q ml:aan nestemäistä näytettä 18 tunnin ajan saatiin tutkittavan näytteen määrästä riippuvalla tavalla kasvavia arvoja (taulukko 1).

Kun erilaisia tilavuuksia F.tularensisia sisältäviä näytteitä johdettiin F.tularensisin suhteen spesifisillä 20 vasta-aineilla päällystetyn putken läpi, havaittiin bakteerien rikastuminen putkeen. Kun putken läpi johdettiin suurehkoja tilavuuksia, saavutettiin vakiotaso (kuva 3) todennäköisesti siitä syystä, että kaikki antigeenin tart-tumiskohdat oli jo käytetty eikä siten ollut mahdollista 25 sitoa enempää bakteereja.

Samanlaisia tuloksia saavutettiin, kun F.tularensisia imeytettiin sykloniväliaineeseen, johon oli lisätty 0,05 tilavuus-% Tween® 20:ä /Olsson, T., Stymne, S. ja Thore, A., "Detektion av bakterieaerosoler med lumi-30 nescensanalys 1. Luminescensanalys av luftprover”, FOA Report C 40061-B 2, 1977, Ursvik, Ruotsi/.

Ligandi-ligandi-vuorovaikutus E.coli (HB101/pRHU845) agglutinoi A-verta mannoosi-resistentin punasoluagglutinaation kautta. Vuorovaiku-35 tus tapahtuu bakteerien erikoisen proteiinirakenteen 8 82986 ja punasoluilla olevan Gal-NAc (l-^> 3) Gal 2 (1—> 4) Gal (1—>4) GLC-seramidireseptorin välillä.

Muoviputki (Tygon ® ) päällystettiin kokoverellä (A-veri). Putkisysteemin läpi johdettiin E.coli-baktee-5 reja pitoisuuksina 0-5 x 10^ bakteeria/ml. Sen jälkeen lisättiin E.colin vastaisia kaniinin vasta-aineita. Sitten lisättiin tunnin ajan 37°C:ssa anti-kaniini-IgG:tä, joka oli leimattu alkalisella fosfataasilla, ja seurattiin lopuksi absorbanssia aallonpituudella 405 nm lisäämällä X0 alkalisen fosfataasin substraattia. Käyttämällä tätä menetelmää oli mahdollista havaita eri pitoisuuksina esiintyvä E.coli.

Taulukko 1 4

Tulokset, joita saatiin, kun 10 F.tularensisia X5 kierrätettiin vaihtelevissa tilavuuksissa neste mäistä tutkittavaa näytettä 18 tuntia Tilavuus(a) A 405/100 min.

(ml)_O F.tul/ml_104 F.tul/ml 5 0,57 + 0,06 0,87 + 0,13 20 15 0,60 + 0/07 1,13 + 0/20 50 0,68 + 0,05 1,27 + 0,23 ^^Kierrätettiin 18 tuntia A405/100 min = absorbanssi aallonpituudella 405 nm/100 min. Tulokset ovat 3 mittauksen keskiarvoja.

25

Taulukko 2

Tulokset, joita saatiin kokeissa, joissa käytettiin mikrolevy-ELISA:a, tutkimusta, jossa neste oli paikallaan putkessa, ja tutkimusta, jossa neste virtasi 30

Bakteerien Mikrolevy- Neste paikallaan-*. Virtaava neste määrä/fril ELISA putkessa (Tygon^ (Tygon@) muoviputki) ______________muoviputki)_ 105 0,125a 0,335 0,504 104 0,028 0,086 0,162 103 0,000 0,027 0,064 35 (a) Absorbanssi aallonpituudella 405 nm/100 min. Arvoista on vähennet ty arvot, joita saatiin F.tularensisia sisältämättömälle vesijohtovedelle i: 9 82986

Havaittavissa oleva F.tularensis-pitoisuus kasvoi käytettäessä virtaavaa nestettä. Suspensioita, jotka si-3 4 5 sälsivät 10 , 10 ja 10 F.tularensis-bakteeria johdettiin Tygon®-muoviputken läpi, joka oli päällystetty F.tula-5 rensisin vastaisilla vasta-aineilla. Tutkittavan suspension virtausnopeus oli noin 100 ml/3 tuntia. Tämän mene-teämän mukaisesti F.tularensis rikastui, ja havaittavissa olevasta määrästä tuli pienempi kuin mikrolevy-ELISA: 11a havaittavissa oleva määrä.

10 Tygon(?)-muoviputken vaikutusta tutkittiin. Tehtiin ELISA-analyysi, jossa ei tapahtunut virtausta Tygon ®-muoviputken läpi. Nestevirtauksen edut kävivät ilmi myös tässä kokeessa. Saatiin aikaan pienempi havaittavissa oleva määrä kuin mikrolevy-ELISA:ssa.

15 Kuvien selitys

Kuva 1:

Rikastuminen putken seiniin käytettäessä virtaus-järjestelmää. Virtausnopeus oli 1,9 ml/min, ja putken tilavuus oli 4Q^ul/cm. Tutkittavan näytteen joko annettiin 20 virrata suoraan putken läpi tai sitä kierrätettiin. Analyysi tehtiin samalla tavalla kuin mikrolevy-ELISA antigeenin ja vasta-aineen suhteen. Putken pituus oli prosessin aikana 10 cm viimeistä vaihetta, jossa entsyymin substraatti lisättiin, lukuun ottamatta. Putki leikattiin kummas-25 takin päästä 5 cm:n pituiseksi ennen mainittua lisäämistä.

Kuva 2:

Tehtiin ELISA mikrolevyillä. Mikrolevyjä esipäällys-tettiin F.tularensisin vastaisella immuuniseerumilla huoneen lämpötilassa yön yli. Huuhtelun jälkeen lisättiin 30 tutkittavat näytteet, ja annettiin reagoida 37°C:ssa 1 tunti. Sitten lisättiin alkalisella fosfataasilla leimattuja affiniteettipuhdistettuja anti-F.tularensis-vasta-aineita, ja mikrolevyjä inkuboitiin tunti 37°C:ssa. Lopuksi lisättiin entsyymin substraattia, ja mitattiin reaktio 35 30 min:n kuluttua käyttämällä automaattista spektrofotomet- 10 82986 riä. Annetut arvot ovat 16 näytteen keskiarvoja + keskipoikkeama.

Kuva 3: F.tularensisin rikastuminen putken seinään käy-5 tettäessä erilaisia tilavuuksia vettä, joka sisälsi 1(; bakteeria/ml. Kokeen kesto oli 3 tuntia. Annetut arvot ovat 3 näytteen keskiarvoja + keskipoikkeama.

Kuva 4:

Erilaisten F.tularensis-pitoisuuksien havaitsemis-10 taso riippui esipäällystetyn Tygon® -putken läpi virranneen tutkittavan näytteen tilavuudesta. 3 tunnin kuluttua 4 voitiin havaita 10 F.tularensis-bakteeria.

2

Jotta voitiin selvästi havaita niin vähän kuin 10 bakteeria/ml, annettiin noin 4,5 1 näytettä (kaikkiaan 15 4,5 x 103 bakteeria) virrata Tygon® -putken läpi.

Mainittu koe osoittaa, että antigeeniä voidaan rikastaa Tygon® -putken sisäseinälle, jos mainittu putki on päällystetty spesifisillä vasta-aineilla. On myös ilmeistä, että koeaika, ts rikastusaika, riippuu tutkittavassa 20 näytteessä olevien bakteerien määrästä.

Bakteeria/ml Käyrän merkintä 102 o-o

103 A - A

104 25

Keskiarvot + keskipoikkeama 9-12 näytteelle.

Tausta-arvot (vesijohtovesi ilman F.tularensisia) on vähennetty annetuista arvoista.

Kuva 5: 30 F.tularensisin havaitsemistaso, kun tutkittavia näytteitä kierrätetään.

Bakteeria/ml Käyrän merkintä 1Q2 o-o 103 + - + 35 104

1Q5 A _ A

J

11 82986

Mittaukset tehtiin 3, 6, 18 ja 24 tunnin kuluttua. Annetut arvot ovat 10-15 näytteen keskiarvoja + keskipoikkeama.

Kuva 6: 5 Absorbanssi aallonpituudella 405 nm/100 min kokeessa, jossa E.coli-pitoisuus oli 0-5 x 10^/ml. Näytettä kierrätettiin 3 tuntia. Tilavuus oli 5 ml. Tulokset ovat 3 näytteen keskiarvot. Shigella dysenteriaen ja Salmonella typhimuriumin indentifiointi vedestä tämän keksinnön mukaisella 10 menetelmällä (putki-ELISA:11a)

Materiaalit ja menetelmät Bakteerit ja bakteriologiset menetelmät Shigella dysenteriaeta (ATCC nro 27345), Salmonella typhimuriumia (LT2), Escherichia coli 031 ja Pseudomonas aeru-15 ginosaa (kliinisesti eristetty) viljeltiin ravintoliemes-sä (Oxoid, Limited Basingstoke, Hampshire, Iso-Britannia) yön yli, ja laskettiin elävien bakteerien lukumäärät ravin-toagarmaljoilla (Oxoid).

Kaniinien hyperimmunisointi 20 Otettiin ennen ensimmäistä immunisointia verinäyte, ja preparoitiin seerumi vertailuseerumiksi. Antigeenin g (tapettuja bakteereja) pitoisuus oli 10 /ml koko immuni-sointiohjelman ajan. Päivänä 1 ruiskutettiin ihonsisäisesti 0,5 ml yhdessä Freundin täydellisen apuaineen kanssa 25 (Difco Laboratories, Detroit, Mn., USA). Päivinä 3, 5 ja 7 annettiin 2 x 0,5 ml ihonalaisesti yhdessä Freundin täydellisen apuaineen kanssa. Päivinä 14 ja 15 injektoitiin 0,5 ml ja päivänä 18 2 x 0,5 ml lihaksensisäisesti. Lopuksi annettiin viikoittain 0,5 ml lihaksensisäisesti 6 vii-30 kon ajan. Sen jälkeen otettiin verinäyte, preparoitiin seerumi (immuuniseerumi) ja säilytettiin se -70°C:ssa.

Kaniinin seerumin puhdistus ja liittäminen Saostottiin immuuniseerumi (20 ml) lisäämällä yhtä suuri määrä kylläistä ammoniumsulfaattiliuosta. Sakka liuo-35 tettiin 1 ml:aan PBS:ää (fosfaattipuskuroitua suolaliuosta) i2 82986 ja dialysoitiin yön yli PBS:ää vastaan. Dialysoitu vasta-aineliuos sekoitettiin (10:1) PBS:ssä olevien bakteerien kanssa. Seosta inkuboitiin 37°C:ssa 1 tunti ja kuivattiin sitten sentrifugoimalla kierrosnopeudella 2000 min ^ 10 5 min. Pelletit liuotettiin 1 M glysiini-HCl-liuokseen, pH 2,8. Kun liuosta oli inkuboitu 3 tuntia huoneen lämpötilassa, se kuivattiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 2QQ0 min 1 10 min. Supernatanttia (joka sisältää spesifisiä vasta-aineita) dialysoitiin PBSrää vastaan 12 tuntia.

]_g Immuuniseerumista puhdistetut spesifiset vasta-ai neet (2 mg) sekoitettiin PBSrssä 5 mg:aan aikalisiä fosfa-taaseja (Sigma Chemidal Co., St. Louis, Mo., USA) huoneen lämpötilassa. Seosta dialysoitiin 18 tuntia PBSrää vastaan 4°C:ssa. Sen jälkeen lisättiin glutaraldehydiä (25 tila-15 vuus-%:sta) loppupitoisuudeksi 0,2 tilavuus-%, minkä jälkeen inkuboitiin 1-2 tuntia huoneen lämpötilassa. Dialysoitiin PBSrää vastaan yön yli 4°C:ssa, minkä jälkeen dialyy-sineste vaihdettiin 0,05 M Tris-HClrksi, pH 8,0, joka sisälsi 1 mmol/1 MgC^/ ja jatkettiin dialyysiä vielä 24 tun-20 tia 4°C:ssa. Lopuksi lisättiin 1 tilavuus-% naudan seerumi-albumiinia (Sigma). Liitettyjä vasta-aineita säilytettiin tummassa pullossa 4°C:ssa.

Putki-ELISA

Tygon®'-putki (sisäläpimitta 2,2 mm) täytettiin 25 immuuniseerumilla, joka oli laimennettu 10~2:een 0,5 M

natriumkarbonaattipuskurilla (3,47 g/1 NaHCOj ja 1,18 g/1 NajCO^), pH 9,6, ja annettiin päällystyä yli yön huoneen lämpötilassa. Putki leikattiin 10 cm:n pituisiksi paloiksi, jotka yhdistettiin pumppuun (Ismatec SA, Mp 3q 25 GJ4, Laboratoriumstechnik, Apparatenban + Elektronik,

Zurich, Sveitsi), jossa niitä pestiin 154 mM NaCl-liuoksel-la, joka sisälsi 0,05 tilavuus-% Tween 20 ja 0,5 % naudan seerumialbumiinia (Sigma). Näytteitä pumpattiin eri putkien läpi huoneen lämpötilassa 3 tuntia, minkä jälkeen ne 35 pestiin vielä kerran. Putket irroitettiin pumpuista ja täy- I: i3 82986 tettiin liitettyjä vasta-aineita sisältävillä liuoksilla. Inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa, minkä jälkeen putket huuhdottiin ja leikattiin 5 cm:n pituisiksi. Täten preparoidut putket täytettiin p-nitrofenyylifosfaattiliuoksella 5 (Sigma). Kun oli inkuboitu 37°C:ssa 30 min, putkien sisällöt siirrettiin mikrolevyille, ja tehtiin detektointi automaattisen spektrofotometrin avulla (Titertech, Multiscan, Flow Laboratories).

Mikrolevy-ELISA

10 ELISA tehtiin pääosin A. Vollerin, A. Bartlettin ja D.E. Bidwellin kuvaamalla tavalla ^Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques, J. Clin. Pathol. 31 (1978) 507-5207.

Vesinäytteiden käsittely 15 Vesijohtoveteen lisättiin sen verran suoloja ja pinta-aktiivista ainetta, että se vastasi tavanomaisessa ELISA:ssa käytettäviä puskureita ^Engvall, E. ja Perlman, P., Enzymelinked immunosorbent assay. III. Quantitation of specific antibodies by enzyme-labeled anti-immunoglobu-20 lin on antigen coated tubes, J.Immunol. 109 (1972) 129-135; Voller, A., Bartlett, A. ja Bidwell, D.E., Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques, J. Clin. Pathol. 31 (1978) 507-5207·

Tulokset ja niiden tarkastelu 25 Shigella dysenteriaen identifiointi

Oli mahdollista identifioida vähintään 10®/ml S.dysenteriaeta (kuva 1) mikrolevy-ELISA:11a, kun vesi-näytteessä olevia bakteereja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Mainittu pitoisuus on hieman suurempi kuin 4 9 , 30 infektoiva annos, joka on 10 -10 /ml. Herkkyyden parantamiseksi ja mahdollisesti pienempään pitoisuuteen pääsemiseksi (10^/ml) käytettiin putki-ELISA.

Oli mahdollista identifioida pienempiä pitoisuuksia S.dysenteriaeta putki-ELISA:11a (kuva 2) kuin mikrolevy-35 ELISA:11a (kuva 1), koska putki-ELISA on rikastus- ja väli- i4 82986 s·* kointimenetelmä /Sandström, G. ja Wolf-Watz, H., Duct-ELISA. A manner to identify low contents Francisella tularensis, FOA Report C 40202-B3, 19847. Kuvasta 2 käy myös ilmi, että mukaan tulleiden arvojen vaihtelu on 5 tässä menetelmässä suurempi kuin mikrolevy-ELISA:ssa (kuva 1). Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että kokeessa käytettävät vasta-aineet eivät olleet kaikkein spesifisimpiä. Bakteerituotteet täytyy puhdistaa ja käyttää niitä immuno-geenina, jotta saavutettaisiin niin suuri spesifisyys kuin mahdollista. Puhdistettuja Francisella tularensis-baktee-rituotteita /Sandström, G., Tärnvik, A., Wolf-Watz, H. ja Löfgren, S., Antigen from Francisella tularensis; Non-identity between determinants participating in cell-mediated and humoral reactions. Infect. Immun. 7 (1984) 101-106/ 15 on käytetty menestyksellisesti immunogeenina putki-ELISA: ssa /Sandström, G. ja Wolf-Watz, H. Duct-ELISA. A manner to identify low contents Francisella tularensis, FOA Report C 402Q2-B3, 19847. On sangen todennäköistä, että on mahdollista identifioida pienintä infektoivaa annosta vas-20 taavia bakteeripitoisuuksia mainittuja parannuksia käyttämällä.

Shigella dysenteriaen identifiointi kontaminoituneista vesinäytteistä

Kun otetaan eri laatuisia vesinäytteitä, voi syntyä 25 myös epäpuhtauksien aiheuttamia ongelmia. On osoitettu, että putki-ELISA voidaan käyttää mainittujen ongelmien voittamiseen /Sandström, g. ja Wolf-Watz, H., Duct-ELISA.

A manner to identify low contents Francisella tularensis, FOA Report C 40202-B3, 19847. Kun vesinäytteet kontami-30 noitiin P.aeruginosalla, E.colilla ja S.typhimuriumilla ja identifioitiin S.dysenteriae mikrolevy-ELISA:11a ja putki-ELISA: 11a, osoittautui edulliseksi käyttää putki-ELISA (kuva 3). Myös tässä suhteessa voitiin havaita bakteerien selektiivinen rikastuminen putki-ELISA-järjestelmässä.

I: is 82986

Salmonella typhimurlumin identifiointi Jotta osoitettaisiin mahdollisuus identifioida muita veden sisältämiä bakteereja, tutkittiin S.typhimu-riumia. Oli mahdollista rikastaa ja identifioida yli 10 5 kertaa pienempiä pitoisuuksia putki-ELISA:11a kuin mikro-levy-ELISA:11a (kuva 4).

Claims (6)

1. Menetelmä biologisten aineiden, joilla on affi-niteettiominaisuuksia, detektoimiseksi, tunnettu 5 siitä, että juoksevan tutkittavan näytteen, joka sisältää detektoitavaa ainetta, jolla on affiniteetti toisen aineen suhteen, annetaan virrata edullisesti hydrofobisen kiinteän, ts. läpäisemättömän, pinnan, kuten putken sisäpinnan yli, johon pintaan on kiinnitettynä toinen aine, jonka 10 suhteen ensimmäisellä, detektoitavalla aineella on affiniteetti, niin että saadaan aikaan detektoitavan aineen rikastuminen ja aktiivisen pinnan kanssa kosketuksessa olevaan näytetilavuuteen nähden moninkertainen tilavuus juoksevaa näytettä virtaa pinnan yli.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että detektoitava aine ja aine, jonka suhteen mainitulla ensimmäisellä aineella on affiniteetti, ovat antigeeni-vasta-aine, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-lektiini-reseptori tai muu ligandi-reseptori-yhdistelmä.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että virtaus saadaan aikaan pumpulla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virta, jota ei kierrätetä, ylittää kiinteän aktiivisen pinnan.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että virtaa kierrätetään.

6. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virtausnopeus määrätään detektoitavan molekyylin koon mukaan. 30 li i7 8 2 9 b 6